Summary
Se describe un protocolo para el mapeo de la distribución espacial de la actividad enzimática de las enzimas que generan nicotinatmide adenina-dinucleótido-fosfato (NAD(P)H) + H + directamente en muestras de tejido.
Abstract
Asignación de actividad enzimática en el espacio y el tiempo es fundamental para entender las bases moleculares del comportamiento celular en tejido normal y la enfermedad. In situ el análisis de la actividad metabólica puede proporcionar información sobre la distribución espacial de la actividad metabólica dentro de un tejido. Aquí proporcionamos un protocolo detallado para el seguimiento de la actividad de la enzima lactato deshidrogenasa directamente en muestras de tejido. Lactato deshidrogenasa es un factor determinante de si la glucosa consumida se convertirán en energía mediante glucólisis aeróbica o anaeróbica. Se proporciona una solución que contiene lactato y NAD a una sección de tejido congelado. Células con actividad alta lactato deshidrogenasa convierte el lactato siempre piruvato, mientras que al mismo tiempo convertir base de nicotinamida adenina dinucleótido (NAD) a NADH y un protón, que se puede detectar en la reducción de azul de formazán, que es visualizada como un precipitado de azul de nitrotetrazolio. Se describe un protocolo detallado para el seguimiento de actividad de lactato deshidrogenasa en piel de ratón. Aplicación de este protocolo, se encontró que la actividad de la lactato deshidrogenasa es alta en las células de vástago del folículo quieto dentro de la piel. Aplicar el protocolo a células madre embrionarias de ratón cultivados reveló la coloración mayor en células de vástago embrionarias cultivadas de fibroblastos embrionarios de ratón. Análisis de la aorta de ratón recién aislado revelaron la coloración en las células musculares lisas perpendiculares a la aorta. La metodología proporcionada puede utilizarse para el mapa espacial de la actividad de las enzimas que generan un protón en el tejido fresco o congelado.
Introduction
Entender las ubicaciones dentro de los tejidos en los que las enzimas tienen actividad alta o baja es esencial para la fisiología y desarrollo de la comprensión. Niveles de transcripción o de la proteína a menudo se utilizan como sustitutos para la actividad enzimática. Mientras que este tipo de estudios puede ser informativo, no proporcionan información que puede ser crítico para la determinación de actividad de una enzima, tales como las modificaciones post-traduccionales, la presencia de complejos de la proteína, o la localización subcelular de la enzima. Cuando la actividad enzimática se mide directamente, a menudo se controla en los lysates de homogeneizados de proteínas que no contienen información sobre células individuales dentro de la mezcla o la distribución espacial de las células con actividad alta o baja dentro de un tejido.
Aquí proporcionamos un protocolo detallado para el mapeo de la distribución espacial de la actividad enzimática dentro de una muestra de tejido. La metodología se basa en estudios anteriores demostrando que sales de tetrazolio pueden utilizarse para localizar la actividad de Deshidrogenasas reductasas y oxidasas en el tejido congelado1. Con estos métodos, un precipitado insoluble en agua se forma cuando los protones son transferidos a un tetrazolio sal2,3. Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa genera NADPH y un protón y se ha detectado actividad de tetrazolio. Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa ha sido monitoreada en platija Europea hepatocitos4, en las células alveolares tipo 2 de los pulmones5 y nefronas del riñón5. Sales de tetrazolio también se han utilizado para supervisar la actividad de la transcetolasa en tejido congelado6. Un acercamiento similar fue utilizado recientemente para supervisar la actividad de Deshidrogenasas múltiples en el mismo tejido en diapositivas adyacentes7.
Aquí describimos un método para utilizar sales de tetrazolio para supervisar la distribución espacial de la actividad de la deshidrogenasa del lactato (figura 1). Lactato deshidrogenasa puede convertir el piruvato generado por glucólisis a lactato y la reacción inversa. Actividad de la lactato deshidrogenasa, en consecuencia, es un determinante importante de la entrada de piruvato en el ciclo del ácido tricarboxílico versus su secreción como lactato. Niveles de lactato en la sangre a menudo se utilizan para diagnosticar una variedad de enfermedades, incluyendo cáncer8,9,10, porque puede indicar que la lesión o enfermedad ha dañado las células y la enzima ha sido liberada.
Hay cuatro genes de la lactato deshidrogenasa: LDHA, LDHB, LDHC y LDHD11. Se cree que han surgido de la duplicación de un temprano LDHA gene12LDHA y LDHB. LDH es activa como un tetrámero y LDHA y LDHB pueden formar homotetramers y heterotetramers uno con el otro. LDHA se divulga para tener una mayor afinidad por el piruvato, mientras que LDHB se divulga para tener una mayor afinidad por el lactato y preferentemente convertir lactato a piruvato13. El promotor LDHA contiene sitios de Unión para los HIF1α, cMYC y FOXM1 transcripción factores11. Además, como muchas otras enzimas glicolíticas14,15, LDH puede ser modificada por modificaciones post-traduccionales. Receptor de factor de crecimiento fibroblástico 1 puede fosforilan LDHA Y10, que promueve la formación de tetrámero, o Y83, que promueve la NADH sustrato Unión16. LDHA también puede ser acetilado17. Por estas razones, una comprensión completa de la actividad LDH requiere supervisión no sólo los niveles de proteínas LDH y actividad de la enzima.
Además el método que presentamos aquí, otros enfoques se han utilizado para supervisar la actividad de la lactato deshidrogenasa. Actividad de la deshidrogenasa de lactato puede ser monitoreado espectrofotométricamente en lisado homogenizada proteína. La generación de NADH como lactato se convierte en piruvato puede ser medida basada en absorbancia a 340 nm, mientras que la desaparición de NADH puede controlarse como piruvato es convertido a lactato18. Actividad de la lactato deshidrogenasa también ha sido monitoreado con la proyección de imagen de resonancia magnética (MRI). 13 C piruvato puede ser administrada y la conversión de piruvato a lactato puede ser monitoreada como la relación entre [1 -13C] lactato / [1 -13C] piruvato. Elevados ratios de [1 -13C] lactato / [1 -13C] piruvato se han observado en tejido de cáncer19. Mientras que los enfoques basados en la MRI pueden proporcionar información sobre actividad de la deshidrogenasa del lactato en condiciones normales y los tejidos de la enfermedad, las metodologías no tienen la resolución necesaria para determinar el nivel de actividad en células específicas. La metodología que aquí puede proporcionar información sobre la actividad de la lactato deshidrogenasa en las áreas de tejido e incluso en las células.
Mediante ensayos de actividad en situ , encontramos que la actividad de la lactato deshidrogenasa es alta en las células de vástago del folículo de pelo de piel de ratón20. También se usó el método para monitorear la actividad de lactato deshidrogenasa en las células madre embrionarias cultivadas y la actividad es mayor en las células de la capa de alimentador. Finalmente, supervisar la actividad de la lactato deshidrogenasa en aorta de ratón fresco y observó tinción en las células musculares lisas. Describimos aquí un protocolo detallado para el seguimiento de actividad de lactato deshidrogenasa en piel de ratón congelado.
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Protocol
Todos los experimentos descritos fueron aprobados por el Comité de cuidado Animal de la Universidad de California, Los Ángeles.
1. generar diapositivas de piel de ratón congelado
- Eutanasia a ratones según política de la institución.
Nota: Siga la política institucional para la ropa de protección. Todos los protocolos que implican animales deben ser aprobados por el Comité institucional de cuidado de animales. - Quitar el pelo del ratón con un recortador de pelo.
- Hacer incisiones en la piel con unas tijeras. Con unas pinzas, levantar la piel de ratón. Con unas tijeras, corte la sección de la piel.
- Llenar el cryomold con congelación reactivo compuesto (véase Tabla de materiales).
- Secciones de piel lugar en rellenos cryomolds con unas pinzas de punta de aguja. Oriente la piel de modo que rebanadas de tejido generará una sección transversal de la piel desde la epidermis a la dermis, la hipodermis y el músculo (figura 2).
Nota: si es posible, montaje experimental y de control ratones juntos en la misma cryomold por lo que pueden ser seccionadas en la misma diapositiva y procesados juntos. Tenga cuidado de no para crear burbujas. - Lugar cryomold en la superficie plana de un bloque de hielo seco en un cubo de hielo y permita que se congele. Siguen la orientación de la piel. Ajustar si es necesario.
Nota: Utilice guantes criogénicos cuando manipule el hielo seco. - Transferencia de cryomolds en un congelador de-80 ° C para el almacenamiento. Las muestras se pueden mantener en el congelador durante aproximadamente 3 meses sin pérdida significativa de la actividad enzimática. No deje que las secciones congeladas secar.
- Usando un criostato a-20 ° C, rodaja de tejido para crear secciones 7-10 μm de grosor de la piel mejor morfología21.
2. preparación de portaobjetos para tinción
- Establecer el conjunto de diapositivas para ser probado. Un control deslizante en el cual se destinará NAD y otro control slide en el que el sustrato, lactato, será retenida. Incluyen un portaobjetos de control positivo de un bloque de tejido congelado previamente investigado.
- Brevemente arreglar diapositivas que contiene secciones de piel con formol al 4% durante 5 minutos por Pipetear 1 mL de formol al 4% en la diapositiva o al procesar varias diapositivas, sumergiendo los portaobjetos en un recipiente con formalina al 4%.
Nota: Se asegurará la fijación de que la piel no pele de las correderas en los siguientes procedimientos y conservar la morfología de la piel.
PRECAUCIÓN: El formol es cancerígeno y peligroso; guantes, no dejarlo tocar su piel y realizar este paso en una campana de humos químicos. - Lavarlas portaobjetos con al menos 1 fosfato mL con tampón salino, pH 7,4, por porta por pipeteo o inmersión.
3. preparar solución de tinción
- Reactivos juntos Vortex para la tinción de actividad de la deshidrogenasa del lactato (50 mM de Tris pH 7.4, 750 μm NADP, 80 μm phenazine methosulfate (PMS), 600 μm azul de nitrotetrazolio cloruro y lactato de 30 mM) en un tubo de tamaño adecuado dependiendo de la cantidad de tinción solución necesaria.
Nota: 1 mL es suficiente para cubrir completamente una diapositiva. - Preparar una segunda solución en la que todos los reactivos están presentes excepto NAD. Preparar una solución tercera en la que todos los reactivos están presentes excepto lactato.
4. Incube los portaobjetos en solución de tinción
- Soluciones de control en las diapositivas preparadas cubriendo la sección en su totalidad o pipetee suavemente la solución de tinción (1 mL es suficiente para una diapositiva). Si se procesan juntos varias diapositivas, sumerja todas las diapositivas en la solución de tinción a la vez (Asegúrese de que el envase tiene suficiente solución para cubrir completamente la sección del tejido).
- Incubar los portaobjetos en un ambiente humidificado a 37 ° C en la oscuridad. Si la solución de tinción es encima de la diapositiva, coloque el portaobjetos en un ambiente humidificado para evitar la evaporación.
5. supervisar las diapositivas
- Controlar la conversión de la solución de tinción de claro a azul por inspección visual. Cuando las muestras han alcanzado el nivel deseado de color azulado, detener la reacción mediante la eliminación de la solución de tinción.
Nota: Para la piel, 10 minutos es suficiente. El tiempo dependerá del órgano y la actividad enzimática. - Enjuague los portaobjetos con tampón fosfato salino mediante pipeteo (1 mL es suficiente para cada diapositiva) o inmersión.
Nota: Las muestras que se compararán entre sí deben mantenerse en solución de tinción para la misma cantidad de tiempo.
6. contratinción y Monte
- Pipeta de un contraste en las diapositivas cuando las diapositivas han alcanzado un nivel adecuado de color azulado.
Nota: Counterstains que los núcleos rojo o verde proporcionará buen contraste con el azul creado por el precipitado precipitante. - Monte con acuoso o no acuoso medio22de montaje. Una a tres gotas (40-50 μL) de medio de montaje es suficiente dependiendo del tamaño de la hoja de cubierta.
7. diapositivas de imágenes y cuantificar
- Imagen se desliza bajo un microscopio de luz. Tomar fotografías de experimental y las muestras de control y todos los controles negativos 10 X, 20 X y 40 aumentos.
- Determinar la intensidad de la mancha azul en diferentes regiones con software de análisis de imagen.
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Representative Results
Hemos divulgado previamente resultados para en situ los ensayos de actividad en piel de ratón20. Como se muestra en la figura 3, se observaron altos niveles de actividad de lactato deshidrogenasa en las células madre de folículo piloso en la base del folículo del pelo cuando los procedimientos describen anteriormente fueron seguidos. Estos resultados fueron corroborados por célula de fluorescencia activada clasificación de piel para las células de vástago del folículo piloso y confirmando la actividad alta lactato deshidrogenasa en el compartimiento de la célula de vástago con ensayos de actividad en las células clasificadas.
En nuestros hallazgos de que las células madre de folículo piloso tiene actividad de la deshidrogenasa de lactato alto, extendimos nuestros estudios de células madre embrionarias cultivadas. Se analizaron los fibroblastos embrionarios de ratón que sirve como una capa de alimentador solo o en presencia de las células madre embrionarias. Para analizar las células cultivadas, el medio fue aspirado, y las células brevemente se fija y se incubaron con solución de tinción como se describe anteriormente la deshidrogenasa del lactato. Se observó actividad alta lactato deshidrogenasa en las células madre embrionarias en comparación con el ratón fibroblastos embrionarios (figura 4).
También hemos aplicado el protocolo de tinción para tejido recién aislado. Aortas ratón disecados y rodajas abiertos. Los vasos se abrió e inmovilizados por lo que el interior lumen de las aortas era accesible. Las muestras se incubaron con equilibrada solución de Hank de sal que contienen 0.5% Triton-X por 10 min, luego con la coloración de la solución por 10 minutos la deshidrogenasa del lactato solución de tinción de lactato deshidrogenasa se aplicó en el tejido fresco. Después de la incubación, se obtuvieron imágenes mostrando tinción en las células de músculo liso (figura 5).
Figura 1 : Actividad química de la deshidrogenasa del lactato y su detección. Lactato deshidrogenasa convierte el lactato + NAD en piruvato + NADH + H+. Los protones que se generaron reducirán nitroazul de tetrazolio a formazan, que formará un precipitado azul. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Esquema de orientación de piel de ratón en cryomolds. Piel de ratón debe orientarse dentro de cryomolds para que cada sección de corte contendrá una sección transversal de la piel entera de la epidermis, dermis, hipodermis y músculo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Lactato deshidrogenasa la coloración de la piel de ratón revela alta actividad en las células de vástago del folículo piloso. Piel de ratón fue congelada en cryomolds y se incubaron con la deshidrogenasa del lactato solución de tinción contiene lactato. Actividad de la deshidrogenasa de lactato era prominente en las células de vástago del folículo piloso. (A, B) Dos imágenes del ensayo de actividad de la deshidrogenasa del lactato de piel de ratón. (C, D) Dos imágenes de control de la coloración con el lactato sustrato retenido. Barra de escala = 50 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Alto lactato deshidrogenasa actividad en células madre embrionarias de ratón cultivadas. Ratón cultivadas las células madre embrionarias cultivadas en una capa de alimentador de fibroblastos embrionarios de ratón irradiados se analizaron para la actividad de la lactato deshidrogenasa. Alta actividad fue observada en las células en comparación con los fibroblastos. Los fibroblastos embrionarios de ratón mostraron niveles similares de coloración con y sin irradiación. Imágenes fueron tomadas con objetivo 20 X. Barra de escala = 50 μm. (A, B, D, E) fibroblastos embrionarios de ratón y células madre. (C, F) Fibroblastos embrionarios de ratón solo. (A-C) Imágenes fueron tomadas después de 7 minutos de incubación con solución de tinción. (D-F) Imágenes fueron tomadas después de 20 minutos de incubación con solución de tinción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 : Actividad alta lactato deshidrogenasa en las células de músculo liso que rodea la aorta ratón. Aortas fueron aislados de ratones eutanasia. Los vasos se fijaron durante 2 minutos en 2% paraformaldehído y lavaron 3 x 10 minutos en tampón de fosfato x 1 solución salina. Los vasos se incubaron con solución salina equilibrada de Hank con 0,5% Triton-X y lavados 3 x 5 minutos en tampón fosfato salino. Se agregó solución de tinción de lactato deshidrogenasa y las muestras se incubaron por 10 min a 37° C y lavaron 3 veces, 5 minutos con solución salina tamponada con fosfato de 1 x. Las muestras se fijaron luego de 1 hora en 2% paraformaldehído, lavaron 3 x 5 min con 1 x solución salina con tampón fosfato y reflejada. (A) solución lactato deshidrogenasa lactato. (B) la deshidrogenasa del lactato solución sin lactato como control negativo. Para cada sección, hay una imagen de aumento más bajada a la izquierda y un área designada se muestra con la mayor ampliación a la derecha. (A, B) Solución completa lactato deshidrogenasa lactato fue utilizado para la tinción. B es que una imagen magnificada del área indicada en la solución de lactato deshidrogenasa A. (C, D) imagen sin lactato fue utilizada para la tinción como control negativo. D es una imagen magnificada del área indicada en C. A y C fueron tomadas con objetivos X 20 (barra de escala = 50 μm) y B y D fueron tomadas con objetivo 40 X (barra de escala = 20 μm). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El método aquí descrito puede utilizarse para supervisar la actividad de la deshidrogenasa del lactato u otras enzimas metabólicas que generan NADH o NADPH, en diferentes tipos celulares dentro de un tejido o diferentes porciones de un tejido con el tiempo. Lactato deshidrogenasa es una enzima importante para la comprensión de la biología de los tumores y las células madre, y la capacidad para monitorear la actividad de la lactato deshidrogenasa en las células individuales es probable que proporcionar penetraciones importantes en la función de esta enzima.
Una ventaja importante de este protocolo en comparación con otras metodologías es que la capacidad de actividad enzimática de monitor, en lugar de a abundancia de proteína, puede dar lugar a información más concluyente sobre no sólo donde están las enzimas lactato deshidrogenasa presente, pero que son realmente funcionales. El enfoque descrito aquí puede combinarse con inmunohistoquímica para que el nivel de una proteína seleccionada, por ejemplo, un marcador de linaje de la célula, se determina en el mismo muestras de tejido como actividad de la lactato deshidrogenasa. Con respecto a enfoques basados en la MRI para supervisar la actividad de la lactato deshidrogenasa, el protocolo siempre tiene la ventaja que puede proporcionar una mayor resolución espacial y ayudar a determinar las células específicas dentro de un tejido que tienen alta actividad enzimática . En comparación con acercamientos a metabolismo de asignación basado en sustratos fluorógenos, detección de señal con el protocolo descrito no está limitado por autofluorescencia1. Miller y coautores realizan un análisis similar de la dependencia del tiempo y la dependencia de sustrato de cinco enzimas diferentes mediante el control de conversión a formazán7. Las reacciones fueron descubiertas seguir stoichiometric principios de cinética de la enzima. Miller y otros autores distinguidas enzimas mitocondriales de las enzimas no mitocondrial por co-localización con tinción mitocondrial7. Utiliza cloruro de 5-Cyano-2,3-di-(p-tolyl)tetrazolium (CTC) como un reactivo de detección seguido de microscopía confocal para el análisis de localización subcelular Co7.
El método descrito tiene desventajas también. Mientras que los enfoques basados en la MRI pueden usarse en los organismos vivos, el enfoque descrito requiere tejido fresco o congelado. Los tejidos congelados sólo son convenientes para unos meses porque la actividad de las enzimas se degradan con el tiempo, incluso cuando congelado. Además, porque el sustrato se suministra en exceso, el enfoque proporciona información sobre "potencial de actividad" asumiendo substrato está presente. Si los niveles de sustrato son limitantes, la distribución de la actividad observada con este ensayo puede desviarse de la cantidad de actividad que se produce fisiológicamente. Además, si existen diferentes isoformas de la misma enzima que realizan la misma actividad enzimática, el método presentado aquí no es capaz de distinguir entre ellos. Por ejemplo, el método no puede distinguir entre la actividad de LDHA versus LDHB. Una aproximación a la dirección de que este problema sería utilizar genéticamente diseñado ratones en los que una isoforma de la enzima solo es genéticamente inactiva.
Hemos experimentado con el SPM, un portador de electrones fotoquímicamente estable que media la transferencia de electrones entre el NADH y tetrazolio tintes23. Mientras que algunos científicos han divulgado que el PMS inhibe la actividad de glucosa 6-fosfato deshidrogenasa y PMS inútil5, encontramos el PMS a ser valioso para la localización de la enzima e incluirlo en nuestro protocolo. Algunos otros autores han informado utilizando alcohol de polivinilo para limitar la difusión de la glucosa 6-fosfato deshidrogenasa enzima1. En nuestros experimentos, no se encontró el alcohol de polivinilo para ser útil y eliminó.
A pocos pasos son críticos para el éxito de la tinción. Una cuestión importante es asegurar que las muestras de tejido se colocan correctamente en el cyromolds. Secciones de piel deben establecerse plana para que cortan rebanadas a través de la piel. Además, si varias secciones van a preparar, es ideal si están incrustados dentro de la misma cryomold por lo que puede ser cortadas juntos en la misma diapositiva. Esto ayudará a eliminar la variación debido al grueso de la diapositiva que se corta con el criostato. También es importante asegurarse de que el tejido conserva la actividad enzimática.
El mejor momento para poner fin a la reacción debe ser determinado empíricamente. Es necesario vigilar de cerca las diapositivas durante el período de incubación y determinar el momento adecuado para agregar contraste y montar las diapositivas basadas en la intensidad de la mancha azul. Si las muestras son también ligeramente manchadas, no será posible determinar dónde está la actividad. Si las muestras son overstained, el precipitado de formazan puede propagarse, lo que es difícil de determinar las áreas específicas que fueron originalmente altas en actividad.
Esperamos que este Protocolo será valioso para los científicos con una amplia gama de preguntas sobre el papel del metabolismo. Las aplicaciones incluyen tinción de co para la actividad metabólica y marcadores de linaje de la célula o marcadores de proliferación, evaluar las contribuciones de diferentes enzimas con modelos genéticos, evaluar la localización subcelular de la actividad enzimática, monitoreo actividad enzimática en el tejido enfermo o durante el desarrollo.
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Disclosures
Los autores tienen intereses que compiten a revelar.
Acknowledgments
HAC fue la Milton E. Cassel de la Rita Allen Foundation (http://www.ritaallenfoundation.org). Este trabajo fue financiado por subvenciones a HAC de nacional Instituto de R01 de ciencias médicas General GM081686 R01 AR070245, del Instituto Nacional de (médico General) Ciencias R01 GM0866465, la Eli y Edythe amplia centro de medicina regenerativa y Stem Cell Research Rose Hills y Hal Gaba premios), centro de salud/UCLA CTSI NIH Grant UL1TR000124, la sociedad de la leucemia linfoma, impacto el Iris Cantor de la mujer premios de Jonsson Comprehensive Cancer Center a WEL y HAC. Investigación en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional del cáncer de los institutos nacionales de salud bajo la concesión número P50CA092131. Los fundadores no tenían ningún papel en el diseño del estudio, recopilación de datos y análisis, publicación o preparación del manuscrito. HAC es un miembro de la Eli y Edythe amplia centro de medicina regenerativa e investigación de células madre, el Instituto de Biología Molecular de la UCLA y el programa interdepartamental de Bioinformática de UCLA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical instruments | For collecting skin from euthanized mice | ||
| Tissue-tek cryomold 25 mm x 20 mm x 5 mm | Fisher Scientific | NC9511236 | For freezing mouse skin |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Fisher Scientific | NC9638938 | For mounting cryomolds |
| Ice bucket | Fisher Scientific | 07-210-106 | |
| Dry Ice | |||
| Polysine Adhesion Slide | Fisher Scientific | 12-545-78 | |
| 4% formalin | Fisher Scientific | 23-245-684 | Dilluted in water |
| phosphate buffered saline, pH 7.4 | |||
| vortex | |||
| Tris base | Fisher Scientific | 23-245-684 | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N7004 | |
| Phenazine methosulfate | Sigma-Aldrich | P9625 | |
| Nitrotetrazolium blue chloride | Sigma-Aldrich | N6876 | |
| Lithium L-lactate | Sigma-Aldrich | L2250 | Substrate |
| 37°C incubator (or tissue culture incubator) | |||
| Braziliant! Counter stain | Anatech | 861 | Counter stain |
| Mounting medium | Vector Laboratories | H-5000 | |
| Cover slips for slides | Fisher Scientific | 12-544D | |
| Light microscope |
References
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