Summary
In questo articolo, dimostriamo l'istituzione delle culture clonale di specie algali coniugazione unicellulari raccolti da un sito di campo naturale.
Abstract
È essenziale stabilire colture clonali di microalghe per uso negli studi di vari argomenti, quali fisiologia, genetica, tassonomia e microbiologia. Pertanto, è estremamente importante sviluppare tecniche per stabilire culture clonale. In questo articolo, dimostriamo l'istituzione delle culture clonale di un'alga coniugazione. Campioni di acqua sono raccolti dal campo. Successivamente, le cellule sono isolate utilizzando una pipetta capillare di vetro, inseriti nei media e coltivate in condizioni idonee per la generazione di una cultura clonale.
Introduction
Coniugando le alghe (dell'ordine Zygnematales), noto anche come conjugatophytes, occupano una posizione filogenetica chiave come i parenti viventi più vicini degli antenati immediati di terra piante1,2. Stabilito culture clonale di alghe hanno portato a una vasta gamma di studi tassonomici, fisiologici e genetici negli ultimi anni. Le tecniche di isolamento di microrganismi da un campo naturale hanno una lunga tradizione3,4. Negli ultimi anni, automatizzato isolamento tecniche mediante citometria a flusso sono stati stabiliti5. Il metodo più comune utilizzato per ottenere una singola cella per la creazione di una cultura clonale è l'isolamento di singole cellule utilizzando una pipetta capillare di vetro6. Questo metodo tradizionale richiede abilità e un preciso protocollo sperimentale.
In questo articolo, dimostriamo il campionamento di alghe da campioni del campo e la creazione di culture clonale di alghe unicellulari coniugazione, come le specie di Closterium , utilizzando una pipetta capillare di vetro. Un campione di acqua contenente cellule vegetative è raccolti da un sito di campo (ad es., un lago, stagno o campo di risaia). Le cellule sono isolate dal campione acqua utilizzando una pipetta capillare di vetro e poi lavate. Le cellule sono coltivate in una provetta contenente azoto-completati medio (CA medio) a 24 ° C sotto una luce: 8 16-h-h regime scuro. Questo metodo è anche adatto per l'isolamento di altre microalghe per generare colture clonali.
Protocol
1. raccolta di un campione di acqua contenente alghe
Nota: Conjugatophytes unicellulari crescere nelle aree di acqua dolce stagnante, come laghi, paludi e risaie. Un campione di acqua contenente alghe raccolti da uno di questi ambienti per la produzione di un ceppo di cultura. I seguenti elementi sono necessari prima di iniziare il processo: un plancton netto, una pipetta monouso e una bottiglia o un tubo da 50 mL per la raccolta di campioni di acqua.
- Utilizzare un plancton netto in un ambiente di lago per raccogliere le alghe dall'acqua. Utilizzare una rete appropriata, a seconda dello scopo.
Nota: La parte superiore della rete è permeabile all'acqua. Le alghe catturate dalla rete sono concentrate nel contenitore inferiore del plancton netto. Un grossolano permette piccole alghe di passare attraverso. Una maglia fine intasarsi facilmente. - Trasferire l'acqua (circa 50 mL) per il tubo da 50 mL o una bottiglia di plastica di 100 mL. Portare il campione di acqua concentrata al laboratorio.
- Conjugatophytes unicellulari anche crescere in paludi o campi di risaia. In queste zone di acque basse, campione di acqua contenente alghe può campionare direttamente con un contagocce. Quindi, trasferire l'acqua (30-50 mL) per il tubo da 50 mL o una bottiglia di plastica di 50 mL.
Nota: L'acqua viene campionata attentamente sopra la superficie del terreno, affinché il campione non contiene alcun terreno.
2. conferma delle alghe
Nota: Sono necessari i seguenti elementi: una lente di ingrandimento o microscopio portatile e un 60 mm piatto per l'osservazione.
- Per confermare la presenza di alghe nel campione mentre è nella pipetta usa e getta, è possibile utilizzare la lente di ingrandimento per osservare il campione direttamente.
Nota: Più grandi cellule di circa 400-1.000 µm di lunghezza (ad es., Closterium trifasciata) può essere facilmente osservato utilizzando questo metodo. - Per confermare le alghe al microscopio portatile, versare il campione di acqua in un piatto di plastica di laboratorio.
- Mettere il campione (3 mL circa) sulla parte interna della metà superiore (coperchio) di 60 mm di Petri, quindi posizionare la metà inferiore, con la sua parte inferiore rivolta verso la parte interna del coperchio, sulla parte superiore.
Nota: Questo metodo conserva il campione da movimento e rende più facile l'osservazione.
- Mettere il campione (3 mL circa) sulla parte interna della metà superiore (coperchio) di 60 mm di Petri, quindi posizionare la metà inferiore, con la sua parte inferiore rivolta verso la parte interna del coperchio, sulla parte superiore.
3. preparazione di una pipetta capillare di vetro da una pipetta Pasteur per l'isolamento
Nota: Prima di iniziare il processo, sono necessari i seguenti elementi: sterilizzato pipette Pasteur, un rack per le pipette Pasteur, guanti, un bulbo di gomma, una lampada a spirito, metanolo per la lampada di spirito, un accendino, forcipe, un bidone per il vetro e una camera pulita o laminare Cappa a flusso (se necessario).
- Accendere un bruciatore ad alcool.
- Per produrre una pipetta capillare di vetro fine per l'isolamento, assicurarsi che la fiamma non è tremolante. Affilare la fiamma e fate sciogliere la pipetta di Pasteur alla sua punta.
- Un vetro sterile pipetta di Pasteur sulla fiamma, supportata dal lato del bulbo di gomma a mano e sul lato di punta usando il forcipe di calore.
- Prendere la pipetta di Pasteur spegne la fiamma e allungarlo.
- Quando il vetro si sta sciogliendo, rimuovere rapidamente la pipetta di Pasteur dalla fiamma e poi tirare.
Nota: In questo esperimento, la pipetta di Pasteur è stata estesa da 15-20 cm. Make sicuro che la pipetta è spento la fiamma durante il tiro.
- Quando il vetro si sta sciogliendo, rimuovere rapidamente la pipetta di Pasteur dalla fiamma e poi tirare.
- Rompere la punta della pipetta capillare di vetro alla lunghezza corretta. Poiché la parte di curvatura è la più bella, è ideale per la punta.
Nota: In questo studio, è stata preparata una pipetta capillare di vetro con una mancia di 5-10 cm.- Assicurarsi di eliminare il capillare dopo fusione esso e confermare che la fiamma è messo fuori.
- Le bolle rilasciate dalla pipetta capillare di vetro indicano le dimensioni della punta di apertura. Selezionare il formato corretto per la cella di essere isolato. Circa 1 mm di bolle è corretto per l'isolamento di specie Closterium , con larghezze di cella di 10-20 µm.
4. single-cell isolamento mediante una pipetta capillare di vetro
Nota: I seguenti elementi sono necessari prima di iniziare: un microscopio ottico invertito, vetri da orologio, un piatto di plastica e sterile filettati provette contenenti CA mezzo (tabella 1) o condizionata CA media7.
- Preparare alcuni vetri da orologio (22 mm di diametro e profondità di 1 mm), ciascuno contenente 1 mL di mezzo sterile di CA.
- Isolare una cellula bersaglio del campione di acqua raccolti sul campo.
- Versare il campione di acqua (circa 30-40 mL) contenenti cellule bersaglio nel piatto in plastica.
- Osservando l'esempio nel piatto di plastica sotto un microscopio ottico invertito, raccogliere singole cellule con la pipetta capillare di vetro.
- Portare la pipetta capillare di vetro accanto alla cella per facilitare l'aspirazione della cellula per azione capillare.
- Trasferire le cellule in un vetro da orologio contenente 1 mL di mezzo di CA sterile (Figura 1a).
- Pick up le celle utilizzando nuovamente una nuova pipetta capillare di vetro dal mezzo CA sterile e trasferirlo in un vetro da orologio secondo contenente mezzo sterile di CA (Figura 1b).
Nota: Questo processo viene ripetuto fino a quando una singola cellula è isolata nella piastra di spot (Figura 1C). - Pick up la singola cella usando una nuova pipetta capillare di vetro e infine di trasferirlo in una provetta contenente 14 mL di medium di CA o medium condizionato di CA (Figura 1D). Incubare il campione a 23 ° C sotto una luce: 8 16-h-h scuro ciclo per 2 settimane.
Nota: I fattore sconosciuti per proliferazione delle cellule, che sono secreti dalle cellule crescenti nell'ambiente circostante, sono inclusi nel medium condizionato per facilitare la divisione cellulare4. Se viene stabilita una cultura clonale, preparare il medium condizionato di CA dal terreno di coltura4. La cultura diventa verde se l'operazione riesce.
Representative Results
Un campione di acqua (Inba1) da 50 mL è stato raccolto da un punto di campionamento nel lago Inba-numa (pH 8.1, 24,7 ° C; 35 ° 44′30. 2″N 140 ° 12′08. 2″E) al Sakura-shi, Chiba, Giappone, il 25 giugno 2016. Il campione è stato conservato a 4-8 ° C. Il giorno successivo dopo la raccolta, un esemplare di Closterium SP. è stato isolato dal campione di acqua contenente cellule vegetative. Quindici cellule vegetative di morfologia identica (Inba1-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, -12, -13, -14 e -15) sono stati isolati dal campione e poi lavati con la pipetta metodo di lavaggio. Quindici isolate singole cellule sono state coltivate in provette indipendente contenente 15 mL di medium condizionato di CA. Dopo 2 settimane di incubazione, la proliferazione delle cellule è stata osservata in 9 provette [Inba1-1, -3, -4, -5 (Figura 2a), -6, -9, -10, -12 (Figura 2b) e -13; Tabella 2]. Nove culture clonali sono state stabilite dagli isolati di campione Inba1 (Figura 3).
Figura 1 : Il flusso di isolamento di singole cellule. (un) trasferimento delle cellule algali il singolo bersaglio da campione originale alla sterile medie il primo vetro d'orologio. (b, c) Trasferire di nuovo la cella per il vetro d'orologio prossimo a lavare. Questa procedura deve essere ripetuta fino a quando non ci sono nessun altre cellule/contaminanti rispetto l'obiettivo nel medio; tre vetri da orologio sono mostrati nel diagramma qui come esempio. (d) Infine, trasferire la cella lavata in una provetta del mezzo appropriato per la crescita. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Fotografie di cellule vegetative di Closterium SP. (un) Inba1-5) e (b) Inba1-12 sono mostrati qui. La barra della scala = 50 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Creazione di una cultura clonale del campione di Inba1. Le provette per 2 settimane in coltura sono state fotografate dal basso. Un asterisco indica la proliferazione delle cellule. La barra della scala = 2 cm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Nome del supporto | Riferimento | Commenti | |
| CA | Ichimura e Watanabe12 | CA (NO3)2·4H2O | 2 mg |
| KNO3 | 10 mg | ||
| NH4NO3 | 5 mg | ||
| Β-Na2glycerophosphate·5H2O | 3 mg | ||
| MgSO4·7H2O | 2 mg | ||
| Vitamina B12 | 0,01 μg | ||
| Biotina | 0,01 μg | ||
| Tiamina HCl | 1 μg | ||
| Metalli PIV | 0,1 mL | ||
| Fe (come EDTA; molare 1:1) | 0,1 mL | ||
| HEPES | 40 mg | ||
| Aggiungere acqua per fare 100 mL | |||
| pH regolare con NaOH per 7.2 | |||
| Metalli di P IV | Provasoli e oviducal13 | Na2EDTA·2H2O | 100 mg |
| FeCl3·6H2O | 19,6 mg | ||
| MnCl2· 4H2O | 3,6 mg | ||
| ZnCl2* | 1,04 mg | ||
| CoCl2·6H2O | 0,4 mg | ||
| 4·2H na2MoO2, O | 0,25 mg | ||
| Aggiungere acqua per fare 100 mL | |||
| Fe (come EDTA; molare 1:1) | Provasoli14 | Fe (NH4)2(quindi4)2·6H2O, | 70,2 mg |
| Na2EDTA·2H2O, | 66 mg | ||
| Aggiungere acqua per fare 100 mL | |||
| Medium condizionato di CA | Abe et al.7 | Incubare le cellule in medium CA fresco per 14 – 20 giorni. Raccogliere il mezzo di colto mediante filtrazione utilizzando carta da filtro qualitativa e sterilizzare il mezzo filtrato in autoclave (121 ° C per 15 min). | |
| * Il NIES, 1,04 mg ZnCl2 è sostituito dal 2,2 mg ZnSO4·7H2O. | |||
Tabella 1: Formulazioni i supporti utilizzati in questo studio.
| Campione di acqua | Nome della cella | Stato dopo cultura | Nome della razza |
| Inba1 | -1 | Le cellule hanno proliferato | Inba1-1 |
| -2 | Non modificato | ||
| -3 | Le cellule hanno proliferato | inba1-3 | |
| -4 | Le cellule hanno proliferato | inba1-4 | |
| -5 | Le cellule hanno proliferato | inba1-5 | |
| -6 | Le cellule hanno proliferato | inba1-6 | |
| -7 | Non modificato | ||
| -8 | Non modificato | ||
| -9 | Le cellule hanno proliferato | inba1-9 | |
| -10 | Le cellule hanno proliferato | inba1-10 | |
| -11 | Non modificato | ||
| -12 | Le cellule hanno proliferato | inba1-12 | |
| -13 | Le cellule hanno proliferato | inba1-13 | |
| -14 | Non modificato | ||
| -15 | Non modificato |
Tabella 2: Il riassunto prova di isolamento.
Discussion
Utilizzando il presente metodo, ceppi 9 cultura clonale di SP. Closterium sono stati stabiliti da 15 cellule isolate dal campione di acqua (Inba1), che rappresenta un tasso di successo del 60%. Identificazione di specie avverrà in futuro di osservazione morfologica, come pure le analisi del DNA, ad esempio analisi filogenetica molecolare8.
Nel presente metodo, la freschezza del campione d'acqua è importante per il tasso di successo. Si consiglia di isolare le cellule dai campioni di acqua appena possibile dopo la raccolta di campi. Anche se le cellule della specie Closterium (ad es., c. trifasciata, c. peracerosum-strigosum-littorale complessi) possono essere mantenute nel campione d'acqua per circa 7 d memorizzandolo a 4-8 ° C, l'isolamento delle cellule è auspicabile il giorno di raccolta o il giorno successivo. È anche importante rimuovere eventuali contaminanti diversi da cellule bersaglio, aumentando così il numero di ripetizioni di lavaggio (cioè, > 3 x) può impedire una contaminazione delle colture di microrganismi nel suolo e nelle cellule.
Una limitazione di questa tecnica è che i mezzi di coltura utilizzati in questo protocollo (CA o medium condizionato di CA) non sono sempre appropriati per coniugare tutte le alghe. In alcuni casi, può essere necessario considerare l'utilizzo di un altro supporto, come pure luce diversa e condizioni di temperatura. Inoltre, come è difficile dimostrare se una cultura è cresciuta da una singola cella, è necessario raccogliere con precisione solo 1 cella durante il trasferimento di cellule in una provetta. Di conseguenza, il trasferimento deve essere effettuato con una pipetta capillare di vetro nuovo ogni volta.
Creazione di una cultura clonale con questa pipetta metodo di lavaggio è un metodo standard di classico/ed è il metodo più affidabile per utilizzare per isolare le cellule desiderate per uno studio. Le culture clonale di alghe utilizzate in molti studi8,9,10,11 di coniugazione sono state stabilite utilizzando il presente metodo. È difficile analizzare la coniugazione alghe senza una cultura clonale. Inoltre, negli ultimi anni, de novo intero genoma sequenze sono diventato facile da ottenere (ad esempio, utilizzando il MinION nanopore sequencer) e instaurazione delle colture clonali faciliterà ulteriormente sequenziamento de novo . In altre parole, questo metodo è il primo passo in futuro lo studio di queste alghe per capire meglio la loro biodiversità.
Al fine di stabilire un ceppo stabile di cultura, è necessario eseguire alcuni passaggi critici con precisione all'interno del protocollo. Il passo più importante è la preparazione di una pipetta capillare di vetro con un'apertura ottima per permettere il passaggio di una singola cella solo. L'apertura della pipetta capillare di vetro deve essere leggermente superiore alla lunghezza di asse minore della cellula di interesse. La pipetta capillare di vetro ottimale può aspirare a una singola cella per azione capillare. Tuttavia, se il diametro del diaframma è troppo grande, il capillare si baserà anche in materiali contaminanti non viventi o anche (un) altro microrganismo, oltre alla cella di destinazione.
Per ottenere una pipetta capillare di vetro con un'apertura ottimale, i seguenti punti sono importanti da notare. In primo luogo, il pilastro della fiamma deve essere stretto durante il riscaldamento la pipetta capillare di vetro. Successivamente, quando si tira la pipetta di Pasteur, deve essere rimosso dalla fiamma; in caso contrario, l'apertura della pipetta Pasteur crollerà.
Le attrezzature e i contenitori mostrati in questo protocollo sono essenziali e possono essere modificati. Ad esempio, utilizzando piastre multi-pozzetto anziché vetri da orologio con un pozzo, il lavaggio della cella possa essere resi più efficiente. Inoltre, i contenitori possono essere sostituiti per altri simili. Con il trasferimento di una singola cella al terreno di coltura nell'ultima fase, può essere stabilita una cultura clonale.
Preparare un contenitore sterile e lavorando in un cappuccio stabilirà axeniche ceppi (incontaminate). Per evitare la contaminazione, è necessario ripetere la fase di lavaggio con aliquote fresche più di 3 volte. A volte, i batteri sono anche sterilizzati aggiungendo antibiotici15.
Questo metodo focalizzato su desmid (Zygnematales) isolamento, ma modificando le dimensioni dell'apertura di pipetta capillare di vetro, può essere applicato per l'isolamento di plancton di dimensioni diverse.
Acknowledgments
Ringraziamo Hisayoshi Nozaki (Università di Tokyo), Takashi Nakada (Keio University), Yuka Marukawa Hashimoto (Università femminile del Giappone) e Hiroyuki Sekimoto (Università femminile del Giappone). Desideriamo ringraziare gli utenti per i loro commenti. Questo studio è stato sostenuto da una sovvenzione per la ricerca scientifica (n. 26440223 e H 15 04413) della Japan Society per la promozione della scienza, Giappone e da una sovvenzione della Fondazione di sviluppo di tecnologia nuova per Yuki Tsuchikane.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sampling | |||
| Plankton net | RIGO, Japan | N-NO380T | Mesh size: 32 µm |
| Portable microscope (e.g., Nature Scope FABRE) | Nikon, Japan | JAN: 4960759 206725 | Magnification: 20× |
| Loupe (e.g., Peak 1985 Steinheil System Magnifier) | Tohkai Sangyo Co. Ltd., Japan | 1985-20 | Magnification: 20× |
| Spuit | EIKEN CHEMICAL CO. LTD. Japan | Sterile spuit No.4 | |
| 50 mL Tube (50 mL centrifuge tubes with screw caps) | Labcon, USA | 3181-345-008 | |
| Bottle (100 mL Polycarbonate bottle) | AS ONE Corporation, Japan | 1-7403-01 | |
| 60 mm dish | Asahi glass Co. Ltd., Japan | 1010-060 | For observation of algae. 60 mm/non-treated dish |
| Preparation of a micropipette | |||
| Pasteur pipettes (cotton plugged 9” Pasteur Pipettes) | Fisher Scientific, USA | 13-678-8B | 7 × 225 mm |
| Rubber bulb (SPOID SILICONE, 1 cc) | AS ONE Corporation, Japan | 5-5669-01 | 10 × 40 mm |
| Stainless forceps | AS ONE Corporation, Japan | PT-09 | 110 mm |
| Single-cell isolation | |||
| Watch glass (Blood reaction board) | Sekiya Rika Co., Ltd, Japan | F14-155-030 | to rinse cells during isolation. 22 mm diameter and 1 mm depth |
| Threaded test tubes | Fujimotorika, Co., Ltd, Japan | XX142 | 18 Ø × 170 mm |
| Inverted light microscope | Olympus, Tokyo, Japan | CKX41N | for isolation of algae. |
| Plastic dish | Asahi glass Co. Ltd., Japan | SH90-15E | 90 × 15 mm |
References
- Wickett, N. J., et al. Phylotranscriptomic analysis of the origin and early diversification of land plants. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, E4859-E4868 (2014).
- Delwiche, C. F., Cooper, E. D. The evolutionary origin of a terrestrial flora. Current Biology. 25, R899-R910 (2015).
- Daste, P., Neuville, D., Victor-Baptiste, B. A simple procedure for obtaining clonal isolation of diatoms. British Journal of Psychology. 18, 1-3 (1983).
- Pringsheim, E. G. Pure Cultures of Algae: Their Preparation and Maintenance. , Cambridge University Press. London, UK. 119 (1946).
- Sieracki, M., Poulton, N., Crosbie, N. Automated isolation techniques for microalgae. Algal Culturing Techniques: Automated isolation techniques for microalgae. Andersen, R. A. , Elsevier Academic Press. 101-116 (2005).
- Andersen, R. A., Kawachi, M. Traditional microalgae isolation techniques. Algal Culturing Techniques: Traditional micro algae isolation techniques. Andersen, R. A. , Elsevier Academic Press. 83-100 (2005).
- Abe, J., et al. Stable nuclear transformation of the Closterium peracerosum-strigosum-littorale complex. Plant and Cell physiology. 52, 1676-1685 (2011).
- Tsuchikane, Y., Tsuchiya, M., Kokubun, Y., Abe, J., Sekimoto, H. Conjugation processes of Penium margaritaceum (Zygnemophyceae, Charophyta). Phycological Research. 59, 74-82 (2011).
- Kanda, N., et al. CRISPR/Cas9-based knockouts reveal that CpRLP1 is a negative regulator of the sex pheromone PR-IP in the Closterium peracerosum-strigosum-littorale complex. Scientific Reports. 7, 17873 (2017).
- Ichimura, T. Mating types and reproductive isolation in Closterium-ehrenbergii Meneghini. Botanical Magazine-Tokyo. 94, 325-334 (1981).
- Sekimoto, H., Satoh, S., Fujii, T. Biochemical and physiological properties of a protein inducing protoplast release during conjugation in the Closterium peracerosum-strigosum-littorale complex. Planta. 182, 348-354 (1990).
- Ichimura, T., Watanabe, M. The Closterium calosporum complex from the Ryukyu Islands-Variation and taxonomical problems. Memoirs of the National Science Museum. 7, (1974).
- Provasoli, L., Pintner, I. J. Artificial media for fresh-water algae: problems and suggestions . The Ecology of Algae, a symposium held at the Pymatuning Laboratory of Field Biology on June 18 and 19, 1959. , Pymatuning Laboratory of Field Biology, University of Pittsburgh, . Pittsburgh. 84-96 (1960).
- Provasoli, L. Media & prospects for the cultivation of marine algae. Proceedings of U. S.-Japan Conference in Hakone, Japan. Tryon, C. A. Jr, Hartmann, R. T. , Japanese Society of Plant Physiologists. 63-75 (1968).
- Guillard, R. R. L. Purification methods for microalgae. Algal Culturing Techniques: Purification methods for microalgae. Andersen, R. A. , Elsevier Academic Press. 117-132 (2005).
