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Bioengineering

Microscopia di fluorescenza di luce-foglio di catturare immagini 4-dimensionale degli effetti di modulazione dello sforzo di taglio sul cuore Zebrafish in via di sviluppo

Published: August 10, 2018 doi: 10.3791/57763
Automatic Translation
*1, *1, 2, 2, 2, 1, 3, 2, 1
1Department of Bioengineering, The University of Texas at Arlington, 2Department of Medicine (Cardiology) and Bioengineering, UCLA, 3College of Health Science and Environmental Engineering, Shenzhen Technology University
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per visualizzare lo sviluppo di cuori in zebrafish in 4 dimensioni (4D). Imaging 4D, tramite microscopia di fluorescenza di luce-foglio (LSFM), prende 3-dimensionale (3D) immagini nel corso del tempo, di ricostruire i cuori in via di sviluppo. Indichiamo qualitativamente e quantitativamente che lo shear stress attiva endocardial tacca di segnalazione durante lo sviluppo di camera, che promuove trabeculation cardiaco.

Abstract

Le forze emodinamiche sperimentato dagli sviluppo cardiaco di influenza cuore, soprattutto trabeculation, che forma una rete di ramificazione escrescenze dal miocardio. Programma genetico difetti nella tacca di segnalazione cascata sono coinvolti nei difetti ventricolari come cardiomiopatia Non-consolidamento ventricolare sinistra o sindrome del cuore sinistro ipoplasico. Usando questo protocollo, è possibile determinare che la sollecitazione di taglio guidato trabeculation e tacca di segnalazione siano legati uno a altro. Utilizzando la microscopia a fluorescenza luce-foglio, visualizzazione del cuore zebrafish sviluppo era possibile. In questo manoscritto, si è valutato se forze emodinamiche modulano l'iniziazione del trabeculation via tacca di segnalazione e così, influenzano la funzione contrattile si verifica. Per qualitativa e quantitativa shear stress analysis, 4-D (3-D + tempo) immagini sono state acquisite durante la morfogenesi cardiaca zebrafish e microscopia di fluorescenza di luce-foglio integrato con sincronizzazione 4D catturato il movimento ventricolare. Viscosità del sangue è stata ridotta tramite gata1a- morpholino oligonucleotidi (MO) micro-iniezione per diminuire la sollecitazione di taglio, quindi, giù-regolando la tacca di segnalazione e attenuando trabeculation. Co-iniezione di Nrg1 mRNA con gata1a MO salvato geni correlati alla tacca per ripristinare trabeculation. Per confermare la sollecitazione di taglio guidato tacca di segnalazione influenze trabeculation, contrazione dei cardiomiociti più ulteriormente è stato arrestato tramite tnnt2a-MO per ridurre le forze emodinamiche, quindi, down-regolazione di geni bersaglio tacca per sviluppare un non-trabecolazioni miocardio. Infine, conferma dei pattern di espressione dei geni Notch sollecitazione di taglio è stata condotta sottoponendo le cellule endoteliali a flusso pulsatile. Così, la microscopia di luce-foglio 4-D scoperto forze emodinamiche sottostante tacca di segnalazione e trabeculation con rilevanza clinica di cardiomiopatia non-consolidamento.

Introduction

Le forze biomeccaniche, quali emodinamico shear stress, sono intimamente coinvolti nella morfogenesi cardiaca. In risposta a forze di taglio emodinamico, scanalature e creste del miocardio si sviluppano in una rete trabecolare ondulatorio in allineamento con la regia della sollecitazione di taglio attraverso la valvola di atrioventricolare (AV)1. Trabeculation cardiaca è necessario aumentare la funzione contrattile e la massa del miocardio2. Le mutazioni in vie di segnalazione Notch provocano difetti cardiaci congeniti in esseri umani ed altri vertebrati3. Ad esempio, gata1a4 e tnnt2a5 morpholino oligonucleotidi (MO) sono stati indicati per ridurre la eritropoiesi, mentre l'eritropoietina (EPO) mRNA6 e isoproterenolo (ISO)7 aumentare rosso sangue cellule e frequenza cardiaca rispettivamente e di conseguenza parete shear stress (WSS). Inoltre, segnalazione di ErbB2, a valle della tacca, promuove la proliferazione dei cardiomiociti e differenziazione per generare forza contrattile, che a sua volta attiva Notch segnalazione8,9. È suggerito che lo shear stress governa Notch segnalazione trabeculation guidato per sviluppo ventricolare. Attualmente, ci sono molti studi che tentano di capire meglio gli eventi programmazione genetici che portano al cuore congenito difetti (CHD)10,11,12, ma molto poco stanno studiando come forze meccaniche influenzano che formano il cuore.

Al fine di indagare le forze meccaniche che agisce sull'endocardio, stretta osservazione durante il periodo dello sviluppo deve essere attuata. Tuttavia, è difficile da ottenere immagini di buona qualità di in vivo battendo campioni dovuto l'inerenza della microscopia tradizionale13. Al fine di osservare l'evoluzione nel tempo all'interno di un campione, fisico di sezionamento e di colorazione, pertanto, necessario verificarsi13,14,15. Sebbene la microscopia confocale è ampiamente usata per l'immagine della struttura 3-d di campioni14,16, acquisizione di questi sistemi di imaging ancora è limitata dalla velocità di scansione lenta.

Microscopia di fluorescenza di luce-foglio (LSFM) è una tecnica di imaging unica che permette la visualizzazione in vivo di eventi dinamici con lungo lavoro distanza13. Questa tecnica usa un microscopio fluorescente a luce-foglio per sezione otticamente un esempio17. A causa di illuminazione di solo un foglio sottile di luce sul campione, c'è una riduzione in foto-candeggio e foto tossicità13,18. Il grande campo di vista e lunga distanza di lavoro consente per grandi campioni a rimanere intatto come sono imaged13,14,17. Il basso ingrandimento permette un'area più grande essere imaged, mentre la lunga distanza di lavoro consente per i campioni più spessi essere imaged senza compromettere il rapporto segnale-rumore. Molti gruppi hanno utilizzato LSFM a immagine intera embrioni17, cervelli14,18, muscoli e cuori19 fra altri tessuti, che mostra i diversi tipi di campioni che possono essere imaged.

Anche se la ricerca precedente ha dimostrato ridotto sforzo emodinamico occludendo le tracce afflusso o deflusso del cuore zebrafish, le informazioni sono esclusivamente qualitative. Provoca un'anormale terza sezione, ciclo cardiaco diminuito e valvola alterata formazione20. Le immagini LSFM 4D dare una nuova prospettiva nel senso che la cesoia emodinamica forze influenzano lo sviluppo del tessuto cardiaco. Queste forze meccaniche possono attivare le molecole di segnalazione sensibili alla forza e indurre la formazione delle creste trabecular. Dato l'aspetto di tempo aggiunto dell'imaging 4D, uno è in grado di tenere traccia delle modifiche in fase di sviluppo in tempo reale, che potrebbe portare a nuove rivelazioni che erano passata inosservate in precedenza. Zebrafish è un modello ideale per l'imaging perché gli scienziati possono osservare un intero animale vertebrato contro solo interazioni cellula-cellula. Ossigeno può diffondersi anche attraverso l'intero embrione, che permette lo sviluppo avvengono senza a seconda del sistema vascolare, a differenza nello sviluppo dei mammiferi. Anche se il cuore di zebrafish manca gli organi polmonari, che richiedono un cuore quattro-a temperatura ambiente, c'è un gran numero di geni cardiaci che sono conservate tra zebrafish e gli esseri umani21.

In questo manoscritto, descriviamo come utilizzare microscopia di fluorescenza di luce-foglio all'immagine le trabecole in via di sviluppo nei cuori di zebrafish in varie circostanze. In primo luogo, l'iniezione di gata1a4 o tnnt2a5 MOs sono stati utilizzati a bassa viscosità del sangue e di conseguenza WSS. La morfologia del cuore è stato poi registrata. In un gruppo separato di pesce, abbiamo aumentato il WSS con la somministrazione di EPO mRNA6 o isoproterenolo7 e osservate i risultati. Inoltre abbiamo condotto uno studio di cellulare con diverse portate pulsatile o oscillatorio. Dopo ogni gruppo di imaging, abbiamo trovato che WSS percepita da endocardio via Notch segnalazione iniziati trabeculation.

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Protocol

I metodi seguenti sono stati eseguiti in conformità a protocolli UTA e UCLA IACUC. Questi gruppi sperimentali sono stati usati con transgenici Tg(cmlc2:gfp), i mutanti wea (debole atrium) o clo (cloche) : controllo (a) wild-type (WT), (b) gata1a MO e iniezioni (c) tnnt2a MO (tabella 1).

Modello Nome Geni modificati Fenotipo Riferimento
Controllo Wild-type Nessuno N/A
TG(cmlc2:GFP) Catena leggera della miosina cardiaca Fluorescenza verde espressa specificamente nel miocardio 34
Sollecitazione di taglio di parete in diminuzione Mutante debole atrium (wea) Catena di heacy Atrium-specifiche Atrio non può contrarre, compatto ventricolo, spessore della parete del miocardio, stretto lume dialated atrio, 37
Mutante Cloche (clo) N/A Rimozione completa dell'endocardio, unaturally grande atrio con piccolo ventricolo, tagliatrici cardiaco inesistente 41
gata1a MO gata1a  Anemia da mancanza di globuli rossi 4
tnnt2a MO tnnt2a 39
Sollecitazione di taglio di parete maggiore MRNA EPO Nessuno Policitemia grave, aumento del numero di cellule del sangue, di circolazione aumentata viscosità 6
Isoproterenolo Nessuno Aumento della frequenza cardiaca 7

Tabella 1: Descrizioni di Zebrafish. Definizioni e descrizioni di Zebrafish utilizzati negli esperimenti.

1. Studio Setup

  1. Preparare Nrg1 ed EPO mRNA per trabeculation soccorso.
    1. Ottenere cDNA umano Nrg1 e amplificare da un plasmide di donatore.
      Nota: Il cDNA umano Nrg1 era dotato da William Talbot presso la Stanford University.
      1. Estrarre i reagenti necessari e materiali, vale a dire mastermix (conservati a-20 ° C) PCR, primer (Vedi tabella 2) (conservati a-20 ° C), un piatto PCR (conservato a temperatura ambiente) e una pipetta 20 μL (conservato a temperatura ambiente). Vedere tabella materiali per esempio prodotti.
        Table 2
        Tabella 2: Iniettori per la clonazione umana di Nrg1 .
      2. Preparare il mastermix per ogni set in triplice copia utilizzando la pipetta 20 μL di primer. Per 1 set di triplici copie, utilizzare 37.5 μL del mastermix, 3 μL di acqua esente da DNA, 4,5 µ l di primer. Per altre triplici copie, basta moltiplicare per il numero di campioni.
      3. Diluire la soluzione di lavoro del cDNA umano Nrg1 (concentrazione di 20 ng / µ g) nella striscia di primer con acqua priva di DNA affinché ci sia 10 μL per pozzetto per campione totale.
        Nota: Garantire che ogni soluzione al punto 1.1.1 è distribuito uniformemente. Questo scopo, ogni soluzione di miscelazione pipettando su e giù. Per evitare la contaminazione incrociata, è possibile utilizzare una punta della pipetta per un solo campione.
      4. Aliquota del cDNA di Nrg1 con la pipetta multicanale 10 μL desiderata nei pozzetti della piastra di PCR.
      5. Aggiungere 14,5 μL del mastermix il cDNA nei pozzetti. Applicare una copertura appiccicosa alla piastra PCR per sigillare i pozzetti e inserire la macchina PCR.
      6. Avviare la macchina PCR e assicurare che il ciclo raggiunge temperature appropriate secondo gli enzimi e primer usati.
    2. Clonare il cDNA di Nrg1 in pCS2 il plasmide+ presso i siti di BamHI ed EcoRI usando gli enzimi in eccesso BamHI ed EcoRI affinché il cDNA è legato a tutti i plasmidi.
      1. Mescolare il cDNA di Nrg1 con il donatore plasmidi pCS2+, disponibili in commercio master mix soluzione e primer (tabella 2).
        Nota: Il volume di reazione totale dovrebbe essere 50 μL con 25 μL di mix master, 3 µ l di primer e 1 μL del plasmide di donatore ng/μL 20 con il cDNA di Nrg1 .
      2. Posizionare il mix dal passaggio 1.1.2.1 in macchina PCR e impostare i parametri per soddisfare le specifiche seguenti: 98 ° C per 10 s, 55 ° C per 5 o 15 s e 72 ° C per 5 s/kb.
      3. Purificare il prodotto PCR utilizzando un kit di purificazione seguendo le istruzioni del produttore. Eluire il prodotto in 50 µ l di tampone di eluizione.
      4. Digerire il prodotto PCR purificato e 5 μg di pCS2+ con BamHI ed EcoRI separatamente a 37 ° C per 2 h in un volume di reazione 200 μL. Purificare la digestione risultante con un kit commerciale ed eluire in 20 μL e 100 μL di Tris-HCl (pH 8.5), rispettivamente.
      5. Lega i 4 μL di cDNA Nrg1 e 2 μL del digerito pCS2+ plasmide in una reazione a 25 µ l con 1 μL di un catalizzatore di ligasi a 16 ° C durante la notte.
        Nota: La procedura può essere fermata qui per incubazione overnight.
      6. Utilizzare 2 μL della soluzione di legatura da passo 1.1.2.5 e trasformazione in 50 μL di cellule di batteri e. coli adatte per clonazione (Vedi Tabella materiali).
    3. Confermare che la trasformazione ha avuto luogo schermando che il cDNA di Nrg1 cloni usando la PCR. Scegliere a caso cloni e aggiungere ad una soluzione di primers specifici, della polimerasi e trifosfati dNTP (dNTP).
      Nota: I controlli erano il vettore (pCS2+) con e senza l'inserto (cDNA umano). Non sollevare troppo grande di una colonia perché batteri eccessiva possono inibire PCR.
      1. Scegliere 8 colonie dalla trasformazione e schermo pCS2+-Nrg1 cloni utilizzando i primer PCR da tabella 2.
      2. Cultura un clone con il cDNA di Nrg1 per isolare il pCS2+-DNA plasmidico di Nrg1. Inoculare con 100 μL di batteri e. coli con pCS2+-Nrg1 plasmide in 100 mL di LB media e cultura agitando (160-225 giri/min) a 37 ° C.
    4. Transfect pCS2 purificato+-Nrg1 plasmide in HEK-293 cellule in una piastra a 6 pozzetti utilizzando un reagente di transfezione commerciali seguendo le istruzioni del produttore.
    5. 24 ore dopo la trasfezione lisare le cellule utilizzando un buffer di lisi e correre attraverso un gel di SDS-PAGE, trasferimento ad una membrana di gel e quindi macchiare con anti-Nrg1 anticorpo22. Verificare l'espressione della proteina Nrg1 utilizzando un Western Blot.
      Nota: Il controllo è un vuoto pCS2+ plasmide. Può essere messo in pausa qui se gel membrana trasferimento si verifica durante la notte.
    6. Sintetizzare mRNA Nrg1 utilizzando un prodotto commerciale simile a quello nella Tabella materiali e seguire le istruzioni del produttore.
      1. Prendere 5 μL del pCS2+-DNA Nrg1 dalla cultura di batteri isolati e digerire con NotI in una reazione di 200 μL per 2 h a 37 ° C per linearizzare il plasmide.
      2. Purificare il plasmide linearizzato con un kit commerciale ed eluire in 20 μL di Tris-HCl (pH 8.5).
      3. Condurre la trascrizione in vitro con un kit di isolamento del RNA commerciale in una reazione di 20 μL usando 5 μL del plasmide linearizzato seguendo le istruzioni del produttore.
      4. Aggiungere che lo in vitro trascritto Nrg1 a 350 μL di tampone di lisi di RNA e poi purificare con un kit di isolamento del RNA. Eluire il RNA in 60 μL di Tris-HCl (pH 8.5).
      5. Misurare la concentrazione di RNA e conservare a-80 ° C per un uso futuro.
    7. Seguire i passaggi 1.1.6.1 - 1.1.6.5 sopra per il cDNA EPO e preparazione di mRNA ma clone cDNA nel plasmide pCS2 + EcoRI e XhoI siti invece.
  2. Iniettare Morpholino in zebrafish
    1. Progettazione23 le iniezioni MO utilizzando uno strumento online (Tabella materiali) contro la sequenza ATG di gata1a4 (5 ′-CTGCAAGTGTAGTATTGAAGATGTC-3 ') e tnnt2a5 (5 ′-CATGTTTGCTCTGATCTGACACGCA-3 ').
    2. Aggiungi gata1a e tnnt2a MO separatamente all'acqua privo di nucleasi per rendere le concentrazioni finali di 8 ng/nL e 4 ng/nL, rispettivamente. Ripetere con EPO mRNA con una concentrazione finale di 20 pg/nL. Assicurarsi che il volume finale è di 1 mL.
    3. Iniettare 1 nL di 8 ng/BN di gata1a MO e 1 nL di 4 ng/BN di tnnt2a MO negli embrioni di zebrafish separato al 1 alla fase 4 celle per ridurre la parete ventricolare shear stress (WSS)24. Per aumentare il WSS, iniettare 1 nL di 20 pg/nL di EPO mRNA6 negli embrioni di zebrafish nella fase 1 - 4 celle.
  3. Trattare chimicamente zebrafish per inibire trabeculation
    1. Utilizzando una pipetta 20 mL, diluire a 10 mg/mL AG1478 in 1% DMSO in E3 media ad una concentrazione finale di 5 μM a 30 hpf in una provetta da 15 mL. Come controllo, trattare ogni pesce con 1% DMSO solo.
    2. Aggiungi N-[N-(3,5-Difluorophenactyl)-L-Alanyl]-S-Phenylglycine t-butil estere (DAPT) in 1% DMSO (100 μM) E3 medio in una provetta da 15 mL per inibire la tacca di segnalazione alle 40 hpf in modo simile. Come controllo, trattare con solo 1% DMSO.

2. tecniche di imaging

  1. 4-D cardiaco LSFM Imaging con algoritmo di sincronizzazione
    1. Assumere 2-D immagini dell'embrione intero pesce più cardiaco battendo cicli utilizzando la procedura descritta qui sotto (Figura 1). Assicurarsi che lo spessore di luce-foglio è di circa 5 μm. Prendere 500 fotogrammi di x-y con un tempo di esposizione di 10 ms Set z-scansione a 1 μm per campionamento digitale senza perdita di dati secondo il principio di campionamento Nyquist25.
      1. Creare un gel di agarosio 1% (p/v) aggiungendo 1 g di agarosio a 100 mL e riscaldandola fino a tutti dell'agarosi sono dissolto. Caricare un piccolo tubo di plastica con l'embrione e l'agarosio utilizzando una pipetta 20 μL e fissarlo sul palco.
      2. Aprire l'immagine software di visualizzazione e fare clic su Live per vedere il live view del campione. Regolare l'obiettivo utilizzando la manopola in modo che il campione è a fuoco. Allo stesso modo, spostare il palco in modo che il live view del campione Mostra la parte superiore dell'embrione.
      3. Prendere immagini 500 volte per 5 s a 10 ingrandimenti utilizzando software26 del microscopio.
      4. Spostare la fase utilizzando il motore di un nuovo livello (1 μm nell'asse z) e ripetere la procedura di imaging.
      5. Ripetere 2 passaggi di cui sopra fino a quando l'intero cuore è completamente ripreso.
    2. Garantire l'integrità dei dati trascurando le immagini del primo e l'ultimo ciclo cardiaco. Trovare il periodo del ciclo cardiaco abbinando le immagini che sono state scattate dallo stesso punto di tempo del ciclo cardiaco, ma in periodi diversi. Utilizzare la seguente equazione che è stata sviluppata per individuare il periodo:
      Equation 1(1)
      dove D è la funzione di costo utilizzata per il montaggio di un'ipotesi di periodo, hom l'immagine catturata, τ' il tempo che l'immagine è stata catturata, zk l'indice z-senso dell'immagine, xm è la vettore dell'indice pixel, e T' è l'ipotesi di periodico.
    3. Utilizzare la seguente equazione per trovare lo spostamento relativo tra due immagini in fasi simili:
      Equation 2(2)
      dove Qk', k denota una funzione di costo per lo spostamento relativo, R è il quartiere spaziale possibile, L è il tempo totale di acquisizione dell'immagine, x è il pixel indice, zk e zk' sono le fette di primo e secondo in direzione z, t è il tempo, e s è l'ipotesi di spostamento relativo.
    4. Convertire lo spostamento relativo spostamento assoluto per quanto riguarda la prima immagine e risolvere l'equazione lineare utilizzando l'approccio pseudo-inversa, per trovare la relazione assoluta per allineare la sezione successiva delle immagini come descritto in precedenza27.
    5. Le immagini finali di 4-D sono state elaborate utilizzando software di elaborazione immagine (Tabella materiali).
      1. Sovrapposizione immagini 2D in 3D
        1. Aprire una software di elaborazione di immagine commerciale.
        2. Fare clic su Open Data.
        3. Selezionare tutte le immagini per essere impilati in 3-d > clic carico.
        4. Aggiungere la dimensione del voxel di 0,65 x 0,65 x 1 > fare clic su OK.
        5. Fare clic sulla casella Visualizza immagini per visualizzare l'immagine 3D.
        6. Pulsante destro del mouse la casella blu slice_1.tiff > selezionare Visualizza > selezionare Volren.
        7. Fare clic su modifica > seleziona Opzioni > seleziona modifica Colormap.
        8. Regolare il colore utilizzando le caselle delineate in rosso > fare clic su OK.
      2. Conversione 3D 4D
        1. Fare clic su "File > Apri dati di serie temporali.
        2. Selezionare il file TIFF 3D che sono stati appena fatto > clic carico.
        3. Immettere la stessa dimensione del voxel come prima.
        4. A destra fare clic sulla casella blu slice_1.tiff > selezionare "Display" > selezionare Volren.
        5. Fare clic su modifica > seleziona Opzioni > seleziona modifica Colormap. Regolare il colore utilizzando le caselle > fare clic su OK.
        6. Fare clic destro Tempo serie controllo > clic su Movie maker > Premere il tasto Play per guardare il film.
        7. Aggiungere un nome file, grandezza, frequenza fotogrammi, qualità uguale a 1, digitare monoscopiche > fare clic su applica
        8. Esportare il video. Aprire il video in un software appropriato.

3. analisi qRT-PCR

  1. Zebrafish isolamento del RNA per quantificare i ligandi di Notch, recettori, del cuore e le espressioni dei geni di destinazione
    1. Sacrificare la zebrafish sottoponendole ad un sovradosaggio di tricaina metilato28,29. Usando un protocollo descritto in precedenza30, i cuori di zebrafish erano asportati e preparati per isolamento del RNA.
    2. il RNA totale di isolare e sintetizzare il cDNA utilizzando il kit di sintesi cDNA seguendo le istruzioni del produttore.
    3. Gli iniettori PCR di design per i ligandi di tacca Jag1, Jag2, Dll4, recettore Notch1be segnalazione relativi geni Nrg1 ed ErbB2. Vedere tabella 3 per i primers che abbiamo usato.
    4. Aggiungere i primer dal punto 3.1.3, il mRNA isolato dal passaggio 3.1.2 e una commerciale mastermix alla piastra PCR. Eseguire la qRT-PCR al condizioni adeguate di temperatura e tempi secondo gli enzimi utilizzati. Normalizzare i risultati di zebrafish α-actina.
      Nota: Questo calcolerà i livelli di espressione per ciascuno dei ligandi, i recettori e geni.

4. in vitro delle cellule endoteliali aortica umana (HAEC) esperimenti

  1. Modello dinamico sollecitazione di taglio
    1. Cellule di HAEC cultura con HAEC cultura media. Una volta completamente confluenti, esporre le cellule di flusso laminare e flusso pulsatile di 23 x 10-5 N al tasso di 1 Hz per 24 h.
      1. Scaldare CE media/DMEM 10% FBS in un'acqua bagno per 20 min.
      2. Recuperare le cellule HAEC dal serbatoio di azoto liquido e posizionare la cuvetta nel bagno di acqua fino a quando sciolto.
      3. Utilizzando una pipetta μL 1.000, rimuovere le cellule scongelate e metterli in una provetta da 15 mL con 3-5 mL di media. Centrifugare la soluzione di cella a 53 x g per 3 min.
      4. Aspirare la soluzione fuori e aggiungere abbastanza media per un volume totale di 10 mL. Aggiungere la soluzione di cella un matraccio T75 sterile, la boccetta di cap e distribuire le cellule in modo uniforme sul fondo della piastra.
      5. Contrassegnare il matraccio con iniziali, data, tipo di cella e numero di passaggio. Incubare la beuta a 37 ° C, 5% CO2, fino a quando le cellule sono 80% confluenti. Ricordatevi di cambiare i media ogni 2-3 giorni.
      6. Utilizzando una pompa commerciale, collegare il tubo al pallone e impostare i parametri di cui sopra nel punto 4.1.131,32,33.
    2. Aggiungere GI254023X a 50 mL di terreno di HAEC ad una concentrazione finale di 5 μM per 30 min.
    3. Con il pre-misti GI254023X, un inibitore di ADAM10 che sopprime la tacca di segnalazione, condurre la stessa a flusso laminare o esperimenti di flusso pulsatile come in 4.1.1.
    4. Quantificare la tacca ligandi (Jag1, Jag2 e Dll4) e geni bersaglio tacca (pelosi e rinforzatore di Spalato [Hes]) mediante qRT-PCR per quattro gruppi di campioni HAEC (flusso laminare, flusso laminare + GI254023X, flusso pulsatile, flusso pulsatile + GI254023X) descritta precedentemente32.

5. salvataggio e sovra-espressione di tacca di segnalazione

  1. Iniettare 1 nL del mRNA Nrg1 preparato ad una concentrazione di 5 pg/nL (dal punto 1.1.6) nella fase 1-4 celle con gata1a MO al fine dei overexpress tacca destinazione geni24.
  2. Iniettare 1 nL del mRNA Nrg1 in wea mutante in un simile modo24.
  3. Doppio della concentrazione di Nrg1 mRNA (10 pg/nL) e iniettare24 1 nL in zebrafish per osservare la morfologia ventricolare.
  4. Iniettare 1 nL di 20 pg/BN di EPO mRNA6 negli embrioni di zebrafish nella fase 1-4 celle per aumentare l'ematopoiesi per aumentare ventricolare WSS come precedentemente illustrato24.
  5. Iniettare 1 nL della 50 μM isoproterenolo7, che aumenta il tasso di contrattilità, al mezzo di E3 per 24 h mentre zebrafish sono coltivate come illustrato in precedenza24.
  6. Eseguire imaging LSFM 4-D per ogni gruppo. Seguire le istruzioni nella procedura 2.1.1-2.1.5.2.8.

6. quantificazione del cambiamento frazionario accorciamento e volume nel tempo

  1. Eseguire imaging LSFM 4-D per ciascun gruppo a 50, 75 e 100 hpf. Seguire le istruzioni nella procedura 2.1.1-2.1.5.2.8. Dividere ogni immagine così ognuno ha 600 nodi per la replica di movimento della parete cardiaca.
  2. Misurare la variazione di diametro del ventricolo durante la diastole e sistole utilizzando la seguente formula:
    Equation 3(3)
    Caricare immagini 3D ventricolare a ogni 0,1 s con software di visualizzazione e misura il volume.
  3. Tracciare la variazione di volume nel tempo per ogni gruppo sperimentale a 75 hpf e 100 hpf.

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Representative Results

LSFM è stato usato in questo manoscritto al fine di acquisire immagini 2D e 3D ad alta risoluzione. Come visto in Figura 1A e 1B, la lente di illuminazione dirige il foglio leggero al campione. A causa della magrezza del foglio luce, solo un unico piano è illuminato. La lente di rilevamento viene posizionata perpendicolarmente alla lente illuminazione e si concentra sul piano illuminato (Figura 1B). Il foglio leggero dalla lente illuminazione quindi analizza il campione da sinistra a destra (Figura 1). La scansione consente meno foto-candeggio, foto-tossicità e ha un rapporto segnale-rumore più basso.

LSFM è stata applicata agli embrioni Tg(cmlc2a:gfp) di visualizzare l' intera struttura cardiaca34 di rapida scansione (> 30 s) con una risoluzione di voxel pari a 0,65 x 0,65 x 1 µm. a causa di un'illuminazione su un unico piano, rumore di fondo era significativamente ridotta (Figura 1). Creste trabecular ha sporto nel lume ventricolare a 75 hpf e una rete trabecolare è stato chiaramente indicato a 100 hpf (Figura 2A, B). Gata1a MO micro-iniezione ridotta ematopoiesi e viscosità da 90%4,35. Questa viscosità in diminuzione attenuato emodinamico shear stress, conseguente un inizio in ritardo e la densità della rete trabecolare a 75 hpf e 100 hpf rispetto al gruppo di controllo (Figura 2, C, D). Inoltre, tacca del ricevitore (Dll4, Jag1e Jag2), leganti (Notch1b), e componenti di segnalazione a valle (Nrg1 ed ErbB2) erano down-regolata in risposta a gata1a MO iniezione (p < 0,05, n = 5) (Figura 2 K)2,8,36. Co-iniezione di gata1a MO con 5 μM di espressione genica in relazione di segnalazione di Notch up-regolato Nrg1 mRNA e formazione trabecular hanno salvato a 75 hpf e 100 hpf (Figura 2E, F, K). Così gata1a MO riduce le forze emodinamiche che conduce alla down-regolazione della tacca di segnalazione, considerando che Nrg1 mRNA di salvataggio up-regolato di geni correlati alla tacca e ri-avviato trabeculation.

Al fine di dimostrare ulteriormente la nostra ipotesi che cambiando emodinamico forze e così trabeculation via di segnalazione Notch, abbiamo introdotto il mutante wea che sviluppa un atrio non contrattile37. In assenza di affluenza ventricolare e forze emodinamiche durante la sistole atriale, wea mutanti esprimono livelli di mRNA cardiaco inferiori della tacca di segnalazione geni componente e geni bersaglio rispetto ai controlli e porto non trabecolazioni, piccolo e debolmente contraenti ventricoli (Figura 2, L). Tuttavia, Nrg1 mRNA micro-iniezione in mutanti wea up-regolato la tacca via, accompagnato dal salvataggio parziale delle creste trabecular, di segnalazione, che conduce ad un più pronunciato ventricolo contrattile nonostante un atrio non contrattile ( Figura 2 H, L)2. In questo contesto, i mutanti di wea ha confermato la relazione tra l'atrio non contrattile ed un ventricolo non trabecolazioni, sottolineando la modulazione emodinamica del trabeculation via tacca di segnalazione.

Tnnt2a MO è stato consegnato per interrompere la contrazione cardiaca inibendo la troponina cardiaca T38,39. Il pesce di MO-iniettato tnnt2a erano completamente privi di circolazione e WSS ventricolare a causa di significativo down-regolato tacca di segnalazione, portando ad una liscia parete ventricolare di superficie e sottile rispetto al gruppo di controllo (Figura 2I, M) . Per studiare se WSS su endocardio era un requisito per trabeculation, abbiamo anche mutanti cloche (clo) per cui endocardio e rivestimento endoteliale del cuore non sviluppano40,41. Il mutante di clo non è riuscito a sviluppare le trabecole cardiache e ha mostrato di più piccole dimensione ventricolo e incompleta cardiaco loop (Figura 2J). Così, il rivestimento endocardial è necessario alla sollecitazione di taglio emodinamico senso attivare Notch segnalazione (Figura 2 M). Tuttavia, quando la sollecitazione di taglio emodinamica è stata aumentata aumentando l'ematopoiesi o trattamento di isoproterenolo per aumentare la contrattilità, non hanno aumentato i livelli di espressione di geni correlati alla tacca e la morfologia della rete trabecolare non è cambiato (Figura 3).

Per illustrare ulteriormente il rapporto tra sollecitazione e tacca di segnalazione, haec sono stati utilizzati per i test in vitro . Un flusso pulsatile fu esercitato sulle cellule confluenti per simulare la sollecitazione di taglio emodinamica osservata dalle cellule endoteliali. È dimostrato che rispetto alla statica, cultura pulsatile aumenta l'espressione di geni correlati alla tacca (Figura 4). Inoltre, il trattamento con l'inibitore di ADAM10 ridotto significativamente Notch segnalazione (Figura 4).

Successivamente, abbiamo calcolato la riduzione frazionaria ventricolare e cavità ventricolare variazione di volume nel tempo per il selvaggio-tipo, gata1a MO, AG1478, e quelli salvati da gruppi di iniezione Nrg1 50 hpf, 75 hpf e 100 hpf (Figura 5A- C) . Trattamento con ErbB segnalazione inibitore, AG1478, significativamente ritardata e ridotta riduzione frazionaria durante la diastole ventricolare a 100 hpf (Figura 5A). Sia gata1a MO e AG1478 trattamento ridotta dimensione della camera ventricolare durante la contrazione, come valutato dai cambiamenti in 4D LSFM (Figura 5E, F). Entrambi i gruppi ha sviluppato un aumentato volume telesistolico e - diastolico rispetto al wild-type. Co-iniezione di Nrg1 mRNA con gata1a MO restaurato sia riduzione frazionaria e frazione di eiezione verso quelli di tipo selvatico.

Figure 1
Figura 1 : Fluorescente luce Panoramica di foglio. (A) sistema rappresentante LSFM dove il campione è posto all'incrocio tra il foglio leggero dalla lente illuminazione (IL) e il percorso di rilevamento della lente di rilevamento (DL). (B) la lente cilindrica dietro il IL crea il micron-dimensioni foglio leggero (viola) all'interno del campione, che eccita un foglio sottile del campione. La lente di rilevamento registra il segnale fluorescente. (C) un disegno schematico del foglio sottile laser (viola) otticamente sezionamento l'embrione di zebrafish che si sposta a destra a sinistra. Questa figura è stata modificata da Lee et al.17. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 : Ventricolare morfologie di geneticamente manipolato TG(cmlc:GFP) zebrafish con tacca ligando e recettore espressione genica. (A) la rete trabecolare è mostrata a 75 hpf di controllo zebrafish. (B) la rete trabecolare a 100 hpf di controllo zebrafish. (C) iniezione di gata1a MO nella fase 1 - 4-cellula ha mostrato poco o nessun trabeculation a 75 hpf. (D) iniezione di gata1a MO in zebrafish ha ritardato la formazione della rete trabecolare. (E) co-iniezione di gata1a MO e mRNA umano Nrg1 parzialmente restaurato trabeculation a 75 hpf. (F) co-iniezione di gata1a MO e mRNA Nrg1 umano quasi completamente ha ristabilito la rete trabecolare a 100 hpf. (G) wea mutante a 100 hpf Mostra nessun trabeculation e una liscia parete ventricolare. (H) iniezione di umano Nrg1 in zebrafish mutanti wea parzialmente restaurato trabeculation a 100 hpf. (I) l'iniezione di tnnt2a MO ha mostrato nessun trabeculation a 75 hpf (non mostrato) e 100 hpf. (J) CLO mutante ha mostrato nessun trabeculation a 100 hpf. (K) iniezione di gata1a MO ha ridotto significativamente l'espressione di mRNA di Notch1, Nrg1 e Jag2 (t-test, * P < 0.05, n = 5 vs controllo). Co-iniezione di gata1a MO e mRNA Nrg1 umano ha aumentato significativamente l'espressione di Notch1b, Nrg1, ErbB e Jag1 rispetto al controllo. (L) il mutante di wea era significativamente più bassa espressione di geni correlati alla tacca (test t, * P < 0.05, n = 5 vs controllo). Iniezione di umano Nrg1 ha aumentato l'espressione di geni correlati alla tacca; Jag1 e Jag2 erano significativamente superiori di controllo. (M) il mutante di tnnt2a MO iniezione e clo ha mostrato un'espressione significativamente più bassa di geni correlati alla tacca (test t, * P < 0.05, n = 5 vs controllo). Scala bar: 50 μm. I dati vengono visualizzati come la deviazione standard media. Questa figura è stata modificata da Lee et al.17. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3 : Aumento WSS in manipolato TG(cmlc:GFP) zebrafish con espressione di gene Notch ligando, il recettore e destinazione in vivo . Aumentando il WSS tramite sovraespressione di ematopoiesi con l'iniezione di EPO(A) o l'aggiunta di ISO (B) via aumentando la frequenza cardiaca non aumenta trabeculation e aveva una rete trabecular simile a quella del controllo. (C) l'iniezione di EPO mRNA o isoproterenolo non ha cambiato l'espressione dei geni di ligando, il recettore o destinazione di tacca (test t, * P < 0.05, n = 5 vs controllo). Questa figura è stata modificata da Lee et al.17. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4 : Cellule endoteliali soggette a sollecitazione di taglio oscillatorio o pulsatile in vitro . Haec soggette alla sollecitazione di taglio pulsatile di τmedio = 30 x 10-5 n/s a 1 Hz aveva upregulated gene Notch-relative espressioni e downregulated di espressioni geniche correlate a tacca quando è stato applicato l'inibitore di ADAM10 (test t, * P < 0.05, n = 5 vs. controllo). Questa figura è stata modificata da Lee et al.17. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5 : Effetto del trabeculation della frazione di accorciamento ed espulsione frazionario. (A-C) Aggiunta di AG1478 e gata1a MO ha fatto diminuire significativamente la riduzione frazionaria a 100 hpf, ma co-iniezione di umano Nrg1 e gata1a MO migliorato. (D) gata1a iniezione e AG1478 ha fatto diminuire significativamente la riduzione frazionaria a 100 hpf (test t, * P < 0.05, n = 5 vs controllo). Co-iniezione di gata1a e mRNA Nrg1 migliorato la riduzione frazionaria. (E-F) Integrare l'algoritmo di sincronizzazione 4D con LSFM ha mostrato che AG1478 e gata1a MO avevano aumentato i volumi di sistolica e diastolica di fine a 75 hpf (E) e 100 hpf (F). I dati vengono visualizzati come la deviazione standard media. Questa figura è stata modificata da Lee et al.17. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Zebrafish Jag1 Avanti CCGCGTATGTTTGAAGGAGTATCAGTCG
Con le versioni precedenti CAGCACGATCCGGGTTTTGTCG
Zebrafish Jag2 Avanti AGCCCTAGCAAAACGAGCGACG
Con le versioni precedenti GCGTGAATGTGCCGTTCGATCAA
Zebrafish Dll4 Avanti CAAAGTGGGAAGCAGACAGAGCTAAGG
Con le versioni precedenti CGGTCATCCCTGGGTGTGCATT
Zebrafish BMP10 Avanti GCATCAAGGGGCCACTCGTGTAGA
Con le versioni precedenti TCGTCTCACTCCACTAGGTCCCATACTG
Zebrafish ErBb2 Avanti GATCAGGACTGCCAAACATTGACGTCT
Con le versioni precedenti AGCAGCACACTGAACATGGCAGCA
Zebrafish Nrg-1 Avanti GTGTGTTTGTCCCTGTGGACGCGT
Con le versioni precedenti CCTCCTGGAGCTTCCCCTCAAACA
Zebrafish Notch1b Avanti CAGAGAGTGGAGGCACAGTGCAATCC
Con le versioni precedenti GCCGTCCCATTCACACTCTGCATT

Tabella 3: Primer usati per lo screening di Zebrafish.

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Discussion

In questo protocollo, abbiamo dimostrato che imaging 4D può essere utilizzato per monitorare lo sviluppo di una rete trabecolare in risposta ai cambiamenti nelle forze biomeccaniche. In particolare, la sollecitazione di taglio con esperienza dalle cellule endoteliali avvia la tacca di segnalazione cascade, che a sua volta promuove trabeculation. In questo manoscritto, abbiamo indicato che (1) gata1a MO iniezione ha ridotto l'ematopoiesi e pertanto ridotta sollecitazione di taglio della parete, (2) tnnt2a MO iniezione ha inibito la funzione contrattile ventricolare per ridurre la sollecitazione di taglio della parete e (3) wea mutanti mancavano la contrazione atriale, che poi ha fatto diminuire la forza emodinamica applicata al ventricolo. Riducendo la sollecitazione di taglio sulle pareti cardiache, abbiamo quantificato la tacca di segnalazione tramite qRT-PCR e abbiamo trovato che con WSS ridotta, c'era ridotto tacca di segnalazione. Per dimostrare ulteriormente la nostra ipotesi, clo mutanti che mancava endocardio non formavano le trabecole e sottoponendo le cellule endoteliali a pulsatile shear stress con ADAM10 presenti hanno mostrato che lo shear stress attiva tacca di segnalazione.

Le altre tecniche di imaging quali la microscopia confocale utilizzabile per campioni di immagine in 3-d14. Tuttavia, questa tecnica e altri hanno molti inconvenienti. Ad esempio, l'imaging confocale non può penetrare in profondità nel campioni, ha bassa risoluzione assiale e la scansione lenta velocità19,42. A causa del limite di profondità di penetrazione nell'imaging confocale, piccoli campioni, quali embrioni di zebrafish, possono solo essere imaged nella sua interezza. Microscopia confocale del due-fotone migliora la profondità di penetrazione, ma la risoluzione, velocità di scansione lenta e costo elevato rendono questa tecnica indesiderabili13. Ci sono stati studi che combinano con successo due fotoni microscopia e LSFM18, tuttavia, gli svantaggi sono ancora prominente42.

LSFM, d'altra parte, ha l'almeno foto-candeggio e danno13,18,42, velocità di acquisizione veloce e per la profondità di penetrazione simile13. Inoltre, a causa della doppia lente e l'eccitazione di un unico piano (Figura 1), il rumore di fondo è sostanzialmente ridotta43. Tuttavia, i campioni devono essere incorporati in gel per immobilizzare il campione, che rende difficile applicare ai modelli in vivo diverso da zebrafish14,17,19. Inoltre, l'utilizzo della luce fluorescente limita la penetrazione di profondità di pochi millimetri. Anche se LSFM è un ottimo metodo per la visualizzazione, è fondamentale che è completato con i dati quantitativi. Perché LSFM è solo di tipo qualitativo, può essere soggetto a varie interpretazioni. Mediante qRT-PCR, abbiamo potuto confermare che le immagini di 4D LFSM erano una corretta rappresentazione degli eventi che si verificano nei campioni dal vivo. Occasionalmente in grandi campioni, strisce e le ombre possono formarsi nelle immagini. Tuttavia, fronte-retro illuminazione o mSPIM può essere utilizzato per ridurre questi artefatti42. Perché LSFM è così versatile, la capacità di catturare ad alta risoluzione e immagini di qualità migliore nel complesso rende il futuro della LSFM promettente. Accennato in precedenza, LSFM combinabile con altri sistemi di imaging per successo imaging18,42.

Abbiamo dimostrato in precedenza che l'applicazione di una sollecitazione di taglio pulsatile di 23 x 10-5 N a 1 Hz per 24 h sostanzialmente sopraregola Notch segnalazione in vitro(Figura 4)17. Abbiamo inoltre dimostrato che le forze di taglio attivano tacca di segnalazione di manipolazione genetica di ematopoiesi (gata1a MO)4, contrazione cardiaca (tnnt1a MO)5, contrazione atriale (wea mutante), endocardial eliminazione (clo mutante) e la localizzazione della tacca di segnalazione (Tg [flk:mCherry; tp1:gfp]). Descriviamo qui che abbassando la sollecitazione di taglio della parete nel ventricolo, che geni correlati alla tacca erano giù-regolato (Figura 2 K, L, M). Inoltre, siamo stati in grado di dimostrare che Nrg1 mRNA era in grado di salvare trabeculation, ripristinare la tacca di segnalazione e migliorare la riduzione frazionaria ventricolare e frazione di eiezione (Figura 2E, F, H, K-M, Figura 5) . Il ripristino della funzione cardiaca è stato indicato dall'aumento contrattile funzione-mediata forze emodinamiche che attivato tacca di segnalazione (Figura 2 K- M).

Inoltre abbiamo determinato che la segnalazione di Notch attivato a sollecitazione di taglio è dipendente endocardial. Utilizzando gata1a MO, tnnt2a MO, wea mutante o trattamento AG1478, trabeculation è stata inibita e tacca di segnalazione era giù-regolato (Figura 2 K- M). Tuttavia, Nrg1 salvato trabeculation e tacca di segnalazione nei mutanti di wea e quando co-iniettato con gata1a MO (Figura 2D, H, K, L). Quando parete shear stress (iniezione diEPO ) o tacca di segnalazione (10 pg/nL Nrg1 iniezione) è stata aumentata, non c'era cambiamento nel gruppo di EPO in termini di morfologia, ma anormale morfogenesi ventricolare era presente in Nrg1 dose aumentata (Figura 3).

In conclusione, abbiamo dimostrato che il mechanotransduction di shear stress attiva il via di segnalazione di Notch. Applicando LSFM 4D e geneticamente zebrafish, abbiamo sviluppato un nuovo modello di sistema che Mostra come critica del flusso sanguigno sia durante lo sviluppo cardiaco alla sua morfologia, contrattilità e funzione globale.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Gli autori vorrebbero esprimere gratitudine a William Talbot presso la Stanford University per fornire l'essere umano Nrg1 cDNA e di Deborah Yelon da UCSD per fornire la WEA mutanti. Gli autori piacerebbe anche ringraziare Cynthia Chen per aiutare con l'acquisizione di immagini. Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni NIH HL118650 (a T.K. Hsiai), HL083015 (a T.K. Hsiai), HD069305 (per Chi N.C. e T.K. Hsiai.), HL111437 (per T.K. Hsiai e Chi N.C.), HL129727 (a T.K. Hsiai), T32HL007895 (a R.R. Sevag Packard), HL 134613 (da V. Messerschmidt) e Università del Texas sistema stelle fondi (di J. Lee).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Clontech Hifi PCR pre-mix  Takara  639298 PCR mastermix
1.1.1.1, 1.1.1.2, 1.1.1.5, 1.1.2.1, 3.1.4
Human Nrg1 cDNA Gift from William Talbot, Stanford University, Stanford, California, USA N/A Used for trabeculation rescue
1.1.1.3, 1.1.1.4, 1.1.2.1
CFX Connect™ Real-Time PCR Detection System Bio-Rad 1855201 PCR Machine
1.1.1.5, 1.1.1.6, 1.1.2.2, 1.1.3.2
pCS2+ GE Health Plasmid used to synthesize mRNA
1.1.2.1, 1.1.2.4, 1.1.2.5
Nucleospin purification kit   Clontech 740609.25 DNA Purification
1.1.2.3, 1.1.2.4, 1.1.6.2
T4 DNA ligase  Clontech 2011A PCR Ligation solution
1.1.2.5
Stellar competent cells Clontech 636763 E. coli cells used for transformation
1.1.2.6, 1.1.3.1, 1.1.3.2
Lipofectamine 2000 transfection reagent Life Technologies 11668027 Transfection reagent
1.1.4
mMessage SP6 kit Invitrogen AM1340 Kit used to synthesize mRNA
1.1.6.3
Aurum Total RNA Mini Kit Bio-Rad 7326820 Purifies RNA 
1.1.6.4, 3.1.2
GeneTools 4.3.8 GeneTools N/A Software for primer design
1.2.1, 3.1.3
EPO cDNA Creative Biogene CDFH006026 Increases WSS
1.2.2, 1.2.3, 1.1.7
AG1478 Sigma-Aldrich  T4182 ErbB inhibitor
1.3.1
E3 medium To grow embryos
1.3.1, 1.3.2, 5.1.5
DAPT Sigma-Aldrich  D5942 γ-secretase inhibitor
1.3.2
Agarose  Sigma-Aldrich  A9539 Used for mounting embryos
2.1.1.1
ORCA-Flash4.0 LT Digital CMOS camera Hamamatsu Photonics C11440-42U Used to capture Images
2.1.1.2, 2.1.1.3
Amira Software FEI Software N/A Visualized and Analysed images into 3D, and 4D
2.1.5.1.1-2.1.5.2.8
Tricaone mesylate  Sigma-Aldrich  886-86-2 Used to humanely sedated or sacrifice embryos
3.1.1
iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad 1708890 Synthesizes cDNA
3.1.2
Eppendorf 5424 microcentrifuge Eppendorf 05-400-005 Microcentrifuge
4.1.1.3
GI254023X Sigma-Aldrich  260264-93-5 ADAM10 inhibitor
4.1.2, 4.1.3 
Isoprenaline hydrochloride Sigma-Aldrich  I5627 Isoproterenol increases WSS
5.1.5
MATLAB Mathworks N/A Cardiac mechanics analysis

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Bioingegneria problema 138 microscopia illuminazione selettiva aereo tacca di segnalazione trabeculation emodinamica zebrafish sviluppo cardiaco shear stress cuore 4-Dimensional imaging mechanobiology cuore microscopia di fluorescenza del foglio leggero

Erratum

Formal Correction: Erratum: Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart
Posted by JoVE Editors on 09/03/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart. Additional author names were added, and an author affiliation was updated.

The author list was updated from:

Victoria Messerschmidt*1, Zachary Bailey*1, Kyung In Baek2, Richard Bryant1, Rongsong Li2, Tzung K. Hsiai2, Juhyun Lee1

to:

Victoria Messerschmidt*1, Zachary Bailey*1, Kyung In Baek2, Yichen Ding2, Jeffrey J. Hsu2, Richard Bryant1, Rongsong Li2, Tzung K. Hsiai2, Juhyun Lee1

The author affiliation for Rongsong Li was updated from:

Department of Medicine (Cardiology) and Bioengineering, UCLA

to:

College of Health Science and Environmental Engineering, Shenzhen Technology University

Microscopia di fluorescenza di luce-foglio di catturare immagini 4-dimensionale degli effetti di modulazione dello sforzo di taglio sul cuore Zebrafish in via di sviluppo
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Messerschmidt, V., Bailey, Z., Baek, … More

Messerschmidt, V., Bailey, Z., Baek, K. I., Ding, Y., Hsu, J. J., Bryant, R., Li, R., Hsiai, T. K., Lee, J. Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart. J. Vis. Exp. (138), e57763, doi:10.3791/57763 (2018).

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