Summary
Denne protokol beskriver en fuld nyre arbejde op, der skal udføres i musemodeller af glomerulær sygdom. Metoderne, der giver mulighed for detaljerede funktionelle, strukturelle og mekanistiske analyse af glomerulær funktion, som kan anvendes til alle musemodeller af glomerulær sygdom.
Abstract
Brugen af murine modeller til at efterligne menneskelige nyresygdom bliver mere og mere almindelige. Vores forskning er fokuseret på vurderingen af glomerulær funktion i diabetisk nefropati og podocyte-specifikke VEGF-en knock-out mus; Derfor, denne protokol beskriver fuld nyre arbejde-op bruges i vores lab til at vurdere disse musemodeller af glomerulær sygdom, gør det muligt for en enorm mængde af informationer vedrørende nyre og glomerulær funktion at være fremstillet af et enkelt museklik. I forhold til alternative metoder præsenteres i litteraturen til at vurdere glomerulær funktion, muliggør brug af metoden beskrevet i denne hvidbog glomerulær fænotype vurderes fuldt ud fra flere aspekter. Ved hjælp af denne metode, kan forskeren bestemme nyre Fænotypen af modellen og vurdere mekanisme, hvorfor fænotype udvikler. Denne vitale oplysninger om mekanismen af sygdommen er påkrævet, når du undersøger potentielle terapeutiske muligheder i disse modeller. Metoderne, der giver mulighed for detaljerede funktionelle vurdering af glomerulær filtration barriere gennem måling af urin albumin kreatinin ratio og individuelle glomerulær vand permeabilitet, samt både strukturelle og ultra-strukturelle gennemgang ved hjælp af periodiske syre-Schiff pletten og elektronmikroskopi. Derudover muliggør analyse af gener dysregulated på mRNA og protein niveau mekanistiske analyse af glomerulær funktion. Denne protokol beskriver de generiske men fleksible metoder, der kan anvendes på alle musemodeller af glomerulær sygdom.
Introduction
Brugen af murine modeller til at efterligne menneskelige nyresygdom bliver mere og mere almindelige. Sådanne murine modeller omfatter spontan modeller som spontant hypertensive rotter (SHR)1, streptozotocin (STZ)-induceret diabetisk rotter og mus2, og db/db type II diabetisk mus3, gensplejsede modeller som primære podocyte-specifik fokal segmentær glomerulær sklerose (FSGS) modeller4, den podocyte-specifikke vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF-A) knock-out (VEGF-A KO) model5, og Alport syndrom modeller6, og erhvervet modeller som 5/6 nephrectomistatus7 og ensidige ureter obstruktion (UUO) model8. For at vurdere de forskellige aspekter ved glomerulær funktion i disse modeller, er flere teknikker til rådighed. Formålet med denne metode papir er at vise et omfattende arbejde op, der skal udføres i musemodeller af nyresygdom for at fuldt ud for at vurdere glomerulær funktion.
Rationalet bag anvendelse af denne metode er, at det muliggør glomerulær fænotype vurderes fuldt ud fra flere aspekter. Dette omfatter vurdering af glomerulær permeabilitet, både protein og vand, glomerulær strukturelle abnormiteter og ændringer i udtryk/splejsning af mRNAs og proteiner afgørende for normal glomerulær funktion. Ved hjælp af denne metode, er at forskeren stand til at bestemme nyre Fænotypen af modellen og vurdere mekanisme, hvorfor fænotype udvikler. Dette er vigtige oplysninger om mekanismen af sygdommen, som er påkrævet, når undersøge potentielle terapeutiske muligheder i disse modeller.
I litteraturen er det en fælles begivenhed at blive præsenteret med en musemodel af glomerulær sygdom hvor fænotype bestemmes af en øget niveau af albumin i urinen. Der er imidlertid grund til at formode, at en enkelt metode til at bestemme glomerulær funktion ikke er altid effektive; måle den urinveje albumin udskillelse sats eller urin albumin kreatinin ratio (uACR) kun giver oplysninger om samlede nyrefunktion, og ikke af de enkelte glomeruli. Tidligere undersøgelser har vist, at permeabiliteten kan variere i forskellige glomeruli fra samme nyre5,9,10. Vurdering af permeabilitet af individuelle glomeruli er desuden en mere følsom måde vurdere glomerulær funktion; teknik til at måle individuelle glomerulær vand permeabilitet (LpA / V,jeg) har vist sig for at være mere følsomme over for ændringer i glomerulær funktion end måling uACR9. Denne analyse er gavnlige i musemodeller der er resistente over for proteinuri, som dem på en c57BL/6 baggrund11. Fordelen ved den nuværende metode papir er, at den undersøger både den samlede renal permeabilitet til albumin såvel som den enkelte glomerulær permeabilitet til vand.
Undersøgelse af glomerulær strukturelle abnormiteter er ofte vurderet af et batteri af pletter såsom periodiske syre Schiff (PAS), trichrome, og sølv pletter. Disse aktiverer en uddannet renal patolog at evaluere niveauet for nyresygdom via en scoring metode. Selv om alle gode metoder, ændringer glomerulær makro-struktur ikke er altid overholdes i modeller akutte nyre skade12. Denne metode foreslår, at ud over udførelsen af renal histologi teknikker beskrevet ovenfor, bør den glomerulær ultra-struktur også vurderes via elektronmikroskopi (EM). En farves glomerulus kan ser relativt normal under en regelmæssig lysmikroskop; dog ved vurdering med EM, små ændringer i glomerulær basalmembran (GBM) bredde, er podocyte foden proces effacement, endotel fenestrations og sub-podocyte plads dækning analyseret. Derfor er det afgørende, at både glomerulær ultra-struktur og mikro-struktur er vurderet for at bestemme mekanismen af glomerulær dysfunktion.
Ud over vurderingen af glomerulær strukturelle abnormiteter, bør ændringer i mRNA og protein udtryk og splejsning samt protein aktivering (fx, fosforylering), undersøges for at yderligere belyse mekanismerne i glomerulær sygdom. Når man ser på glomerulær sygdom, eller, for eksempel, når KO/over-expressing et gen specielt i glomerulær celler, som i den podocyte-specifikke VEGF-A KO mus5, er det vigtigt at protein og mRNA ændringerne undersøges kun inden for de glomerulær celler, og ikke hele nyren. Denne protokol beskriver en metode hvor glomeruli er isoleret fra mus nyre cortex, og derefter protein/RNA er isoleret. Det giver specifikke analyse af protein/mRNA dysregulering i glomeruli sygdom model.
Denne protokol beskriver en fuld nyre arbejde op, der skal udføres i musemodeller af glomerulær sygdom, gør det muligt for en enorm mængde af informationer vedrørende nyre og glomerulær funktion at være fremstillet af et enkelt museklik. Metoderne, der giver mulighed for detaljerede funktionelle, strukturelle og mekanistiske analyse af glomerulær funktion, som kan anvendes til alle musemodeller af glomerulær sygdom.
Protocol
Alle eksperimenter blev udført i overensstemmelse med britiske lovgivning og lokale etiske udvalg godkendelse. Dyreforsøg blev godkendt ved University of Bristol videnskabsetisk Komité.
1. urin Albumin kreatinin Ratio (uACR)
Bemærk: UACR der bruges til at vurdere permeabilitet af GFB til albumin. Tilstedeværelsen af albumin i urinen angiver øget permeabilitet over GFB, som er normaliseret til kreatinin til kontrol for variationer i strømningshastigheden af urin. Albuminuri er en fælles markør for kronisk nyresygdom.
- Indsamle urin på den eksperimentelle baseline og med jævne mellemrum (én gang ugentligt at når månedlige) indtil den eksperimentelle slutpunkt.
- Konfigurere musen metaboliske bure med vand og berigelse kost. Placere mus (mandlige, i alderen 6-8 uger) i individuelle bure til 6 h i et stille rum.
- Tilbagevenden mus til regelmæssig boliger og indsamle urin fra Tom bure. Der kræves et minimum af 50 µL.
Bemærk: Hvis musen ikke producerer urin i den givne tid, gentages på en anden dag i et varmere rum. - Der centrifugeres urin på 500 x g i 10 min. indsamle urinen og fastholde sediment for at vurdere podocyte tab. Opbevare urin ved-20 ° C på kort sigt på dette punkt.
- Fortynde urinen i 1% bovint serumalbumin (BSA) i 1 x Tris bufferet saltvand (TBS pH 7,5) på en 1: 500 til 1: 10000 fortynding, afhængigt af sværhedsgraden af albuminuri.
Bemærk: Ende volumen skal være > 400 µL. Optimer til at bestemme den rigtige fortynding på hver gang pege. - Kvantificere urin albumin koncentration ved hjælp af en mus albumin enzym forbundet immunosorbent assay (ELISA) pr fabrikantens anvisninger.
- Kort frakke ELISA-plade, som er optimeret til protein binding, med 100 µL af den anti-mus albumin primære antistof (10 µg/mL i 0,5 M karbonat-bikarbonat pH 9,6) i 1 time ved stuetemperatur.
- Vask overskydende antistof fra brøndene fem gange med 1 x TBS plus 0,05% Tween (pH 8.0), og tilføje 200 µL blokerende løsning (1 x TBS med 1% BSA pH 8,0) natten over ved stuetemperatur.
- Vask plade fem gange og tilsæt 100 µL standarder (seriel fortynding: 2000 µg/mL til 15,63 µg/mL i 1 x TBS med 1% BSA, pH 8,0), tom, og de fortyndede prøver i tre eksemplarer. Forlade i 1 time ved stuetemperatur og derefter vaske plade fem gange.
- Tilsæt 100 µL af HRP detektor-antistof til hver brønd (10 ng/mL i 1xTBS med 1% BSA, pH 8,0) og inkuberes ved stuetemperatur i 1 time.
- Vask pladen fem gange og tilsæt 100 µL af enzymet substratopløsning til hver brønd. Forlader pladen i mørke til at udvikle i 15 min og stoppe reaktionen ved at tilføje 100 µL af 0.18 M svovlsyre (H2SO4).
Forsigtig: H2så4 er ætsende.
- Bestemme albumin koncentrationen af hver prøve ved at læse nummerpladen på en absorbans på 450 nm. Brug standardkurven til at kvantificere albumin til stede i hver prøve. Hvis de tekniske gentagelser har en CV værdi større end 5%, skal du gentage analysen for disse prøver.
- Alternativt, vurdere urin albumin koncentration ved hjælp af elektroforese. Tilføj 5 µL af 4 x protein prøve loading bufferen til 15 µL af urin. Opvarme prøverne til 95 ° C i 10 min og derefter indlæse i en 4-12% Tris præfabrikerede gel.
- Kør gelen på 100 V og pletten natten over i Coomassie blå pr. producentens protokol.
- Efter imaging gel, skal du bruge densitometri at vurdere fold ændring albumin koncentration i forhold til kontrol.
Bemærk: Hvis ingen bands er observeret for albumin når forventes, vurdere proteinkoncentration af urinen og justere lydstyrken på urin tilføjes gel.
- Fortynd rå urinprøven i dH2O ved 1:1, 1:5 og 1:10.
Bemærk: Ende volumen skal være > 70 µL. Optimer til at bestemme den rigtige fortynding af hver prøve. - Kvantificere urin kreatinin koncentrationen ved hjælp af en kemisk analyse pr sættet anvisninger. Kort, indlæse 20 µL af kreatinin standarder, tom eller fortyndet urin til en 96 godt plade i tre eksemplarer.
- Bestemme kreatinin koncentrationen af hver prøve ved at læse nummerpladen på en absorbans på 490 nm før og efter tilsætning af den syre (forsigtighed, ætsende, undgå kontakt med huden).
Bemærk: Forskellen mellem absorbans værdier er direkte proportional med koncentrationen af kreatinin i hver prøve. En standardkurve er generation fra standarder. Hvis de tekniske gentagelser har en CV værdi større end 5%, skal du gentage analysen for disse prøver. - Generere uACR (µg/mg). Normalisere dataene til baseline værdien af hver musen til grafisk repræsentation.
2. væv og blod samling
Bemærk: Nyre og glomerulær væv kan bruges til at vurdere strukturelle, protein og mRNA udtryk markører af nyresygdom. Blodet kan bruges til at vurdere markører af nyrefunktionen, såsom kreatinin, som kan være op-reguleret i nyresygdom, der angiver en reduktion i filtrering kapacitet af glomeruli.
- Forberede følgende løsninger: frisk 2,5% glutaraldehyd i 0,1 M natrium cacodylate (pH 7.3), 4% PARAFORMALDEHYD i 1 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS), pattedyr Ringers løsning (115 mM natriumchlorid (NaCl), 10 mM natriumacetat (CH3COONa), 1.2 mM natriumfosfat (Na2HPO4), 25 MM natriumbicarbonat (NaHCO3), 1,2 mM magnesium sulfat (MgSO4), 1 mM calciumchlorid (CaCl2), 5,5 mM D (+) glucose, pH 7,4) med 1% BSA, og 1 x PBS.
Forsigtig: 2.5% glutaraldehyd: giftige, sensibiliserende, lokalirriterende; bruge i en røg kabinet. 0,1 M natrium cacodylate: giftig, brug i en røg kabinet. 4% PFA: fiksativ, brug i fume kabinet - Forberede følgende materialer: isofluran, små ethylendiamintetra syre (EDTA)-belagt blod rør, 23-25G nåle, 5 mL EDTA belagt sprøjter, 10 mL hætteglas, 10 mL plastik hætteglas, 0,5 mL plasticrør, engangs væv forme, tøris, flydende N 2, mus kirurgiske værktøjer, og optimal opskæring medium (OLT).
- Placer musen under dyb anæstesi, som er kontrolleret af musen at være ikke-lydhøre over for en nål prick til mund pad, ved hjælp af en isofluran kammer, eller tilsvarende ruter af terminal anæstesi såsom injicerbare bedøvelsesmiddel agenser (pentobarbital, 50 mg/kg intraperitoneal [IP]; Avertin, 240 mg/kg IP), eller kuldioxid (CO2) eksponering (75% CO2/25% O2).
- Frasortering musen via hjerte punktering ind i venstre hjertekammer og indsamle så meget blod som muligt. Overførsel til EDTA-belagt blod tube for op til 4 h. Hvis det foretrækkes, kan mus være aflivet via cervikal dislokation med omhu ikke at briste halsfedt.
- Dissekere ud nyrerne gennem maven og vask i is koldt 1 x PBS.
- At undersøge de kortikale glomeruli, fjerne en stang af nyre cortex og skåret i 1 mm3 stykker. For at undersøge de dybe juxta-medullær glomeruli, gentage den samme teknik med væv fra medulla. Sted i 5 mL 2,5% glutaraldehyd opløsning i et hætteglas EM. Opbevares ved 4 ° C.
Forsigtig: 2.5% glutaraldehyd løsning: giftige, sensibiliserende, lokalirriterende; bruge i en røg kabinet
Bemærk: proces inden for 1 måned for de bedste resultater. - For histologi, fjerne den øverste tredjedel af en nyre, at sikre både kortikale og juxta-medullær glomeruli vil være til stede, og fix i 5 mL 4% PARAFORMALDEHYD ved 4 ° C i 24 h. overførsel til 5 mL af 70% EtOH i 24 timer før indlejring i paraffin.
Forsigtig: 4% PFA: fiksativ, brug i fume kabinet - Immunfluorescens, Læg en tredjedel af nyre, at sikre både kortikale og medullær glomeruli vil være til stede, i væv mug og frakke i oktober sted på tøris til at fryse og opbevares ved-80 ° C.
- For proteiner og RNA fryse sted 3 x 2 mm3 stykker af nyre cortex i 0,5 mL plasticrør og snap i flydende Nielsen2. Opbevares ved-80 ° C. For langsigtet væv opbevaring for RNA, placere væv i 5 bind af RNA stabilisering løsning og opbevares ved-80 ° C.
- Til isolering af glomeruli, skive op den tilbageværende nyrevæv og placere i 5 mL af pattedyr Ringers løsning med 1% BSA på is. Forbered dig på at sigten glomeruli straks.
3. plasma kreatinin
Bemærk: Plasma creatinin kan være op-reguleret i nyresygdom, der angiver en reduktion i filtrering kapacitet af glomeruli. Urinstof-nitrogen (bolle) i blodet kan også vurderes, selv om protokollen ikke er beskrevet her.
- Centrifugeres blodprøve ved 500 x g i 15 min. ved 4 ° C.
- Indsamle plasma, som kan opbevares ved-20 ° C på kort sigt på dette punkt.
- Kvantificere den plasma kreatinin koncentration ved hjælp af en kemisk kreatinin assay per instruks ovenfor for urin kreatinin i protokollen 1.11.
- Bestemme kreatinin koncentrationen af hver prøve ved at læse nummerpladen på en absorbans på 490 nm før og efter tilsætning af syre løsningen.
Bemærk: Forskellen mellem disse absorbans værdier er direkte proportional med koncentrationen af kreatinin i hver prøve. En standardkurve er generation fra standarder. Hvis de tekniske gentagelser har en CV værdi større end 5%, skal du gentage analysen for disse prøver.
4. isolering af Glomeruli
Bemærk: Glomeruli kan være isoleret for at vurdere permeabilitet af individuelle glomeruli ex vivo, såvel som udtryk for bestemt protein og mRNA markører for glomerulær sygdom.
- Tage nyrevæv placeret i pattedyr Ringers løsning med 1% BSA og dissekere glomeruli ved hjælp af en standard sigtning teknik13. Kort, stak de 70 µm (nederst), 100 µm, 125 µm, 175 µm, 250 µm og 425 µm (top) sigter på et glas bægerglas.
- Mash nyre, ved hjælp af en sprøjte stemplet, i den 425 µm sigtes og skubbe brug af is kold pattedyr Ringers løsning med 1% BSA. Som bits af nyre er skubbet, fjerne top sien og gå videre til at gøre det samme på næste. Gentag indtil kun 100 µm og 70 µm sier forblive.
- Overføre den glomerulær høst opbevares af de 100 µm og 70 µm sier 10 ml frisk pattedyr Ringers løsning med 1% BSA, på is.
Bemærk: Hvis antallet af glomeruli pr. mL Ringers løsning er par, reducere mængden af Ringers løsning bruges til at indsamle glomeruli fra de to sidste sigter. - Fjern 5 mL af opløsningen, der indeholder glomeruli i to separate rør (2,5 mL) og centrifugeres ved 1.000 x g i 10 min. ved 4 ° C. Fjern supernatanten og snap fryse glomeruli i flydende N2 før opbevaring på-80 ° C til proteiner og RNA indvinding på et senere tidspunkt.
- Placer de resterende løsning der indeholder glomeruli i et vandbad ved 37 ° C for måling af glomerulær LpA / V,jegex vivo. Komplet inden for 3 h for at fjerne nyrerne.
5. glomerulær vand permeabilitet (LpA / V,jeg)
Bemærk: Glomerulær LpA / Vjeg assay gør det muligt ex vivo -måling af permeabilitet af individuelle glomeruli i en hurtig en reproducerbar måde. En stigning i glomerulær LpA / V,jeg angiver afbrydelse af GFB, som er tankevækkende af nyresygdom.
- Nedsat glomerulær LpA / V,jeg rig som beskrevet i laks mfl10. Henvises til figur 1 for en detaljeret diagram af sæt op.
- Forberede følgende løsninger: pattedyr Ringers løsning med 1% BSA (pH 7,4) og pattedyr Ringers løsning med 8% BSA (pH 7,4). Varm både til 37 ° C.
- Trække Mikropipetter fra glas kapillarrør (optisk densitet: 1,2 mm). Generere en 5-8 µm blænde tip ved at skære mikropipette under et mikroskop.
- Bruge glomerulær LpA / V,jeg rig for at fange intakt individuelle glomeruli, som er fri for Bowman's kapsel og rørformede fragmenter på mikropipette ved hjælp af sugekop. En detaljeret oversigt over oncometric analysen findes i laks mfl10. Kort sagt, når en glomerulus er fanget og sikret på den suge mikropipette, begynde at optage video af glomerulus under mikroskop.
- For det første reagensglasset glomerulus i 1% BSA Ringers løsning til 30 s før du skifter perifusate til koncentreret 8% BSA Ringers løsning for 10 s. Derefter skifter perifusate tilbage til 1% BSA Ringers løsning og stoppe optagelsen.
- Vaske glomerulus væk og Gentag processen for 10-15 glomeruli pr. mus. Sikre perifusate strømningshastigheder er identiske og ikke for hurtigt (10 mL/min.) for ikke at fordreje det glomerulær struktur.
- Måle den oprindelige sats af glomerulær svind at beregne glomerulær vand permeabilitet (LpA) normaliseret til glomerulær volumen (Vjeg). Detaljerede oplysninger om analysen kan findes i laks mfl10.
6. periodiske syre-Schiff (ikke) plet
Bemærk: PAS pletten vil fremhæve kælderen membraner glomerulær kapillær loops og rørformede epitel. Det giver mulighed for detaljerede visualisering af glomerulær celler, mesangial matrix og potentiale ekspansion og potentielle ændringer af GBM (dvs., fortykkelse og uregelmæssigheder).
- Afsnit paraffin-embedded, PFA-fast nyre cortex ved hjælp af en mikrotom på 5 µm tykkelse på poly-L-lysin belagt dias. Tør ved 37 ° C i 1 h. sikre afsnittet ikke indeholder nogen folder eller huller, som kan fordreje morfologi under mikroskop.
- Deparaffinize dias ved at inkubere to gange i xylen (forsigtighed, lokalirriterende; brug i fume kabinet) i 3 min. hver, to gange i 100% EtOH i 3 min, og derefter en gang i 95%, 70% og 50% EtOH i 3 min. hver, alle ved stuetemperatur. Re-hydrat dias i dH2O.
- Glassene inkuberes i periodiske syre løsning (forsigtighed, lokalirriterende; brug i fume kabinet) (1 g/dL) for 5 min, og derefter skylles dias i flere ændringer af dH2O. bruger en container med 100 mL dH2O ved stuetemperatur.
Forsigtig: periodiske syre løsning: lokalirriterende; bruge i fume kabinet - Inkuber dias i Schiff's reagens (Parasoaniline HCl 6 g/L og natrium metabisulfite 4% i HCl 0,25 mol/L) i 15 min. ved stuetemperatur. Vask dias i rindende vand i 5 min.
- Kontrastfarve med hæmatoxylin for 3 s før grundigt skylning dias i rindende vand i 15 min.
Bemærk: Nogle optimering kan være nødvendigt at fastslå det optimale tidspunkt for hæmatoxylin farvning. - Dehydrere dias ved hjælp af bagsiden af deparaffinization-protokollen i trin 6.2. Slut med xylen.
- Luft tørre dias og mount med xylol-baserede montering medier.
- Billede på et lysmikroskop på 400 X forstørrelse at vurdere glomerulær strukturer. Vurdere følgende: fortykkelse og uregelmæssigheder af GBM, kollapser af kapillar sløjfer, fibrotisk væv, sklerose, cellulære spredning (endotel, podocyte, og mesangial, eller inflammatoriske celler infiltrerer tuft).
Bemærk: For en omfattende evaluering af glomerulær Patofysiologi, læsioner andre steder i nyrerne bør evalueres, f.eks tubuli.
7. transmissions elektronmikroskopi (TEM)
Bemærk: TEM giver mulighed for undersøgelse af ultra-strukturelle abnormiteter i nyrerne, som GBM, podocyte foden processer og endotel fenestrations, som ikke er synlige med lysmikroskopi. Dette er vigtigt i modeller hvor renal skader ikke er så udtalt (dvs., ingen albuminuri og større strukturel abnormiteter).
- Tage 2,5% gluteraldehdye - fast hakkede nyre og post fix i 1% osmium dinitrogentetraoxid for 1 h. vask i 50 mL af 0,1 M cacodylate buffer (pH 7.3) og derefter 50 mL af dH2O (3 x 15 min ændringer).
Forsigtig: 2.5% glutaraldehyd: giftige, sensibiliserende, lokalirriterende; bruge i en røg kabinet. 0,1 M natrium cacodylate: giftig, brug i en røg kabinet - Dehydrere med EtOH og integrere i Araldite harpiks.
- Skær sektioner på 50-100 nm tykkelse og plette med 3% (vandig) uranyl acetat og Reynolds' bly natriumcitratopløsning.
- Overtage flere områder af glomerulus på 940 X digital micrographs, 1250 X og 6200 X være sikker på podocytes, GCS, GBM og mesangium kan identificeres.
- Bruge ImageJ til at analysere de blindede glomeruli. Angive skala for hver 6200 X Mikrograf ved at tegne en streg mellem to punkter af kendt afstand, som en lineal. Gå til at analysere og derefter angive skala, hvor længden af linjen vises i pixels. Skrive i en kendt afstand og måleenheder. Brug de protokoller, der er anført nedenfor for måling af hver parameter.
Bemærk: Denne analyse kræver omkring 1 dag pr. mus. Tilstrækkelig statistisk power, brug de gennemsnitlige målinger fra 3 glomeruli fra 3 mus.- GBM, indsætte et fast digital gitter (10 x 10) over 6200 X Mikrograf og måle tykkelsen af GBM på det punkt, hvor gitterlinjerne krydser GBM. Måle fra basal endotel cellemembranen til basal podocyte mund proces cellemembranen i en vinkelret tangent til i endothelial cellemembranen ved hjælp af værktøjet lige linje. Bestemme den gennemsnitlige måling for hver glomerulus fra 10 individuelle målinger.
- I endothelial fenestration antallet, måle længden af den nuværende i 6200 X Mikrograf GBM og tælle antallet af endotel fenestrations pr. enhed længde af GBM. Tage et gennemsnit af mindst 4 micrographs pr. glomerulus.
- For podocyte mund proces bredde, indsætte et fast digital gitter (10 x 10) over 6200 X Mikrograf. Måle bredden af de podocyte mund processer, der krydser gitterlinjerne. Måle bredden på den bredeste del af foden proces hvor det opfylder GBM; sikre linjen vinkelret på tangenten af podocyte basale membran. Bestemme den gennemsnitlige måling for hver glomerulus fra 10 individuelle målinger.
- For podocyte spalteformede bredde, skal du indsætte en fast digital gitter (10 x 10) over 6200 X Mikrograf. Måle bredden af podocyte slids membraner, der krydser gitterlinjerne. Dette er det punkt, hvor foden processer er tættest sammen, på den bredeste del af hver fod proces, fra podocyte membran til membranen. Sikre, at målingen er vinkelret på tangenten af podocyte basale membran. Bestemme den gennemsnitlige måling for hver glomerulus fra 10 individuelle målinger.
- For antallet af podocyte mund processer, måle længden af den nuværende i 6200 X Mikrograf GBM og tælle antallet af podocyte mund processer pr. enhed længde af GBM. Tage et gennemsnit af mindst 4 micrographs pr. glomerulus.
- For sub-podocyte plads dækning, se detaljeret metode i Neal mfl. 14.
- Bruger de 940 X micrographs, undersøge glomeruli for tilstedeværelsen af unormal struktur, indskud og infiltrater med det blotte øje.
8. immunofluorescens for Podocyte og endotel markører
Bemærk: Immunfarvning giver mulighed for visualisering af protein udtryk mønstre, såsom endotel kapillær sløjfer, der kan kollapse i glomerulær sygdom.
- Placer OCT-formen indeholder frosne nyre ved-20 ° C i 2 timer før skæring. Sikre snitfladen i nyrerne er omhyggeligt placeret mod bunden af OCT-formen til at aktiverer godt orienteret væv sektioner.
- Bruger en kryostaten, belagt afsnit væv på 5 µm tykkelse på poly-L-lysin dias.
Bemærk: Sørge for der er ingen folder eller huller i afsnittet væv, som kan fordreje morfologi. - Efter udtagning fra kryostaterne, lave dias i 4% PFA i 10 min. Skyl dias 3 x 5 min. i en beholder med 100 mL af dH2O.
Forsigtig: 4% PFA: fiksativ, brug i fume kabinet - For at minimere mængden af antistof anvendes, trække omkring sektioner med en hydrofobe pen. Lad ikke afsnittene tørre.
- Inkuber i blokerende løsning (3% BSA og 5% normalt serum i 1 x PBS) i 1 time ved stuetemperatur.
- Fjern blokering løsningen med en betjent sug og inkuberes sektioner med primær antistof (Nephrin, podocin eller PECAM-1) fortyndet 1:250 (3% BSA i 1 x PBS). Placer dias i en fugtig kammer ved 4 ° C natten over. Hvis der ikke findes et fugtkammer, let placere en lille strimmel af parafilm over det antistof-dias. Vær forsigtig ved at fjerne den næste dag, ikke forstyrre afsnittet.
- Vask dias 3 x 5 min. i 1 x PBS.
- Inkuber med passende fluorescerende sekundær antistof fortynding 1:1000 (3% BSA i 1 x PBS) i 2 timer ved stuetemperatur i mørke.
- Vask dias 3 x 5 min. i 1 x PBS. Mount med fluorescerende montering medier indeholdende DAPI.
- Billede dias med et fluorescerende mikroskop på 400 X forstørrelse at se glomeruli. Sikre, at dette er blindet for at undgå bias.
- Brug ImageJ analysere farvning intensiteten, normaliseret til området glomerulær og mønster af farvning, dvs, antallet af kapillar sløjfer normaliseret til området glomerulær i en blindet måde.
9. protein udvinding og Western Blotting
Bemærk: Western blotting tillader os at vurdere udtryk proteiner kendt for at være dysregulated i nyresygdom. For eksempel, angiver en reduktion i podocin og nephrin udtryk podocyte tab.
- Uddrag protein fra nyre cortex og sigtede glomeruli; protokollen er den samme for hver og mængden af lysisbuffer er justeret for størrelsen af væv.
- Tø nyre/glomeruli på is før du tilføjer lysis NP-40 buffer (150 mM NaCl, 1% NP-40, 50 mM Tris pH 8) indeholdende protease og fosfatase hæmmere. Homogeniseres prøve for 30 s.
- Inkuber de homogeniserede prøver på is i 30 min, vortexing med jævne mellemrum.
- Centrifugeres prøver på 10.000 x g i 15 min. ved 4 ° C.
- Fjern supernatanten til en frisk tube på is.
Bemærk: Forvent at genvinde ca 1 mg protein pr. prøve. - Denaturere proteiner ved hjælp af de standard 4 x Laemmli buffer. Kog blandingen ved 95-100 ° C i 5 min.
- Vurdere udtryk for glomerulær celle markør proteiner (Nephrin, Podocin, PECAM-1, osv.) og fosforylering og udtryk for proteiner kendte/hypotese ændres i nyre/glomeruli sygdom model ved hjælp af Western blotting) standard metode; Mahmood og Yang15).
Bemærk: Protokollen vil variere afhængigt af størrelse og overflod af protein af interesse.
10. RNA udvinding og Polymerase Chain Reaction (PCR)
Bemærk: mRNA udtryk analyse gør det muligt for os at afgøre, hvordan gener er reguleret i nyre sygdom, såsom ændringer i genekspression og alternativ splicing.
- Mens nyre cortex er stadig frosset, grundigt grind i 3 mL af phenol reagens med en pistil og morter. Hvis du bruger glomerulær ekstrakter, der tilsættes 1 mL af phenol reagens og homogeniseres prøve for 30 s.
Forsigtig: TRIzol reagens: lokalirriterende; bruge i fume kabinet - Udføre en RNA udvinding ved hjælp af metoden beskrevet af Chomczynski og Sacchi16.
Bemærk: Kommercielle RNA udvinding kits er tilgængelige som et alternativ til denne metode. - Vurdere mængden og kvaliteten af RNA fremstillet ved hjælp af en af de forskellige metoder til rådighed. RNA er aliquoted og opbevares ved-80 ° C på dette punkt. Undgå gentagelse fryse optøning.
Bemærk: Hvis nye til denne metode, kontrollere kvaliteten af RNA, før du fortsætter til næste trin ved at køre RNA på en agarosegel at sikre en klar 28S og 18S ribosomale band. Forvent at inddrive mellem 2-5 µg af RNA ved hjælp af denne metode. - DNase behandle 1 µg RNA (make volumen op til 10 µL med RNase-fri vand plus 1 µL af DNase og 1 µL af DNase buffer) i 1 time ved 37 ° C. Stop reaktion med 1 µL af DNase stopopløsning på 65 ° C i 10 min.
- Tilsæt 0,5 µL af oligo (dT) og tilfældige primere. Der inkuberes ved 70 ° C i 10 min.
- Straks slukke i isbad i 5 min.
- Tilføj følgende; MMLV reverse transkriptase enzym (400 U, Erstat med DEPC H2O i RT - kontrolprøve), MMLV buffer (1 x), dNTP mix (0,5 mM) og ribonuklease inhibitor (40 U); gøre op til 50 µL med DEPC vand.
- Inkuber mastermix ved 37 ° C i 1 h efterfulgt af 95 ° C i 5 min at deaktivere enzymet.
Bemærk: For at generere et højere udbytte af cDNA, inkuberes ved 37 ° C i op til 3 h. - Vurdere mængden og kvaliteten af cDNA ved hjælp af de forskellige metoder til rådighed.
- Brug PCR at vurdere mRNA udtryk og splicing mønstre af gener hypotese for at være dysregulated i modellen glomerulær sygdom. Protokollen vil variere afhængigt af gen af interesse.
Representative Results
Urinen blev indsamlet ved hjælp af metaboliske bure fra vildtype (WT), inducerbar podocyte-specifikke VEGF-A banke ud (VEGF-A KO) og VEGF-A KO X Neph-VEGF165b mus (VEGF-A KO mus, der over express menneskelige VEGF-A165b isoform i podocytes i en konstituerende måde). Ved måling af urin albumin kreatinin ratio på uger 0, 4, 10 og 14 efter doxycyclin induktion af VEGF-A KO udviklet VEGF-A KO mus progressive albuminuri af 10 uger i forhold til WT littermate kontrol. De absolutte værdier kan ses i figur 2A, og den normaliserede til grundlinjen på hver mus værdier i figur 2B. Dog albuminuri i ikke observeret i VEGF-A X Neph-VEGF-A165b mus (figur 2), der angiver at VEGF-A165b er beskyttende i modellen af albuminuri5.
Den glomerulær LpAVjeg blev målt i individuelle glomeruli sigtes fra WT, VEGF-A KO og VEGF-A X Neph-VEGF-A165b nyrerne. Et eksempel på hvordan en glomerulus er fanget og svind observeret, når perifused med 8% BSA er vist i figur 3A. Denne svind bruges derefter til at bestemme den glomerulær LpA / Vjeg for hver glomerulus (figur 3B). VEGF-en KO mus havde en signifikant øget glomerulær LpA / Vjeg på 14 uger post VEGF-KO induktion i forhold til WT kontrol glomeruli. Selv om lavere i VEGF-A X Neph-VEGF-A165b musene, øget glomerulær LpA / V,jeg var ikke hindres af overdreven udtryk af VEGF-A165b på 14 uger5.
PAS farvning af nyre cortex afsnit 14 uger efter induktion af VEGF-A KO ikke afsløre nogen glomerulær strukturelle abnormiteter i VEGF-A KO eller VEGF-A X Neph-VEGF-A165b mus (figur 4A). Dog ved analyse af glomerulær ultra-strukturen via EM, VEGF-A KO mus havde udviklet en øget GBM bredde, faldt antallet af endotel fenestrae, faldt SPS dækning og øget gennemsnitlig podocyte spalteformede bredde (figur 4 c-4F ). Gennemsnitlige podocyte foden behandle bredde og antallet af spalter uændret (figur 3B og 3 G). Overdrevne udtryk af VEGF-A165b i VEGF-A KO mus forhindret ændringerne til GBM og udskærer bredde (figur 4 c og 4F). Dog havde VEGF-A165b ingen effekt på den ændrede fenestrae nummer og SPS dækning (figur 4D og 4E)5.
RT-PCR udføres på RNA ekstraheret fra sigtede glomeruli afslørede, at den menneskelige VEGF165Baasch mRNA er kun til stede i VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165b mus (figur 5A). Når udvinding protein fra sigtede glomeruli og vurdere niveauet af proteiner via Western blotting, blev glomerulær protein udtryk af VEGFR-2 fundet at være faldet i VEGF-A KO mus, som blev forhindret af overdrevne udtryk af VEGF-A165b ( Figur 5B og 5 C)5.
Figur 1. Skematisk nedsat glomerulær permeabilitet (LpA) riggen. (A) glomerulus er fanget på (B) mikropipette inden for en indehaver bruger suge, som er fastspændt på et mount for stabilitet. (C) rektangulære microslide. (D) 4 X formålet med et mikroskop med et videokamera. (E) 1% BSA opløsning opvarmes til 37 ° C. (F) 8% BSA opløsning opvarmes til 37 ° C. (G) fjernbetjeningen tryk forsynet med to perifusate, der indeholder linjer, som tillader hurtig perifusate dataudveksling. (H) rute af perifusate mod microslide, som derefter bader glomerulus. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Urin albumin kreatinin ratio. (A) uACR værdier uger 0, 4, 10 og 14 efter induktion af VEGF-A KO i WT, VEGF-A KO og VEGF-A X Neph-VEGF-A165b mus. (B) de samme uACR-værdier normaliseret til en baseline værdi (uge 0) af hver individuelle mus. UACR steget betydeligt i VEGF-A KO mus i uge 10 og 14 i forhold til WT littermate kontrol, som blev forhindret i VEGF-A X Neph-VEGF-A165b mus (* p < 0,05; To-vejs ANOVA, korrektion for sammenligning mellem par; n = 4-12 mus pr. tidspunkt; fejllinjer: standard fejl af middelværdien [SEM]). Dette tal er blevet ændret fra Stevens mfl5. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Måling af glomerulær vand permeabilitet. (A) af glomerulus er fanget på mikropipette via suge; perifusate er skiftet fra 1% BSA (Ai) til 8% BSA (Aii), og glomerulær svind er observeret. (B) målinger taget før og efter 8% BSA kontakten bruges til at bestemme den glomerulær LpA / V,jeg. (C) VEGF-A KO mus udvikler en øget glomerulær LpA / Vjeg på 14 uger post induktion af VEGF-A KO i forhold til WT kontrol. Dette var ikke signifikant forhindret i VEGF-A X Neph-VEGF-A165b mus (* p < 0,05; Én måde ANOVA, Bonferroni korrektion for sammenligning mellem par; n = 4-9 mus, 15-30 glomeruli; fejllinjer: SEM). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Glomerulær strukturel analyse. (A) PAS farvning af nyre cortex angav ikke nogen strukturel abnormiteter i glomeruli fra WT, VEGF-A KO og VEGF-A X Neph-VEGF-A165b mus (Ai - iii). EM afslørede ultra-strukturelle abnormiteter i VEGF-A KO glomeruli (Aiv - vi). (B) det gennemsnitlige FPW ikke ændre mellem grupper. (C) The GBM steg i VEGF-A KO glomeruli, som blev forhindret af VEGF-A165b. (D) antallet af fenestrae faldt i VEGF-A KO glomeruli, som forblev uforandret af VEGF-A165b. (E) den SPS dækning var faldet i VEGF-A KO glomeruli, som også er uændret af VEGF-A165b. (F) den gennemsnitlige spalteformede bredde blev forøget i VEGF-A KO glomeruli, som blev forhindret af VEGF-A165b. (G) slids antallet var uændret mellem de tre grupper (* p < 0,05; Én måde ANOVA, Bonferroni korrektion for sammenligning mellem par; n = 3 mus, 9 glomeruli; fejllinjer: SEM). Dette tal er blevet ændret fra Stevens mfl5. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. mRNA og protein udtryk markører. (A) RT-PCR viste, at menneskelige VEGF-A165b mRNA udtryk kun var tydeligt i de sigtede glomeruli fra VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165b mus. (B) Western blotting tilkendegivet, at VEGFR-2 protein udtryk var nedreguleret i VEGF-A KO glomeruli, som blev forhindret i VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165b glomeruli (* p < 0,05; Én måde ANOVA, Bonferroni korrektion for sammenligning mellem par; n = 3 - 6 mus; fejllinjer: SEM). Dette tal er blevet ændret fra Stevens mfl5. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Denne protokol beskriver en fuld nyre arbejde op, der skal udføres i musemodeller af glomerulær sygdom, gør det muligt for en enorm mængde af informationer vedrørende nyre og glomerulær funktion at være fremstillet af et enkelt museklik. De kritiske trin i hver metode giver mulighed for funktionelle, strukturelle og mekanistiske DETAILANALYSE af glomerulær funktion, herunder vurdering af permeabilitet af nyrerne som helhed (uACR og plasma kreatinin målinger), permeabilitet af enkelte glomeruli (glomerulær LpA / V,jeg), undersøgelse af de strukturelle ændringer (PAS, Trichrome blå og EM), protein lokalisering (IF) og glomerulær genekspression (RT-PCR og Western blotting). Disse metoder er nøglen til den fulde vurdering af glomerulær funktion i musemodeller af nyresygdom.
Ved vurderingen af permeabilitet af GFB, har mange undersøgelser valgt for at bruge den konventionelle uACR eller 24 h albumin udskillelse sats som en effektiv foranstaltning17,18. Selvom disse teknikker tillader vurdering af GFB permeabilitet som helhed, giver det ikke mulighed for individuelle glomerulær permeabilitet vurdering og variation blandt glomeruli. Tidligere undersøgelser har fundet måling af glomerulær LpA / Vi at være en mere følsom mål for ændringer i GFB permeabilitet5,9. Faktisk, i de repræsentative resultater viste i dette papir, på 14 uger post induktion af VEGF-A KO, VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165b mus har en betydeligt lavere uACR i forhold til VEGF-A KO mus; men dette resultat er ikke afspejlet i glomerulær LpA / Vjeg målinger, hvor VEGF-A165b ikke forhindre betydeligt øger i GFB permeabilitet (figur 1 og figur 2)5. Dette viser betydningen af at bruge flere assays til at vurdere både nyre permeabilitet og permeabilitet af individuelle glomeruli. Derudover glomerulær LpA / Vjeg oncometric analyse tyder på, at permeabiliteten af individuelle glomeruli fra samme nyrerne kan variere meget, især i sygdommen modeller5,10, 19. en begrænsning til måling af glomerulær LpA / Vjeg er, at det kun kan udføres på den eksperimentelle end-point; således, regelmæssig uACR målinger er forpligtet til at give en indikation af den eksperimentelle end-point.
Ud over vurderingen af den funktionelle fænotype, tilskynder den nuværende metode også vurdering af de strukturelle og ultrastrukturelle fænotype. Dette kan gøres ved hjælp af et udvalg af pletter såsom PAS, trichrome, og sølv pletter; hver at vurdere forskellige aspekter af glomerulær morfologi. I akut modeller af glomerulær sygdom, som det ofte er tilfældet i musemodeller, kan være svære at opdage eventuelle store strukturelle abnormiteter ved hjælp af disse pletter, medmindre du er en uddannet renal patolog. Derfor foreslås udfører EM for at vurdere ultrastruktur af GFB, som giver mulighed for kvantitativ måling af parametre såsom GBM, endotel fenestrae størrelse og antal og podocyte karakteristika. Sådanne målinger kræver minimal uddannelse til at udføre og muliggør investigator at bestemme celle-typer/strukturer påvirket i en sygdom model. I eksemplet vist i de repræsentative resultater, VEGF-A KO mus blev fundet at være en mild model af glomerulær sygdom, således, var ingen store strukturelle abnormiteter til stede ved PAS farvning. Dog podocyte-specifikke VEGF-A KO fremkalde ændringer til GBM, podocytes og endotelceller, når den undersøger de glomerulær ultra-struktur5. Forberedelse af nyrerne til EM beskrevet i den aktuelle metode giver desværre ikke påvisning af i endothelial glycocalyx, som også er kendt for at have betydelige virkninger på permeabilitet af GFB19. For at præcist at måle glycocalyx dybde, skal nyrerne være perfuse-fast med 2,5% glutaraldehyd med 1% Alcian blå i endothelial glycocalyx mærkning, som beskrevet i Oltean mfl19.
Når den funktionelle og strukturelle fænotype er blevet vurderet, kan udtryk/aktivisering mønstre af forskellige gener og veje derefter vurderes konkret i glomeruli. Ultra-strukturelle forhåndsvurdering kunne give nogle oplysninger om cellen typer/glomerulær strukturer involveret, der angiver, om podocyte - eller endotel-specifikke gener/veje bør undersøges. For eksempel, i de repræsentative resultater fra VEGF-A KO mus, blev en reduktion i endothelial fenestrae antallet observeret (figur 3D); Derfor blev glomerulær protein udtryk for en endotel mærke kendt for at være involveret i VEGF-en vej undersøgt; VEGFR-2 (figur 4B)5. Ud over udtrykket af proteiner i glomeruli, kan deres lokalisering også visualiseres ved hjælp af hvis. I en undersøgelse af Zhang mfl20, blev podocyte-specifikke overekspression af GLUT1 bekræftet i podocytes af hvis Co lokalisere den øgede GLUT1 med podocin.
I forhold til alternative metoder præsenteres i litteraturen til at vurdere glomerulær funktion, giver brug af metoden beskrevet i denne hvidbog at vurdere nyrefunktionen i musemodeller af glomerulær sygdom glomerulær fænotype vurderes fuldt ud fra flere aspekter. Ved hjælp af denne metode, er at forskeren stand til at bestemme nyre Fænotypen af modellen og vurdere mekanisme, hvorfor fænotype udvikler. Denne vitale oplysninger om mekanismen af sygdommen er påkrævet, når du undersøger potentielle terapeutiske muligheder i disse modeller. Denne metode kan nemt anvendes til fremtidige undersøgelser glomerulær funktion både i vurderingen af sygdom fænotyper og potentielle therapeutics.
Til sidst, beskriver denne generisk og fleksibel protokol en fuld nyre arbejde op for musemodeller af glomerulær sygdom, gør det muligt for en enorm mængde af informationer vedrørende nyre og glomerulær funktion at være fremstillet af et enkelt museklik. Metoderne, der giver mulighed for detaljerede funktionelle, strukturelle og mekanistiske analyse af glomerulær funktion, som kan anvendes til alle musemodeller af glomerulær sygdom.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af den britiske Heart Foundation, Richard Bright VEGF forskning har tillid og MRC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Metabolic Cages | Harvard Apparatus | 52-6731 | |
| Tris buffered saline (10x) | Sigma-Aldrich | T5912-1L | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| Mouse Albumin ELISA Quantitation Set | Bethyl Laboratories | E90-134 | |
| TMB ELISA Substrate solution | ThermoFisher Scientific | 34028 | |
| Sulphuric acid | Sigma-Aldrich | 339741 | |
| SPECTRstar nano | BMG Labtech | SPECTRstar nano or equivalent | |
| RNAlater stabilisation solution | ThermoFisher Scientific | AM7020 | |
| 4-15% precast protein gel | BIORAD | 4568084 | |
| 4x Laaemmli Sample buffer | BIORAD | 161-0747 | |
| Mini Trans-Blot cell | BIORAD | 1703930 | |
| 10x Tris running buffer | BIORAD | 1610732 | |
| Coomassie Brilliant Blue Dye | ThermoFisher Scientific | 20278 | |
| Creatinine Companion | Exocell | 1012 Strip Plate | |
| Glutaraldehyde Solution | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Sodium Cacodylate | Sigma-Aldrich | C0250 | |
| 10x Phosphate Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | AM9625 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| Sodium Phosphate | Sigma-Aldrich | 342483 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M2643 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| D(+)Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| EDTA Blood Collection tubes | BD | 367835 | |
| 23-25G Needle | BD | PMC0735 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| 10 ml Glass Vial | Thomas Scientific | 0914X10 | |
| Falcon 10 ml Polypropylene Tubes | ThermoFisher Scientific | 10110101 | |
| 0.5 ml Tubes | ThermoFisher Scientific | 10681894 | |
| Disposable Tissue Molds | ThermoFisher Scientific | 22-363-553 | |
| Mouse Surgical Disection Kit | ThermoFisher Scientific | 13-005-204 | |
| Optimal Cutting Medium | ThermoFisher Scientific | 23-730-571 | |
| 4% Paraformaldehyde | ThermoFisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| Glass Capillary Tubes | Harvard Apparatus | EC1 64-0770 | |
| Glomerular Permeability Rig | Built at the Univeristy of Bristol - not comercially available | Citation of LpA rig: Salmon et al. 2006; J. Physiol | |
| Stainless Steel Sieves | Cole-Parmer | WZ-59984 | |
| Periodic Acid-Schiff (PAS) Staining System | Sigma-Aldrich | 395B-1KT | |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H3136 | |
| Xylene | MerckMillipore | 108298 | |
| Poly-Prep Slides | Sigma-Aldrich | P0425-72EA | |
| Mounting Medium | ThermoFisher Scientific | 8030 | |
| Osmium tetroxide solution | Sigma-Aldrich | 75632 | |
| Aradite Resin | Agar Scientific | CY212 | |
| Uranyl Acetate | Agar Scientific | AGR1260A | |
| Lead Citrate | Agar Scientific | AGR1210 | |
| Cryostat | ThermoFisher Scientific | e.g. 957000H | |
| Hydrophobic Pen | Abcam | ab2601 | |
| Nephrin (1243-1256) Antibody | Acris | BP5030 | |
| Anti-Podocin | Sigma-Aldrich | P0372-200UL | |
| Anti-CD31 | BD Biosciences | 550274 | |
| Alexa Fluor Secondary Antibody | ThermoFisher Scientific | A32732 | |
| Vectashield Mounting Medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| NP40 Cell Lysis Buffer | ThermoFisher Scientific | FNN0021 | |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail | ThermoFisher Scientific | 78437X4 | |
| 10x Transfer Buffer | BIORAD | 1610734 | |
| PVDF Membrane | ThermoFisher Scientific | LC2002 | |
| HRP-Conjugated Secondary Antibodies | Abcam | ab6721 | |
| ECF Substrate for Western Blotting | Fisher | 10713387 | |
| TRIzol | ThermoFisher Scientific | 15596018 | |
| Dnase I | New England Biolabs | M0303S | |
| M-MLV Reverse Transcriptase | New England Biolabs | M053S | |
| Oligo dT | ThermoFisher Scientific | 18418012 | |
| Random Primers | ThermoFisher Scientific | 48190011 | |
| dNTP | ThermoFisher Scientific | 18427088 | |
| Ribonuclease Inhibitor | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
| DEPC Water | ThermoFisher Scientific | AM9915G | |
| Fluorescent Light Miscroscope | Leica Microsystems | ||
| Image J Analysis Software | Image J | ||
| PCR Thermocycler | ThermoFisher Scientific | ||
| TEM Microscope | Britannica |
References
- Humtstrom, M. Development of structural kidney damage in spontaneously hypertensive rats. Journal of Hypertension. 30 (6), 1087-1091 (2012).
- Kitada, M., Ogura, Y., Koya, D. Rodent models of diabetic nephropathy: their utility and limitations. International Journal of Nephrology and Renovascular Disease. 14 (9), 279-290 (2016).
- Tesch, G. H., Lim, A. K. Recent insights into diabetic renal injury form the db/db mouse model of type 2 diabetic nephropathy. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 300 (2), F301-F310 (2011).
- Fogo, A. B. Animal models of FSGS: lessons for pathogenesis and treatment. Seminars in Nephrology. 23 (2), 161-171 (2003).
- Stevens, M., et al. VEGF-A165b protects against proteinuria in a mouse model with progressive depletion of all endogenous VEGF-A splice isoforms from the kidney. Journal of Physiology. 595 (19), 6281-6298 (2017).
- Cosgrove, D., Kalluri, R., Miner, J. H., Segal, Y., Borza, D. B. Choosing a mouse model to study the molecular pathobiology of Alport glomerulonephritis. Kindey International. 71 (7), 615-618 (2007).
- Kujal, P., Vernerova, Z. 5/6 nephrectomy as an experimental model of chronic renal failure and adaptation to reduced nephron number. Ceskoslenska Fysiologuie. 57 (4), 104-109 (2008).
- Chevalier, R. L., Forbes, M. S., Thornhill, B. A. Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy. Kidney International. 75 (11), 1145-1152 (2009).
- Oltean, S., et al. VEGF165b overexpression restores normal glomerular water permeability in VEGF164-overexpressing adult mice. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 303 (7), F1026-F1036 (2012).
- Salmon, A. H., Neal, C. R., Bates, D. O., Harper, S. J. Vascular endothelial growth factor increases the ultrafiltration coefficient in isolated intact Wistar rat glomeruli. Journal of Physiology. 570 (Pt 1), 141-156 (2006).
- Zheng, F., Striker, G. E., Esposito, C., Lupia, E., Striker, L. J. Strain differences rather than hyperglycemia determine the severity of glomerulosclerosis in mice. Kidney International. 54 (6), 1999-2007 (1998).
- Betz, B., Conway, B. R. An update on the use of animal models in diabetic nephropathy research. Current Diabetes Reports. 16 (18), (2016).
- Savin, V. J., Terreros, D. A. Filtration in single isolated mammalian glomeruli. Kidney International. 20 (2), 188-197 (1981).
- Neal, C. R., Crook, H., Bell, E., Harper, S. J., Bates, D. O. Three-dimensional reconstruction of glomeruli by electron microscopy reveals a distinct restrictive urinary subpodocyte space. Journal of the American Society of Nephrology. 16 (5), 1223-1235 (2005).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medicine & Science. 4 (9), 429-434 (2012).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry. 162 (1), 156-159 (1987).
- Adembri, C., et al. Sepsis induces albuminuria and alterations in the glomerular filtration barrier: a morphofunctional study in the rat. Critical Care. 15 (6), R277 (2011).
- Ma, S. T., Liu, D. L., Deng, J. J., Niu, R., Liu, R. B. Effect of arctiin on glomerular filtration barrier damage in STZ-induced diabetic nephropathy rats. Phytotherapy Research. 27 (10), 1474-1480 (2013).
- Oltean, S., et al. Vascular endothelial growth factor-A165b is protective and restores endothelial glycocalyx in diabetic nephropathy. Journal of the American Society of Nephrology. 26 (8), 1889-1904 (2015).
- Zhang, H., et al. Podocyte-specific overexpression of GLUT1 surprisingly reduces mesangial matric expansion in diabetic nephropathy in mice. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 299 (1), F91-F98 (2010).
