Summary
Det här protokollet beskriver en full njure arbete-up som bör utföras i musmodeller av glomerulär sjukdom. Metoderna som möjliggör detaljerad funktionella, strukturella och mekanistiska analys av glomerulär funktion, som kan tillämpas på alla musmodeller av glomerulär sjukdom.
Abstract
Användningen av murina modeller att efterlikna mänskliga njursjukdom blir allt vanligare. Vår forskning är inriktad på bedömning av glomerulär funktion i diabetisk nefropati och podocyte-specifika VEGF-A knock-out möss; Det här protokollet beskriver därför full njure arbete-upp används i vårt labb för att bedöma dessa mus-modeller av glomerulär sjukdom, möjliggör en stor mängd information om njur- och glomerulär funktion som kan uppnås genom ett enda musklick. I jämförelse med alternativa metoder som presenteras i litteraturen att bedöma glomerulär funktion, ger användningen av den metod som anges i detta dokument den glomerulära fenotypen utvärderas fullständigt från flera aspekter. Genom att använda denna metod kan forskaren avgöra njure fenotypen av modellen och bedöma mekanismen om varför fenotypen utvecklar. Denna viktiga information på mekanismen av sjukdom krävs när man undersöker potentiella terapeutiska vägar i dessa modeller. Metoderna som möjliggör detaljerad funktionell bedömning av den glomerulära barriären genom mätning av den urin albumin kreatininclearance baserat och enskilda glomerulär vattengenomsläpplighet, samt både strukturella och Ultra strukturella undersökning med hjälp av Perjodsyra-Schiff fläcken och elektronmikroskopi. Dessutom möjliggör analys av de gener dysreglerad på mRNA och protein nivå mekanistiska analys av glomerulär funktion. Detta protokoll beskriver de generiska men anpassningsbara metoder som kan tillämpas på alla musmodeller av glomerulär sjukdom.
Introduction
Användningen av murina modeller att efterlikna mänskliga njursjukdom blir allt vanligare. Sådan murina modeller inkluderar spontan modeller såsom spontant hypertensiva råttor (SHR)1, streptozotocin (STZ)-inducerad diabetiska råttor och möss2och db/db typ II diabetiker möss3, genetiskt modifierade modeller såsom primär podocyte-specifika fokal segmentell glomerulär skleros (FSGS) modeller4, den podocyte-specifika vaskulär endotelial tillväxtfaktorn (VEGF-A) knock-out (VEGF-A KO) modell5, och Alport syndrom modeller6, och förvärvade modeller såsom den 5/6 nefrektomi7 och den ensidiga uretär obstruktion (UUO) modell8. För att bedöma olika aspekter av glomerulär funktion i dessa modeller, finns flera tekniker tillgängliga. Syftet med denna metod papper är att visa en omfattande arbete-up som bör utföras i musmodeller av njursjukdom för att fullt ut bedöma glomerulär funktion.
Logiken bakom denna metod är att det möjliggör den glomerulära fenotypen utvärderas fullt ur flera aspekter. Detta inkluderar bedömning av glomerulär permeabilitet, både protein och vatten, glomerulär strukturella avvikelser och förändringar i den uttryck/skarvning av mRNA och proteiner viktiga för normal glomerulär funktion. Genom att använda denna metod är forskaren kunna avgöra njure fenotypen av modellen och bedöma mekanismen om varför fenotypen utvecklar. Detta är viktig information om mekanismen av sjukdom, som krävs när man undersöker potentiella terapeutiska vägar i dessa modeller.
I litteraturen är det vanligt att presenteras med en musmodell av glomerulär sjukdom där fenotypen bestäms av en ökad nivå av albumin i urinen. Det finns dock tecken som tyder på att en enda metod för att bestämma glomerulär funktion inte är alltid effektivt. mäta andelen urin albumin utsöndring eller urinvägar albumin kreatinin kvoten (uACR) endast ger information på totala njurfunktionen, och inte de enskilda glomeruli. Tidigare studier har visat att permeabiliteten kan variera i olika glomeruli från samma njure5,9,10. Bedömning av permeabiliteten av enskilda glomeruli är dessutom ett känsligare sätt att utvärdera glomerulär funktion; tekniken att mäta de enskilda glomerulär vattengenomsläpplighet (LpA / Vjag) har visat sig vara mer känslig för förändringar i glomerulär funktion än mätning uACR9. Denna analys är fördelaktigt i musmodeller som är resistenta mot proteinuri, såsom de på en c57BL/6 bakgrunden11. Fördelen med det nuvarande metoden papperet är att det undersöker både totala nedsatt permeabilitet till albumin samt enskilda glomerulär permeabilitet för vatten.
Undersökning av glomerulär strukturella avvikelser bedöms ofta av ett batteri av fläckar såsom Perjodsyra Schiff (PAS), trikrom, och silver fläckar. Dessa möjliggör en utbildad nedsatt patolog att utvärdera nivån på njursjukdom via en Poängmetod. Även om alla bra metoder, förändringar i glomerulär makro-strukturen inte alltid iakttas i modeller akut njurskada12. Denna metod föreslår att utöver nedsatt histologi metoder som beskrivs ovan, bör glomerulär ultra-strukturen också bedömas via elektronmikroskopi (EM). En betsad glomeruli kan se relativt normalt under ett vanligt ljusmikroskop; dock vid bedömning med EM, små förändringar i den glomerulära basalmembranet (GBM) bredden, analyseras podocyte fot processen utplåning, endothelial fenestrations och sub-podocyte utrymme täckningen. Därför är det viktigt att både glomerulär ultra-struktur och mikrostruktur utvärderas för att bestämma mekanismen av glomerulär dysfunktion.
Förutom att bedöma glomerulär strukturella avvikelser, bör förändringar i mRNA och proteinuttryck och skarvning, samt protein aktivering (t.ex., fosforylering), undersökas för att ytterligare belysa mekanismerna av glomerulär sjukdom. När man tittar på glomerulär sjukdom, eller, till exempel när KO/över-expressing en gen specifikt i glomerulära celler, såsom i den podocyte-specifika VEGF-A KO mus5, är det viktigt att protein och mRNA ändringarna undersöks endast inom den glomerulära celler, och inte hela njuren. Det här protokollet beskriver en metod där glomeruli är isolerade från mus njure cortex, och sedan protein/RNA isoleras. Detta tillåter särskild analys av den protein/mRNA dysreglering i glomeruli av sjukdom modell.
Det här protokollet beskriver en full njure arbete-up som bör utföras i musmodeller av glomerulär sjukdom, möjliggör en stor mängd information om njur- och glomerulär funktion som kan uppnås genom ett enda musklick. Metoderna som möjliggör detaljerad funktionella, strukturella och mekanistiska analys av glomerulär funktion, som kan tillämpas på alla musmodeller av glomerulär sjukdom.
Protocol
Alla experiment genomfördes i enlighet med brittisk lagstiftning och lokala etiska kommittén godkännande. Djurstudier har godkänts av University of Bristol forskningsetisk kommitté.
1. urin Albumin kreatininclearance baserat (uACR)
Obs: UACR används för att bedöma genomträngligheten av GFB till albumin. Förekomsten av albumin i urinen indikerar ökad permeabilitet över den GFB, som är normaliserad till kreatinin för variationer i urin flöde. Albuminuri är en gemensam markör för kronisk njursjukdom.
- Samla urin vid den experimentella baseline och med jämna mellanrum (en gång i veckan till en gång per månad) fram till den experimentella slutpunkten.
- Ställa in mus metabolismburar med vatten och anrikning diet. Placera möss (manlig, år 6-8 veckor) i enskilda burar för 6 h i ett tyst rum.
- Return möss till ordinarie bostäder och samla urin från de tomma burarna. Det krävs minst 50 µL.
Obs: Om musen inte producerar urin i den angivna tiden, upprepa på en annan dag i ett varmare rum. - Centrifugera urinen vid 500 x g i 10 min. samla urinen och behålla sediment för att bedöma podocyte förlust. Lagra urinen vid-20 ° C på kort sikt på denna punkt.
- Späd ut urinen till 1% bovint serumalbumin (BSA) i 1 x Tris buffrad koksaltlösning (TBS pH 7,5) på en 1: 500 till 1:10000 utspädning, beroende på svårighetsgraden av albuminuri.
Obs: Slut volymen bör vara > 400 µL. optimera för att avgöra rätt utspädning på varje gång peka. - Kvantifiera urin albumin koncentrationen med hjälp av en mus albumin enzym länkade immunosorbent assay (ELISA) per tillverkarens anvisningar.
- Kort, coat ELISA-plattan, som är optimerad för proteinbindning, med 100 µL av antimus albumin primär antikropp (10 µg/mL i 0,5 M karbonat-bikarbonat pH 9,6) för 1 h i rumstemperatur.
- Tvätta överskjutande antikroppar från brunnarna fem gånger med 1 x TBS plus 0,05% Tween (pH 8,0), och tillsätt 200 µL blockerande lösning (1 x TBS med 1% BSA pH 8,0) över natten i rumstemperatur.
- Tvätta plattan fem gånger och tillsätt 100 µL av standarder (seriell utspädning: 2000 µg/mL till 15.63 µg/mL i 1 x TBS med 1% BSA, pH 8,0), blank och utspädda proverna i tre exemplar. Låt verka 1 h i rumstemperatur och sedan tvätta plattan fem gånger.
- Tillsätt 100 µL av HRP detektionsantikropp till varje brunn (10 ng/mL i 1xTBS med 1% BSA, pH 8,0) och inkubera i rumstemperatur i 1 h.
- Tvätta plattan fem gånger och tillsätt 100 µL av enzymet substratlösningen i varje brunn. Lämnar plattan i mörkret att utveckla för 15 min och stoppa reaktionen genom att lägga till 100 µL av 0,18 M svavelsyra (H2SO4).
FÖRSIKTIGHET: H2så4 är frätande.
- Bestämma albumin koncentrationen av varje prov genom att läsa på plattan på en absorbans 450 nm. Använd standardkurvan för att kvantifiera albumin i varje prov. Om de tekniska repetitioner har en CV-värde som är större än 5%, upprepa analysen för dessa prover.
- Alternativt kan bedöma urin albumin koncentrationen med elektrofores. Tillsätt 5 µL av 4 x protein prov lastning buffert till 15 µL av urin. Värma prover till 95 ° C i 10 min och Lägg sedan till en 4-12% Tris förtillverkade gel.
- Kör gelen vid 100 V och fläck över natten i Coomassie blå per tillverkarens protokollet.
- Efter imaging gelen, använda densitometry att bedöma fold change albumin koncentration i förhållande till kontroll.
Obs: Om inga band observeras för albumin när förväntas, utvärdera protein koncentrationen av urinen och justera volymen av urin till gelen.
- Späd raw urinprovet i dH2O 1:1, 1:5 och 1:10.
Obs: Slut volymen bör vara > 70 µL. optimera för att avgöra rätt utspädning av varje prov. - Kvantifiera urin kreatinin koncentration med en kemisk analys per instruktionerna kit. Kort, Ladda 20 µL av kreatinin standarder, tomt, eller utspädd urin på en 96 väl tallrik i tre exemplar.
- Bestämma kreatinin koncentration varje prov genom att läsa på plattan på en absorbans 490 nm före och efter tillsats av syra lösningen (försiktighet, frätande, Undvik kontakt med huden).
Obs: Skillnaden mellan absorbansvärdena är direkt proportionell mot koncentrationen av kreatinin i varje prov. En standardkurva är generation från normerna. Om de tekniska repetitioner har en CV-värde som är större än 5%, upprepa analysen för dessa prover. - Generera uACR (µg/mg). Normalisera data till utgångsvärdet av varje mus för grafisk representation.
2. vävnad och blodinsamling
Obs: Njure och glomerulär vävnad kan användas för att bedöma strukturella, protein och mRNA uttryck markörer för njursjukdom. Blodet kan användas för att bedöma markörer av njurfunktionen, såsom kreatinin, som kan vara uppreglerat i njursjukdom, som visar en minskning filtreringskapacitet av glomeruli.
- Förbered följande lösningar: färska 2,5% glutaraldehyd i 0,1 M natrium cacodylate (pH 7,3), 4% PARAFORMALDEHYD 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS), däggdjur Ringers lösning (115 mM natriumklorid (NaCl), 10 mM natriumacetat (CH3COONa), 1,2 mM-natriumfosfat (Na2HPO4) 25 MM natriumbikarbonat (NaHCO3), 1,2 mM magnesiumsulfat (MgSO4), 1 mM kalciumklorid (CaCl2), 5,5 mM D (+) glukos, pH 7,4) med 1% BSA och 1 x PBS.
FÖRSIKTIGHET: 2,5% glutaraldehyd: giftig, sensibiliserande, irriterande; Använd i ett dragskåp skåp. 0,1 M natrium cacodylate: giftig, användning i ett dragskåp skåp. 4% PFA: fixativ, användning i rök skåp - Förbered följande material: isofluran, små etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA)-belagda blod rör, 23-25G injektionsnålar, 5 mL EDTA belagda sprutor, 10 mL injektionsflaskor av glas, 10 mL injektionsflaskor av plast, 0,5 mL plaströr, disponibel vävnad mögel, torris, vätska N 2, mus kirurgiska verktyg och optimal skärning medium (ULT).
- Placera musen under djup anestesi, som verifieras av musen att vara icke-lyhörd för en nål prick till foten pad, med en isofluran kammare eller motsvarande vägar av terminal anestesi såsom injicerbara bedövningsmedel (pentobarbital, 50 mg/kg intraperitoneal [IP]; ««««Avertin, 240 mg/kg IP), eller koldioxid (CO2) exponering (75% CO2/25% O2).
- Slakta mus via hjärt punktering till vänster kammare och samla så mycket blod som möjligt. Överföra till EDTA-belagd blodet röret för upp till 4 h. Om program, kan möss slaktas via cervikal dislokation med omsorg för att inte brista halsvenen.
- Dissekera ut njurarna genom buken och tvätta i is kallt 1 x PBS.
- Undersöka de kortikala glomeruli, ta bort en pol av njure cortex och skär i 1 mm3 bitar. För att undersöka de djupt juxta-medullär glomeruli, upprepa samma teknik med vävnad från medulla. Placera i 5 mL 2,5% glutaraldehyd lösning i en injektionsflaska av glas-EM. Förvaras vid 4 ° C.
FÖRSIKTIGHET: 2,5% glutaraldehyd lösning: giftig, sensibiliserande, irriterande; Använd i ett dragskåp skåp
Obs: processen inom 1 månad för bästa resultat. - För histologi, ta bort den övre tredjedelen av en njure, att säkerställa både kortikalt och juxta-medullär glomeruli kommer att närvara, och fix i 5 mL 4% PARAFORMALDEHYD vid 4 ° C under 24 h. överföring till 5 mL 70% EtOH 24 timmar innan inbäddning i paraffin.
FÖRSIKTIGHET: 4% PFA: fixativ, användning i rök skåp - För immunofluorescens, placera en tredje njure, att säkerställa både kortikalt och medullär glomeruli kommer att vara närvarande, in i vävnad mögel och kappa i OCT. plats på torris att frysa och lagra vid-80 ° C.
- För protein och RNA frysa plats 3 x 2 mm3 bitar av njure cortex i 0,5 mL plaströr och snap i vätska N2. Förvaras vid-80 ° C. För långtidsförvaring vävnad för RNA, placera vävnad i 5 volymer av RNA stabilisering lösning och lagra vid-80 ° C.
- För isolering av glomeruli, skära upp den kvarvarande njure vävnaden och placera i 5 mL däggdjur Ringers lösning med 1% BSA på is. Förbered att sikten glomeruli omedelbart.
3. plasma kreatinin
Obs: Plasma kreatinin kan vara uppreglerat i njursjukdom, som visar en minskning filtreringskapacitet av glomeruli. Kväve (BUN) urea i blodet kan också bedömas, även om protokollet inte beskrivs här.
- Centrifugera blodprovet vid 500 x g i 15 minuter vid 4 ° C.
- Samla in plasman, som kan förvaras vid-20 ° C på kort sikt på denna punkt.
- Kvantifiera plasma kreatinin koncentration med en kemisk kreatinin-analys per instruktionerna ovan för urin kreatinin i protokollet 1.11.
- Bestämma kreatinin koncentration varje prov genom att läsa på plattan på en absorbans 490 nm före och efter tillsats av syra lösningen.
Obs: Skillnaden mellan dessa absorptionsvärden är direkt proportionell mot koncentrationen av kreatinin i varje prov. En standardkurva är generation från normerna. Om de tekniska repetitioner har en CV-värde som är större än 5%, upprepa analysen för dessa prover.
4. isolering av Glomeruli
Obs: Glomeruli kan isoleras för att bedöma genomträngligheten av enskilda glomeruli ex vivo, liksom uttrycket av specifika protein och mRNA markörer för glomerulär sjukdom.
- Ta de njure vävnad placeras i däggdjur Ringers lösning med 1% BSA och dissekera de glomeruli använder en standard siktning teknik13. Kort, stack den 70 µm (botten), 100 µm, 125 µm, 175 µm, 250 µm och 425 µm (övre) siktar vidare till en glasbägare.
- Mosa njuren, använder en sprutkolven, in i de 425 µm sikten och driva igenom med is kallt däggdjur Ringers lösning med 1% BSA. Eftersom bitarna av njure skjuts, ta bort den övre sikten och fortsätt att göra samma sak på Nästa. Upprepa tills endast 100 µm och 70 µm siktar kvar.
- Överföra glomerulär skörden av de 100 µm och 70 µm siktar 10 ml av färska däggdjur Ringers lösning med 1% BSA, på is.
Obs: Om antalet glomeruli per mL Ringers lösning är några, minska volymen av Ringers lösning används för att samla glomeruli från de två sista siktarna. - Ta bort 5 mL av lösningen innehållande glomeruli in två separata rören (2,5 mL) och centrifugera vid 1 000 x g under 10 minuter vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten och snapin frysa i glomeruli i vätska N2 före förvaring vid-80 ° C för proteiner och RNA-extraktion vid ett senare tillfälle.
- Placera de återstående lösning innehållande glomeruli i vattenbad vid 37 ° C för mätning av den glomerulära LpA / Vjagex vivo. Slutföra inom 3 h att ta bort njuren.
5. glomerulär vattengenomsläpplighet (LpA / Vjag)
Obs: Den glomerulära LpA / Vjag assay gör ex vivo mätning av permeabiliteten av enskilda glomeruli i ett snabbt ett reproducerbart sätt. En ökning av den glomerulära LpA / Vjag indikerar avbrott i GFB, som är suggestiv för njursjukdom.
- Ställ in den glomerulära LpA / Vjag Rigga som beskrivs i lax et al10. Se figur 1 för ett detaljerat diagram för inrättas.
- Förbered följande lösningar: däggdjur Ringers lösning med 1% BSA (pH 7,4) och däggdjur Ringers lösning med 8% BSA (pH 7,4). Värm båda till 37 ° C.
- Dra Mikropipetter från kapillär glasrör (optisk densitet: 1,2 mm). Generera en 5-8 µm bländare spets genom att skära mikropipett under ett mikroskop.
- Använd den glomerulära LpA / Vjag Rigga för att fånga intakt enskilda glomeruli som är fria från Bowman's kapsel och tubulär fragment på den mikropipett med sug. En detaljerad sammanfattning av oncometric analysen finns i lax et al10. I korthet, när en njure är fångad och säkrade på den sug mikropipett, börja spela in video av urin under mikroskopet.
- För det första, temperera glomeruli i 1% BSA Ringers lösning för 30 s innan du byter perifusate till den koncentrerade 8% BSA Ringers lösning för 10 s. Då växlar perifusate tillbaka till 1% BSA Ringers lösning och stoppa inspelningen.
- Tvätta i glomeruli bort och upprepa processen för 10-15 glomeruli per mus. Säkerställa de perifusate flödena är identiska och inte till snabb (10 mL/min) så att inte snedvrida glomerulär struktur.
- Mäta den ursprungliga satsen av glomerulär krympning att beräkna den glomerulära vattengenomsläpplighet (LpA) normaliserad till glomerulär volymen (Vjag). Detaljerad information om analysen kan hittas i lax et al10.
6. Perjodsyra-Schiff (inte) fläcken
Obs: PAS fläcken kommer att belysa källaren hinnor av glomerulär kapillär loopar och tubulära epitelet. Det möjliggör detaljerad visualisering av den glomerulära celler, systemet matris och potential expansion och potentiella förändringar av GBM (dvs, förtjockning och oegentligheter).
- Avsnitt paraffin-inbäddat, PFA-fasta njure cortex använder en mikrotom med 5 µm tjocklek på poly-L-lysin belagda diabilder. Torr vid 37 ° C under 1 h. Kontrollera att avsnittet inte innehåller några veck eller hål, som kan snedvrida morfologi under mikroskopet.
- Deparaffinize bilder av ruvning två gånger i xylen (försiktighet, irriterande; användning i rök skåp) för varje 3 min, två gånger i 100% EtOH för 3 min varje, och därefter en gång i 95%, 70% och 50% EtOH för 3 min vardera, alla vid rumstemperatur. Återfukta på bilder i dH2O.
- Inkubera bilder i periodisk syra lösningen (försiktighet, irriterande; användning i rök skåp) (1 g/dL) för 5 min och skölj sedan använda bilder i flera förändringar av dH2O. en behållare med 100 mL dH2O vid rumstemperatur.
FÖRSIKTIGHET: Periodisk syra lösningen: irriterande; använda i rök skåp - Odling av objektglas i Schiff's reagens (Parasoaniline HCl 6 g/L och natrium E223 4% i HCl 0,25 mol/L) under 15 minuter vid rumstemperatur. Tvätta objektglas i rinnande vatten i 5 min.
- Motfärg med Hematoxylin för 3 s innan du noggrant sköljer diabilder i rinnande vatten i 15 min.
Obs: Vissa optimering kan krävas för att fastställa den optimala tiden för Hematoxylin färgning. - Torkar ut bilder med hjälp av baksidan av protokollet avparaffinering i steg 6,2. Avsluta med xylen.
- Luften torr diabilder och montera med xylen-baserade montering media.
- Bild på ett ljusmikroskop med 400 X förstoring att bedöma glomerulär strukturer. Utvärdera följande: förtjockning och oegentligheter av GBM, kollapsa av kapillär loopar, fibrotisk vävnad, skleros, cellulär proliferation (endotelceller, podocyte, och systemet eller inflammatoriska celler infiltrerar tofs).
Obs: För en omfattande utvärdering av glomerulär patofysiologi, lesioner på andra håll i njurarna bör utvärderas, exempelvis i tubuli.
7. transmissionselektronmikroskopi (TEM)
Obs: TEM tillåter granskning av Ultra strukturella avvikelser i njurarna, som GBM, podocyte fot processer och endotel fenestrations, som inte syns med ljusmikroskop. Detta är viktigt i modeller där njurskador inte så uttalas (dvs, ingen albuminuri och större strukturella avvikelser).
- Ta 2,5% gluteraldehdye - fast tärnad njuren och efter fixa i 1% osmium vanligtvis för 1 h. Wash i 50 mL 0,1 M cacodylate buffert (pH 7,3) och därefter 50 mL dH2O (3 x 15 min förändringar).
FÖRSIKTIGHET: 2,5% glutaraldehyd: giftig, sensibiliserande, irriterande; Använd i ett dragskåp skåp. 0,1 M natrium cacodylate: giftig, användning i ett dragskåp skåp - Torkar med EtOH och bädda in i Araldite harts.
- Skär sektioner på 50-100 nm tjocklek och fläcken med 3% (vattenlösning) uranyl acetat och Reynolds' bly citratlösningen.
- Överta flera områden av urin på 940 X digital micrographs, 1250 X och 6200 X till den podocytes, GEnCs, GBM och mesangium kan identifieras.
- Använd ImageJ för att analysera de blindade glomeruli. Ställa in skalan för varje 6200 X Mikrograf genom att rita en linje mellan två punkter i uppmätt sträcka, till exempel en linjal. Gå till analysera och sedan ange skala, där längden av linjen visas i bildpunkter. Skriv i kända avstånd och måttenheter. Använda protokollen nedan för mätning av varje parameter.
Obs: Denna analys kräver cirka 1 dag per mus. För adekvat statistisk power, använda de genomsnittliga mätningarna från 3 glomeruli från 3 möss.- För GBM, infoga ett fast digitala rutnät (10 x 10) över de 6200 X Mikrograf och mäta tjockleken på GBM vid den punkt där rutnätets linjer korsar GBM. Mät från basal endothelial cellmembranet till cellmembranet basala podocyte fot processen i en vinkelrät tangerar endothelial cellmembranet med hjälp av verktyget rak linje. Bestämma medelvärdet mätningen för varje glomeruli från 10 individuella mätningar.
- För numret endothelial fenestration, mäta längden på den närvarande i de 6200 X Mikrograf GBM och räkna antalet endothelial fenestrations per längdenhet av GBM. Ta ett genomsnitt från minst 4 micrographs per glomeruli.
- För podocyte fot processen bredd, infoga ett fast digitala rutnät (10 x 10) över de 6200 X Mikrograf. Mät bredden på podocyte fot processerna som korsar rutnätslinjerna. Mäta bredden på den bredaste delen av foten processen där den möter GBM; Se till att linjen är vinkelrät mot tangenten podocyte basal membran. Bestämma medelvärdet mätningen för varje glomeruli från 10 individuella mätningar.
- För podocyte skåra bredd, infoga ett fast digitala rutnät (10 x 10) över de 6200 X Mikrograf. Mät bredden på podocyte slit membranen som korsar rutnätslinjerna. Detta är den punkt där foten processerna är närmaste tillsammans på den bredaste delen av varje fot process, från podocyte membran till membran. Se till att mätningen är vinkelrät mot tangenten podocyte basal membran. Bestämma medelvärdet mätningen för varje glomeruli från 10 individuella mätningar.
- För antalet podocyte fot processer, mäta längden på den närvarande i de 6200 X Mikrograf GBM och räkna antalet podocyte fot processer per längdenhet av GBM. Ta ett genomsnitt från minst 4 micrographs per glomeruli.
- Sub-podocyte utrymme täckning, se detaljerad metod i Neal et al. 14.
- Använder de 940 X micrographs, undersöka glomeruli för förekomst av onormal struktur, insättningar och infiltrat av ögat.
8. immunofluorescens för Podocyte och endotel markörer
Obs: Immunfärgning tillåter visualisering av protein uttrycksmönster, såsom endothelial kapillär loopar, som kan kollapsa vid glomerulär sjukdom.
- Placera OCT-mögel som innehåller frysta njure vid-20 ° C i 2 h före snittning. Säkerställa den skurna ytan av njure är noggrant placerade mot botten av OCT-mögel att aktivera väl orienterad vävnadssnitt.
- Använder en kryostaten, belagd avsnitt vävnad 5 µm tjock vidare till poly-L-lysin diabilder.
Anmärkning: Se till att inga veck eller hål i avsnittet vävnad, som kan snedvrida morfologi. - Efter borttagning från kryostaten, fixa bilder i 4% PFA för 10 min. Tvätta glider 3 x 5 min i en behållare med 100 mL dH2O.
FÖRSIKTIGHET: 4% PFA: fixativ, användning i rök skåp - För att minimera mängden antikroppar används, rita runt sektioner med en hydrofob penna. Låt inte avsnitten torka.
- Inkubera i blockering lösning (3% BSA och 5% normalt serum i 1 x PBS) för 1 h i rumstemperatur.
- Ta bort blockering lösningen med en insugningsventil och inkubera sektioner med primär antikropp (Nephrin, podocin eller PECAM-1) efter utspädning 1: 250 (3% BSA i 1 x PBS). Placera bilder i en fuktig kammare vid 4 ° C över natten. Om en fuktig kammare inte är tillgänglig, lätt att placera en liten remsa av parafilm över antikroppsbelagda bilden. Var försiktig när du tar bort nästa dag att inte störa avsnittet.
- Tvätta diabilder 3 x 5 min i 1 x PBS.
- Inkubera med lämpliga fluorescerande sekundär antikropp utspädning 1: 1000 (3% BSA i 1 x PBS) för 2 h i rumstemperatur i mörkret.
- Tvätta diabilder 3 x 5 min i 1 x PBS. Montera med fluorescerande montering media som innehåller DAPI.
- Bild glider med ett fluorescerande Mikroskop vid 400 X förstoring Visa i glomeruli. Säkerställa detta är förblindad för att undvika bias.
- Användning ImageJ att analysera färgning intensiteten, normaliserade till området glomerulär och mönstret av färgning, dvs, antalet kapillär slingor normaliserade till glomerulär området, på ett sätt som blindad.
9. protein utvinning och Western Blotting
Obs: Western blotting tillåter oss att bedöma de uttryck proteiner kända för att vara dysreglerad i njursjukdom. En minskning av podocin och nephrin uttryck anger till exempel podocyte förlust.
- Extrahera protein från njure cortex och Söll glomeruli; protokollet är detsamma för varje och volymen lyseringsbuffert justeras för den mängd vävnad.
- Tina njure/glomeruli på is innan du lägger till NP-40 lysis buffert (150 mM NaCl, 1% NP-40, 50 mM Tris pH 8) innehållande proteashämmare och fosfatas-hämmare. Homogenisera provet för 30 s.
- Inkubera de homogeniserade proverna på is för 30 min, vortexa med jämna mellanrum.
- Centrifugera proverna vid 10 000 x g i 15 minuter vid 4 ° C.
- Ta bort supernatanten till en färsk röret på is.
Obs: räkna med att återställa cirka 1 mg protein per prov. - Denaturera proteiner med hjälp av standard 4 x Laemmli bufferten. Koka blandningen på 95-100 ° C i 5 min.
- Utvärdera uttryck för glomerulär markör cellproteiner (Nephrin, Podocin, PECAM-1, osv.) och den fosforylering och uttrycket av proteiner kända/hypotesen att ändras i de njure/glomeruli av sjukdom modell använder Western blotting) standardmetod; Mahmood och Yang15).
Obs: Protokollet kommer att variera beroende på storlek och överflöd av proteinet av intresse.
10. RNA-extraktion och polymeraskedjereaktion (PCR)
Obs: mRNA uttryck analys tillåter oss att bestämma hur gener regleras i njursjukdom, såsom förändringar i genuttryck och alternativ splitsning.
- Samtidigt njure cortex är fortfarande frusen, slipa noggrant i 3 mL fenol reagens med en mortelstöt och murbruk. Om du använder glomerulär extrakt, tillsätt 1 mL fenol reagens och Homogenisera provet för 30 s.
FÖRSIKTIGHET: TRIzol reagens: irriterande; använda i rök skåp - Utföra en RNA-extraktion med metoden som beskrevs av Chomczynski och Sacchi16.
Obs: Kommersiella RNA extraktion kit finns som ett alternativ till denna metod. - Bedöma kvantitet och kvalitet av RNA som erhållits med en av de olika metoderna som finns. RNA är aliquoted och lagras vid-80 ° C vid denna punkt. Undvika upprepning frysa upptining.
Obs: Om nya till denna metod, kontrollera kvaliteten på RNA innan du fortsätter till nästa steg genom att köra RNA på en agarosgel att säkerställa en tydlig 28S och 18S ribosomal band. Räkna med att återhämta sig mellan 2 till 5 µg RNA med denna metod. - DNAS behandla 1 µg av RNA (se volym upp till 10 µL med RNase-fritt vatten plus 1 µL DNAS och 1 µL DNAS buffert) för 1 h vid 37 ° C. Stoppa reaktionen med 1 µL DNAS stopp lösning vid 65 ° C i 10 min.
- Tillsätt 0,5 µL av oligo (dT) och slumpmässiga primers. Inkubera vid 70 ° C i 10 min.
- Genast släcka på is för 5 min.
- Lägg till följande; MMLV omvänt transkriptas enzym (400 U; Ersätt med DEPC H2O i RT - kontrollprov), MMLV buffert (1 x), dNTP mix (0,5 mM) och ribonunkleas hämmare (40 U); gör upp till 50 μl DEPC vatten.
- Inkubera reaktionsblandning vid 37 ° C för 1 h följt av 95 ° C i 5 min att avaktivera enzymet.
Obs: För att generera en högre avkastning av cDNA, inkubera vid 37 ° C i upp till 3 h. - Bedöma kvantitet och kvalitet av cDNA använder olika metoder.
- Använd PCR att bedöma de mRNA uttryck och skarvning mönster av gener hypotesen för att vara dysreglerad i glomerulär sjukdom modellen. Protokollet kommer att variera beroende på genen av intresse.
Representative Results
Urin samlades in med hjälp av metabolismburar från vildtyp (WT), inducerbara podocyte-specifika VEGF-A knock-out (VEGF-A KO) och VEGF-A KO X Neph-VEGF165b möss (VEGF-A KO möss som alltför express den humana VEGF-A165b isoformen i podocytes i en konstituerande sätt). Vid mätning av urin albumin kreatinin förhållandet vid vecka 0, 4, 10 och 14 efter doxycyklin induktion av VEGF-A KO utvecklat VEGF-A KO möss progressiva albuminuri av 10 veckor jämfört med WT littermate kontroller. De absoluta värdena kan ses i figur 2Aoch den normaliserade till baslinjen varje mus värdena i figur 2B. Albuminuri i inte observerats i VEGF-A X Neph-VEGF-A165b möss (figur 2), vilket indikerar att VEGF-A165b är dock skyddande i modellen av albuminuri5.
Den glomerulära LpAVjag var mätt i enskilda glomeruli siktas från WT, VEGF-A KO och VEGF-A X Neph-VEGF-A165b njurar. Ett exempel av hur en njure är fångad och krympning iakttas när perifused med 8% BSA visas i figur 3A. Denna krympning används sedan för att bestämma den glomerulära LpA / Vjag för varje glomeruli (figur 3B). VEGF-A KO möss hade en betydligt ökad glomerulär LpA / Vjag på 14 veckor post VEGF-KO induktion jämfört med WT kontroll glomeruli. Även om lägre i VEGF-A X Neph-VEGF-A165b möss, de ökad glomerulär LpA / Vjag var inte hindras av över uttryck av VEGF-A165b vid 14 veckor5.
PAS färgning av njure cortex avsnitt 14 veckor efter induktion av VEGF-A KO visade inte någon glomerulär strukturella avvikelser i VEGF-A KO eller VEGF-A X Neph-VEGF-A165b möss (figur 4A). Dock vid analys av glomerulär ultra-strukturen via EM, VEGF-A KO möss hade utvecklat en ökad GBM bredd, minskat antal endotelceller fenestrae, minskade SPS täckning och ökade genomsnittliga podocyte skåra bredd (figur 4 c-4F ). Genomsnittliga podocyte foten bearbeta bredd och antal slitsar oförändrad (figur 3B och 3 G). Över uttryck av VEGF-A165b i VEGF-A KO möss hindrade ändringarna till GBM och slits bredd (figur 4 c och 4F). VEGF-A165b hade dock ingen effekt på förändrade fenestrae antal och SPS täckning (figur 4 d och 4E)5.
RT-PCR utförs på RNA extraherade från Söll glomeruli avslöjade att den humana VEGF-A165b mRNA finns endast i VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165b möss (figur 5A). När utvinna protein från Söll glomeruli och bedöma nivåerna av proteiner via Western blotting, befanns glomerulär proteinuttryck för VEGFR-2 vara minskade i VEGF-A KO möss, som hindrades av över uttryck av VEGF-A165b ( Figur 5B och 5 C)5.
Figur 1. Schematisk uppsättning upp glomerulär permeabilitet (LpA) riggen. (A) glomeruli är fångad på (B) mikropipett inom en hållare med sug, som spänns fast på ett fäste för stabilitet. (C) rektangulära microslide. (D) 4 X-objektiv av ett Mikroskop med en videokamera. (E) 1% BSA lösning värmas till 37 ° C. (F) 8% BSA lösning värmas till 37 ° C. (G) Remote tryck uthärda två perifusate-innehållande linjer, som tillåter snabb perifusate exchange. (H) rutten av perifusate mot den microslide, som sedan badar i glomeruli. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Urin-albumin kreatininclearance baserat. (A) uACR värdena vid vecka 0, 4, 10 och 14 efter induktion av VEGF-A KO i WT, VEGF-A KO och VEGF-A X Neph-VEGF-A165b möss. (B) samma uACR värden normaliseras till utgångsvärdet (vecka 0) av varje enskild mus. UACR ökat betydligt i VEGF-A KO möss vid vecka 10 och 14 jämfört med WT littermate kontroller, som förhindrades i VEGF-A X Neph-VEGF-A165b möss (* p < 0,05; Tvåvägs ANOVA, korrigering för jämförelse mellan paren; n = 4-12 möss per tidpunkt; felstaplar: standard standardfel [SEM]). Denna siffra har ändrats från Stevens et al5. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Mätning av glomerulär vattengenomsläpplighet. (A) i glomeruli är fångad på mikropipett via sug; perifusate slås från 1% BSA (Ai) till 8% BSA (Aii) och glomerulär krympning observeras. (B) mätningar före och efter 8% BSA switch används för att bestämma den glomerulära LpA / Vjag. (C) VEGF-A KO möss utvecklar en ökad glomerulär LpA / Vjag på 14 veckor post induktion av VEGF-A KO jämfört med WT kontroller. Detta hindrades inte signifikant i VEGF-A X Neph-VEGF-A165b möss (* p < 0,05; Envägs ANOVA, Bonferroni korrigering för jämförelse mellan paren; n = 4-9 möss, 15-30 glomeruli; felstaplar: SEM). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Glomerulär strukturell analys. (A) PAS färgning av njure cortex indikerade inte några strukturella avvikelser i glomeruli från WT, VEGF-A KO och VEGF-A X Neph-VEGF-A165b möss (Ai - iii). EM avslöjade Ultra strukturella avvikelser i de VEGF-A KO glomeruli (Aiv - vi). (B) den genomsnittliga FPW förändrades inte mellan grupperna. (C) The GBM ökade i de VEGF-A KO glomeruli, som förhindrades av VEGF-A165b. (D) antalet fenestrae minskade i VEGF-A KO glomeruli, som förblev oförändrat av VEGF-A165b. (E) The SPS täckning var minskade i VEGF-A KO glomeruli, som också varit oförändrat av VEGF-A165b. (F) den genomsnittliga skåra bredd ökades i VEGF-A KO glomeruli, som förhindrades av VEGF-A165b. (G) antalet slit var oförändrad mellan de tre grupperna (* p < 0,05; Envägs ANOVA, Bonferroni korrigering för jämförelse mellan paren; n = 3 möss, 9 glomeruli; felstaplar: SEM). Denna siffra har ändrats från Stevens et al5. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. mRNA och protein uttryck för markörer. (A) RT-PCR visade att humana VEGF-A165b mRNA uttryck endast var tydligt i de Söll glomeruli från VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165b möss. (B) Western blotting anges att VEGFR-2 proteinuttryck var ned-reglerade i VEGF-A KO glomeruli, som hindrades i VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165b glomeruli (* p < 0,05; Envägs ANOVA, Bonferroni korrigering för jämförelse mellan paren; n = 3 - 6 möss; felstaplar: SEM). Denna siffra har ändrats från Stevens et al5. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Det här protokollet beskriver en full njure arbete-up som bör utföras i musmodeller av glomerulär sjukdom, möjliggör en stor mängd information om njur- och glomerulär funktion som kan uppnås genom ett enda musklick. De kritiska steg i varje metod möjliggör detaljerad funktionella, strukturella och mekanistiska analys av glomerulär funktion, inklusive bedömning av permeabiliteten i njurarna som helhet (uACR och plasma kreatinin mätningar), permeabiliteten i enskilda glomeruli (glomerulär LpA / Vjag), undersökning av strukturella förändringar (PAS, Trichrome blå och EM), protein lokalisering (om), och glomerulär genuttryck (RT-PCR och Western blotting). Dessa metoder är nyckeln till den fullständiga utvärderingen av glomerulär funktion i musmodeller av njursjukdom.
Vid bedömningen av permeabiliteten i GFB, har många studier valt för att använda den konventionella uACR eller 24 h albumin utsöndring kursen som en effektiv åtgärd17,18. Även om dessa tekniker tillåter bedömning av GFB permeabilitet som helhet, tillåter det inte för enskilda glomerulär permeabilitet bedömning och variation bland glomeruli. Tidigare studier har hittat mätning av den glomerulära LpA / Vi att vara ett känsligare mått på förändringar till GFB permeabilitet5,9. Faktiskt, i de representativa resultat visat i detta papper, på 14 veckor post induktion av VEGF-A KO, VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165b möss har en betydligt lägre uACR jämfört med VEGF-A KO möss; men detta resultat inte återspeglas i den glomerulära LpA / Vjag mätningar, där VEGF-A165b betydligt inte hindrade ökar i GFB permeabilitet (figur 1 och figur 2)5. Detta visar vikten av att använda flera analyser för att bedöma både njure permeabilitet och genomträngligheten av enskilda glomeruli. Dessutom den glomerulära LpA / Vjag oncometric analysen antyder att permeabiliteten av enskilda glomeruli från samma njuren kan variera kraftigt, särskilt i sjukdom modeller5,10, 19. en begränsning till mätning av glomerulär LpA / Vjag är att den endast kan utföras på experimentell slutpunkten; regelbundna uACR mätningar måste således ge en indikation av experimentella slutpunkten.
Förutom att bedöma funktionella fenotypen, uppmuntrar denna metod också bedömning av strukturella och ultrastrukturella fenotypen. Detta kan göras med hjälp av ett urval av fläckar som PAS, trikrom, och silver fläckar; var och en att bedöma olika aspekter av glomerulär morfologi. I akut modeller av glomerulär sjukdom, som ofta är fallet i musmodeller, kan vara svårt att upptäcka eventuella stora strukturella avvikelser med dessa fläckar om du är en utbildad nedsatt patolog. Därför föreslås genomför EM för att bedöma ultrastruktur av den GFB, som tillåter kvantitativ mätning av parametrar såsom GBM, endothelial fenestrae storlek och antal och podocyte egenskaper. Sådana mätningar kräver minimal utbildning för att utföra och gör utredaren att avgöra de cell-typer/strukturer påverkas i en sjukdom modell. I exemplet som visas i de representativa resultat, VEGF-A KO musen konstaterades vara en mild modell av glomerulär sjukdom, således var inga stora strukturella avvikelser närvarande vid PAS färgning. Dock inducerade podocyte-specifika VEGF-A KO förändringar till GBM, podocytes och endotelceller vid prövningen av den glomerulära ultra-struktur5. Utarbetandet av njuren för EM som beskrivs i denna metod kan tyvärr inte upptäckt av den endothelial glykokalyx, som också är känd att ha betydande effekter på permeabilitet av GFB19. För att noggrant mäta glykokalyx djupet, bör njurarna BEGJUTA-fast med 2,5% glutaraldehyd med 1% Alcian blå endothelial glykokalyx märkning, som beskrivs i Nicolae Oltean et al19.
När den funktionella och strukturella fenotypen har bedömts, kan uttryck/aktivering mönster av olika gener och vägar då bedömas särskilt i glomeruli. Ultra strukturella förhandsbedömning kan ge viss information om cellen typer/glomerulär strukturer involverade, som anger om podocyte - eller endotel-specifika gener/vägar bör undersökas. Exempelvis i representativa resultat från VEGF-A KO möss observerades en minskning av antalet endothelial fenestrae (figur 3D); Därför undersöktes glomerulär proteinuttryck för en endothelial markör kända för att vara involverade i VEGF-A väg; VEGFR-2 (figur 4B)5. Förutom att uttrycket av proteiner i glomeruli, kan deras localization också visualiseras med om. I en studie av Zhang et al20bekräftades podocyte-specifika överuttryck av GLUT1 i podocytes av om samtidig lokalisera den ökade GLUT1 med podocin.
I jämförelse med alternativa metoder som presenteras i litteraturen att bedöma glomerulär funktion, ger användningen av den metod som anges i detta dokument att bedöma njurfunktion i musmodeller av glomerulär sjukdom den glomerulära fenotypen utvärderas helt från flera aspekter. Genom att använda denna metod är forskaren kunna avgöra njure fenotypen av modellen och bedöma mekanismen om varför fenotypen utvecklar. Denna viktiga information på mekanismen av sjukdom krävs när man undersöker potentiella terapeutiska vägar i dessa modeller. Metoden kan enkelt tillämpas på framtida utredningar av glomerulär funktion både i bedömningen av sjukdom fenotyper och potentiella therapeutics.
Avslutningsvis beskriver detta generiska och anpassningsbar protokollet en full njure arbete upp för musmodeller av glomerulär sjukdom, möjliggör en stor mängd information om njur- och glomerulär funktion som kan uppnås genom ett enda musklick. Metoderna som möjliggör detaljerad funktionella, strukturella och mekanistiska analys av glomerulär funktion, som kan tillämpas på alla musmodeller av glomerulär sjukdom.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av stiftelsen brittiska hjärtat, Richard Bright VEGF forskning lita och MRC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Metabolic Cages | Harvard Apparatus | 52-6731 | |
| Tris buffered saline (10x) | Sigma-Aldrich | T5912-1L | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| Mouse Albumin ELISA Quantitation Set | Bethyl Laboratories | E90-134 | |
| TMB ELISA Substrate solution | ThermoFisher Scientific | 34028 | |
| Sulphuric acid | Sigma-Aldrich | 339741 | |
| SPECTRstar nano | BMG Labtech | SPECTRstar nano or equivalent | |
| RNAlater stabilisation solution | ThermoFisher Scientific | AM7020 | |
| 4-15% precast protein gel | BIORAD | 4568084 | |
| 4x Laaemmli Sample buffer | BIORAD | 161-0747 | |
| Mini Trans-Blot cell | BIORAD | 1703930 | |
| 10x Tris running buffer | BIORAD | 1610732 | |
| Coomassie Brilliant Blue Dye | ThermoFisher Scientific | 20278 | |
| Creatinine Companion | Exocell | 1012 Strip Plate | |
| Glutaraldehyde Solution | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Sodium Cacodylate | Sigma-Aldrich | C0250 | |
| 10x Phosphate Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | AM9625 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| Sodium Phosphate | Sigma-Aldrich | 342483 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M2643 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| D(+)Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| EDTA Blood Collection tubes | BD | 367835 | |
| 23-25G Needle | BD | PMC0735 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| 10 ml Glass Vial | Thomas Scientific | 0914X10 | |
| Falcon 10 ml Polypropylene Tubes | ThermoFisher Scientific | 10110101 | |
| 0.5 ml Tubes | ThermoFisher Scientific | 10681894 | |
| Disposable Tissue Molds | ThermoFisher Scientific | 22-363-553 | |
| Mouse Surgical Disection Kit | ThermoFisher Scientific | 13-005-204 | |
| Optimal Cutting Medium | ThermoFisher Scientific | 23-730-571 | |
| 4% Paraformaldehyde | ThermoFisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| Glass Capillary Tubes | Harvard Apparatus | EC1 64-0770 | |
| Glomerular Permeability Rig | Built at the Univeristy of Bristol - not comercially available | Citation of LpA rig: Salmon et al. 2006; J. Physiol | |
| Stainless Steel Sieves | Cole-Parmer | WZ-59984 | |
| Periodic Acid-Schiff (PAS) Staining System | Sigma-Aldrich | 395B-1KT | |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H3136 | |
| Xylene | MerckMillipore | 108298 | |
| Poly-Prep Slides | Sigma-Aldrich | P0425-72EA | |
| Mounting Medium | ThermoFisher Scientific | 8030 | |
| Osmium tetroxide solution | Sigma-Aldrich | 75632 | |
| Aradite Resin | Agar Scientific | CY212 | |
| Uranyl Acetate | Agar Scientific | AGR1260A | |
| Lead Citrate | Agar Scientific | AGR1210 | |
| Cryostat | ThermoFisher Scientific | e.g. 957000H | |
| Hydrophobic Pen | Abcam | ab2601 | |
| Nephrin (1243-1256) Antibody | Acris | BP5030 | |
| Anti-Podocin | Sigma-Aldrich | P0372-200UL | |
| Anti-CD31 | BD Biosciences | 550274 | |
| Alexa Fluor Secondary Antibody | ThermoFisher Scientific | A32732 | |
| Vectashield Mounting Medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| NP40 Cell Lysis Buffer | ThermoFisher Scientific | FNN0021 | |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail | ThermoFisher Scientific | 78437X4 | |
| 10x Transfer Buffer | BIORAD | 1610734 | |
| PVDF Membrane | ThermoFisher Scientific | LC2002 | |
| HRP-Conjugated Secondary Antibodies | Abcam | ab6721 | |
| ECF Substrate for Western Blotting | Fisher | 10713387 | |
| TRIzol | ThermoFisher Scientific | 15596018 | |
| Dnase I | New England Biolabs | M0303S | |
| M-MLV Reverse Transcriptase | New England Biolabs | M053S | |
| Oligo dT | ThermoFisher Scientific | 18418012 | |
| Random Primers | ThermoFisher Scientific | 48190011 | |
| dNTP | ThermoFisher Scientific | 18427088 | |
| Ribonuclease Inhibitor | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
| DEPC Water | ThermoFisher Scientific | AM9915G | |
| Fluorescent Light Miscroscope | Leica Microsystems | ||
| Image J Analysis Software | Image J | ||
| PCR Thermocycler | ThermoFisher Scientific | ||
| TEM Microscope | Britannica |
References
- Humtstrom, M. Development of structural kidney damage in spontaneously hypertensive rats. Journal of Hypertension. 30 (6), 1087-1091 (2012).
- Kitada, M., Ogura, Y., Koya, D. Rodent models of diabetic nephropathy: their utility and limitations. International Journal of Nephrology and Renovascular Disease. 14 (9), 279-290 (2016).
- Tesch, G. H., Lim, A. K. Recent insights into diabetic renal injury form the db/db mouse model of type 2 diabetic nephropathy. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 300 (2), F301-F310 (2011).
- Fogo, A. B. Animal models of FSGS: lessons for pathogenesis and treatment. Seminars in Nephrology. 23 (2), 161-171 (2003).
- Stevens, M., et al. VEGF-A165b protects against proteinuria in a mouse model with progressive depletion of all endogenous VEGF-A splice isoforms from the kidney. Journal of Physiology. 595 (19), 6281-6298 (2017).
- Cosgrove, D., Kalluri, R., Miner, J. H., Segal, Y., Borza, D. B. Choosing a mouse model to study the molecular pathobiology of Alport glomerulonephritis. Kindey International. 71 (7), 615-618 (2007).
- Kujal, P., Vernerova, Z. 5/6 nephrectomy as an experimental model of chronic renal failure and adaptation to reduced nephron number. Ceskoslenska Fysiologuie. 57 (4), 104-109 (2008).
- Chevalier, R. L., Forbes, M. S., Thornhill, B. A. Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy. Kidney International. 75 (11), 1145-1152 (2009).
- Oltean, S., et al. VEGF165b overexpression restores normal glomerular water permeability in VEGF164-overexpressing adult mice. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 303 (7), F1026-F1036 (2012).
- Salmon, A. H., Neal, C. R., Bates, D. O., Harper, S. J. Vascular endothelial growth factor increases the ultrafiltration coefficient in isolated intact Wistar rat glomeruli. Journal of Physiology. 570 (Pt 1), 141-156 (2006).
- Zheng, F., Striker, G. E., Esposito, C., Lupia, E., Striker, L. J. Strain differences rather than hyperglycemia determine the severity of glomerulosclerosis in mice. Kidney International. 54 (6), 1999-2007 (1998).
- Betz, B., Conway, B. R. An update on the use of animal models in diabetic nephropathy research. Current Diabetes Reports. 16 (18), (2016).
- Savin, V. J., Terreros, D. A. Filtration in single isolated mammalian glomeruli. Kidney International. 20 (2), 188-197 (1981).
- Neal, C. R., Crook, H., Bell, E., Harper, S. J., Bates, D. O. Three-dimensional reconstruction of glomeruli by electron microscopy reveals a distinct restrictive urinary subpodocyte space. Journal of the American Society of Nephrology. 16 (5), 1223-1235 (2005).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medicine & Science. 4 (9), 429-434 (2012).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry. 162 (1), 156-159 (1987).
- Adembri, C., et al. Sepsis induces albuminuria and alterations in the glomerular filtration barrier: a morphofunctional study in the rat. Critical Care. 15 (6), R277 (2011).
- Ma, S. T., Liu, D. L., Deng, J. J., Niu, R., Liu, R. B. Effect of arctiin on glomerular filtration barrier damage in STZ-induced diabetic nephropathy rats. Phytotherapy Research. 27 (10), 1474-1480 (2013).
- Oltean, S., et al. Vascular endothelial growth factor-A165b is protective and restores endothelial glycocalyx in diabetic nephropathy. Journal of the American Society of Nephrology. 26 (8), 1889-1904 (2015).
- Zhang, H., et al. Podocyte-specific overexpression of GLUT1 surprisingly reduces mesangial matric expansion in diabetic nephropathy in mice. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 299 (1), F91-F98 (2010).
