Summary
이 문서에서는, 종의 단 세포 변화 조류 자연 필드 사이트에서 수집 된 클론 문화의 설립을 설명 합니다.
Abstract
다양 한 주제, 생리학, 유전학, 분류학, 미생물학 등의 연구에 사용 하기 위해 미세 클론 문화 확립에 필수적 이다. 따라서, 매우 클론 문화를 구축 하는 기술을 개발 하는 것이 중요 하다. 이 문서에서는, conjugating 조류의 클론 문화의 설립을 설명합니다. 물 샘플은 현장에서 수집 됩니다. 그 후, 세포를 유리 모 세관 피 펫, 미디어에 배치 하 고 클론 문화 생성을 위해 적당 한 조건 하에서 재배를 사용 하 여 격리 됩니다.
Introduction
동산 (의 주문 Zygnematales) 조류, 일컬어 conjugatophytes, 차지 토지 식물1,2의 즉시 조상의 가장 가까운 살아있는 친척으로 주요 계통 발생 위치. 설립된 클론 문화 조류의 분류학, 생리, 그리고 유전자 연구의 광범위 한 지난 몇 년간 끌고있다. 자연적인 분야에서 미생물의 절연 기술을 오랜 전통3,4있다. 최근 몇 년 동안, cytometry 사용 하는 기술도 있다 자동화 된 격리 설립5. 클론 문화의 설립에 대 한 단일 셀을 가져오는 데 사용 하는 가장 일반적인 방법이입니다 유리 모 세관 피펫은6을 사용 하 여 단일 셀 격리. 이 전통적인 방법 기술과 정확한 실험 프로토콜에 필요합니다.
이 문서에서 설명 해 조류의 샘플링 필드 샘플 및 Closterium 종 같은 단 세포의 변화 조류의 클론 문화의 설립에서 유리 모 세관 피 펫을 사용 하 여 합니다. 식물 세포를 포함 하는 물 샘플 필드 사이트 (예를 들면, 호수, 연못, 또는 논)에서 수집 됩니다. 세포는 유리 모 세관 피 펫을 사용 하 여 물 샘플에서 격리 하 고 씻어. 셀 16 h 빛: 8에서 24 ° C에서 질소 보충 매체 (CA 중간)를 포함 하는 테스트 튜브에 교양-h 어두운 정권. 이 메서드는 또한 클론 문화 생성 하 다른 미세 분리에 적합.
Protocol
1. 해 조류를 포함 하는 물 샘플의 수집
참고: 단 세포 conjugatophytes 호수, 늪, 논 등 정체 민물 지역에서 성장 한다. 조류-포함 된 물 샘플은 문화 긴장을 생산 하기 위해 이러한 환경 중 하나에서 수집 됩니다. 프로세스를 시작 하기 전에 다음과 같은 항목이 필요: 플랑크톤 넷, 일회용 피 펫, 그리고 병 또는 50 mL 튜브 물 샘플을 수집.
- 플랑크톤 호수 환경에서 인터넷을 사용 하 여 물에서 조류를 수집. 사용 목적에 따라 적절 한 net.
참고: 그물의 상부는 물 침투성. 그물에 의해 조류 그물 플랑크톤의 하단 컨테이너에 집중 된다. 굵고 메쉬 작은 조류를를 통해 전달할 수 있습니다. 좋은 메쉬 쉽게 막힌 가져옵니다. - 50 mL 튜브 또는 100 mL 플라스틱 병에 물 (약 50ml)을 전송 합니다. 실험실에 집중된 물 샘플을가지고.
- 단 세포 conjugatophytes는 또한 늪 이나 논에서 성장 한다. 이 얕은 물 지역에서 조류를 포함 하는 물 샘플 직접 스포이드와 함께 샘플링 될 수 있습니다. 그런 다음, 전송 (30-50 mL) 물 50 mL 튜브 또는 50 mL 플라스틱 병.
참고: 물은 신중 하 게 샘플링 토양 표면 위의 샘플 어떤 토양을 포함 하지 않습니다.
2입니다. 조류의 확인
참고: 다음 항목은 필요 시는 루 페 또는 휴대용 현미경 및 60 m m 관찰에 대 한 접시.
- 일회용 피 펫에는 샘플에 조류의 존재를 확인, 샘플을 직접 관찰 하는 루 페를 사용 합니다.
참고: 약의 더 큰 셀 400-1000 µ m 길이 (예를 들어, Closterium ehrenbergii)에 쉽게 수 있습니다이 방법을 사용 하 여 관찰. - 휴대용 현미경 조류를 확인 하려면 플라스틱 실험실 접시에 물 샘플을 붓는 다.
- 윗부분의 안쪽 부분에 샘플 (약 3 mL)을 넣어 (뚜껑) 60 mm 페 트리 접시의 위에 뚜껑의 안쪽 부분을 직면 하 고 그것의 바닥 부분과 아래쪽 절반 장소.
참고:이 메서드는 이동에서 샘플을 유지 하 고 관찰을 쉽게.
- 윗부분의 안쪽 부분에 샘플 (약 3 mL)을 넣어 (뚜껑) 60 mm 페 트리 접시의 위에 뚜껑의 안쪽 부분을 직면 하 고 그것의 바닥 부분과 아래쪽 절반 장소.
3. 격리 한 유리 모 세관 피 펫 파스퇴르 피 펫에서의 준비
참고: 프로세스를 시작 하기 전에 다음과 같은 항목이 필요: 살 균 파스퇴르 펫, 파스퇴르 펫, 장갑, 고무 전구, 정신 램프, 유리, 쓰레기통, 집게, 라이터, 정신 램프에 대 한 메탄올에 대 한 랙 및 클린 룸 또는 층 류 흐름 후드 (필요한 경우)입니다.
- 알콜 버너 점화.
- 격리에 대 한 정밀한 유리 모 세관 피펫은 생산, 불꽃은 경 경 하지 있는지 확인 합니다. 불꽃을 날카롭게 하 고 파스퇴르 피 펫의 끝을 녹여.
- 지원 되는 고무 전구 측면에 손으로 및 팁 사이드에 집게를 사용 하 여 불꽃에 파스퇴르 피 펫 멸 균 유리 열.
- 불꽃에서 파스퇴르 피 펫을가지고 고 그것을 스트레칭.
- 유리 용 해, 신속 하 게 불꽃에서 파스퇴르 피 펫을 제거 하 고 키를 누릅니다.
참고:이 실험에서 파스퇴르 피펫으로 확장 되었다에 의해 15-20 cm. 확인 확실을 피펫으로 불꽃을 당기는 동안.
- 유리 용 해, 신속 하 게 불꽃에서 파스퇴르 피 펫을 제거 하 고 키를 누릅니다.
- 적절 한 길이를 유리 모 세관 피 펫의 끝을 휴식. 때문에 굴복 부분은 최고의 팁에 이상적입니다.
참고:이 연구에서 5-10 cm의 팁과 유리 모 세관 피펫은 준비 되었다.- 그것을 용융 후 모 세관을 삭제 하 고 불꽃 나오는 것을 확인 해야 합니다.
- 거품 유리 모 세관 피 펫에서 발표 여 팁의 크기를 나타냅니다. 격리 되어야 하는 셀에 대 한 적절 한 크기를 선택 합니다. 약 1 m m 거품의 셀 폭이 10-20 µ m의 Closterium 종의 격리에 대 한 적절 한입니다.
4. 단일 셀 격리 유리 모 세관 피 펫
참고: 시작 하기 전에 다음과 같은 항목이 필요: 거꾸로 가벼운 현미경, 시계 안경, 플라스틱 접시, 그리고 메 마른 스레드 시험관 CA 매체 (표 1)를 포함 하거나 CA 중간7조건.
- 몇 가지 시계 안경 (22 m m 직경에서 및 깊이 1 m m), 살 균 CA 매체의 각 포함 1 mL를 준비 합니다.
- 현장에서 수집 물 샘플에서 목표 셀을 격리 합니다.
- 플라스틱 그릇에 대상 셀을 포함 하는 물 샘플 (약 30-40 mL)를 따르십시오.
- 거꾸로 가벼운 현미경 플라스틱 접시에 샘플을 관찰 하는 동안 유리 모 세관 피 펫을 사용 하 여 단일 셀을 선택 합니다.
- 모 세관 작용에 의해 세포의 포부를 촉진 하기 위하여 셀 근처 유리 모 세관 피 펫을가지고.
- 살 균 CA 매체 (그림 1a)의 1 mL를 포함 하는 시계 유리에 셀을 전송 합니다.
- 다시 새로운 유리 모 세관 피펫은 멸 균 CA 매체에서를 사용 하 여 셀을 선택 하 고 메 마른 캘리포니아 매체 (그림 1b)를 포함 하는 두 번째 시계 유리에 그것을 전송.
참고:이 프로세스는 단일 셀 자리 플레이트 (그림 1c)에 격리 될 때까지 반복 됩니다. - 새로운 유리 모 세관 피펫은를 사용 하 여 단일 셀을 선택 하 고 마지막으로 CA 매체 또는 조건된 CA 매체 (그림 1의 d)의 14 mL를 포함 하는 테스트 튜브에 전송. 16 h 빛: 8에서 23 ° C에서 샘플을 품 어-어두운 h 2 주 주기.
참고: 주변 환경으로 성장 하는 세포에서 분 비 되는 세포 증식에 대 한 알 수 없는 factor(s)4세포 분열 촉진 하기 위하여 조절된 매체에 포함 됩니다. 클론 문화를 설립 하는 경우 배양4에서 바른된 CA 매체를 준비 합니다. 문화 성공 하면 녹색을 돌 것 이다.
Representative Results
50 mL의 물 샘플 (Inba1) 한 샘플링 지점 호수 바 numa에서에서 수집 (pH 8.1 24.7 ° C; 35 ° 44′30. 2″N 140 ° 12′08. 2″E)에 사쿠라 시, 치 바, 일본, 6 월 25 일, 2016. 물 샘플은 4-8 ° c.에 저장 된 Closterium sp.의 표본 수집 후 다음날 식물 세포를 포함 하는 물 샘플에서 분리 했다. 동일한 형태학의 15 식물 세포 (Inba1-1,-2,-3,-4,-5,-6,-7,-8,-9,-10,-11,-12,-13,-14, 및-15) 샘플에서 고립 되었고 다음 세척 방법 피 펫을 사용 하 여 세척. 15 고립 된 단일 셀 조건된 CA 매체의 15 mL를 포함 하는 독립적인 테스트 튜브에 교양 있었다. 2 주 후 부 화, 세포 증식 9 테스트 튜브에서 관찰 되었다 [Inba1-1,-3,-4,-5 (그림 2a),-6,-9,-10,-(그림 2b), 12와-13; 표 2]입니다. 9 클론 문화 Inba1 샘플 분리 (그림 3)에서 설립 되었다.
그림 1 : 단일 셀 격리의 흐름. 첫 번째 시계 유리에서 (은)는 살 균을 원래 물 샘플에서 단일 대상 조류 셀 전송 매체. (b, c) 씻어 다음 시계 유리 셀을 다시 전송 합니다. 없는 다른 셀/오염 매체; 대상 보다는 때까지이 절차를 반복 해야 합니다. 3 개의 시계 유리는 예를 들어 여기에 다이어그램에 표시 됩니다. (d) 마지막으로, 성장에 대 한 적절 한 매체의 테스트 튜브를 씻어 셀을 전송. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 식물 세포의 사진 Closterium sp. (한) Inba1-5와 (b) Inba1-12 여기에 표시 됩니다. 눈금 막대 = 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : Inba1 샘플에서 클론 문화의 설립. 2 주 동안 배양 시험관 바닥에서 촬영 했다. 별표는 셀 확산을 나타냅니다. 눈금 막대 = 2 cm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 미디어의 이름 | 참조 | 코멘트 | |
| CA | Ichimura와 와타나베12 | 캘리포니아 (3)2·4H2O | 2 밀리 그램 |
| 알 것3 | 10 mg | ||
| NH43 | 5 mg | ||
| Β-나2glycerophosphate·5H2O | 3 밀리 그램 | ||
| MgSO4·7H2O | 2 밀리 그램 | ||
| 비타민 B12 | 0.01 μ g | ||
| 비타민 b 복합체 | 0.01 μ g | ||
| 티 아민 HCl | 1 μ g | ||
| PIV 금속 | 0.1 mL | ||
| Fe (EDTA;로 1:1 어 금 니) | 0.1 mL | ||
| HEPES | 40 mg | ||
| 100 mL를 만들기 위해 물을 추가합니다 | |||
| pH 7.2 NaOH로 조정 | |||
| P 4 금속 | Provasoli 및 Pintner13 | 나2EDTA·2H2O | 100 mg |
| FeCl3·6H2O | 19.6 mg | ||
| MnCl2· 4 H2O | 3.6 mg | ||
| ZnCl2* | 1.04 mg | ||
| CoCl2·6H2O | 0.4 밀리 그램 | ||
| 나2무4·2H2O | 0.25 mg | ||
| 100 mL를 만들기 위해 물을 추가합니다 | |||
| Fe (EDTA;로 1:1 어 금 니) | Provasoli14 | Fe (NH4)2(이렇게4)2·6H2O, | 70.2 mg |
| Na2EDTA·2H2O, | 66 밀리 그램 | ||
| 100 mL를 만들기 위해 물을 추가합니다 | |||
| 바른된 CA 매체 | 아베 외7 | 14-20 일에 대 한 신선한 CA 매체에 세포를 품 어. 교양된 매체 여과 질적 필터 종이 사용 하 여 수집 하 고 압력가 마로 소독 (15 분 동안 121 ° C)에 의해 필터링 된 매체를 소독. | |
| *에 NIES 1.04 mg ZnCl2 2.2 mg ZnSO4·7H2o.에 의해 대체 됩니다. | |||
표 1:이 연구에 사용 된 미디어의 공식.
| 물 샘플 | 셀의 이름 | 문화 후 상태 | 스트레인 이름 |
| Inba1 | -1 | 세포 증식 | Inba1-1 |
| -2 | 변경 되지 | ||
| -3 | 세포 증식 | inba1-3 | |
| -4 | 세포 증식 | inba1-4 | |
| -5 | 세포 증식 | inba1-5 | |
| -6 | 세포 증식 | inba1-6 | |
| -7 | 변경 되지 | ||
| -8 | 변경 되지 | ||
| -9 | 세포 증식 | inba1-9 | |
| -10 | 세포 증식 | inba1-10 | |
| -11 | 변경 되지 | ||
| -12 | 세포 증식 | inba1-12 | |
| -13 | 세포 증식 | inba1-13 | |
| -14 | 변경 되지 | ||
| -15 | 변경 되지 |
표 2:에서 격리 시험 요약입니다.
Discussion
현재 메서드를 사용 하 여 Closterium sp.의 9 클론 문화 긴장 15 셀 60%의 성공률을 나타내는 물 샘플 (Inba1)에서 고립에서 설립 되었다. 종 식별 밖으로 미래에 형태학 관찰 분자 계통 발생 분석8같은 DNA 분석에 의해 실행 될 것 이다.
현재의 방법에서 물 샘플의 신선도 성공률에 중요 하다. 필드 컬렉션 후 즉시 물 샘플에서 세포를 분리 하는 것이 낫다. Closterium 종 (예를 들어, C. ehrenbergii, C. peracerosum-strigosum-littorale 복잡 한)의 세포는 4-8 ° C에서 그것을 저장 하 여 약 7 d 물 샘플에서 유지 될 수, 세포의 분리는 바람직한 컬렉션 또는 다음 날의 하루. 그것은 또한 세척 반복의 수를 증가 하는 그래서 대상 셀 이외의 어떤 오염 물질을 제거 하는 것이 중요 (즉, > 3 x) 미생물 토양과 셀에 의해 문화의 오염 되지 않을 수 있습니다.
이 기술은 한계 (CA 또는 CA 매체 조절된)이이 프로토콜에 사용 된 문화 미디어는 항상 모든 conjugating 조류에 대 한 적절 한입니다. 경우에 따라 그것은 다른 매체 뿐 아니라 다른 빛과 온도 조건을 사용 하 여 필요할 수 있습니다. 또한, 그것은 하나의 단일 셀에서 문화 성장 여부를 증명 하기 어려운, 그것은 테스트 튜브에 세포를 전송할 때 정확 하 게 1 셀을 선택 하는 데 필요한. 따라서, 전송 할 수 새로운 유리 모 세관 피 펫을 각 시간.
이 피 펫 세척 방법 클론 문화 수립 클래식/표준 방법 이며, 연구에 대 한 원하는 셀을 사용 하는 가장 신뢰할 수 있는 방법입니다. 많은 연구8,9,,1011 에 사용 되는 조류를 동산의 클론 문화는 현재 메서드를 사용 하 여 설치 되었다. 클론 문화 없이 변화 조류를 분석 하는 것이 어렵습니다. 또한, 최근 몇 년 동안, 드 노 보 전체 게놈 시퀀스를 (예를 들어, 미니 언 nanopore 시퀀서를 사용 하 여), 쉽게 되었고 클론 문화 구축 더 드 노 보 시퀀싱을 촉진 한다. 즉,이 메서드는 첫 번째 단계는 미래에 더 그들의 생물 다양성을 이해 하는 것이 조류의 연구.
안정적인 문화 긴장을 설정 하기 위해 그것은 정확 하 게는 프로토콜 내에서 특정 중요 한 단계를 수행 하는 데 필요한입니다. 가장 중요 한 단계는 단일 셀만의 통과 허용 하는 최적의 조리개와 유리 모 세관 피 펫의 준비 합니다. 유리 모 세관 피 펫의 조리개의 셀의 작은 축 길이 보다 약간 더 있어야 합니다. 최적의 유리 모 세관 피펫은 모 세관 작용에 의해 단일 셀을 발음 수 있습니다. 그러나, 조리개의 직경이 너무 크면, 모 세관 비 생활 오염 물질 또는 심지어 (는) 다른 organism(s), 목표 셀 외에 그릴 것입니다.
최적의 조리개와 유리 모 세관 피 펫을 얻기 위해 다음 사항을 주의 하는 중요 하다. 첫째, 불꽃의 기둥 유리 모 세관 피 펫을가 열 하는 때 좁은 수 있어야 합니다. 다음, 파스퇴르 피 펫, 당기는 불꽃;에서 제거 그렇지 않으면, 파스퇴르 피 펫의 조리개 붕괴 됩니다.
장비 및 컨테이너가이 프로토콜에 표시 된 기본은 하 고 수정할 수 있습니다. 예를 들어 사용 하 여 멀티 잘 플레이트 한 잘 시계 안경 대신, 셀 세척 할 수 있다 더 효율적. 또한, 기타 유사한 것 들에 대 한 컨테이너를 교체하실 수 있습니다. 마지막 단계에서 문화 매체에 단일 셀을 전송 하 여 클론 문화를 설정할 수 있습니다.
멸 균된 용기를 준비 하 고 후드에서 axenic (오염된) 긴장을 설정 합니다. 오염을 방지 하기 위해, 그것은 이상 3 x 신선한 aliquots와 세척 단계를 반복 해야 합니다. 가끔은, 박테리아는 또한 항생제15을 추가 하 여 멸 균.
이 방법에 초점을 맞춘 desmid (Zygnematales) 절연, 하지만 유리 모 세관 피펫은 조리개의 크기를 바꾸어 서, 그것은 다르게 크기의 플랑크톤의 고립에 적용할 수 있습니다.
Acknowledgments
우리 감사 히사요 노자 키 (도쿄 대학), 오 나카 다 (게이오 대학), 유카 Marukawa 하시 모토 (일본 여자 대학교), 히로유키 Sekimoto (일본 여자의 대학). 그들의 의견에 대 한 검토자에 게 감사 하 길. 이 연구는 과학의 승진, 일본, 일본 사회에서 과학 연구 (No. 26440223 및 15 H 04413)에 대 한 특정 고 유키 Tsuchikane에 새로운 기술 개발 재단에서 교부 금에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sampling | |||
| Plankton net | RIGO, Japan | N-NO380T | Mesh size: 32 µm |
| Portable microscope (e.g., Nature Scope FABRE) | Nikon, Japan | JAN: 4960759 206725 | Magnification: 20× |
| Loupe (e.g., Peak 1985 Steinheil System Magnifier) | Tohkai Sangyo Co. Ltd., Japan | 1985-20 | Magnification: 20× |
| Spuit | EIKEN CHEMICAL CO. LTD. Japan | Sterile spuit No.4 | |
| 50 mL Tube (50 mL centrifuge tubes with screw caps) | Labcon, USA | 3181-345-008 | |
| Bottle (100 mL Polycarbonate bottle) | AS ONE Corporation, Japan | 1-7403-01 | |
| 60 mm dish | Asahi glass Co. Ltd., Japan | 1010-060 | For observation of algae. 60 mm/non-treated dish |
| Preparation of a micropipette | |||
| Pasteur pipettes (cotton plugged 9” Pasteur Pipettes) | Fisher Scientific, USA | 13-678-8B | 7 × 225 mm |
| Rubber bulb (SPOID SILICONE, 1 cc) | AS ONE Corporation, Japan | 5-5669-01 | 10 × 40 mm |
| Stainless forceps | AS ONE Corporation, Japan | PT-09 | 110 mm |
| Single-cell isolation | |||
| Watch glass (Blood reaction board) | Sekiya Rika Co., Ltd, Japan | F14-155-030 | to rinse cells during isolation. 22 mm diameter and 1 mm depth |
| Threaded test tubes | Fujimotorika, Co., Ltd, Japan | XX142 | 18 Ø × 170 mm |
| Inverted light microscope | Olympus, Tokyo, Japan | CKX41N | for isolation of algae. |
| Plastic dish | Asahi glass Co. Ltd., Japan | SH90-15E | 90 × 15 mm |
References
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