Summary
Bu makalede, biz klonal bir doğal alanı sitesinden toplanan tek hücreli conjugating yosun türlerin kültürleri kurulması göstermek.
Abstract
Mikroalg kullanmak için klonal kültürleri fizyolojisi, genetik, Taksonomi ve Mikrobiyoloji gibi çeşitli konularda çalışmaları kurmak için önemlidir. Böylece, klonal kültürler kurmak için teknikleri geliştirmek son derece önemlidir. Bu makalede, biz conjugating alga klonal kültürleri kurulması göstermek. Su örnekleri tarladan toplanır. Daha sonra medyada yer ve klonal bir kültür oluşturmak için uygun koşullar altında yetiştirilen bir cam kapiller pipet, kullanarak izole hücrelerdir.
Introduction
Algler (Zygnematales düzenin) conjugating, olarak da bilinen conjugatophytes, işgal arazi bitkiler1,2hemen atalarının en yakın yaşayan akrabası olarak anahtar bir filogenetik konumu. Klonal kültürleri oluşturulmuş: yosun taksonomik, fizyolojik ve genetik çalışmalar çok çeşitli için son yıl içinde açmıştır. Doğal bir alandan mikroorganizmaların yalıtım teknikleri uzun geleneği3,4var. Son yıllarda, otomatik yalıtım teknikleri kullanarak akış sitometresi de5kurdu. Klonal bir kültür kurulması için tek bir hücre elde etmek için kullanılan en yaygın yöntemdir cam kapiller pipet6kullanarak tek hücreli yalıtım. Bu geleneksel yöntem beceri ve hassas bir deneysel protokol gerektirir.
Bu makalede, biz yosun örnekleme alanı örnekleri ve Closterium türler gibi conjugating tek hücreli alg klonal kültürler kurulması bir cam kapiller pipet kullanarak göstermek. Bitkisel hücreleri içeren su örneği bir alan sitesinden (Örneğin, bir göl, gölet veya çeltik alan) toplanır. Hücreler bir cam kapiller pipet kullanarak su örneği izole ve sonra yıkanır. Hücreleri azot takıma Orta (CA orta) içeren bir test tüpünde bir 16-h ışık: 8 altında 24 ° C'de kültürlü-s karanlık rejimi. Bu yöntem klonal kültürler oluşturmak için diğer mikroalg yalıtmak için uygundur.
Protocol
1. toplama algler içeren su örneği
Not: Tek hücreli conjugatophytes gölleri, bataklıklar ve çeltik alanları gibi durgun tatlı su alanlarda büyümek. Bir yosun içeren su örneği bir kültür yük üretmek için bu ortamların birini toplanır. Aşağıdaki öğeler işlemine başlamadan önce ihtiyaç vardır: bir plankton net, tek kullanımlık bir pipet ve bir şişe veya su örnekleri toplamak için bir 50 mL tüp.
- Bir göl ortamında net bir plankton yosun denizden toplamak için kullanın. Amaca bağlı olarak uygun bir net kullanın.
Not: Net üst kısmındaki Su geçirgen. Tarafından net yakaladı yosun plankton net alt kapsayıcıya yoğunlaşmıştır. Kaba bir kafes küçük yosun geçmesine izin verir. İyi bir kafes kolayca tıkanmış. - (Yaklaşık 50 mL) su 50 mL tüp ya da 100 mL plastik şişe aktarmak. Konsantre su örneği laboratuvara getir.
- Tek hücreli conjugatophytes de bataklıklar veya çeltik alanlarını büyümeye. Bu sığ su gibi yerlerde, algler içeren su örneği doğrudan bir damlalık ile tatmak mümkündür. Ardından 50 mL tüp ya da 50 mL plastik şişe su (30-50 mL) aktarın.
Not: örnek herhangi bir toprak içermiyor olabilir böylece su dikkatle toprak yüzeyi üzerinde örneklenir.
2. onay alg
Not: Aşağıdaki öğeler gereklidir: bir büyüteç veya taşınabilir mikroskop ve 60 mm çanak gözlem için.
- Tek kullanımlık pipet ise yosun örnek varlığını doğrulamak için örnek doğrudan gözlemlemek için Büyüteç kullanın.
Not: Yaklaşık büyük hücreler kolayca 400-1000 µm (Örneğin, Closterium ehrenbergii) uzunluğunda olabilir gözlenen bu yöntemi kullanarak. - Yosun taşınabilir mikroskop altında onaylamak için bir plastik laboratuvar tabağına su örneği dökün.
- Üst yarısı iç kısmı (yaklaşık 3 mL) örnek koymak (kapak) 60 mm Petri dish, sonra alt yarısında, üst kapak iç kısmı karşı karşıya onun alt kısmı ile yer.
Not: Bu yöntem örnek hareket etmesini tutar ve gözlem kolaylaştırır.
- Üst yarısı iç kısmı (yaklaşık 3 mL) örnek koymak (kapak) 60 mm Petri dish, sonra alt yarısında, üst kapak iç kısmı karşı karşıya onun alt kısmı ile yer.
3. yalıtım için cam kapiller pipet Pasteur pipet üzerinden hazırlanması
Not: işlemi başlamadan önce aşağıdaki öğeler gereklidir: Pasteur Pipetler, bir raf Pasteur Pipetler, eldiven, bir lastik ampul, bir ruh lamba, metanol ruhu lamba, bir çakmak, forseps, çöp kutusu, camlar için için için steril ve temiz oda veya laminar akış hood (gerekirse).
- Bir alkol brülör tutuşturmak.
- İnce cam kapiller pipet yalıtım için üretmek için alev değil titreşen emin olun. Alev keskinleştirmek ve Pasteur pipet ucu, eritin.
- Isı Steril cam Pasteur pipet forseps kullanarak el ile ve ipucu yan tarafında kauçuk ampul desteklenir, alev üzerinde.
- Pasteur pipet alev kapalı almak ve o streç.
- Cam eritme, hızlı bir şekilde Pasteur pipet alev kaldırmak ve sonra çekin.
Not: Bu deneyde, Pasteur pipet 15-20 cm. tarafından Make emin alev kapatın çekerek sırasında olan pipet uzatıldı.
- Cam eritme, hızlı bir şekilde Pasteur pipet alev kaldırmak ve sonra çekin.
- Cam kapiller pipet ucu için uygun uzunlukta kesin. Selam bölümü en iyi olduğu için için belgili tanımlık uç idealdir.
Not: Bu çalışmada, bir cam kapiller pipet ucu 5-10 cm ile hazırlanmıştır.- Kılcal erime sonra atmak ve alev koymak onaylamak emin olun.
- Cam kapiller pipet yayımlanan kabarcıklar açılış belgili tanımlık uç boyutunu gösterir. İzole edilmesi için hücre için doğru boyutu seçin. Kabarcıklar yaklaşık 1 mm Closterium türler, yalıtım ile 10-20 µm hücre genişlikleri için uygun.
4. tek hücreli yalıtım cam kapiller pipet tarafından
Not: Başlamadan önce aşağıdaki öğeleri ihtiyaç vardır: bir ters ışık mikroskobu, watch gözlük, bir plastik tabak ve steril dişli test CA Orta (Tablo 1) içeren veya CA orta7şartına tüpleri.
- Bir kaç saat gözlük (22 mm çapında ve 1 mm derinlik), her içeren 1 mL steril CA orta hazırlayın.
- Hedef hücre alanında toplanan su örneği üzerinden ayırma.
- Hedef hücreleri içeren plastik tabak içine su örneği (yaklaşık 30-40 mL) dökün.
- Örnek bir ters ışık mikroskobu altında Plastik tabak kesilmediğini gözleyerek, cam kapiller pipet kullanarak tek hücreleri seçin.
- Hücre hücre aspirasyon kılcal eylem tarafından kolaylaştırmak için yakın cam kapiller pipet getir.
- Hücreleri 1 mL steril CA Orta (Şekil 1a) içeren bir izleme cam içine aktarın.
- Tekrar bir yeni cam kapiller pipet steril CA ortamdan kullanarak hücreleri almak ve steril CA Orta (Şekil 1b) içeren bir ikinci izle cam için transfer.
Not: Bu işlem tek bir hücre spot plaka (Şekil 1 c) izole kadar yinelenir. - Yeni bir cam kapiller pipet kullanarak tek hücre kadar almak ve sonunda CA orta veya şartına CA Orta (Şekil 1 d) 14 mL içeren bir test tüpünde aktarın. Örnek bir 16-h ışık: 8 altında 23 ° C'de kuluçkaya-h karanlık döngüsü 2 hafta boyunca.
Not: hücre bölünmesi4kolaylaştırmak için klimalı ortamda çevresini hücre büyümesini salgılanan, bilinmeyen factor(s) hücre çoğalması için eklenmiştir. Klonal bir kültür kurulmuşsa, kültür orta4şartına CA orta hazırlayın. Kültür başarılı olursa yeşile döndürür.
Representative Results
50 mL su örneği (Inba1) bir örnekleme noktasından Gölü INBA numa toplanmıştır (pH 8.1, 24,7 ° C; 35 ° 44′30. 2″N 140 ° 12′08. 2″E), Sakura-shi, Chiba, Japonya, 25 Haziran 2016. Su örneği 4-8 ° C'de depolanan Koleksiyon, bir örnek Closterium sp., ertesi günü bitkisel hücreleri içeren su örneği izole edildi. Bitkisel hücrelerin on beş özdeş morfoloji (Inba1-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, -12, -13, -14 ve -15) alınan örneğin izole edildi ve yöntemi yıkama pipet kullanarak yıkadım. On beş izole tek hücreleri bağımsız test şartına CA orta 15 mL içeren tüplerde kültürlü. Kuluçka 2 hafta sonra hücre çoğalması 9 test tüplerde gözlendi [Inba1-1, -3, -4, -5 (Şekil 2a), -6, -9, -10, -12 (Şekil 2b) ve -13; Tablo 2]. Dokuz klonal kültürler Inba1 örnek yalıtır (Şekil 3) kuruldu.
Resim 1 : Tek hücreli yalıtım akışının. (bir) Transfer tek hedef yosun hücre özgün su örneği steril ortamda ilk izle cam. (b, c) Hücreyi tekrar yıkamak için sonraki izle cam aktarmak. Hiçbir diğer hücreleri/kirletici hedef Orta olana bu yordamı yinelenmelidir; üç saat gözlük şemada burada örnek olarak gösterilir. (d) son olarak, yıkanmış hücre büyüme için uygun orta tüp bebek transfer. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Bitkisel hücrelerin fotoğraflarını Closterium SP. (bir) Inba1-5 ve (b) Inba1-12 burada gösterilir. Ölçek çubuğu 50 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Inba1 örnek klonal bir kültürden kurulması. 2 hafta boyunca kültürlü test tüpleri altından çekildi. Yıldız işareti hücre çoğalması gösterir. Ölçek çubuğu 2 cm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Ortam adı | Başvuru | Yorumlar | |
| CA | Ichimura ve Watanabe12 | CA (NO3)2·4H2O | 2 mg |
| KNO3 | 10 mg | ||
| NH4NO3 | 5 mg | ||
| Β-Na2glycerophosphate·5H2O | 3 mg | ||
| MgSO4·7H2O | 2 mg | ||
| B12 vitamini | 0,01 μg | ||
| Biotin | 0,01 μg | ||
| Tiamin HCl | 1 μg | ||
| PIV metaller | 0.1 mL | ||
| Fe (EDTA; olarak 1:1 molar) | 0.1 mL | ||
| HEPES | 40 mg | ||
| 100 mL yapmak için su ekleyin | |||
| pH 7.2 için NaOH ile ayarlamak | |||
| P IV metaller | 13 Provasoli ve Pintner | Na2EDTA·2H2O | 100 mg |
| FeCl3·6H2O | 19,6 mg | ||
| MnCl2· 4H2O | 3.6 mg | ||
| ZnCl2* | 1,04 mg | ||
| CoCl2·6H2O | 0.4 mg | ||
| Na2MoO4·2H2O | 0,25 mg | ||
| 100 mL yapmak için su ekleyin | |||
| Fe (EDTA; olarak 1:1 molar) | Provasoli14 | Fe (NH4)2(yani4)2·6H2O, | 70,2 mg |
| Na2EDTA·2H2O, | 66 mg | ||
| 100 mL yapmak için su ekleyin | |||
| Klimalı CA orta | Abe vd.7 | Taze CA orta hücrelerde 14-20 gün kuluçkaya. Kültürlü orta nitel filtre kağıdı kullanarak filtreleme tarafından toplamak ve ısıyla (15dk için 121 ° C) tarafından filtre uygulanmış orta sterilize. | |
| * İçinde imkan sağlayacaktır, 1,04 mg ZnCl2 2.2 mg ZnSO4·7H2O. tarafından değiştirilir | |||
Tablo 1: Formülasyonları Bu çalışmada kullanılan medya.
| Su örneği | Hücrenin adını | Sonra kültür durumu | Soy adı |
| Inba1 | -1 | Hücreleri hızla | Inba1-1 |
| -2 | Değişmedi | ||
| -3 | Hücreleri hızla | inba1-3 | |
| -4 | Hücreleri hızla | inba1-4 | |
| -5 | Hücreleri hızla | inba1-5 | |
| -6 | Hücreleri hızla | inba1-6 | |
| -7 | Değişmedi | ||
| -8 | Değişmedi | ||
| -9 | Hücreleri hızla | inba1-9 | |
| -10 | Hücreleri hızla | inba1-10 | |
| -11 | Değişmedi | ||
| -12 | Hücreleri hızla | inba1-12 | |
| -13 | Hücreleri hızla | inba1-13 | |
| -14 | Değişmedi | ||
| -15 | Değişmedi |
Tablo 2: Yalıtım deneme Özeti.
Discussion
Mevcut yöntemini kullanarak, Closterium sp. 9 klonal kültür suşları %60 başarı oranı temsil eden su örneği (Inba1), izole 15 hücrelerden kuruldu. Tür kimliği gelecekte morfolojik gözlem yanı sıra moleküler filogenetik Analizi8gibi DNA analizleri yapılacaktır.
Mevcut yönteminde su örneği tazelik için başarı oranı önemlidir. Su örnekleri hücrelerden en kısa zamanda alan koleksiyonu sonra ayırmak daha iyidir. Her ne kadar Closterium türlerinin (Örneğin, C. ehrenbergii, C. peracerosum-strigosum-littorale karmaşık) hücreleri su örnek için 7 d 4-8 ° C'de depolayarak korunabilir, yalıtım hücrelerin arzu edilir Rezervasyonun yapıldığı gün toplama ya da öbür gün. Yani çamaşır Tekrarlamaların sayısını artırmayı hedef hücreleri dışında herhangi bir kirletici kaldırmak önemlidir (Örneğin, > 3 x) kültürlerin bir kirlenme mikroorganizmaların toprak ve hücreleri tarafından engel olabilir.
Bu tekniğin bir sınırlama kültür bu protokol (CA veya şartına CA orta) için kullanılan ortam her zaman tüm conjugating algler için uygun değildir. Bazı durumlarda, başka bir ortam, aynı zamanda farklı ışık ve sıcaklık koşullarında kullanmayı düşünün gerekebilir. Ayrıca, bu bir kültür bir tek hücreden büyüdü olup olmadığını kanıtlaması zor olduğundan, doğru bir şekilde sadece 1 hücre hücreleri bir test tüpünde aktarırken almak gereklidir. Bu nedenle, Transfer bir yeni cam kapiller pipet ile her zaman yapılmalıdır.
Klonal bir kültür yöntemi yıkama Bu pipet ile kurulması bir klasik/standart yöntemdir ve bir çalışma için istediğiniz hücreleri izole etmek için kullanmak için en güvenilir yöntemdir. Birçok çalışmalar8,9,10,11 kullanılan yosun conjugating klonal kültürleri mevcut yöntemini kullanarak kuruldu. Conjugating yosun klonal bir kültür olmadan analiz etmek zordur. Ayrıca, son yıllarda de novo tüm genom dizileri (MinION nanopore sequencer kullanarakÖrneğin,) elde etmek kolay oldu ve klonal kültürler oluşturma de novo sıralama daha da kolaylaştıracaktır. Başka bir deyişle, bu yöntem ilk adım gelecekte onların biyolojik çeşitliliğin daha iyi anlamak için bu alg eğitim olur.
Bir kararlı kültür yük oluşturmak için doğru protokolü içinde kritik belirli adımları gerçekleştirmek gereklidir. Sadece tek bir hücreye geçişini izin vermek için en uygun bir diyafram ile cam kapiller pipet hazırlanması en önemli adımdır. Cam kapiller pipet diyafram faiz hücre küçük eksen uzunluğundan daha biraz daha fazla olması gerekir. Optimum cam kapiller pipet tek bir hücre kılcal eylem tarafından Aspire. Ancak, diyafram çapı çok büyükse, kılcal da olmayan yaşam kirletici maddeler veya bile (bir) diğer organism(s), hedef hücre ek olarak çizecektir.
Bir cam kapiller pipet optimum bir diyafram ile elde etmek için aşağıdaki noktaları unutmayın. İlk olarak, alev ayağı cam kapiller pipet Isıtma dar olması gerekir. Ardından, Pasteur pipet çekerek zaman o alev kaldırılması gerekir; Aksi takdirde, Pasteur pipet diyafram çökecek.
Ekipman ve kapsayıcılar bu protokol için gösterilen temel ve değiştirilebilir. Örneğin, çok iyi plakaları izle gözlük bir kuyu ile yerine kullanarak, hücre çamaşır daha verimli hale getirilebilir. Buna ek olarak, konteyner benzer diğerleri için yedek olabilir. Tek bir hücre kültür ortamına son aşamada aktararak, klonal bir kültür kurulabilir.
Steril bir kap hazırlama ve bir mahallede çalışma axenic (kirlenmemiş) suşlar kuracak. Kontaminasyonu önlemek için daha--dan 3 x ile taze aliquots çamaşır adımı yinelemek gereklidir. Bazen bakteriler de antibiyotik15ekleyerek sterilize.
Bu yöntem desmid üzerinde (Zygnematales) yalıtım odaklı, ancak cam kapiller pipet diyafram boyutunu değiştirerek, bu farklı ölçekli plankton yalıtım için uygulanabilir.
Acknowledgments
Biz Hisayoshi Nozaki (Tokyo Üniversitesi), Takashi Nakada (Keio Üniversitesi), Yuka Marukawa Hashimoto (Japonya Kadın Üniversitesi) ve Hiroyuki Sekimoto (Japonya Kadın Üniversitesi) teşekkür ederim. Gözden geçirenler kendi yorum için teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışmada bilim promosyon, Japonya, Japonya toplumdan bilimsel araştırma (No. 26440223 ve 15 H 04413) için bir Grant-in-Aid ve yeni teknoloji geliştirme Vakfı Hibe Yuki Tsuchikane için tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sampling | |||
| Plankton net | RIGO, Japan | N-NO380T | Mesh size: 32 µm |
| Portable microscope (e.g., Nature Scope FABRE) | Nikon, Japan | JAN: 4960759 206725 | Magnification: 20× |
| Loupe (e.g., Peak 1985 Steinheil System Magnifier) | Tohkai Sangyo Co. Ltd., Japan | 1985-20 | Magnification: 20× |
| Spuit | EIKEN CHEMICAL CO. LTD. Japan | Sterile spuit No.4 | |
| 50 mL Tube (50 mL centrifuge tubes with screw caps) | Labcon, USA | 3181-345-008 | |
| Bottle (100 mL Polycarbonate bottle) | AS ONE Corporation, Japan | 1-7403-01 | |
| 60 mm dish | Asahi glass Co. Ltd., Japan | 1010-060 | For observation of algae. 60 mm/non-treated dish |
| Preparation of a micropipette | |||
| Pasteur pipettes (cotton plugged 9” Pasteur Pipettes) | Fisher Scientific, USA | 13-678-8B | 7 × 225 mm |
| Rubber bulb (SPOID SILICONE, 1 cc) | AS ONE Corporation, Japan | 5-5669-01 | 10 × 40 mm |
| Stainless forceps | AS ONE Corporation, Japan | PT-09 | 110 mm |
| Single-cell isolation | |||
| Watch glass (Blood reaction board) | Sekiya Rika Co., Ltd, Japan | F14-155-030 | to rinse cells during isolation. 22 mm diameter and 1 mm depth |
| Threaded test tubes | Fujimotorika, Co., Ltd, Japan | XX142 | 18 Ø × 170 mm |
| Inverted light microscope | Olympus, Tokyo, Japan | CKX41N | for isolation of algae. |
| Plastic dish | Asahi glass Co. Ltd., Japan | SH90-15E | 90 × 15 mm |
References
- Wickett, N. J., et al. Phylotranscriptomic analysis of the origin and early diversification of land plants. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, E4859-E4868 (2014).
- Delwiche, C. F., Cooper, E. D. The evolutionary origin of a terrestrial flora. Current Biology. 25, R899-R910 (2015).
- Daste, P., Neuville, D., Victor-Baptiste, B. A simple procedure for obtaining clonal isolation of diatoms. British Journal of Psychology. 18, 1-3 (1983).
- Pringsheim, E. G. Pure Cultures of Algae: Their Preparation and Maintenance. , Cambridge University Press. London, UK. 119 (1946).
- Sieracki, M., Poulton, N., Crosbie, N. Automated isolation techniques for microalgae. Algal Culturing Techniques: Automated isolation techniques for microalgae. Andersen, R. A. , Elsevier Academic Press. 101-116 (2005).
- Andersen, R. A., Kawachi, M. Traditional microalgae isolation techniques. Algal Culturing Techniques: Traditional micro algae isolation techniques. Andersen, R. A. , Elsevier Academic Press. 83-100 (2005).
- Abe, J., et al. Stable nuclear transformation of the Closterium peracerosum-strigosum-littorale complex. Plant and Cell physiology. 52, 1676-1685 (2011).
- Tsuchikane, Y., Tsuchiya, M., Kokubun, Y., Abe, J., Sekimoto, H. Conjugation processes of Penium margaritaceum (Zygnemophyceae, Charophyta). Phycological Research. 59, 74-82 (2011).
- Kanda, N., et al. CRISPR/Cas9-based knockouts reveal that CpRLP1 is a negative regulator of the sex pheromone PR-IP in the Closterium peracerosum-strigosum-littorale complex. Scientific Reports. 7, 17873 (2017).
- Ichimura, T. Mating types and reproductive isolation in Closterium-ehrenbergii Meneghini. Botanical Magazine-Tokyo. 94, 325-334 (1981).
- Sekimoto, H., Satoh, S., Fujii, T. Biochemical and physiological properties of a protein inducing protoplast release during conjugation in the Closterium peracerosum-strigosum-littorale complex. Planta. 182, 348-354 (1990).
- Ichimura, T., Watanabe, M. The Closterium calosporum complex from the Ryukyu Islands-Variation and taxonomical problems. Memoirs of the National Science Museum. 7, (1974).
- Provasoli, L., Pintner, I. J. Artificial media for fresh-water algae: problems and suggestions . The Ecology of Algae, a symposium held at the Pymatuning Laboratory of Field Biology on June 18 and 19, 1959. , Pymatuning Laboratory of Field Biology, University of Pittsburgh, . Pittsburgh. 84-96 (1960).
- Provasoli, L. Media & prospects for the cultivation of marine algae. Proceedings of U. S.-Japan Conference in Hakone, Japan. Tryon, C. A. Jr, Hartmann, R. T. , Japanese Society of Plant Physiologists. 63-75 (1968).
- Guillard, R. R. L. Purification methods for microalgae. Algal Culturing Techniques: Purification methods for microalgae. Andersen, R. A. , Elsevier Academic Press. 117-132 (2005).
