Summary
I denne artikkelen viser vi etableringen av klonal kulturer encellede bøye alger arter fra et naturlig feltet område.
Abstract
Det er viktig å etablere klonal kulturer av mikroalger for bruk i studier av forskjellige emner, som fysiologi, genetikk, taksonomi og mikrobiologi. Dermed er det svært viktig å utvikle teknikker for å etablere klonal kulturer. I denne artikkelen viser vi etableringen av klonal kulturer av en conjugating alga. Vannprøver fra feltet. Deretter er celler isolert ved hjelp av en glass kapillær pipette, plassert i media, og dyrket under betingelser egnet for å generere en klonal kultur.
Introduction
Bøye alger (i orden Zygnematales), oppta også kjent som conjugatophytes, en nøkkel Fylogenetiske plasseringen som den nærmeste nålevende slektninger av Familiebakgrunn land planter1,2. Etablerte klonal kulturer av alger har ført til en rekke ulike taksonomiske, fysiologiske og genetiske studier de siste årene. Isolasjon teknikker av mikroorganismer fra et naturlig har en lang tradisjon3,4. De siste årene etablert automatisert isolering teknikker bruker flowcytometri har også vært5. Den vanligste metoden brukes til å innhente en enkeltcelle for etablering av en klonal kultur er encellede isolasjon bruker et glass kapillær pipette6. Denne tradisjonelle metoden krever dyktighet og en presis eksperimentelle protokoll.
I denne artikkelen viser vi prøvetaking av alger fra feltet prøver og etablering av klonal kulturer av encellede bøye alger, som Closterium arter, ved hjelp av en glass kapillær pipette. En vann utvalget inneholder vegetative celler samles fra et felt nettsted (f.eks, en innsjø, tjern eller paddy feltet). Cellene er isolert fra vann prøven ved hjelp av en glass kapillær pipette og deretter vasket. Cellene er kultivert i et reagensrør inneholder nitrogen-supplert medium (CA medium) på 24 ° C 16-h lys: 8-h mørke regimet. Denne metoden er også egnet for å isolere andre mikroalger å generere klonal kulturer.
Protocol
1. innsamling av en som inneholder alger
Merk: Encellede conjugatophytes vokse i stillestående ferskvann områder, for eksempel innsjøer, myrer og paddy felt. En alger inneholder vann utvalget samles fra en av disse miljøene til å produsere en kultur belastning. Følgende elementer er nødvendig før du starter prosessen: Planktonhåv, en engangs pipette, og en flaske eller en 50 mL tube for innsamling av vannprøver.
- Bruk Planktonhåv i innsjøen omgivelser for å samle alger fra vannet. Bruk et passende nett, avhengig av formålet.
Merk: Den øvre delen av nettet er permeabel til vann. Algene fanget av nettet er konsentrert i beholderen bunnen av plankton netto. En grov mesh kan små alger passerer. En finmasket får tett lett. - Overføre vannet (ca 50 mL) til 50 mL tube eller 100 mL plastflaske. Bringe konsentrert vann utvalget til laboratoriet.
- Encellet conjugatophytes også vokse i myrer paddy felt. Plassene grunt vann kan vann utvalget inneholder alger direkte samplet med en dropper. Deretter overføre vann (30-50 mL) 50 mL tube eller en 50 mL plastflaske.
Merk: Vannet er forsiktig samplet over overflaten slik at prøven ikke inneholder noen jord.
2. bekreftelse av alger
Merk: Følgende elementer er nødvendig: en loupe eller transportabel microscope og en 60 mm rett for observasjon.
- For å bekrefte tilstedeværelse av alger i utvalget mens det i den disponible pipette, bruk lupeverktøyet til å observere prøven direkte.
Merk: Større celler på ca 400-1000 µm i lengde (f.eks Closterium ehrenbergii) kan lett bli observert ved hjelp av denne metoden. - For å bekrefte alger under bærbare mikroskopet, hell vann utvalget i plast laboratorium parabol.
- Sette prøven (ca 3 mL) på den indre delen av den øvre halvdelen (lokk) av 60 mm Petriskål, plasser den nedre delen, med sin nederst mot den indre delen av lokket, på toppen.
Merk: Denne metoden holder prøven seg og gjør observasjon enklere.
- Sette prøven (ca 3 mL) på den indre delen av den øvre halvdelen (lokk) av 60 mm Petriskål, plasser den nedre delen, med sin nederst mot den indre delen av lokket, på toppen.
3. forberedelse av en Glass kapillær Pipette fra en Pasteur Pipette for isolering
Merk: Før du starter prosessen, følgende er nødvendig: sterilisert Pasteur Pipetter, en rack for Pasteur Pipetter, hansker, en gummi pære, en ånd lampe, metanol for ånd lampen, en lighter, tang, en papirkurv for glass, og en rent eller laminær flyt hood (om nødvendig).
- Tenne en alkohol-brenner.
- For å produsere en fin glass kapillær pipette for isolering, kontroller at flammen ikke flimrer. Skjerpe flammen og smelte Pasteur pipette på spissen sin.
- Varme et sterilt glass Pasteur pipette på flammen, støttet på siden av gummi pære for hånd og på siden tips ved hjelp av pinsett.
- Ta Pasteur pipette av flammen og strekke den.
- Når glasset smelter, raskt fjerne Pasteur pipette fra flammen og trekk.
Merk: I dette eksperimentet, Pasteur pipette ble utvidet av 15-20 cm. Hekle sikker som pipette av flammen under trekke.
- Når glasset smelter, raskt fjerne Pasteur pipette fra flammen og trekk.
- Bryte spissen av glass kapillær Pipetter til riktig lengde. Fordi delen bukker er den fineste, er det ideelt for tipset.
Merk: I denne studien, en glass kapillær pipette med tips 5-10 cm var forberedt.- Husk å kaste av kapillær etter smelte det, og Bekreft at flammen er satt ut.
- Bobler fra glass kapillær pipette angir størrelsen på spissen åpning. Velg den riktige størrelsen for cellen isoleres. Ca 1 mm bobler er riktig for isolering av Closterium arter, med cellebredder på 10-20 µm.
4. encellede isolasjon av et Glass kapillær Pipetter
Merk: Følgende elementer er nødvendig før du begynner: en invertert lys mikroskop, se briller, en plast rett og sterile gjengede test-rør som inneholder CA medium (tabell 1) eller betinget CA medium7.
- Forbered noen se briller (22 mm i diameter og 1 mm i dybde), hver med 1 mL steril CA medium.
- Isolere en Målcelle fra vann eksempel samlet i feltet.
- Hell vann prøven (ca 30-40 mL) som inneholder målet celler i plast parabolen.
- Mens observere eksemplet i plast rett under en invertert lys mikroskop, plukke opp enkeltceller bruker glass kapillær pipette.
- Bringe glass kapillær pipette nær cellen å lette aspirasjon av cellen kapillær handling.
- Overføre cellene i en se glass som inneholder 1 mL steril CA medium (figur 1a).
- Plukk opp cellene igjen med en ny glass kapillær pipette fra sterilt CA medium og overføre den til en andre se glasset som inneholder sterilt CA medium (figur 1b).
Merk: Denne prosessen gjentas til en enkelt celle er isolert i spotplate (figur 1 c). - Plukk opp enkelt cellen med en ny glass kapillær pipette, og til slutt overføre det til en test-rør som inneholder 14 mL CA medium eller betinget CA medium (figur 1 d). Inkuber prøven på 23 ° C 16-h lys: 8-h mørke syklus i 2 uker.
Merk: Ukjent factor(s) for celle spredning, som utskilles fra voksende celler i omgivelsene, er inkludert i betinget medium å lette celledeling4. Hvis en klonal kulturen er etablert, forberede betinget CA mediet kultur medium4. Kulturen bli grønn hvis vellykket.
Representative Results
En vann utvalget (Inba1) 50 ml ble samlet inn fra en prøvepunktet i Lake Inba-numa (pH 8.1, 24.7 ° C, 35 ° 44′30. 2″N 140 ° 12′08. 2″E) på Sakura-shi, Chiba, Japan, på 25 juni 2016. Vann prøven ble lagret på 4-8 ° C. Dagen etter samlingen, et eksemplar av Closterium sp. ble isolert fra vann utvalget inneholder vegetative celler. Femten vegetative celler med identiske morfologi (Inba1-1-2 -3 -4,-5, -6, -7,-8,-9, -10,-11, -12,-13,-14, og -15) ble isolert fra utvalget og deretter vasket med Pipetter vaske metoden. Femten isolert enkeltceller ble kultivert i uavhengig test-rør som inneholder 15 mL av betinget CA medium. Etter 2 uker med inkubering celle spredning ble observert i 9 reagensglass [Inba1-1-3, -4, 5 (figur 2a), -6,-9, -10, -12 (figur 2b), og-13; Tabell 2]. Ni klonal kulturer ble opprettet fra Inba1 eksempel isolert (Figur 3).
Figur 1 : Flyten av encellede isolasjon. (en) overføring alger enkelt målcellen fra den opprinnelige vann prøven til den sterile medium i første se glass. (b, c) Overføre cellen igjen til neste se glasset å vaske. Denne fremgangsmåten bør gjentas til det er ingen andre celler/forurensninger enn målet i medium; tre se glass vises i diagrammet her som et eksempel. (d) til slutt overføre vasket cellen slik testen av aktuelle mediet for vekst. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Fotografier av vegetative celler av Closterium Sp. (en) Inba1-5 og (b) Inba1-12 vises her. Baren skala = 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Etablering av en klonal kultur fra Inba1 eksempel. Reagensglass kultivert for 2 uker ble fotografert fra bunnen. En stjerne angir celle spredning. Baren skala = 2 cm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Navnet på media | Referanse | Kommentarer | |
| CA | Ichimura og Watanabe12 | Ca (ingen3)2·4H2O | 2 mg |
| KNO3 | 10 mg | ||
| NH4ingen3 | 5 mg | ||
| Β-Na2glycerophosphate·5H2O | 3 mg | ||
| MgSO4·7H2O | 2 mg | ||
| Vitamin B12 | 0,01 μg | ||
| Biotin | 0,01 μg | ||
| Thiamin HCl | 1 μg | ||
| PIV metaller | 0,1 mL | ||
| Fe (som EDTA; 1:1 molar) | 0,1 mL | ||
| HEPES | 40 mg | ||
| Legge til vann for å lage 100 mL | |||
| pH justere med NaOH til 7.2 | |||
| P IV metaller | Provasoli og Pintner13 | Na2EDTA·2H2O | 100 mg |
| FeCl3·6H2O | 19,6 mg | ||
| MnCl2· 4H2O | 3.6 mg | ||
| ZnCl2* | 1.04 mg | ||
| CoCl2·6H2O | 0,4 mg | ||
| Na2MoO4·2H2O | 0,25 mg | ||
| Legge til vann for å lage 100 mL | |||
| Fe (som EDTA; 1:1 molar) | Provasoli14 | Fe (NH4)2(så4)2·6H2O, | 70.2 mg |
| Na2EDTA·2H2O, | 66 mg | ||
| Legge til vann for å lage 100 mL | |||
| Betinget CA medium | Abe et al.7 | Inkuber celler i frisk CA medium for 14-20 dager. Samle helstøpt medium ved filtrering ved hjelp av kvalitative filter papir og sterilisere filtrerte mediet av autoklavering (121 ° C i 15 min). | |
| * I Selskapene, er 1.04 mg ZnCl2 erstattet av 2.2 mg ZnSO4·7H2O. | |||
Tabell 1: Formuleringer av mediene som brukes i denne studien.
| Vann utvalget | Navnet på cellen | Status etter kultur | Belastning navn |
| Inba1 | -1 | Celler proliferated | Inba1-1 |
| -2 | Ikke endret | ||
| -3 | Celler proliferated | inba1-3 | |
| -4 | Celler proliferated | inba1-4 | |
| -5 | Celler proliferated | inba1-5 | |
| -6 | Celler proliferated | inba1-6 | |
| -7 | Ikke endret | ||
| -8 | Ikke endret | ||
| -9 | Celler proliferated | inba1-9 | |
| -10 | Celler proliferated | inba1-10 | |
| -11 | Ikke endret | ||
| -12 | Celler proliferated | inba1-12 | |
| -13 | Celler proliferated | inba1-13 | |
| -14 | Ikke endret | ||
| -15 | Ikke endret |
Tabell 2: Isolasjon prøve sammendraget.
Discussion
Med metoden finnes ble 9 klonal kultur stammer Closterium SP etablert fra 15 celler isolert fra vann utvalget (Inba1), som representerer en 60% suksessrate. Identifisering av arter vil bli utført i fremtiden morfologiske observasjon samt DNA analyser, som molecular Fylogenetiske analyser8.
Metoden finnes er friskhet av det viktig å suksessraten. Det er bedre å isolere cellene fra vannprøver så snart som mulig etter feltet samlingen. Selv om celler av Closterium arter (f.eks C. ehrenbergii, C. peracerosum-lever-littorale komplekse) kan opprettholdes i vann utvalget for ca 7 d ved å lagre den på 4-8 ° C, er isolasjon cellene ønskelig på dagen for samlingen eller neste dag. Det er også viktig å fjerne eventuelle forurensninger enn målcellene, så øker antallet vask repetisjoner (dvs., > 3 x) kan hindre en forurensning av kulturer av mikroorganismer i jord og celler.
En begrensning av denne teknikken er at kultur mediene som brukes i denne protokollen (CA eller betinget CA medium) ikke er alltid passer for alle conjugating alger. I noen tilfeller kan det være nødvendig å vurdere å bruke et annet medium, samt annet lys og temperaturer. Også, som det er vanskelig å bevise om en kultur har vokst fra en enkelt celle, er det nødvendig å plukke bare 1 celle når du overfører celler til et reagensrør. Derfor skal overføring gjøres med en ny glass kapillær pipette hver gang.
Å etablere en klonal kultur med denne pipette vaske metoden er en klassisk/standard metode og er den mest pålitelige metoden for å isolere ønsket celler for en studie. Klonal kulturer å bøye alger brukes i mange studier8,9,10,11 ble etablert med metoden finnes. Det er vanskelig å analysere bøye alger uten en klonal kultur. Videre de siste årene, de novo hele genomet sekvenser ble lett å få (f.eksved hjelp av MinION nanopore sequenceren), og å etablere klonal kulturer vil ytterligere forenkle de novo sekvensering. Med andre ord, er denne metoden det første trinnet i fremtiden studie av disse alger til å forstå deres biologisk mangfold.
For å etablere et stabilt belastning, er det nødvendig å utføre visse kritiske trinn nøyaktig i protokollen. Viktigste er utarbeidelsen av en glass kapillær pipette med en optimal aperture å tillate passasje av bare enkeltceller. Åpningen av glasset kapillær pipette må være litt mer enn mindre aksen cellen rundt. Optimal glass kapillær pipette kan Sug opp en enkeltcelle kapillær handling. Men hvis diameteren på blenderåpningen er for stor, vil av kapillær også trekke i ikke-levende miljøgifter eller selv (en) andre organism(s), i tillegg til målcellen.
For å få en glass kapillær pipette med en optimal blenderåpning, er følgende punkter viktige å merke. Først må søyle av flammen være smal når oppvarming glass kapillær pipette. Deretter når Pasteur pipette, har den å bli fjernet fra flammen; ellers vil blenderåpning av Pasteur pipette kollapse.
Utstyr og beholdere i denne protokollen er grunnleggende og kan bli endret. For eksempel ved å bruke flere bra plater i stedet for å se glass med en brønn, kan celle vask gjøres mer effektiv. I tillegg kan beholdere erstattes for andre. Ved å overføre en enkeltcelle til kultur medium på siste trinn, kan en klonal kultur etableres.
Forberede en sterilisert beholder og arbeider i hette vil etablere axenic (forurenset) stammer. For å hindre forurensning, er det nødvendig å gjenta vask trinnet med fersk dele mer enn 3 x. Noen ganger er bakterier også steriliseres ved å legge til antibiotika15.
Denne metoden fokusert på desmid (Zygnematales) isolasjon, men ved å endre størrelsen på glass kapillær pipette blenderåpning, kan den brukes på isolasjon av forskjellig størrelse plankton.
Acknowledgments
Vi takker Hisayoshi Nozaki (Universitetet i Tokyo), Takashi Nakada (Keio University), Yuka Marukawa Hashimoto (Japan kvinner University) og Hiroyuki Sekimoto (Japan kvinner University). Vi ønsker å takke korrekturleserne for deres kommentarer. Denne studien ble støttet av en Grant-in-Aid for vitenskapelig forskning (nr 26440223 og 15H 04413) fra Japan Society for fremme av vitenskap, Japan, og av et stipend fra den nye teknologien Development Foundation til Yuki Tsuchikane.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sampling | |||
| Plankton net | RIGO, Japan | N-NO380T | Mesh size: 32 µm |
| Portable microscope (e.g., Nature Scope FABRE) | Nikon, Japan | JAN: 4960759 206725 | Magnification: 20× |
| Loupe (e.g., Peak 1985 Steinheil System Magnifier) | Tohkai Sangyo Co. Ltd., Japan | 1985-20 | Magnification: 20× |
| Spuit | EIKEN CHEMICAL CO. LTD. Japan | Sterile spuit No.4 | |
| 50 mL Tube (50 mL centrifuge tubes with screw caps) | Labcon, USA | 3181-345-008 | |
| Bottle (100 mL Polycarbonate bottle) | AS ONE Corporation, Japan | 1-7403-01 | |
| 60 mm dish | Asahi glass Co. Ltd., Japan | 1010-060 | For observation of algae. 60 mm/non-treated dish |
| Preparation of a micropipette | |||
| Pasteur pipettes (cotton plugged 9” Pasteur Pipettes) | Fisher Scientific, USA | 13-678-8B | 7 × 225 mm |
| Rubber bulb (SPOID SILICONE, 1 cc) | AS ONE Corporation, Japan | 5-5669-01 | 10 × 40 mm |
| Stainless forceps | AS ONE Corporation, Japan | PT-09 | 110 mm |
| Single-cell isolation | |||
| Watch glass (Blood reaction board) | Sekiya Rika Co., Ltd, Japan | F14-155-030 | to rinse cells during isolation. 22 mm diameter and 1 mm depth |
| Threaded test tubes | Fujimotorika, Co., Ltd, Japan | XX142 | 18 Ø × 170 mm |
| Inverted light microscope | Olympus, Tokyo, Japan | CKX41N | for isolation of algae. |
| Plastic dish | Asahi glass Co. Ltd., Japan | SH90-15E | 90 × 15 mm |
References
- Wickett, N. J., et al. Phylotranscriptomic analysis of the origin and early diversification of land plants. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, E4859-E4868 (2014).
- Delwiche, C. F., Cooper, E. D. The evolutionary origin of a terrestrial flora. Current Biology. 25, R899-R910 (2015).
- Daste, P., Neuville, D., Victor-Baptiste, B. A simple procedure for obtaining clonal isolation of diatoms. British Journal of Psychology. 18, 1-3 (1983).
- Pringsheim, E. G. Pure Cultures of Algae: Their Preparation and Maintenance. , Cambridge University Press. London, UK. 119 (1946).
- Sieracki, M., Poulton, N., Crosbie, N. Automated isolation techniques for microalgae. Algal Culturing Techniques: Automated isolation techniques for microalgae. Andersen, R. A. , Elsevier Academic Press. 101-116 (2005).
- Andersen, R. A., Kawachi, M. Traditional microalgae isolation techniques. Algal Culturing Techniques: Traditional micro algae isolation techniques. Andersen, R. A. , Elsevier Academic Press. 83-100 (2005).
- Abe, J., et al. Stable nuclear transformation of the Closterium peracerosum-strigosum-littorale complex. Plant and Cell physiology. 52, 1676-1685 (2011).
- Tsuchikane, Y., Tsuchiya, M., Kokubun, Y., Abe, J., Sekimoto, H. Conjugation processes of Penium margaritaceum (Zygnemophyceae, Charophyta). Phycological Research. 59, 74-82 (2011).
- Kanda, N., et al. CRISPR/Cas9-based knockouts reveal that CpRLP1 is a negative regulator of the sex pheromone PR-IP in the Closterium peracerosum-strigosum-littorale complex. Scientific Reports. 7, 17873 (2017).
- Ichimura, T. Mating types and reproductive isolation in Closterium-ehrenbergii Meneghini. Botanical Magazine-Tokyo. 94, 325-334 (1981).
- Sekimoto, H., Satoh, S., Fujii, T. Biochemical and physiological properties of a protein inducing protoplast release during conjugation in the Closterium peracerosum-strigosum-littorale complex. Planta. 182, 348-354 (1990).
- Ichimura, T., Watanabe, M. The Closterium calosporum complex from the Ryukyu Islands-Variation and taxonomical problems. Memoirs of the National Science Museum. 7, (1974).
- Provasoli, L., Pintner, I. J. Artificial media for fresh-water algae: problems and suggestions . The Ecology of Algae, a symposium held at the Pymatuning Laboratory of Field Biology on June 18 and 19, 1959. , Pymatuning Laboratory of Field Biology, University of Pittsburgh, . Pittsburgh. 84-96 (1960).
- Provasoli, L. Media & prospects for the cultivation of marine algae. Proceedings of U. S.-Japan Conference in Hakone, Japan. Tryon, C. A. Jr, Hartmann, R. T. , Japanese Society of Plant Physiologists. 63-75 (1968).
- Guillard, R. R. L. Purification methods for microalgae. Algal Culturing Techniques: Purification methods for microalgae. Andersen, R. A. , Elsevier Academic Press. 117-132 (2005).
