Summary
Neste artigo, vamos demonstrar o estabelecimento de culturas clonais de espécies de algas conjugação unicelulares coletadas de um site de campo natural.
Abstract
É essencial para estabelecer culturas clonais de microalgas para uso em estudos de vários temas, tais como fisiologia, genética, taxonomia e Microbiologia. Assim, é extremamente importante desenvolver técnicas para estabelecer culturas clonais. Neste artigo, vamos demonstrar o estabelecimento de culturas clonais de uma alga de conjugação. São coletadas amostras de água do campo. Posteriormente, as células são isoladas, usando uma pipeta capilar de vidro, colocado na mídia e cresceu em condições adequadas para a geração de uma cultura clonal.
Introduction
Conjugação de algas (da ordem Zygnematales), também conhecido como conjugatophytes, ocupam uma posição-chave filogenética como os parentes vivos mais próximos dos antepassados imediatos da terra plantas1,2. Estabelecidas culturas clonais de algas têm levado a uma grande variedade de estudos taxonômicos, fisiológicos e genéticos ao longo dos últimos anos. As técnicas de isolamento de microorganismos de um campo natural têm uma longa tradição de3,4. Nos últimos anos, isolamento automatizado técnicas usando citometria de fluxo foram também estabelecidos5. O método mais comum usado para obter uma única célula para o estabelecimento de uma cultura clonal é isolamento de célula única usando uma pipeta capilar de vidro6. Esse método tradicional requer habilidade e um protocolo experimental preciso.
Neste artigo, demonstramos a amostragem de algas de amostras de campo e o estabelecimento de culturas clonais de algas unicelulares de conjugação, tais como a espécie Closterium , usando uma pipeta capilar de vidro. Uma amostra de água contendo as células vegetativas é coletada de um site de campo (por exemplo, um lago, lagoa ou arrozal). As células são isoladas da amostra de água usando uma pipeta capilar de vidro e em seguida lavadas. As células são cultivadas em um tubo de ensaio contendo meio de nitrogênio-completada (médio CA) a 24 ° C, sob uma luz: 8 16-h-h regime de escuro. Esse método também é apropriado para isolar outras microalgas para gerar culturas clonais.
Protocol
1. a recolha de uma amostra de água contendo algas
Nota: Conjugatophytes unicelulares crescer em áreas de água doce estagnadas, como Lagos, pântanos e arrozais. Uma amostra de água contendo algas é recolhida a partir de um desses ambientes para produzir uma tensão de cultura. Os seguintes itens são necessários antes de iniciar o processo: uma rede de plâncton, uma pipeta descartável e uma garrafa ou um tubo de 50 mL para a coleta de amostras de água.
- Use uma rede em um ambiente de Lago de plâncton para coletar as algas da água. Use uma rede apropriada, dependendo da finalidade.
Nota: A parte superior da rede é permeável à água. As algas pego pela net concentram-se no recipiente inferior da rede de plâncton. Uma malha grossa permite que pequenas algas a passagem. Uma malha fina entupir facilmente. - Transferi a água (cerca de 50 mL) para o tubo de 50 mL ou uma garrafa de plástico de 100 mL. Levar a amostra de água concentrada para o laboratório.
- Conjugatophytes unicelulares também crescem em pântanos ou arrozais. Nestas áreas de águas rasas, a amostra de água contendo algas pode ser degustada diretamente com um conta-gotas. Em seguida, transferi a água (30-50 mL) para o tubo de 50 mL ou uma garrafa de plástico de 50 mL.
Nota: A água cuidadosamente colhidas amostras acima da superfície do solo para que a amostra não contém qualquer tipo de solo.
2. a confirmação das algas
Nota: Os seguintes itens são necessários: uma lupa ou microscópio portátil e um 60 mm prato para observação.
- Para confirmar a presença de algas na amostra enquanto na pipeta descartável, use a lupa para observar a amostra diretamente.
Nota: Células maiores de aproximadamente 400-1.000 µm de comprimento (por exemplo, Closterium ehrenbergii) pode ser facilmente observado usando esse método. - Para confirmar as algas sob o microscópio portátil, despeje a amostra de água em um prato de plástico do laboratório.
- Colocar a amostra (cerca de 3 mL) na parte interna da parte superior (tampa) do prato de Petri 60 milímetros, em seguida, coloque a metade inferior, com a parte inferior virada para a parte interna da tampa, na parte superior.
Nota: Esse método impede que a amostra se movendo e facilita a observação.
- Colocar a amostra (cerca de 3 mL) na parte interna da parte superior (tampa) do prato de Petri 60 milímetros, em seguida, coloque a metade inferior, com a parte inferior virada para a parte interna da tampa, na parte superior.
3. preparação de uma pipeta capilar de vidro de uma pipeta Pasteur para a isolação
Nota: Antes de iniciar o processo, os seguintes itens são necessários: esterilizar pipetas Pasteur, um rack para as pipetas Pasteur, um bulbo de borracha, luvas, uma lâmpada de espírito, metanol para a lâmpada do espírito, fórceps, um isqueiro, uma lata de lixo para o vidro e uma sala limpa ou laminar capa de fluxo (se necessário).
- Acenda uma lamparina.
- Para produzir uma pipeta capilar de vidro fino para o isolamento, certifique-se que a chama não está piscando. Aguçar a chama e derrete a pipeta Pasteur na sua ponta.
- Um vidro estéril pipeta Pasteur na chama, apoiada na parte lateral do bulbo de borracha com a mão e no lado de ponta usando fórceps de calor.
- Levar a pipeta Pasteur fora a chama e esticá-lo.
- Quando o vidro está a derreter, retire a pipeta Pasteur rapidamente a chama e puxe.
Nota: Neste experimento, a pipeta Pasteur foi prorrogada por 15-20 cm. fazer claro a pipeta é desligado a chama durante o puxando.
- Quando o vidro está a derreter, retire a pipeta Pasteur rapidamente a chama e puxe.
- Quebre a ponta da pipeta vidro capilar para o comprimento correcto. Porque a parte da curvando-se é o melhor, é ideal para a ponta.
Nota: Neste estudo, foi preparada uma pipeta capilar de vidro com uma ponta de 5 a 10 cm.- Certifique-se de descartar o capilar depois derrete-lo, e confirmar que a chama é posta para fora.
- As bolhas libertadas a pipeta capilar de vidro indicam o tamanho da ponta da abertura. Selecione o tamanho apropriado para a célula a ser isolada. Cerca de 1 mm de bolhas é adequada para o isolamento de espécies Closterium , com larguras de célula de 10-20 µm.
4. célula única isolamento por uma pipeta capilar de vidro
Nota: Os seguintes itens são necessários antes de começar: um microscópio invertido, vidros de relógio, um prato de plástico e estéril rosca tubos de ensaio contendo meio de CA (tabela 1) ou condicionado CA média7.
- Prepare alguns vidros de relógio (22 mm de diâmetro e 1 mm de profundidade), cada contendo 1 mL de meio estéril de CA.
- Isole uma célula-alvo da amostra de água coletada no campo.
- Despeje a amostra de água (cerca de 30-40 mL) que contém as células de destino para o prato de plástico.
- Enquanto observa a amostra no prato plástico sob um microscópio invertido, pega células únicas usando a pipeta capilar de vidro.
- Trazer a pipeta capilar de vidro perto da célula para facilitar a aspiração da célula por ação capilar.
- Transferi as células em um vidro de relógio contendo 1 mL de meio de CA estéril (Figura 1a).
- Pegar as células novamente usando uma pipeta capilar de vidro novo do meio estéril de CA e transferi-lo para um segundo vidro de relógio contendo meio estéril de CA (Figura 1b).
Nota: Este processo é repetido até que uma única célula é isolada na placa local (Figura 1C). - Pegar a única célula usando uma pipeta capilar de vidro novo e finalmente, transferi-lo para um tubo de ensaio contendo 14 mL de meio de CA ou condicionados CA médio (Figura 1 d). Incubar a amostra a 23 ° C, sob uma luz: 8 16-h-h escuro ciclo por 2 semanas.
Nota: O factor desconhecido para a proliferação celular, que é secretadas do crescimento de células para o meio ambiente, está incluídos no meio condicionado para facilitar a divisão celular4. Se for estabelecida uma cultura clonal, prepare o suporte de CA condicionado do meio de cultura4. A cultura vai ficar verde, se for bem sucedida.
Representative Results
Uma amostra de água (Inba1) de 50 mL foi coletada de um ponto de amostragem no lago Inba-numa (pH 8.1, 24,7 ° C; 35 ° 44′30. 2″N 140 ° 12′08. 2″E) no Sakura-shi, Chiba, Japão, em 25 de junho de 2016. A amostra de água era armazenada em 4-8 ° C. No dia seguinte após a coleta, uma amostra de Closterium SP. foi isolado a partir da amostra de água contendo as células vegetativas. As células vegetativas quinze de morfologia idêntica (Inba1-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, -12,-13, -14 e -15) foram isoladas a partir da amostra e em seguida, lavou usando a pipeta método de lavagem. Quinze células únicas isoladas foram cultivadas em tubos de ensaio independentes, contendo 15 mL de meio de CA condicionado. Depois de 2 semanas de incubação, observou-se proliferação celular em 9 tubos de ensaio [Inba1-1, -3, -4, -5 (Figura 2a), -6, -9, -10, -12 (Figura 2b) e-13; Tabela 2]. Estabeleceram-se nove culturas clonais dos Inba1 isolados de amostra (Figura 3).
Figura 1 : O fluxo de isolamento de célula única. (a) transferência a célula algal único alvo a amostra de água original para o estéril médio no primeiro vidro de relógio. (b, c) Transferi o celular novamente para o vidro de relógio próximo para lavar. Este procedimento deve ser repetido até que não haja nenhuma outras células/contaminantes do que o alvo a médio; três vidros de relógio são mostrados no diagrama aqui como exemplo. (d) finalmente, transferir a célula lavada para um tubo de ensaio do meio adequado para o crescimento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Fotografias de células vegetativas de Closterium SP. (um) Inba1-5) e (b) Inba1-12 são mostrados aqui. Barra de escala = 50 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Estabelecimento de uma cultura clonal da amostra Inba1. Os tubos de ensaio, cultivados por 2 semanas foram fotografados do fundo. Um asterisco indica a proliferação celular. Barra de escala = 2 cm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Nome da mídia | Referência | Comentários | |
| CA | Ichimura e Watanabe12 | O CA (não3)2·4H2 | 2 mg |
| KNO3 | 10 mg | ||
| NH4não3 | 5 mg | ||
| Β – at2glycerophosphate·5H2O | 3 mg | ||
| O MgSO4·7H2 | 2 mg | ||
| Vitamina B12 | 0,01 μg | ||
| Biotina | 0,01 μg | ||
| Tiamina HCl | 1 μg | ||
| Metais PIV | 0,1 mL | ||
| Fe (como EDTA; molar de 1:1) | 0,1 mL | ||
| HEPES | 40 mg | ||
| Adicione água para completar 100 mL | |||
| ajustar o pH com NaOH a 7.2 | |||
| Metais P IV | Provasoli e Pintner13 | At2EDTA·2H2, O | 100 mg |
| O FeCl3·6H2 | 19,6 mg | ||
| MnCl2· 4H2O | 3,6 mg | ||
| ZnCl2* | 1,04 mg | ||
| O CoCl2·6H2 | 0,4 mg | ||
| At2MoO4·2H2, O | 0,25 mg | ||
| Adicione água para completar 100 mL | |||
| Fe (como EDTA; molar de 1:1) | Provasoli14 | Fe (NH4)2(então4)2·6H2O, | 70,2 mg |
| Na2EDTA·2H2O, | 66 mg | ||
| Adicione água para completar 100 mL | |||
| Médio de CA condicionado | Abe et al.7 | Incube as células em meio fresco CA 14 – 20 dias. Coletar o médio cultivado por filtração utilizando papel de filtro qualitativo e esterilizar o meio filtrado em autoclave (121 ° C por 15 min). | |
| * O NIES, 1,04 mg ZnCl2 redacção 2,2 mg ZnSO4·7H2O. | |||
Tabela 1: Formulações de meios de comunicação utilizados neste estudo.
| Amostra de água | Nome da célula | Estatuto após a cultura | Nome de estirpe |
| Inba1 | -1 | As células se proliferaram | Inba1-1 |
| -2 | Não mudou | ||
| -3 | As células se proliferaram | inba1-3 | |
| -4 | As células se proliferaram | inba1-4 | |
| -5 | As células se proliferaram | inba1-5 | |
| -6 | As células se proliferaram | inba1-6 | |
| -7 | Não mudou | ||
| -8 | Não mudou | ||
| -9 | As células se proliferaram | inba1-9 | |
| -10 | As células se proliferaram | inba1-10 | |
| -11 | Não mudou | ||
| -12 | As células se proliferaram | inba1-12 | |
| -13 | As células se proliferaram | inba1-13 | |
| -14 | Não mudou | ||
| -15 | Não mudou |
Tabela 2: O isolamento julgamento sumário.
Discussion
Usando o método presente, cepas de 9 cultura clonal de SP. Closterium foram estabelecidas de 15 células isoladas da amostra de água (Inba1), que representa uma taxa de sucesso de 60%. Identificação de espécies realizarão no futuro por observação morfológica, bem como análises de ADN, tais como análise filogenética molecular8.
No presente método, o frescor da amostra de água é importante para a taxa de sucesso. É melhor isolar as células a partir das amostras de água logo que possível após a coleta de campo. Embora as células da espécie Closterium (por exemplo, c. ehrenbergii, c. peracerosum-strigosum-littorale complexo) podem ser mantidas na amostra de água para cerca de 7 d armazenando-a 4-8 ° C, o isolamento das células é desejável no dia da coleção ou no dia seguinte. Também é importante remover todos os contaminadores que não sejam as células alvo, aumentando assim o número de repetições de lavagem (i.e., > 3 x) podem impedir a contaminação das culturas por microorganismos no solo e células.
Uma limitação dessa técnica é que os meios de cultura utilizados neste protocolo (CA ou condicionados CA médio) nem sempre são adequados para todas as algas de conjugação. Em alguns casos, pode ser necessário considerar o uso de outro meio, bem como a luz diferente e a condições de temperatura. Além disso, como é difícil provar se uma cultura cresceu de uma única célula, é necessário buscar com precisão apenas 1 célula ao transferir células para um tubo de ensaio. Portanto, a transferência deve ser feito com uma nova pipeta capilar de vidro cada vez.
Estabelecer uma cultura clonal com este método de lavagem de pipeta é um método clássico/padrão e é o método mais confiável para usar para isolar as células desejadas para um estudo. Estabeleceram-se as culturas clonais de conjugação algas usadas em muitos estudos8,9,10,11 usando o método actual. É difícil analisar a conjugação algas sem uma cultura clonal. Além disso, nos últimos anos, sequências do genoma inteiro de novo tornou-se fácil de obter (por exemplo, usando o MinION nanopore sequencer), e estabelecer culturas clonais facilitará ainda mais o sequenciamento de novo . Em outras palavras, esse método é o primeiro passo no futuro estudar destas algas para compreender melhor a sua biodiversidade.
A fim de estabelecer uma tensão estável de cultura, é necessário realizar determinadas etapas críticas com precisão dentro do protocolo. O passo mais importante é a preparação de uma pipeta capilar de vidro com uma abertura ideal para permitir a passagem de apenas uma única célula. A abertura da pipeta capilar de vidro deve ser ligeiramente mais do que o comprimento do eixo menor da célula de interesse. A pipeta capilar de vidro ideal pode aspirar a uma única célula por ação capilar. No entanto, se o diâmetro da abertura é muito grande, o capilar também desenhará em materiais de contaminantes não-vivos ou mesmo (um) outro microrganismo, além da célula-alvo.
Para obter uma pipeta capilar de vidro com um ideal de abertura, os seguintes pontos são importantes para observação. Primeiro, o pilar de fogo deve ser estreito ao aquecer a pipeta capilar de vidro. Em seguida, quando puxar a pipeta Pasteur, tem que ser removido da chama; caso contrário, a abertura da pipeta Pasteur entrará em colapso.
Os equipamentos e recipientes mostrados neste protocolo são básicos e podem ser modificados. Por exemplo, usando placas multi bem em vez de vidros de relógio com um poço, a lavagem da célula pode ser feita mais eficiente. Além disso, os recipientes podem ser substituídos por outros semelhantes. Através da transferência de uma única célula para o meio de cultura para a última etapa, uma cultura clonal pode ser estabelecida.
Preparar um recipiente esterilizado e trabalhando em um capuz estabelecerá axénica cepas (não contaminadas). Para evitar a contaminação, é necessário repetir a etapa de lavagem com alíquotas frescas mais de 3x. Às vezes, as bactérias também são esterilizadas pela adição de antibióticos15.
Esse método focado em gênero (Zygnematales) isolamento, mas alterando o tamanho da abertura da pipeta capilar de vidro, pode ser aplicado para o isolamento de diferente tamanho plâncton.
Acknowledgments
Agradecemos Hisayoshi Nozaki (Universidade de Tóquio), Takashi Nakada (Keio University), Yuka Marukawa Hashimoto (Universidade feminina do Japão) e Hiroyuki Sekimoto (Universidade feminina do Japão). Gostaríamos de agradecer os revisores para suas observações. Este estudo foi suportado por um subsídio para investigação científica (n. º 26440223 e 15H 04413) da sociedade para a promoção da ciência, Japão, Japão e por uma concessão da Fundação de desenvolvimento de nova tecnologia para Yuki Tsuchikane.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sampling | |||
| Plankton net | RIGO, Japan | N-NO380T | Mesh size: 32 µm |
| Portable microscope (e.g., Nature Scope FABRE) | Nikon, Japan | JAN: 4960759 206725 | Magnification: 20× |
| Loupe (e.g., Peak 1985 Steinheil System Magnifier) | Tohkai Sangyo Co. Ltd., Japan | 1985-20 | Magnification: 20× |
| Spuit | EIKEN CHEMICAL CO. LTD. Japan | Sterile spuit No.4 | |
| 50 mL Tube (50 mL centrifuge tubes with screw caps) | Labcon, USA | 3181-345-008 | |
| Bottle (100 mL Polycarbonate bottle) | AS ONE Corporation, Japan | 1-7403-01 | |
| 60 mm dish | Asahi glass Co. Ltd., Japan | 1010-060 | For observation of algae. 60 mm/non-treated dish |
| Preparation of a micropipette | |||
| Pasteur pipettes (cotton plugged 9” Pasteur Pipettes) | Fisher Scientific, USA | 13-678-8B | 7 × 225 mm |
| Rubber bulb (SPOID SILICONE, 1 cc) | AS ONE Corporation, Japan | 5-5669-01 | 10 × 40 mm |
| Stainless forceps | AS ONE Corporation, Japan | PT-09 | 110 mm |
| Single-cell isolation | |||
| Watch glass (Blood reaction board) | Sekiya Rika Co., Ltd, Japan | F14-155-030 | to rinse cells during isolation. 22 mm diameter and 1 mm depth |
| Threaded test tubes | Fujimotorika, Co., Ltd, Japan | XX142 | 18 Ø × 170 mm |
| Inverted light microscope | Olympus, Tokyo, Japan | CKX41N | for isolation of algae. |
| Plastic dish | Asahi glass Co. Ltd., Japan | SH90-15E | 90 × 15 mm |
References
- Wickett, N. J., et al. Phylotranscriptomic analysis of the origin and early diversification of land plants. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, E4859-E4868 (2014).
- Delwiche, C. F., Cooper, E. D. The evolutionary origin of a terrestrial flora. Current Biology. 25, R899-R910 (2015).
- Daste, P., Neuville, D., Victor-Baptiste, B. A simple procedure for obtaining clonal isolation of diatoms. British Journal of Psychology. 18, 1-3 (1983).
- Pringsheim, E. G. Pure Cultures of Algae: Their Preparation and Maintenance. , Cambridge University Press. London, UK. 119 (1946).
- Sieracki, M., Poulton, N., Crosbie, N. Automated isolation techniques for microalgae. Algal Culturing Techniques: Automated isolation techniques for microalgae. Andersen, R. A. , Elsevier Academic Press. 101-116 (2005).
- Andersen, R. A., Kawachi, M. Traditional microalgae isolation techniques. Algal Culturing Techniques: Traditional micro algae isolation techniques. Andersen, R. A. , Elsevier Academic Press. 83-100 (2005).
- Abe, J., et al. Stable nuclear transformation of the Closterium peracerosum-strigosum-littorale complex. Plant and Cell physiology. 52, 1676-1685 (2011).
- Tsuchikane, Y., Tsuchiya, M., Kokubun, Y., Abe, J., Sekimoto, H. Conjugation processes of Penium margaritaceum (Zygnemophyceae, Charophyta). Phycological Research. 59, 74-82 (2011).
- Kanda, N., et al. CRISPR/Cas9-based knockouts reveal that CpRLP1 is a negative regulator of the sex pheromone PR-IP in the Closterium peracerosum-strigosum-littorale complex. Scientific Reports. 7, 17873 (2017).
- Ichimura, T. Mating types and reproductive isolation in Closterium-ehrenbergii Meneghini. Botanical Magazine-Tokyo. 94, 325-334 (1981).
- Sekimoto, H., Satoh, S., Fujii, T. Biochemical and physiological properties of a protein inducing protoplast release during conjugation in the Closterium peracerosum-strigosum-littorale complex. Planta. 182, 348-354 (1990).
- Ichimura, T., Watanabe, M. The Closterium calosporum complex from the Ryukyu Islands-Variation and taxonomical problems. Memoirs of the National Science Museum. 7, (1974).
- Provasoli, L., Pintner, I. J. Artificial media for fresh-water algae: problems and suggestions . The Ecology of Algae, a symposium held at the Pymatuning Laboratory of Field Biology on June 18 and 19, 1959. , Pymatuning Laboratory of Field Biology, University of Pittsburgh, . Pittsburgh. 84-96 (1960).
- Provasoli, L. Media & prospects for the cultivation of marine algae. Proceedings of U. S.-Japan Conference in Hakone, Japan. Tryon, C. A. Jr, Hartmann, R. T. , Japanese Society of Plant Physiologists. 63-75 (1968).
- Guillard, R. R. L. Purification methods for microalgae. Algal Culturing Techniques: Purification methods for microalgae. Andersen, R. A. , Elsevier Academic Press. 117-132 (2005).
