Summary
В этой статье мы продемонстрировать создание клоновых культур одноклеточными спрягать видов водорослей, собранные от естественного поля сайта.
Abstract
Важно установить клоновых культур микроводорослей для использования в исследованиях по различным темам, например, физиологии, генетики, таксономии и микробиологии. Таким образом чрезвычайно важно разработать методы для установления клоновых культур. В этой статье мы продемонстрировать создание клоновых культур спрягать Алга. Пробы воды собираются из поля. Впоследствии клетки изолированы с помощью стекла капиллярные пипетки, размещены в средствах массовой информации и выросли в условиях подходит для генерации клоновых культуры.
Introduction
Спряжение водорослей (ордена Zygnematales), также известен как conjugatophytes, занимают ключевых Филогенетическое положение как ближайших живущих родственников немедленное предки наземных растений1,2. Установленным клоновых культуры водорослей привели к широкий спектр таксономических, физиологических и генетических исследований за последние годы. Методы изоляции микроорганизмов от естественного поля имеют давнюю традицию3,4. В последние годы автоматизированных изоляции, что методы, с помощью проточной цитометрии также были созданы5. Наиболее распространенный метод, используемый для получения одной ячейки для создания клоновых культуры является одной ячейки изоляции с помощью стеклянные капиллярные пипетки6. Этот традиционный метод требует мастерства и точное экспериментальный протокол.
В этой статье мы демонстрируем выборки водорослей из поля образцов и создание клоновых культур спрягать одноклеточные водоросли, такие как Closterium видов, с использованием стеклянные капиллярные пипетки. Пробы воды, содержащие растительные клетки собирается из области сайта (например, озеро, пруд или рисовом поле). Клетки изолированы от образца воды с помощью стеклянные капиллярные пипетки и затем промывают. Клетки культивируемых в пробирки, содержащие азот дополнить среднего (CA средний) при 24 ° C под свет: 8 16-h-h темный режим. Этот метод также подходит для изоляции другие микроводорослей для создания клоновых культур.
Protocol
1. сбор пробы воды, содержащие водорослей
Примечание: Одноклеточные conjugatophytes растут в застойные пресноводных районах, например, озер, болот и рисовых полей. Водоросли содержащие образец воды собираются из одной из этих сред для создания культуры штамма. Перед началом процесса требуются следующие элементы: чистая планктона, одноразовые пипетки и бутылка или 50 мл трубки для сбора проб воды.
- Используйте планктона, чистой в среде озера для сбора водорослей от воды. Используйте соответствующие сети, в зависимости от цели.
Примечание: Верхняя часть сети является проницаемой для воды. Водоросли, пойман в сети сосредоточены в нижней контейнер чистой планктона. Грубой очистки позволяет мелких водорослей пройти. Тонкой сеткой получает забиты легко. - Передать Тюбик 50 мл или 100 мл бутылка воды (около 50 мл). Принесите концентрированные воды образца в лабораторию.
- Одноклеточные conjugatophytes также растут в болотах или рисовые поля. В этих районах мелководья пробы воды, содержащие водорослей можно непосредственно пробы с капельницей. Затем перенесите (30-50 мл) воды на тюбик 50 мл или 50 мл бутылка.
Примечание: Вода тщательно отобранных выше поверхности почвы так, что образец не содержит каких-либо почвы.
2. подтверждение водорослей
Примечание: Требуются следующие элементы: лупы или портативный микроскоп и 60 мм блюдо для наблюдения.
- Чтобы подтвердить наличие водорослей в образце, пока он находится в одноразовой пипетки, используйте лупа для непосредственно наблюдать образца.
Примечание: Большие клетки около 400-1000 мкм в длину (например, Closterium ehrenbergii) может быть легко наблюдаемых с помощью этого метода. - Чтобы подтвердить водорослей под портативный микроскоп, залейте пробу воды в пластиковых Лаборатория блюдо.
- Поместить образец (около 3 мл) на внутренней части верхней половины (крышка) 60 мм Петри, затем поместите нижнюю половину, с его нижней части, с видом на внутреннюю часть крышки, на вершине.
Примечание: Этот метод сохраняет образца от движущихся и облегчает наблюдение.
- Поместить образец (около 3 мл) на внутренней части верхней половины (крышка) 60 мм Петри, затем поместите нижнюю половину, с его нижней части, с видом на внутреннюю часть крышки, на вершине.
3. Подготовка стеклянные капиллярные пипетки от пипетки Пастера для изоляции
Примечание: Перед началом процесса, требуются следующие элементы: стерилизованное пипетки Пастера, стойки для пипетки Пастера, перчатки, резиновую грушу, Спиртовка, метанола для Спиртовка, зажигалку, щипцы, мусорный бак для стекла и чистой комнате или слоистые капот потока (при необходимости).
- Воспламенение спиртовая горелка.
- Производить декоративные стекла капиллярные пипетки для изоляции, убедитесь, что пламя не мерцает. Точить пламени и расплавить пипетка Пастера на его кончик.
- Тепла стерильной стеклянной пипетки Пастера на пламя, поддерживаемые на стороне резиновую грушу вручную и на стороне иглы с помощью щипцов.
- Возьмите пипетку Pasteur от пламени и растянуть его.
- Когда плавления стекла, быстро удалить пипетка Пастера из пламени и затем тянуть.
Примечание: В этом эксперименте, пипетка Пастера был продлен на 15-20 см. сделать конечно что пипетки у пламени в течение потянув.
- Когда плавления стекла, быстро удалить пипетка Пастера из пламени и затем тянуть.
- Разорвать кончик стеклянные капиллярные пипетки для надлежащей длины. Потому что часть кланяясь является лучшим, это идеально подходит для подсказки.
Примечание: В этом исследовании, был подготовлен стеклянные капиллярные пипетки с наконечником 5-10 см.- Убедитесь в том отменить капиллярно после плавления его и подтвердить, что пламя потушить.
- Пузыри, освобождены от стеклянные капиллярные пипетки указывают размер кончика открытия. Выберите нужный размер для ячейки быть изолированы. Около 1 мм пузырей является надлежащей для изоляции видов Closterium , с шириной ячеек 10-20 мкм.
4. одноклеточных изоляции, стеклянные капиллярные пипетки
Примечание: Перед началом требуются следующие элементы: Перевернутый световой микроскоп, часы очки, пластиковые блюдо и стерильные резьбовые пробирки содержащие CA среднего (Таблица 1) или кондиционером CA средних7.
- Подготовьте несколько часы очки (22 мм в диаметре и 1 мм в глубину), каждый содержащий 1 мл стерильного CA среды.
- Изолируйте целевую ячейку из образца воды, собранные на местах.
- Залейте пробу воды (около 30-40 мл), содержащие клеток-мишеней в пластиковую посуду.
- Соблюдая образца в пластиковых блюдо под Перевернутый световой микроскоп, подберите отдельные ячейки, используя стеклянные капиллярные пипетки.
- Принесите ячейку для облегчения стремление ячейки капиллярность стеклянные капиллярные пипетки.
- Перенесите клетки в часы стекла, содержащие 1 мл стерильного CA среды (рис. 1a).
- Выбрать вверх снова, используя новые стекла капиллярные пипетки из стерильной среды CA клетки и перенести его на второй смотреть стекла, содержащие стерильные CA среднего (рис. 1b).
Примечание: Этот процесс повторяется до тех пор, пока одна ячейка изолирован в месте пластины (рис. 1С). - Возьмите одну ячейку, используя новые стекла капиллярные Пипетка и наконец, передача его в пробирку, содержащую 14 мл CA среднего или кондиционером CA среднего (рис. 1 d). Инкубировать образца при 23 ° C под свет: 8 16-h-h темные цикла за 2 недели.
Примечание: Неизвестный factor(s) для пролиферации клеток, которые сделаны секретным от выращивания клеток в окружающую среду, включены в среде с кондиционером для содействия клеточного деления4. Если установлено клоновых культуры, подготовьте кондиционером CA среднего от культуры среднего4. Культура повернет зеленый, если успешные.
Representative Results
Воды (Inba1) 50 мл был проб из одной точки выборки в озеро Инба numa (рН 8.1, 24,7 ° C; 35 ° 44′30. 2″N, 140 ° 12′08. 2″E) в Сакура Ши, Чиба, Япония, 25 июня 2016 года. Пробы воды хранится в 4-8 ° C. На следующий день после сбора, образец Closterium sp. был изолирован от пробы воды, содержащие растительные клетки. Пятнадцать вегетативной клетки идентичны морфологии (Inba1-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, -12, -13, -14 и -15) были изолированы от образца, а затем промывают, используя пипетку, мытье метод. Пятнадцать изолированные отдельные клетки были культивировали в независимых пробирки, содержащие 15 мл с кондиционерами CA среды. После 2 недель инкубации, пролиферацию клеток наблюдалось в 9 пробирки [Inba1-1, -3, -4, -5 (Рисунок 2a), -6, -9, -10, -12 (рис. 2b) и -13; Таблица 2]. Девять клоновых культур были созданы из изолятов пример Inba1 (рис. 3).
Рисунок 1 : Поток одной ячейки изоляции. () передачу единый целевой водорослевые клетки от исходного образца воды стерильной среды в первые часы стекло. (b, c) Передача ячейку снова на следующий стекла смотреть мыть. Эта процедура должна повторяться до тех пор, пока есть без других клеток/загрязнений чем целевого объекта в среде; три часы очки показаны на диаграмме здесь в качестве примера. (d) наконец, передача мыть ячейки в пробирке соответствующей среды для роста. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Фотографии вегетативных клеток Closterium SP. () Inba1-5 и (b) Inba1-12 приведены здесь. В баре шкалы = 50 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Создание клоновых культуры из образца Inba1. Пробирки культивировали в течение 2 недель были сфотографированы снизу. Звездочка указывает пролиферации клеток. В баре шкалы = 2 см. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Название СМИ | Ссылка | Комментарии | |
| CA | 12 Ichimura и Ватанабэ | CA (№3)2·4H2O | 2 мг |
| KNO3 | 10 мг | ||
| NH4№3 | 5 мг | ||
| Β – Na2glycerophosphate·5H2O | 3 мг | ||
| MgSO4·7H2O | 2 мг | ||
| Витамин B12 | 0,01 мкг | ||
| Биотин | 0,01 мкг | ||
| Тиамин HCl | 1 мкг | ||
| PIV металлов | 0,1 мл | ||
| FE (как ЭДТА; молярной 1:1) | 0,1 мл | ||
| HEPES | 40 мг | ||
| Добавить воду, чтобы сделать 100 мл | |||
| pH отрегулировать с NaOH до 7,2 | |||
| P IV металлов | Provasoli и Pintner13 | Na2EDTA·2H2O | 100 мг |
| O FeCl3·6H2 | 19,6 мг | ||
| НКД2· 4H2O | 3,6 мг | ||
| ZnCl2* | 1.04 мг | ||
| CoCl2·6H2O | 0,4 мг | ||
| Na2MoO4·2H2O | 0,25 мг | ||
| Добавить воду, чтобы сделать 100 мл | |||
| FE (как ЭДТА; молярной 1:1) | Provasoli14 | FE (NH4)2(так4)2·6H2O, | 70.2 мг |
| Na2EDTA·2H2O, | 66 мг | ||
| Добавить воду, чтобы сделать 100 мл | |||
| Кондиционерами CA среднего | Абэ et al.7 | Инкубации клеток в свежих средних CA для 14 – 20 дней. Собирать культурной среды путем фильтрации с использованием качественных фильтр-бумаги и стерилизовать отфильтрованных среды путем автоклавирования (121 ° C 15 мин). | |
| * В НИС 1.04 мг ZnCl2 заменяется на 2,2 мг ZnSO4·7H2O. | |||
Таблица 1: Составы средств массовой информации, используемые в данном исследовании.
| Пробы воды | Имя ячейки | Состояние после культуры | Штамм имя |
| Inba1 | -1 | Клетки распространились | Inba1-1 |
| -2 | Не изменилось | ||
| -3 | Клетки распространились | inba1-3 | |
| -4 | Клетки распространились | inba1-4 | |
| -5 | Клетки распространились | inba1-5 | |
| -6 | Клетки распространились | inba1-6 | |
| -7 | Не изменилось | ||
| -8 | Не изменилось | ||
| -9 | Клетки распространились | inba1-9 | |
| -10 | Клетки распространились | inba1-10 | |
| -11 | Не изменилось | ||
| -12 | Клетки распространились | inba1-12 | |
| -13 | Клетки распространились | inba1-13 | |
| -14 | Не изменилось | ||
| -15 | Не изменилось |
Таблица 2: Изоляции пробную резюме.
Discussion
С помощью нынешнего метода, 9 клоновых культуры штаммов Closterium sp. были созданы из 15 клеток, изолированных от образца воды (Inba1), представляющий 60% успеха. В будущем будет осуществляться идентификации видов морфологических наблюдения, а также анализ ДНК, например молекулярного филогенетического анализа8.
В рамках нынешнего метода свежесть образца воды имеет важное значение для успеха. Это лучше изолировать клетки из проб воды как можно скорее после коллекции полей. Хотя клетки Closterium видов (например, C. ehrenbergii, C. peracerosum-strigosum Земляничная комплекс) может быть сохранен в образце воды для примерно 7 d, сохраняя его в 4-8 ° C, желательно изоляция клетки в день из коллекции или на следующий день. Это также важно для удаления любых загрязнений, за исключением клеток-мишеней, таким образом увеличивая количество повторений стиральная (то есть, > 3 x) может предотвратить загрязнение культур микроорганизмов в почве и клетки.
Ограничением этой методики является то, что средства массовой информации культуры, используемые в настоящем Протоколе (CA или кондиционером CA среднего) не всегда подходят для всех спрягать водорослей. В некоторых случаях может потребоваться рассмотреть вопрос об использовании другой среды, а также различные свет и температурных условий. Кроме того как это трудно доказать ли культуры выросла из одной одной ячейки, нужно точно подобрать только 1 клеток при переводе ячейки в пробирке. Таким образом перенос должно быть сделано с новой стекла капиллярные пипетки каждый раз.
Создание клоновых культуры с этой пипетки, мытье метод является методом классической/стандарт и является самым надежным методом для использования изолировать нужные ячейки для исследования. Клоновых культур спрягать водорослей, используемые в многих исследований8,9,10,11 были созданы с использованием нынешнего метода. Это трудно анализировать спрягать водоросли без клоновых культуры. Кроме того в последние годы, de novo весь геном последовательности стал легко получить (например, с помощью программы sequencer Нанопор Миньон), и создание клоновых культуры будет и далее содействовать последовательности de novo . Другими словами этот метод является первым шагом в будущем изучение этих водорослей, чтобы лучше понять их биоразнообразия.
Для того чтобы создать стабильную культуры штамма, необходимо выполнить определенные критические шаги точно в рамках протокола. Наиболее важным шагом является подготовка стеклянные капиллярные пипетки с отверстием оптимального разрешить прохождение только одну ячейку. Диафрагма стеклянные капиллярные пипетки должна быть немного больше, чем длина малой оси клетки интереса. Капиллярные пипетки оптимальное стекло может аспирационная одну ячейку действием капиллярных. Однако если диаметр диафрагмы является слишком большим, капилляр также привлекут в неживые загрязнения материалов или даже () других organism(s), в дополнение к целевой ячейки.
Для получения стекла капиллярные пипетки с оптимальной диафрагмы, необходимо отметить следующие моменты. Во-первых столп пламени должны быть узкими, при нагревании стеклянные капиллярные пипетки. Далее когда потянув пипетка Пастера, он должен быть удален от пламени; в противном случае будет крах отверстие пипетка Пастера.
Оборудование и контейнеры, показано в этом протоколе основные и могут быть изменены. Например с помощью нескольких хорошо пластин вместо часы очки с одной скважиной, мойки клетки можно сделать более эффективным. Кроме того контейнеры можно заменить для других аналогичных. Передавая одну ячейку питательной среды на последнем шаге, клоновые культуры могут быть установлены.
Подготовка стерилизованный контейнер и работающих в капюшоне создаст стерильных штаммов (незагрязненный). Чтобы предотвратить заражение, необходимо повторить шаг Стиральная с свежие аликвоты более чем 3 x. Иногда бактерии также стерилизовать, добавив15антибиотиков.
Этот метод сосредоточена на desmid изоляции (Zygnematales), но, изменив размер проема стеклянные капиллярные Пипетка он может применяться к изоляции разного размера планктона.
Acknowledgments
Мы благодарим Хисайоши Нозаки (Университет Токио) и Такаси Накада (Университет Кэйо), Юка Онодэра Хасимото (Япония женский университет), Хироюки Sekimoto (Университет Япония женщин). Мы хотим поблагодарить рецензентов для получения их замечаний. Это исследование было поддержано субсидий для научных исследований (№ 26440223 и 15H 04413) из японского общества для содействия развитию науки, Япония и Грант от Фонда развития новых технологий для Yuki Tsuchikane.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sampling | |||
| Plankton net | RIGO, Japan | N-NO380T | Mesh size: 32 µm |
| Portable microscope (e.g., Nature Scope FABRE) | Nikon, Japan | JAN: 4960759 206725 | Magnification: 20× |
| Loupe (e.g., Peak 1985 Steinheil System Magnifier) | Tohkai Sangyo Co. Ltd., Japan | 1985-20 | Magnification: 20× |
| Spuit | EIKEN CHEMICAL CO. LTD. Japan | Sterile spuit No.4 | |
| 50 mL Tube (50 mL centrifuge tubes with screw caps) | Labcon, USA | 3181-345-008 | |
| Bottle (100 mL Polycarbonate bottle) | AS ONE Corporation, Japan | 1-7403-01 | |
| 60 mm dish | Asahi glass Co. Ltd., Japan | 1010-060 | For observation of algae. 60 mm/non-treated dish |
| Preparation of a micropipette | |||
| Pasteur pipettes (cotton plugged 9” Pasteur Pipettes) | Fisher Scientific, USA | 13-678-8B | 7 × 225 mm |
| Rubber bulb (SPOID SILICONE, 1 cc) | AS ONE Corporation, Japan | 5-5669-01 | 10 × 40 mm |
| Stainless forceps | AS ONE Corporation, Japan | PT-09 | 110 mm |
| Single-cell isolation | |||
| Watch glass (Blood reaction board) | Sekiya Rika Co., Ltd, Japan | F14-155-030 | to rinse cells during isolation. 22 mm diameter and 1 mm depth |
| Threaded test tubes | Fujimotorika, Co., Ltd, Japan | XX142 | 18 Ø × 170 mm |
| Inverted light microscope | Olympus, Tokyo, Japan | CKX41N | for isolation of algae. |
| Plastic dish | Asahi glass Co. Ltd., Japan | SH90-15E | 90 × 15 mm |
References
- Wickett, N. J., et al. Phylotranscriptomic analysis of the origin and early diversification of land plants. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, E4859-E4868 (2014).
- Delwiche, C. F., Cooper, E. D. The evolutionary origin of a terrestrial flora. Current Biology. 25, R899-R910 (2015).
- Daste, P., Neuville, D., Victor-Baptiste, B. A simple procedure for obtaining clonal isolation of diatoms. British Journal of Psychology. 18, 1-3 (1983).
- Pringsheim, E. G. Pure Cultures of Algae: Their Preparation and Maintenance. , Cambridge University Press. London, UK. 119 (1946).
- Sieracki, M., Poulton, N., Crosbie, N. Automated isolation techniques for microalgae. Algal Culturing Techniques: Automated isolation techniques for microalgae. Andersen, R. A. , Elsevier Academic Press. 101-116 (2005).
- Andersen, R. A., Kawachi, M. Traditional microalgae isolation techniques. Algal Culturing Techniques: Traditional micro algae isolation techniques. Andersen, R. A. , Elsevier Academic Press. 83-100 (2005).
- Abe, J., et al. Stable nuclear transformation of the Closterium peracerosum-strigosum-littorale complex. Plant and Cell physiology. 52, 1676-1685 (2011).
- Tsuchikane, Y., Tsuchiya, M., Kokubun, Y., Abe, J., Sekimoto, H. Conjugation processes of Penium margaritaceum (Zygnemophyceae, Charophyta). Phycological Research. 59, 74-82 (2011).
- Kanda, N., et al. CRISPR/Cas9-based knockouts reveal that CpRLP1 is a negative regulator of the sex pheromone PR-IP in the Closterium peracerosum-strigosum-littorale complex. Scientific Reports. 7, 17873 (2017).
- Ichimura, T. Mating types and reproductive isolation in Closterium-ehrenbergii Meneghini. Botanical Magazine-Tokyo. 94, 325-334 (1981).
- Sekimoto, H., Satoh, S., Fujii, T. Biochemical and physiological properties of a protein inducing protoplast release during conjugation in the Closterium peracerosum-strigosum-littorale complex. Planta. 182, 348-354 (1990).
- Ichimura, T., Watanabe, M. The Closterium calosporum complex from the Ryukyu Islands-Variation and taxonomical problems. Memoirs of the National Science Museum. 7, (1974).
- Provasoli, L., Pintner, I. J. Artificial media for fresh-water algae: problems and suggestions . The Ecology of Algae, a symposium held at the Pymatuning Laboratory of Field Biology on June 18 and 19, 1959. , Pymatuning Laboratory of Field Biology, University of Pittsburgh, . Pittsburgh. 84-96 (1960).
- Provasoli, L. Media & prospects for the cultivation of marine algae. Proceedings of U. S.-Japan Conference in Hakone, Japan. Tryon, C. A. Jr, Hartmann, R. T. , Japanese Society of Plant Physiologists. 63-75 (1968).
- Guillard, R. R. L. Purification methods for microalgae. Algal Culturing Techniques: Purification methods for microalgae. Andersen, R. A. , Elsevier Academic Press. 117-132 (2005).
