Summary
ويصف هذا البروتوكول عمل الكلي كامل حتى التي ينبغي الاضطلاع بها في نماذج الماوس من المرض الكبيبي. الأساليب التي يسمح بإجراء تحليل الوظيفية والهيكلية والميكانيكية مفصلة وظيفة الكبيبي، والتي يمكن تطبيقها على جميع نماذج الماوس من المرض الكبيبي.
Abstract
استخدام نماذج مورين لتقليد أمراض الكلي البشرية أصبحت شائعة بشكل متزايد. لدينا أبحاث تركز على تقييم الدالة الكبيبي في حدوث السكري والفئران المغلوب فيجف-أ بودوسيتي على حدة؛ ولذلك، يصف هذا البروتوكول يصل العمل الكلي الكامل المستخدمة في لدينا مختبر لتقييم هذه النماذج الماوس من المرض الكبيبي، تمكين كمية هائلة من المعلومات المتعلقة بالكلى ودالة الكبيبي يمكن الحصول عليها من ماوس واحدة. بالمقارنة مع طرق بديلة عرضت في الأدب لتقييم دالة الكبيبي، يمكن استخدام الطريقة المبينة في هذه الورقة النمط الظاهري الكبيبي تقييمه بشكل كامل من جوانب متعددة. باستخدام هذا الأسلوب، يمكن تحديد النمط الظاهري الكلي للنموذج الباحث وتقييم الآلية بشأن لماذا يتطور النمط الظاهري. هذه المعلومات الحيوية عن الآلية المرض مطلوب عند دراسة السبل العلاجية المحتملة في هذه النماذج. الأساليب تسمح بتقييم وظيفي مفصل للحاجز الترشيح الكبيبي عن طريق قياس نسبة كرياتينين الزلال البولي ونفاذيه المياه الكبيبي الفردية، فضلا عن دراسة هيكلية وهيكلية فائقة استخدام "حمض الدوري شيف" وصمة عار والمجهر الإلكتروني. وعلاوة على ذلك، يتيح تحليل dysregulated الجينات على مستوى البروتين ومرناً آليا إلى تحليل وظيفة الكبيبي. هذا البروتوكول يحدد أساليب عامة ولكن قابلة للتكيف التي يمكن تطبيقها على جميع نماذج الماوس من المرض الكبيبي.
Introduction
استخدام نماذج مورين لتقليد أمراض الكلي البشرية أصبحت شائعة بشكل متزايد. وتشمل هذه النماذج مورين نماذج عفوية مثل تلقائياً ارتفاع ضغط الدم الفئران (باستفاض)1، بالستريبتوزوتوسين (STZ)-التي يسببها السكري الجرذان والفئران2، واكتب db/db الثاني الفئران السكري3، نماذج المهندسة وراثيا مثل النماذج الأولية الخاصة بودوسيتي التنسيق القطاعي الكبيبي التصلب (FSGS)4، خاصة بودوسيتي الأوعية الدموية غشائي عامل النمو (فيجف-A) المغلوب (فيجفا كو) نموذج5، وألبرت متلازمة نماذج6، واكتسبت نموذج نماذج مثل استئصال 5/67 وانسداد الحالب الانفرادية (أو)8. وبغية تقييم الجوانب المختلفة للدالة الكبيبي في هذه النماذج، تتوفر عدة تقنيات. والغرض من هذه الورقة الأسلوب هو إثبات شاملة عمل أعلى التي يجب تنفيذها في نماذج الماوس لأمراض الكلي من أجل إجراء تقييم كامل للدالة الكبيبي.
الأساس المنطقي لاستخدام هذا الأسلوب أنه يتيح النمط الظاهري الكبيبي تقييمه بشكل كامل من جوانب متعددة. وهذا يشمل تقييم نفاذية الكبيبي، سواء للبروتين والماء، والتشوهات الهيكلية الكبيبي، والتغييرات في التعبير/الربط مرناس والبروتينات ضروري لوظيفة الكبيبي طبيعية. باستخدام هذا الأسلوب، الباحث قادراً على تحديد النمط الظاهري الكلي للنموذج وتقييم الآلية بشأن لماذا يتطور النمط الظاهري. هذه هي معلومات حيوية عن الآلية للمرض، ومطلوب عند دراسة السبل العلاجية المحتملة في هذه النماذج.
في الأدب، هو شائع لتقديمها مع نموذج الفأر من المرض الكبيبي حيث يتم تحديد النمط الظاهري بزيادة مستوى الزلال في البول. ومع ذلك، هناك أدلة على أن أسلوب واحد لتحديد دالة الكبيبي ليست دائماً فعالة؛ قياس معدل إفراز الزلال البولي أو نسبة كرياتينين الزلال البولي (أواكر) فقط يوفر معلومات عن الدالة المجموع الكلي، وليس من جلوميرولي الفردية. وقد أثبتت الدراسات السابقة أن النفاذية يمكن أن تختلف في جلوميرولي مختلفة من نفس الكلي5،،من910. وبالإضافة إلى ذلك، يتم تقييم نفاذية glomeruli الفردية بطريقة أكثر حساسية لتقييم دالة الكبيبي؛ تقنية قياس نفاذية المياه الكبيبي الفردية (LpA/Vأنا) قد أظهرت أن تكون أكثر حساسية للتغيرات في وظيفة الكبيبي من قياس أواكر9. هذا التحليل مفيد في نماذج الماوس التي تقاوم بروتينية، مثل تلك المتعلقة خلفية c57BL/611. وميزة هذه الورقة الأسلوب أن يفحص نفاذية الكلي الإجمالي للزلال فضلا عن نفاذية الكبيبي الفردية للمياه.
غالباً ما يتم تقييم دراسة التشوهات الهيكلية الكبيبي ببطارية من البقع مثل حمض الدوري Schiff (PAS)، تريتشرومي، والبقع الفضية. وهي تمكن أخصائي الكلي مدربين لتقييم مستوى مرض الكلي عن طريق أسلوب التهديف. على الرغم من أن جميع طرق جيدة، تغييرات على الهيكل الكلي الكبيبي لا تحترم دائماً في نماذج كلوي حاد إصابة12. وتقترح هذه الطريقة أن الترا الكبيبي-الهيكل ينبغي أيضا تقييم بالإضافة إلى اضطلاعها بالانسجة الكلوية التقنيات الموضحة أعلاه، عن طريق الميكروسكوب الإلكتروني (م). الكبيبة الملون يمكن أن تبدو طبيعية نسبيا تحت مجهر خفيفة عادية؛ ومع ذلك، عند تقييم مع م، التغييرات الصغيرة في عرض الغشاء الكبيبي (GBM)، بودوسيتي القدم عملية عفو، فينيستريشنز بطانية، وتغطية مساحة بودوسيتي الفرعية يتم تحليل. ولذلك، من المهم أن الكبيبي الترا-الهيكل والبنية الصغرى هو تقييم لتحديد إليه الخلل الوظيفي الكبيبي.
وبالإضافة إلى تقييم التشوهات الهيكلية الكبيبي، ينبغي دراسة التغيرات في مرناً والتعبير البروتين والربط، فضلا عن تنشيط البروتين (مثلاً، الفسفرة)، لتوضيح آليات المرض الكبيبي. عندما ننظر إلى المرض الكبيبي، أو، على سبيل المثال، عندما كو/عبر-expressing جينات على وجه التحديد في الخلايا الكبيبي، مثلما حدث في بودوسيتي الخاصة "فيجفا كو" الماوس5، من المهم أن يتم فحص التغييرات البروتين ومرناً فقط داخل الخلايا الكبيبي، وليس كله الكلي. ويصف هذا البروتوكول وسيلة التي glomeruli أنها معزولة من قشرة الكلي الماوس، ومن ثم يتم عزل البروتين/الجيش الملكي النيبالي. يسمح هذا التحليل محددة من التقلبات البروتين/مرناً في جلوميرولي طراز المرض.
ويصف هذا البروتوكول عمل الكلي كامل متابعة التي ينبغي الاضطلاع بها في نماذج الماوس من المرض الكبيبي، تمكين كمية هائلة من المعلومات المتعلقة بالكلى ودالة الكبيبي يمكن الحصول عليها من ماوس واحدة. الأساليب التي يسمح بإجراء تحليل الوظيفية والهيكلية والميكانيكية مفصلة وظيفة الكبيبي، والتي يمكن تطبيقها على جميع نماذج الماوس من المرض الكبيبي.
Protocol
أجريت جميع التجارب وفقا لتشريعات المملكة المتحدة وموافقة اللجنة الأخلاقية المحلية. ووافقت جامعة "بريستول لجنة أخلاقيات البحوث" الدراسات الحيوانية.
1-البولي "نسبة كرياتينين" الزلال (أواكر)
ملاحظة: يتم استخدام أواكر تقييم نفاذية جفب للزلال. ويشير إلى وجود الزلال في البول زيادة نفاذية عبر جفب، الذي هو تطبيع إلى كرياتينين لمراقبة التغيرات في معدل تدفق البول. بيله علامة شائعة لأمراض الكلي المزمنة.
- جمع البول في الأساس التجريبي وعلى فترات منتظمة (مرة واحدة أسبوعيا لمرة واحدة شهريا) حتى نقطة النهاية التجريبية.
- إعداد الماوس أقفاص الأيضية مع النظام الغذائي في المياه وتخصيب اليورانيوم. ضع الفئران (الذكور، الذين تتراوح أعمارهم بين 6-8 أسابيع) في أقفاص فردية ح 6 في غرفة هادئة.
- العودة من الفئران للمساكن العادية وجمع البول من أقفاص فارغة. مطلوب على الأقل 50 ميليلتر.
ملاحظة: إذا كان الماوس لا تنتج البول في وقت معين، كرر في يوم آخر في غرفة أكثر دفئا. - الطرد المركزي البول في ز 500 x لأدنى 10 جمع البول واستبقاء الرواسب لتقييم خسائر بودوسيتي. وعند هذه النقطة بتخزين البول في-20 درجة مئوية في الأجل القصير.
- تمييع البول في ألبومين المصل البقري 1% (BSA) في 1 x Tris مخزنة المالحة (TBS الرقم الهيدروجيني 7.5) في 1: 500 لتمييع 1:10000، اعتماداً على شدة بيله.
ملاحظة: يجب أن يكون حجم نهاية > 400 ميليلتر. النقطة الأمثل لتحديد تمييع الحق في كل وقت. - قياس تركيز الزلال البولي باستخدام ماوس الزلال إنزيم الممتز مرتبط مقايسة (أليسا) لإرشادات الشركة المصنعة.
- بإيجاز، معطف لوحة أليسا، الذي هو الأمثل للبروتين ملزمة، مع 100 ميليلتر من جسم الزلال الماوس المضادة الأولية (10 ميكروغرام/مل في 0.5 م كربونات بيكربونات pH 9.6) ح 1 في درجة حرارة الغرفة.
- أغسل جسم الزائد من الآبار خمس مرات مع 1 x TBS بالإضافة إلى 0.05% توين (pH 8.0)، وإضافة 200 ميليلتر من عرقلة الحل (x TBS 1 مع 1% جيش صرب البوسنة pH 8.0) بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
- أغسل لوحة خمس مرات وإضافة 100 ميليلتر من المعايير (تمييع المسلسل: 2000 ميكروغرام/مل إلى 15.63 ميكروغرام/مل في x TBS 1 مع 1% جيش صرب البوسنة، pH 8.0)، الفارغة، وعينات المخفف في ثلاث نسخ. ترك ح 1 في درجة حرارة الغرفة ثم يغسل صفيحة خمس مرات.
- إضافة 100 ميليلتر من برنامج الصحة الإنجابية الكشف عن الأجسام المضادة لكل بئر (10 نانوغرام/مل في 1xTBS مع 1% جيش صرب البوسنة، pH 8.0) واحتضان في درجة حرارة الغرفة ح 1.
- أغسل اللوحة خمس مرات وإضافة 100 ميليلتر من إنزيم الركازة الحل لكل بئر. اترك اللوحة في الظلام لوضع لمدة 15 دقيقة، ووقف رد الفعل بإضافة 100 ميليلتر من حامض الكبريتيك 0.18 متر (ح2هكذا4).
تنبيه: ح2حتى4 التآكل.
- تحديد تركيز الزلال كل عينة عن طريق قراءة اللوحة في امتصاص 450 نانومتر. استخدام المنحنى القياسي لقياس الزلال موجودة في كل عينة. إذا كان يكرر التقنية السيرة ذاتية قيمة أكبر من 5%، كرر التحليل تلك العينات.
- وبدلاً من ذلك، تقييم تركيز الزلال البولي باستخدام التفريد. إضافة 5 ميليلتر من 4 × البروتين عينة تحميل المخزن المؤقت إلى 15 ميليلتر من البول. الحرارة عينات إلى 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ثم قم بتحميل إلى هلام تريس الجاهزة 4-12%.
- تشغيل الهلام في 100 الخامس ووصمة عار بين عشية وضحاها في أخذ اللون الأزرق للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
- وبعد التصوير الهلام، استخدام قياس كثافة لتقييم إضعاف تركيز الزلال التغيير بالنسبة لعنصر التحكم.
ملاحظة: في حالة ملاحظة لا فرق بالنسبة للزلال عندما يتوقع، تقييم تركيز البروتين البول وضبط حجم البول إضافة إلى الهلام.
- تمييع عينة البول الخام في dH2س في 1:1 و 1:5 و 01:10.
ملاحظة: يجب أن يكون حجم نهاية > 70 ميليلتر. الأمثل لتحديد تمييع الحق لكل عينة. - قياس تركيز كرياتينين البول استخدام تحليل كيميائية كل مجموعة التعليمات. بإيجاز، تحميل 20 ميليلتر كرياتينين البول فارغة، أو تضعف المعايير، لوح جيدا 96 في ثلاث نسخ.
- تحديد تركيز كرياتينين لكل عينة بقراءة اللوحة في امتصاص 490 نانومتر قبل وبعد إضافة الحل حمض (تنبيه، أكالة؛ تجنب ملامسة الجلد).
ملاحظة: الفرق بين القيم امتصاص طرديا مع تركيز كرياتينين في كل عينة. منحنى قياسي جيل من المعايير. إذا كان يكرر التقنية السيرة ذاتية قيمة أكبر من 5%، كرر التحليل تلك العينات. - إنشاء أواكر (ميكروغرام/mg). تطبيع البيانات إلى قيمة الأساس لكل الماوس لتمثيل رسومي.
2-الأنسجة وجمع الدم
ملاحظة: الكلي والأنسجة الكبيبي يمكن أن تستخدم لتقييم علامات التعبير البروتين والهيكلية، ومرناً لأمراض الكلي. يمكن استخدام الدم لتقييم علامات لوظيفة الكلي، مثل كرياتينين، التي يمكن تنظيمها حتى في أمراض الكلي، مما يشير إلى انخفاض في قدرة الترشيح glomeruli.
- إعداد الحلول التالية: الطازجة 2.5 ٪ glutaraldehyde في بارافورمالدهيد 4% في 1 × الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، الحل في المسابقة الثدييات (115 مم كلوريد الصوديوم (NaCl)، خلات الصوديوم 10 ملم (CH3كونا) و 1.2 م 0.1 الصوديوم كاكوديلاتي (7.3 درجة الحموضة)، مم فوسفات الصوديوم (Na2هبو4)، بيكربونات الصوديوم 25 مم (ناكو3)، سلفات المغنيزيوم 1.2 مم (مجسو4)، كلوريد الكالسيوم 1 مم (كاكل2)، الجلوكوز د (+) 5.5 مم، الرقم الهيدروجيني 7.4) مع جيش صرب البوسنة 1%، و 1 x PBS.
تنبيه: 2.5 ٪ glutaraldehyde: السامة، محسس، مهيجة؛ استخدم في خزانة الأبخرة. 0.1 كاكوديلاتي الصوديوم M: استخدام في خزانة الأبخرة السامة. 4% منهاج عمل بيجين: مثبت، الاستخدام في مجلس الوزراء الدخان - إعداد المواد التالية: إيسوفلوراني، حمض الإيثيلين الصغيرة (يدتا)-مغلفة بأنابيب الدم، إبر ز 23-25، 5 مل يدتا مغلفة الحقن، قنينات زجاج 10 مل، 10 مل قارورة من البلاستيك، أنابيب بلاستيكية 0.5 مل، قوالب الأنسجة المتاح، الثلج الجاف، السائل ن 2، الماوس الأدوات الجراحية، وقطع الأمثل المتوسطة (OCT).
- ضع الماوس تحت التخدير العميق، الذي يمكن التحقق منه بالماوس ويجري غير المستجيبة لوخزة إبرة إلى لوح سيرا على الأقدام، باستخدام دائرة isoflurane، أو ما يعادل طرق التخدير الطرفي مثل وكلاء مخدر عن طريق الحقن (بينتوباربيتال، 50 مغ/كغ داخل [IP]؛ أفيرتين، IP 240 ملغ/كغ)، أو التعرض لغاز ثاني أكسيد الكربون (CO2) (75% CO2%25 س2).
- إعدام الماوس عبر ثقب القلب في البطين الأيسر وجمع الدم قدر الإمكان. نقل إلى أنبوب الدم يدتا المغلفة لما يصل إلى 4 س. إذا فضلت, يمكن أعدمت الفئران عن طريق خلع عنق الرحم مع الحرص على عدم تمزق حبل الوريد.
- تشريح الخروج الكلي عن طريق البطن والمياه والصرف الصحي في برنامج تلفزيوني x 1 الباردة الجليد.
- دراسة جلوميرولي القشرية وإزالة القطب واحد من قشرة الكلي وإلى قطع3 1 مم. دراسة glomeruli العميقة المجاورة النخاع، كرر نفس الأسلوب مع الأنسجة من لب. ضع 5 مل من 2.5 ٪ glutaraldehyde الحل في قنينة زجاج م. مخزن في 4 درجات مئوية.
تنبيه: 2.5 ٪ glutaraldehyde الحل: السامة، محسس، مهيجة؛ استخدم في خزانة الأبخرة
ملاحظة: العملية في غضون شهر 1 للحصول على أفضل النتائج. - بالنسبة لعلم الأنسجة، إزالة الثالث العلوي الكلي، لضمان جلوميرولي القشرية والمجاورة النخاع على حد سواء سيكون حاضرا، والإصلاح في 5 مل بارافورمالدهيد 4% في 4 درجات مئوية عن 24 حاء التحويل إلى 5 مل من 70% EtOH لمدة 24 ساعة قبل تضمينها في البارافين.
تنبيه: 4% منهاج عمل بيجين: مثبت، الاستخدام في مجلس الوزراء الدخان - الفلورة، مكان ثالث للكلى، لضمان جلوميرولي القشرية والنخاع على حد سواء سيكون حاضرا، في الأنسجة العفن ومعطف في أكتوبر الماضي على الثلج الجاف تجميد وتخزين في-80 درجة مئوية.
- للبروتين والحمض النووي الريبي، تجميد مكان 3 × 2 مم3 قطعة من قشرة الكلي إلى 0.5 مل أنابيب بلاستيكية والمفاجئة في سائل ن2. مخزن في-80 درجة مئوية. للتخزين طويل الأجل الأنسجة للجيش الملكي النيبالي، وضع الأنسجة في 5 مجلدات من الحمض النووي الريبي تثبيت الحل وتخزينها في-80 درجة مئوية.
- لعزل glomeruli، شريحة حتى النسيج الكلي المتبقية ووضع في 5 مل من محلول الثدييات المسابقة مع جيش صرب البوسنة 1% على الجليد. إعداد منخل glomeruli فورا.
3-البلازما كرياتينين
ملاحظة: يمكن كرياتينين البلازما حتى ينظم في أمراض الكلي، مما يشير إلى انخفاض في قدرة الترشيح glomeruli. ويمكن أيضا تقييم مستويات النيتروجين (بون) اليوريا في الدم، على الرغم من أن البروتوكول لا يرد هنا.
- الطرد المركزي عينة الدم في 500 غ س لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- جمع البلازما، التي يمكن تخزينها في-20 درجة مئوية في الأجل القصير في هذه المرحلة.
- قياس تركيز كرياتينين البلازما استخدام مقايسة كرياتينين كيميائية كل الإرشادات المذكورة أعلاه كرياتينين البول في البروتوكول 1.11.
- تحديد تركيز كرياتينين لكل عينة بقراءة اللوحة في امتصاص 490 نانومتر قبل وبعد إضافة حمض الحل.
ملاحظة: الفرق بين هذه القيم امتصاص طرديا مع تركيز كرياتينين في كل عينة. منحنى قياسي جيل من المعايير. إذا كان يكرر التقنية السيرة ذاتية قيمة أكبر من 5%، كرر التحليل تلك العينات.
4-عزل جلوميرولي
ملاحظة: يمكن أن تكون معزولة Glomeruli لتقييم نفاذية glomeruli الفردية السابقين فيفو، فضلا عن التعبير عن البروتين محددة وعلامات مرناً للمرض الكبيبي.
- تأخذ الأنسجة الكلي في الحل الثدييات المسابقة مع جيش صرب البوسنة 1% وتشريح جلوميرولي استخدام معيار النخل تقنية13. بإيجاز، كومة 70 ميكرومتر (أسفل)، 100 ميكرومتر، 125 ميكرومتر، ميكرومتر 175، 250 ميكرون، وثقب سيتا (العلوي) ميكرومتر 425 إلى كوب زجاج.
- الهريس في الكلي، واستخدام المكبس المحاقن، إلى ميكرومتر 425 منخل والدفع من خلال استخدام الحل للجليد الباردة الثدييات في المسابقة مع جيش صرب البوسنة 1%. من خلال دفع البتات الكلي، إزالة غربال أعلى والمضي قدما للقيام بنفس الشيء على التالي. كرر حتى فقط 100 ميكرومتر و 70 ميكرومتر ثقب سيتا البقاء.
- نقل الحصاد الكبيبي الإبقاء 100 ميكرومتر و 70 ميكرومتر ثقب سيتا إلى 10 مل من محلول المسابقة الثدييات جديدة مع جيش صرب البوسنة 1%، على الجليد.
ملاحظة: إذا كان عدد glomeruli كل حل مل المسابقة القليلة، تقليص حجم الحل للمسابقة المستخدمة لجمع في جلوميرولي من ثقب سيتا الأخيرتين. - إزالة 5 مل الحل الذي يحتوي على جلوميرولي في أنابيب منفصلة اثنين (2.5 مل في كل) وأجهزة الطرد المركزي في 1,000 س ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة المادة طافية وتجميد الأداة جلوميرولي في السائل ن2 قبل تخزينها في-80 درجة مئوية للبروتين واستخراج الحمض النووي الريبي في وقت لاحق.
- ضع الحل المتبقية المحتوية على جلوميرولي في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لقياس الكبيبي LpA/Vأناالسابقين فيفو. كاملة داخل ح 3 من إزالة الكلي.
5-نفاذية المياه الكبيبي (LpA/Vأنا)
ملاحظة: الكبيبي LpA/Vأنا المقايسة تمكن السابقين فيفو قياس نفاذية glomeruli الفردية في استنساخه بطريقة سريعة. زيادة الكبيبي LpA/Vأنا يشير إلى تعطل جفب، وتوحي بمرض كلوي.
- إعداد الكبيبي LpA/Vأنا تلاعب كما هو موضح في سمك السلمون وآخرون10. يرجى الرجوع إلى الشكل 1 لرسم تخطيطي مفصل لتعيين لأعلى.
- إعداد الحلول التالية: حل الثدييات المسابقة مع جيش صرب البوسنة 1% (درجة الحموضة 7.4) وحل الثدييات المسابقة مع جيش صرب البوسنة 8% (درجة الحموضة 7.4). الدافئة على حد سواء إلى 37 درجة مئوية.
- سحب ميكروبيبيتيس من أنابيب شعرية زجاجية (الكثافة البصرية: 1.2 مم). إنشاء تلميح 5-8 ميكرومتر فتحه بقطع ميكروبيبيتي تحت مجهر.
- استخدام الكبيبي LpA/Vأنا تلاعب للقبض على جلوميرولي الفردية سليمة خالية من كبسولة بومان الشعبية وشظايا أنبوبي على ميكروبيبيتي استخدام الشفط. تم العثور على ملخص مفصل للانزيم أونكوميتريك في سمك السلمون وآخرون10. وباختصار، عندما اشتعلت الكبيبة والمضمونة في ميكروبيبيتي الشفط، بدء تسجيل فيديو الكبيبة تحت المجهر.
- أولاً، حجته الكبيبة في الحل المسابقة 1% جيش صرب البوسنة لمدة 30 ثانية قبل التبديل بريفوست حل المسابقة جيش صرب البوسنة 8% مركزة 10 s. ثم التبديل بريفوست إلى حل لجيش صرب البوسنة في المسابقة 1% وإيقاف التسجيل.
- يغسل في الكبيبة وكرر العملية 10-15 جلوميرولي الواحدة والماوس. التأكد من أن معدلات تدفق بريفوست متطابقة ولا بسرعة (10 مل/دقيقة) حتى لا يؤدي إلى تشويه هيكل الكبيبي.
- قياس معدل انكماش الكبيبي لحساب نفاذية المياه الكبيبي (LpA) تطبيع حجم الكبيبي (الخامسأنا) الأولى. يمكن الاطلاع على معلومات مفصلة بشأن التحليل في10من سمك السلمون وآخرون.
6-حامض الدوري Schiff (PAS) وصمة عار
ملاحظة: سوف تبرز وصمة عار نظام تقييم الأداء الأغشية الطابق السفلي من الحلقات الشعرية الكبيبي وظهاره أنبوبي. أنه يمكن التصور مفصلة الخلايا الكبيبي و mesangial مصفوفة وإمكانية التوسع، والتغيرات المحتملة الخليج للحاسبات الآلية (أي، وسماكة المخالفات).
- الفرع قشرة الكلي جزءا لا يتجزأ من البارافين، ومنهاج عمل بيجين--الثابتة باستخدام مبضع في 5 ميكرون سمك على الشرائح بولي-L-يسين المغلفة. الجافة في 37 درجة مئوية حاء 1 ضمان القسم لا يحتوي على أي طيات أو الثقوب، التي يمكن أن تشوه مورفولوجية تحت المجهر.
- ديبارافينيزي الشرائح التي تفرخ مرتين في زيلين نفط (تنبيه، مهيجة؛ والاستخدام في مجلس الوزراء الدخان) لمدة 3 دقائق، مرتين في 100% EtOH لمدة 3 دقائق، ومرة واحدة ثم في 95% و 70% و 50% EtOH لدقيقة 3 كل، كلها في درجة حرارة الغرفة. إعادة هيدرات الشرائح الموجودة في العرض dH2o.
- احتضان الشرائح في حل حامض الدوري (تنبيه، مهيجة؛ والاستخدام في مجلس الوزراء الدخان) (1 غ/دل) لمدة 5 دقائق، وشطف ثم استخدام الشرائح في عدة تغييرات dH2سين حاوية مع 100 مل dH2س في درجة حرارة الغرفة.
تنبيه: حمض الدوري الحل: مهيجة؛ استخدم في مجلس الوزراء الدخان - احتضان الشرائح في شيف لكاشف (HCl باراسوانيليني ز 6/لتر والصوديوم بيروكبريتيت 4 ٪ في HCl 0.25 مول/لتر) لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تغسل شرائح في إدارة مياه الحنفية لمدة 5 دقائق.
- كونتيرستين مع توضع 3 s قبل الشطف دقة الشرائح في إدارة مياه الحنفية لمدة 15 دقيقة.
ملاحظة: قد تتطلب بعض التحسين لتحديد الوقت الأمثل لتلوين الهيماتوكسيلين. - يذوي الشرائح باستخدام على عكس بروتوكول ديبارافينيزيشن في الخطوة 6، 2. إنهاء مع زيلين نفط.
- الشرائح الهواء الجاف وجبل مع الوسائط المستندة إلى زيلين نفط المتصاعدة.
- الصورة على مجهر ضوء على 400 X التكبير لتقييم هياكل الكبيبي. تقييم ما يلي: مخالفات الخليج للحاسبات الآلية، وسماكة تنهار الحلقات الشعرية، أنسجة تليفية، والتصلب، وانتشار الهاتف الخلوي (بطانية، بودوسيتي، وميسانجيال، أو الخلايا التحريضية التسلل إلى خصل).
ملاحظة: لإجراء تقييم شامل للفيزيولوجيا المرضية الكبيبي، الآفات في أماكن أخرى في الكلي ينبغي أن يكون تقييمها، مثل الأنابيب.
7-مجهر إلكتروني (TEM)
ملاحظة: تيم يسمح بدراسة التشوهات الهيكلية فائقة في الكلي، مثل الخليج للحاسبات الآلية، والعمليات بودوسيتي سيرا على الأقدام، وفينيستريشنز بطانية، التي لا تظهر بالفحص المجهري الخفيفة. هذا أمر مهم في نماذج فيها الضرر الكلوي لا حتى يشتد (أي، لا بيله، والتشوهات الهيكلية الرئيسية).
- تأخذ 2.5% جلوتيرالديهديي--الثابتة مكعبات الكلي وبعد إصلاحها في أكسيد أوزميوم 1% حاء 1 يغسل في 50 مل من 0.1 م كاكوديلاتي المخزن المؤقت (7.3 درجة الحموضة)، ومن ثم 50 مل من dH2س (التغييرات 3 × 15 دقيقة).
تنبيه: 2.5 ٪ glutaraldehyde: السامة، محسس، مهيجة؛ استخدم في خزانة الأبخرة. 0.1 كاكوديلاتي الصوديوم M: استخدام في خزانة الأبخرة السامة - يذوي مع EtOH وتضمين في الراتنج أرالديتي.
- قطع المقاطع في سمك 50-100 نانومتر ووصمة عار مع خلات اليورانيل (مائي) 3% وحل سترات الرصاص رينولدز.
- تأخذ ميكروجرافس الرقمية عبر عدة مناطق من الكبيبة في 940 X، 1250 X، و 6200 العاشر للتأكد بودوسيتيس، جينكس، الخليج للحاسبات الآلية، وميسانجيوم يمكن التعرف.
- استخدم إيماجيج لتحليل glomeruli أعمى. ضبط المقياس لكل صورة مجهرية 6200 العاشر من رسم خط بين نقطتين من المسافة المعروفة، مثل مسطرة. الانتقال إلى تحليل ثم قم بتعيين المقياس، حيث سيتم عرض طول الخط بالبكسل. اكتب المسافة المعروفة ووحدات القياس. استخدام البروتوكولات المذكورة أدناه لقياس كل معلمة.
ملاحظة: يتطلب هذا التحليل اليوم حوالي 1 لكل الماوس. لقوة إحصائية كافية، استخدام قياسات متوسط من 3 جلوميرولي من الفئران 3.- الخليج للحاسبات الآلية، إدراج شبكة رقمية ثابتة (10 × 10) على صورة مجهرية 6200 العاشر وقياس سمك الخليج للحاسبات الآلية في النقطة التي تعبر فيها خطوط الشبكة في الخليج للحاسبات الآلية. قياس من غشاء الخلية القاعدية بطانية لغشاء الخلية القاعدية بودوسيتي العملية سيرا على الأقدام في ظل عمودي لغشاء الخلية البطانية باستخدام أداة الخط المستقيم. تحديد قياس متوسط لكل الكبيبة من القياسات الفردية 10.
- عدد التثقب بطانية، قياس طول الخليج للحاسبات الآلية الموجودة في صورة مجهرية 6200 العاشر وحساب عدد فينيستريشنز بطانية كل وحدة طول الخليج للحاسبات الآلية. يستغرق في متوسط من ميكروجرافس على الأقل 4 في الكبيبة.
- بودوسيتي القدم عملية العرض، أدخل شبكة رقمية ثابتة (10 × 10) على صورة مجهرية 6200 العاشر. قياس عرض العمليات بودوسيتي سيرا على الأقدام عبر خطوط الشبكة. قياس العرض في الجزء أوسع عملية سيرا على الأقدام حيث تجتمع في الخليج للحاسبات الآلية؛ التأكد من الخط عمودي على المماس للغشاء القاعدي بودوسيتي. تحديد قياس متوسط لكل الكبيبة من القياسات الفردية 10.
- بودوسيتي شق العرض، بإدراج شبكة رقمية ثابتة (10 × 10) على صورة مجهرية 6200 العاشر. قياس عرض أغشية الشق بودوسيتي أن عبر خطوط الشبكة. هذه هي المرحلة التي يتم فيها عمليات القدم أقرب معا، في الجزء أوسع عملية سيرا على الأقدام، وكل من بودوسيتي الغشاء للغشاء. تأكد من القياس عمودي على المماس للغشاء القاعدي بودوسيتي. تحديد قياس متوسط لكل الكبيبة من القياسات الفردية 10.
- لعدد بودوسيتي القدم العمليات وقياس طول الخليج للحاسبات الآلية الموجودة في صورة مجهرية 6200 العاشر وحساب عدد العمليات القدم بودوسيتي كل وحدة طول الخليج للحاسبات الآلية. يستغرق في متوسط من ميكروجرافس على الأقل 4 في الكبيبة.
- لتغطية مساحة sub-بودوسيتي، راجع الطريقة المفصلة في نيل et al. 14.
- استخدام ميكروجرافس X 940، دراسة جلوميرولي لوجود بنية غير طبيعية، والودائع، وتتسرب بالعين المجردة.
8-الفلورة بودوسيتي وعلامات غشائي
ملاحظة: يسمح Immunostaining تصور أنماط التعبير البروتين، مثل الحلقات الشعرية بطانية، ويمكن أن تنهار في أمراض الكبيبي.
- ضع أكتوبر-القالب يحتوي على الكلي المجمدة في-20 درجة مئوية ح 2 قبل تمزيقها. ضمان قطع سطح الكلي يوضع بعناية ضد الجزء السفلي من أكتوبر-العفن تمكين قطاعات النسيج الموجه.
- استخدام كريوستات، قسم الأنسجة في سمك 5 ميكرومتر إلى بولي-L-يسين المغلفة الشرائح.
ملاحظة: ضمان لا توجد الطيات أو ثقوب في قسم الأنسجة، التي يمكن أن تشوه مورفولوجية. - عند إزالة من كريوستات، إصلاح الشرائح في 4% الشرائح منهاج عمل بيجين للحد الأدنى 10 يغسل 3 × 5 دقيقة في حاوية مع 100 مل من dH2o.
تنبيه: 4% منهاج عمل بيجين: مثبت، الاستخدام في مجلس الوزراء الدخان - لتقليل الكمية من الأجسام المضادة المستخدمة، رسم حول الأقسام بقلم مسعور. لا تدع الأجزاء الجافة.
- احتضان في عرقلة حل (BSA 3% والمصل العادي 5% في برنامج تلفزيوني x 1) ح 1 في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة الحل حظر مع المضخة واحتضان الأقسام مع جسم الابتدائي (نيفرين أو بودسين أو بيكم-1) المخفف 1: 250 (3% جيش صرب البوسنة في برنامج تلفزيوني س 1). وضع الشرائح في دائرة هوميديفيد في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. إذا لم يتوفر دائرة رطبة، خفيفة ضع شريط صغير من بارافيلم على الشريحة المغلفة بالأجسام المضادة. العناية عند إزالة في اليوم التالي فيما يتعلق بعدم تعطيل القسم.
- تغسل شرائح 3 x 5 دقيقة في برنامج تلفزيوني 1 x.
- احتضان مع جسم الثانوي الفلورسنت المناسب تمييع 1: 1000 (BSA 3% في برنامج تلفزيوني 1 x) عن ح 2 في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
- تغسل شرائح 3 x 5 دقيقة في برنامج تلفزيوني 1 x. جبل مع الفلورسنت تصاعد الوسائط التي تحتوي على DAPI.
- صورة الشرائح مع مجهر فلوري في 400 X التكبير لعرض glomeruli. ضمان هذا هو أعمى لتجنب التحيز.
- استخدام إيماجيج لتحليل كثافة المصبوغة، تطبيع لمنطقة الكبيبي، ونمط تلطيخ، أي، عدد الحلقات الشعرية تطبيع إلى منطقة الكبيبي، على نحو أعمى.
9-البروتين الاستخراج والنشاف الغربية
ملاحظة: النشاف الغربية يسمح لنا بتقييم تعبير البروتينات من المعروف أن dysregulated في أمراض الكلي. على سبيل المثال، انخفاضا في التعبير بودسين ونيفرين تشير إلى فقدان بودوسيتي.
- استخراج البروتين من قشرة الكلي وينخل glomeruli؛ البروتوكول هو نفسه بالنسبة لكل منهما، ويتم ضبط حجم المخزن المؤقت لتحلل كمية الأنسجة.
- ذوبان الجليد الكلي/جلوميرولي على الجليد قبل إضافة تحلل NP-40 المخزن المؤقت مثبطات البروتياز والفوسفاتيز المحتوية على (150 مم كلوريد الصوديوم، 1% التي أرستها-40، 50 مم تريس pH 8). مجانسة العينة لمدة 30 ثانية.
- احتضان هذه العينات المتجانس على الجليد لمدة 30 دقيقة، فورتيكسينج على فترات منتظمة.
- الطرد المركزي العينات في 10,000 ز س لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- إزالة المادة طافية على أنبوب جديد على الجليد.
ملاحظة: نتوقع لاسترداد حوالي 1 ملغ بروتين كل عينة. - تؤذي البروتينات باستخدام المخزن المؤقت x Laemmli 4 القياسية. يغلي الخليط في 95-100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- تقييم تعبير البروتينات علامة الخلية الكبيبي (نيفرين، بودسين، بيكم-1، إلخ.) والفسفره والتعبير عن البروتينات المعروفة باسم/الفرضية قد تكون غيرت في الكلي/جلوميرولي الطراز المرض باستخدام الغربية النشاف ( الأسلوب القياسي؛ محمود ويانغ15).
ملاحظة: تتنوع البروتوكول تبعاً لحجم ووفرة من بروتين الفائدة.
10-الجيش الملكي النيبالي الاستخراج وتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)
ملاحظة: تحليل التعبير مرناً يسمح لنا بتحديد كيف ينظم الجينات في الأمراض الكلوية، مثل التغيرات في التعبير الجيني والربط بديلة.
- بينما لا يزال يتم تجميد قشرة الكلي، دقة طحن في 3 مل كاشف الفينول باستخدام مدقة وهاون. في حالة استخدام مقتطفات الكبيبي، أضف 1 مل كاشف الفينول ومجانسة العينة لمدة 30 ثانية.
تنبيه: تريزول كاشف: مهيجة؛ استخدم في مجلس الوزراء الدخان - القيام باستخراج الحمض النووي الريبي استخدام الطريقة الموصوفة ب تشومكزينسكي وساكي16.
ملاحظة: تتوفر مجموعات استخراج الحمض النووي الريبي التجارية كبديل لهذا الأسلوب. - تقييم كمية ونوعية للجيش الملكي النيبالي الحصول عليها باستخدام أحد الأساليب المختلفة المتاحة. الجيش الملكي النيبالي اليكووتيد والمخزنة في-80 درجة مئوية في هذه المرحلة. تجنب تكرار تجميد ذوبان الجليد.
ملاحظة: إذا كان جديداً على هذا الأسلوب، التحقق من جودة الجيش الملكي النيبالي قبل المتابعة إلى الخطوة التالية عن طريق تشغيل الجيش الملكي النيبالي على [اغروس] هلام لضمان 28S واضحة والفرقة ريبوسومال 18S. ويتوقع لاسترداد بين 2 إلى 5 ميكروغرام من الجيش الملكي النيبالي باستخدام هذا الأسلوب. - علاج الدناز 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي (جعل حجم ما يصل إلى 10 ميليلتر مع المياه خالية من رناسي زائد 1 ميليلتر من الدناز و 1 ميليلتر من المخزن المؤقت الدناز) ح 1 في 37 درجة مئوية. التوقف عن رد فعل مع 1 ميليلتر الدناز وقف الحل عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
- إضافة 0.5 ميليلتر اليغو (dT) وكبسولة تفجير عشوائي. تبني على 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
- إخماد فورا على الجليد لمدة 5 دقائق.
- يضاف ما يلي؛ ملف إنزيم المنتسخة العكسية (400 ش؛ واستبدال مع ديبك ح2س في الرايت-نموذج عنصر تحكم)، ملف المخزن المؤقت (س 1)، دنتب ميكس (0.5 ملم)، و ribonuclease المانع (40 ش)؛ أن يصل إلى 50 ميليلتر ماء ديبك.
- احتضان ميكس رد فعل في 37 درجة مئوية ح 1 تليها 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لإلغاء تنشيط الإنزيم.
ملاحظة: لتوليد عائد أعلى من كدنا، احتضان في 37 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 ساعات. - تقييم كمية ونوعية كدنا استخدام الأساليب المختلفة المتاحة.
- استخدام PCR لتقييم أنماط التعبير والربط مرناً للجينات الافتراض بأن تكون dysregulated في نموذج المرض الكبيبي. البروتوكول يختلف حسب الجينات للفائدة.
Representative Results
وجمعت البول استخدام الأقفاص الأيضية من نوع البرية (WT) الخاصة بودوسيتي فيجف-أ ضرب إيندوسيبلي (فيجفا كو) والفئران ب165فيجفا كو X نيف-VEGF (الفئران "فيجفا كو" الإفراط تعبر عن isoform ب البشرية VEGF-أ165في بودوسيتيس في طريقة التأسيسي). عند قياس نسبة كرياتينين الزلال البولي في الأسابيع 0, 4 و 10 و 14 بعد تحريض الدوكسي "كو فيجفا"، وضعت الفئران "فيجفا كو" بيله التدريجي قبل 10 أسابيع مقارنة بوزن ليتيرماتي عناصر التحكم. يمكن أن ينظر إليه القيم المطلقة في الشكل 2 ألف، وتم تسويتها بخط الأساس لكل قيم الماوس في الشكل 2. بيله في لا تراعي في الفئران ب165فيجفا X نيف-فيجف-أ (الشكل 2)، مما يشير إلى أن فيجف-أ165ب غير الواقية في نموذج بيله5.
الكبيبي لفAVأنا كان قياس glomeruli الفردية غربلة من وزن، فيجفا كو، والكلى ب165نف س فيجفا-فيجف-أ. مثال عن كيف يتم صيده من الكبيبة والانكماش لاحظ عندما بيريفوسيد مع جيش صرب البوسنة 8% ويرد في الشكل 3A. ثم يتم استخدام هذا الانكماش لتحديد الكبيبي LpA/Vأنا لكل الكبيبة (الشكل 3B). فيجف-أ كو الفئران قد زيادة كبيرة الكبيبي LpA/Vأنا في 14 أسبوعا آخر التعريفي VEGF-كو جلوميرولي التحكم بالوزن بالمقارنة مع. على الرغم من أن أقل في فيجفا س نيف-فيجف-أ165ب الفئران، L الكبيبي زيادةفA/Vأنا لم يمنع من التعبير المفرط عن VEGF-أ165ب 14 أسبوعا5.
PAS تلطيخ أبواب قشرة الكلي 14 أسبوعا بعد تحريض "كو فيجفا" لم تكشف عن أي شذوذ هيكلية الكبيبي في كو فيجفا أو فيجفا X نيف-فيجف-أ الفئران ب165(الشكل 4 أ). بيد بناء على تحليل للهيكل الترا الكبيبي عن طريق م، "كو فيجفا" الفئران قد نمواً زيادة عرض الخليج للحاسبات الآلية وانخفض عدد fenestrae بطانية، انخفاض التغطية النباتية، وزاد متوسط بودوسيتي شق العرض (الشكل 4-4F ). عملية القدم بودوسيتي متوسط العرض وعدد من الشقوق وظلت دون تغيير (الشكل 3B والجيل الثالث 3g). منع التغييرات إلى الخليج للحاسبات الآلية التعبير المفرط عن ب VEGF-أ165في الفئران "فيجفا كو" وشق العرض (الشكل 4 و 4F). بيد أنه فيجف-A165ب أي تأثير على عدد فينسترا المعدلة والصحة والصحة النباتية التغطية (الشكل 4 و 4E)5.
RT-PCR تجري على الحمض النووي الريبي المستخرج من glomeruli ينخل كشفت أن ب165ألف VEGF البشرية مرناً موجودة فقط في الفئران ب165فيجفا كو X نيف-فيجف-أ (الشكل 5A). عند استخراج البروتين من glomeruli ينخل وتقييم مستويات البروتينات عن طريق النشاف الغربية، تعبير البروتين الكبيبي فيجفر-2 وجد أن يكون قد انخفض في الفئران "فيجفا كو"، الذي منعت بسبب الإفراط في التعبير عن VEGF-أ165ب ( الشكل 5B وج 5)5.
الشكل 1. إعداد البيانية من تلاعب نفاذية الكبيبي (LpA)- (أ) يتم القبض عليه في الكبيبة في (ب) ميكروبيبيتي داخل حامل استخدام الشفط، التي فرضت على جبل للاستقرار. (ج) ميكروسليدي مستطيلة. (د) الهدف X 4 مجهر مع كاميرا فيديو. (ه) درجة حرارة حل جيش صرب البوسنة 1% إلى 37 درجة مئوية. (و) تحسنت حل جيش صرب البوسنة 8 ٪ إلى 37 درجة مئوية. (ز) بعد الاستفادة من تأثير هذين الخطين المحتوية على بريفوست، الذي يسمح بتبادل بريفوست السريع. (ح) مسار بريفوست نحو ميكروسليدي، الذي ثم تستحم في الكبيبة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2. نسبة كرياتينين الزلال البولي. (أ) القيم أواكر في الأسابيع 0, 4 و 10 و 14 بعد تحريض "كو فيجفا" في الفئران ب165WT فيجفا كو ونف س فيجفا-فيجف-أ. (ب) تطبيع نفس القيم أواكر إلى قيمة خط الأساس (الأسبوع 0) كل الماوس الفردية. أواكر زيادة كبيرة في الفئران "فيجفا كو" في الأسابيع 10 و 14 مقارنة WT ليتيرماتي عناصر التحكم، التي منعت في الفئران ب165فيجفا X نيف-فيجف-أ (* p < 0.05؛ ثنائية الاتجاه ANOVA، تصحيح للمقارنة بين أزواج; n = 4-12 الفئران كل الوقت نقطة؛ أشرطة الخطأ: الخطأ المعياري للوسط [SEM]). وقد تم تعديل هذا الرقم من ستيفنز وآخرون5. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3. قياس نفاذية المياه الكبيبي. (أ) يتم القبض عليه في الكبيبة في ميكروبيبيتي عن طريق شفط؛ يتم تبديل بريفوست من جيش صرب البوسنة 1% (منظمة العفو الدولية) إلى 8% جيش صرب البوسنة (أخي)، ويلاحظ تقلص الكبيبي. (ب) تستخدم القياسات المتخذة قبل وبعد رمز التبديل جيش صرب البوسنة 8% لتحديد الكبيبي LpA/Vأنا. (ج) وضع الفئران "كو فيجفا" زيادة الكبيبي LpA/Vأنا في الأسابيع 14 وظيفة تحريض "كو فيجفا" مقارنة بضوابط WT. وهذا لم يمنع إلى حد كبير في الفئران ب165فيجفا X نيف-فيجف-أ (* p < 0.05؛ طريقة واحدة ANOVA، تصحيح بونفيروني للمقارنة بين أزواج; n = 4-9 الفئران، جلوميرولي 15-30؛ أشرطة الخطأ: وزارة شؤون المرأة). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4. التحليل الهيكلي الكبيبي. (أ) PAS تلطيخ من قشرة الكلي لم تشر إلى أي شذوذ هيكلية في جلوميرولي من وزن، فيجفا كو ونيف س فيجفا-فيجف-أ165ب الفئران (منظمة العفو الدولية-ثالثا). م كشف التشوهات الهيكلية فائقة في جلوميرولي "كو فيجفا" (Aiv-سادسا). (ب) لم تتغير الخطة الإطارية للمرأة متوسط بين المجموعات. (ج) زيادة "الخليج للحاسبات الآلية" في glomeruli "كو فيجفا"، التي منعت VEGF-أ165باء (د) قد انخفض عدد فينسترا في جلوميرولي "فيجفا كو"، الذي ظل دون تغيير بالتغطية "الصحة والصحة النباتية" (ه) باء-فيجف-A165 وقد انخفض في جلوميرولي "فيجفا كو"، الذي أيضا لم يتغير VEGF-أ165باء (و) زاد متوسط شق العرض في جلوميرولي "كو فيجفا"، والتي منعت بسبب VEGF-أ165ب (ز) عدد الشق لم يتغير بين المجموعات الثلاث (* p < 0.05؛ طريقة واحدة ANOVA، تصحيح بونفيروني للمقارنة بين أزواج; n = 3 الفئران، جلوميرولي 9؛ أشرطة الخطأ: وزارة شؤون المرأة). وقد تم تعديل هذا الرقم من ستيفنز وآخرون5. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5. التعبير مرناً والبروتين من علامات. (أ) RT-PCR أظهر أن165ألف VEGF البشرية ب مرناً التعبير فقط واضحة في glomeruli ينخل من الفئران ب165فيجفا كو X نيف-فيجف-أ. (ب) النشاف غربية أشارت إلى أن التعبير البروتين فيجفر-2 أسفل-ينظم glomeruli "كو فيجفا"، التي منعت في فيجفا كو X نيف-فيجف-أ جلوميرولي ب165(* p < 0.05؛ طريقة واحدة ANOVA، تصحيح بونفيروني للمقارنة بين أزواج; n = 3-6 فئران؛ أشرطة الخطأ: وزارة شؤون المرأة). وقد تم تعديل هذا الرقم من ستيفنز وآخرون5. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Discussion
ويصف هذا البروتوكول عمل الكلي كامل متابعة التي ينبغي الاضطلاع بها في نماذج الماوس من المرض الكبيبي، تمكين كمية هائلة من المعلومات المتعلقة بالكلى ودالة الكبيبي يمكن الحصول عليها من ماوس واحدة. الخطوات الحاسمة في كل أسلوب يسمح بتحليل الوظيفية والهيكلية والميكانيكية المفصلة للدالة الكبيبي، بما في ذلك تقييم نفاذية الكلي ككل (أواكر والبلازما، كرياتينين القياسات)، النفاذية جلوميرولي الفردية (الكبيبي LpA/Vأنا)، دراسة التعديلات الهيكلية (نظام تقييم الأداء، تريتشرومي الأزرق، وطب الطوارئ)، البروتين التعريب (إذا كان)، والتعبير الجيني الكبيبي (RT-PCR والنشاف الغربية). هذه الأساليب هي المفتاح إلى تقييم كامل للدالة الكبيبي في نماذج الماوس لأمراض الكلي.
عند تقييم نفاذية جفب، اختارت العديد من الدراسات على استخدام معدل إفراز الزلال أواكر أو ح 24 التقليدية ك تدبير فعال17،18. على الرغم من أن هذه التقنيات تسمح بتقييم نفاذية جفب ككل، فإنه لا يسمح بتقييم نفاذية الكبيبي الفردية والتباين بين glomeruli. وقد وجدت الدراسات السابقة قياس الكبيبي LpA/Vi لتكون مقياسا أكثر حساسية للتغيرات إلى5،نفاذية جفب9. في الواقع، في نتائج الممثل أظهر في هذه الورقة، في 14 أسبوعا بعد تحريض "كو فيجفا"، والفئران ب165فيجفا كو X نيف-فيجف-أ أواكر أقل بكثير مقارنة بالفئران "كو فيجفا"؛ غير أن هذه النتيجة لا ينعكس في الكبيبي LpA/Vأنا القياسات، حيث VEGF-أ165ب لا يمنع إلى حد كبير يزيد في جفب النفاذية (الشكل 1 و الشكل 2)5. وهذا يبين أهمية استخدام فحوصات عدة لتقييم نفاذية الكلي ونفاذيه glomeruli الفردية. وعلاوة على ذلك، الكبيبي LpA/الإنزيم أونكوميتريكأنا الخامس تقترح أن نفاذية glomeruli الفردية من نفس الكلي يمكن أن تختلف إلى حد كبير، ونماذج خاصة المرض105،، 19. حد واحد لقياس الكبيبي LpA/Vأنا أنه يمكن فقط أداؤها في نقطة النهاية التجريبية؛ وهكذا، ملزمون بالقياسات أواكر العادية تعطي مؤشرا لنقطة النهاية التجريبية.
وبالإضافة إلى تقييم النمط الظاهري الوظيفية، تشجع الأسلوب الحالي أيضا تقييم النمط الظاهري الهيكلية و ultrastructural. يمكن أن يتم ذلك باستخدام مجموعة مختارة من البقع مثل نظام تقييم الأداء، تريتشرومي، والبقع الفضية؛ كل منهما لتقييم الجوانب المختلفة مورفولوجية الكبيبي. في نماذج الحادة من مرض الكبيبي، الذي غالباً ما يكون الحال في نماذج الماوس، يمكن أن يكون من الصعب على الكشف عن أي شذوذ هيكلية كبرى استخدام هذه البقع إلا إذا كنت أخصائي الكلي مدربين. ولذلك، يقترح إجراء م لتقييم أولتراستروكتوري جفب، مما يسمح القياس الكمي للمعلمات مثل الخليج للحاسبات الآلية، وحجم فينسترا بطانية وعدد وخصائص بودوسيتي. يتطلب الحد الأدنى من التدريب لأداء هذه القياسات وتمكن المحقق لتحديد الخلية-الأنواع/الهياكل المتضررة في نموذج مرض. في المثال المعروض في نتائج تمثيلية، تم العثور على الماوس "فيجفا كو" يكون نموذج معتدل للمرض الكبيبي، وهكذا، لا شذوذ هيكلية رئيسية حاضرين عند تلطيخ PAS. بيد الخاصة بودوسيتي "فيجفا كو" تحدث تغييرات إلى الخليج للحاسبات الآلية، بودوسيتيس، وخلايا بطانية عند دراسة هيكل الترا الكبيبي5. ولسوء الحظ، لا يمكن إعداد الكلي م الموصوفة في الأسلوب الحالي للكشف عن جليكوكاليكس بطانية، ومن المعروف أيضا أن تكون لها آثار على نفاذية جفب19. ولقياس عمق جليكوكاليكس بدقة، ينبغي الكلي نتخلل-ثابتة مع 2.5 ٪ glutaraldehyde مع 1% السيان الأزرق لوضع العلامات جليكوكاليكس بطانية، كما هو موضح في أولتين وآخرون19.
مرة واحدة وقد قسمت النمط الظاهري الوظيفية والهيكلية، يمكن تقييم أنماط التعبير/تفعيل جينات مختلفة ومسارات ثم على وجه التحديد في glomeruli. تقييم هيكلية فائقة مسبق يمكن أن يعطي بعض المعلومات فيما يتعلق بالخلية الكبيبي/أنواع الهياكل المعنية، التي تشير إلى ما إذا كان ينبغي دراسة الجينات/مسارات محددة بودوسيتي أو بطانية. على سبيل المثال، في نتائج تمثيلية من الفئران "فيجفا كو"، لوحظ انخفاضا في عدد fenestrae غشائي (3D الشكل)؛ ولذلك، كان بحث تعبير البروتين الكبيبي علامة غشائي المعروفة للمشاركة في مسار VEGF-أ؛ فيجفر-2 (الشكل 4)5. بالإضافة إلى التعبير عن البروتينات في جلوميرولي، الترجمة يمكن أيضا تصور استخدام إذا. في دراسة أجرتها تشانغ وآخرون20، أكدت الخاصة بودوسيتي overexpression من GLUT1 في بودوسيتيس إذا شارك تعريب GLUT1 زيادة مع بودسين.
بالمقارنة مع طرق بديلة عرضت في الأدب لتقييم دالة الكبيبي، يتيح استخدام الطريقة المبينة في هذه الورقة لتقييم وظائف الكلي في نماذج الماوس من المرض الكبيبي النمط الظاهري الكبيبي تقييمه بشكل كامل من جوانب متعددة. باستخدام هذا الأسلوب، الباحث قادراً على تحديد النمط الظاهري الكلي للنموذج وتقييم الآلية بشأن لماذا يتطور النمط الظاهري. هذه المعلومات الحيوية عن الآلية المرض مطلوب عند دراسة السبل العلاجية المحتملة في هذه النماذج. يمكن تطبيق هذا الأسلوب بسهولة للتحقيقات مستقبلا في وظيفة الكبيبي سواء في التقييم تعمل المرض والعلاجات المحتملة.
وفي الختام، يصف هذا البروتوكول عام وقابلة للتكيف الكلي كامل عمل الهاتفي لنماذج الماوس من المرض الكبيبي، تمكين كمية هائلة من المعلومات المتعلقة بالكلى ودالة الكبيبي يمكن الحصول عليها من ماوس واحدة. الأساليب التي يسمح بإجراء تحليل الوظيفية والهيكلية والميكانيكية مفصلة وظيفة الكبيبي، والتي يمكن تطبيقها على جميع نماذج الماوس من المرض الكبيبي.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
كان يدعمها هذا العمل في مؤسسة القلب البريطانية، ريتشارد برايت VEGF البحوث الثقة، ولجنة نهر الميكونج.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Metabolic Cages | Harvard Apparatus | 52-6731 | |
| Tris buffered saline (10x) | Sigma-Aldrich | T5912-1L | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| Mouse Albumin ELISA Quantitation Set | Bethyl Laboratories | E90-134 | |
| TMB ELISA Substrate solution | ThermoFisher Scientific | 34028 | |
| Sulphuric acid | Sigma-Aldrich | 339741 | |
| SPECTRstar nano | BMG Labtech | SPECTRstar nano or equivalent | |
| RNAlater stabilisation solution | ThermoFisher Scientific | AM7020 | |
| 4-15% precast protein gel | BIORAD | 4568084 | |
| 4x Laaemmli Sample buffer | BIORAD | 161-0747 | |
| Mini Trans-Blot cell | BIORAD | 1703930 | |
| 10x Tris running buffer | BIORAD | 1610732 | |
| Coomassie Brilliant Blue Dye | ThermoFisher Scientific | 20278 | |
| Creatinine Companion | Exocell | 1012 Strip Plate | |
| Glutaraldehyde Solution | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Sodium Cacodylate | Sigma-Aldrich | C0250 | |
| 10x Phosphate Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | AM9625 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| Sodium Phosphate | Sigma-Aldrich | 342483 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M2643 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| D(+)Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| EDTA Blood Collection tubes | BD | 367835 | |
| 23-25G Needle | BD | PMC0735 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| 10 ml Glass Vial | Thomas Scientific | 0914X10 | |
| Falcon 10 ml Polypropylene Tubes | ThermoFisher Scientific | 10110101 | |
| 0.5 ml Tubes | ThermoFisher Scientific | 10681894 | |
| Disposable Tissue Molds | ThermoFisher Scientific | 22-363-553 | |
| Mouse Surgical Disection Kit | ThermoFisher Scientific | 13-005-204 | |
| Optimal Cutting Medium | ThermoFisher Scientific | 23-730-571 | |
| 4% Paraformaldehyde | ThermoFisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| Glass Capillary Tubes | Harvard Apparatus | EC1 64-0770 | |
| Glomerular Permeability Rig | Built at the Univeristy of Bristol - not comercially available | Citation of LpA rig: Salmon et al. 2006; J. Physiol | |
| Stainless Steel Sieves | Cole-Parmer | WZ-59984 | |
| Periodic Acid-Schiff (PAS) Staining System | Sigma-Aldrich | 395B-1KT | |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H3136 | |
| Xylene | MerckMillipore | 108298 | |
| Poly-Prep Slides | Sigma-Aldrich | P0425-72EA | |
| Mounting Medium | ThermoFisher Scientific | 8030 | |
| Osmium tetroxide solution | Sigma-Aldrich | 75632 | |
| Aradite Resin | Agar Scientific | CY212 | |
| Uranyl Acetate | Agar Scientific | AGR1260A | |
| Lead Citrate | Agar Scientific | AGR1210 | |
| Cryostat | ThermoFisher Scientific | e.g. 957000H | |
| Hydrophobic Pen | Abcam | ab2601 | |
| Nephrin (1243-1256) Antibody | Acris | BP5030 | |
| Anti-Podocin | Sigma-Aldrich | P0372-200UL | |
| Anti-CD31 | BD Biosciences | 550274 | |
| Alexa Fluor Secondary Antibody | ThermoFisher Scientific | A32732 | |
| Vectashield Mounting Medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| NP40 Cell Lysis Buffer | ThermoFisher Scientific | FNN0021 | |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail | ThermoFisher Scientific | 78437X4 | |
| 10x Transfer Buffer | BIORAD | 1610734 | |
| PVDF Membrane | ThermoFisher Scientific | LC2002 | |
| HRP-Conjugated Secondary Antibodies | Abcam | ab6721 | |
| ECF Substrate for Western Blotting | Fisher | 10713387 | |
| TRIzol | ThermoFisher Scientific | 15596018 | |
| Dnase I | New England Biolabs | M0303S | |
| M-MLV Reverse Transcriptase | New England Biolabs | M053S | |
| Oligo dT | ThermoFisher Scientific | 18418012 | |
| Random Primers | ThermoFisher Scientific | 48190011 | |
| dNTP | ThermoFisher Scientific | 18427088 | |
| Ribonuclease Inhibitor | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
| DEPC Water | ThermoFisher Scientific | AM9915G | |
| Fluorescent Light Miscroscope | Leica Microsystems | ||
| Image J Analysis Software | Image J | ||
| PCR Thermocycler | ThermoFisher Scientific | ||
| TEM Microscope | Britannica |
References
- Humtstrom, M. Development of structural kidney damage in spontaneously hypertensive rats. Journal of Hypertension. 30 (6), 1087-1091 (2012).
- Kitada, M., Ogura, Y., Koya, D. Rodent models of diabetic nephropathy: their utility and limitations. International Journal of Nephrology and Renovascular Disease. 14 (9), 279-290 (2016).
- Tesch, G. H., Lim, A. K. Recent insights into diabetic renal injury form the db/db mouse model of type 2 diabetic nephropathy. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 300 (2), F301-F310 (2011).
- Fogo, A. B. Animal models of FSGS: lessons for pathogenesis and treatment. Seminars in Nephrology. 23 (2), 161-171 (2003).
- Stevens, M., et al. VEGF-A165b protects against proteinuria in a mouse model with progressive depletion of all endogenous VEGF-A splice isoforms from the kidney. Journal of Physiology. 595 (19), 6281-6298 (2017).
- Cosgrove, D., Kalluri, R., Miner, J. H., Segal, Y., Borza, D. B. Choosing a mouse model to study the molecular pathobiology of Alport glomerulonephritis. Kindey International. 71 (7), 615-618 (2007).
- Kujal, P., Vernerova, Z. 5/6 nephrectomy as an experimental model of chronic renal failure and adaptation to reduced nephron number. Ceskoslenska Fysiologuie. 57 (4), 104-109 (2008).
- Chevalier, R. L., Forbes, M. S., Thornhill, B. A. Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy. Kidney International. 75 (11), 1145-1152 (2009).
- Oltean, S., et al. VEGF165b overexpression restores normal glomerular water permeability in VEGF164-overexpressing adult mice. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 303 (7), F1026-F1036 (2012).
- Salmon, A. H., Neal, C. R., Bates, D. O., Harper, S. J. Vascular endothelial growth factor increases the ultrafiltration coefficient in isolated intact Wistar rat glomeruli. Journal of Physiology. 570 (Pt 1), 141-156 (2006).
- Zheng, F., Striker, G. E., Esposito, C., Lupia, E., Striker, L. J. Strain differences rather than hyperglycemia determine the severity of glomerulosclerosis in mice. Kidney International. 54 (6), 1999-2007 (1998).
- Betz, B., Conway, B. R. An update on the use of animal models in diabetic nephropathy research. Current Diabetes Reports. 16 (18), (2016).
- Savin, V. J., Terreros, D. A. Filtration in single isolated mammalian glomeruli. Kidney International. 20 (2), 188-197 (1981).
- Neal, C. R., Crook, H., Bell, E., Harper, S. J., Bates, D. O. Three-dimensional reconstruction of glomeruli by electron microscopy reveals a distinct restrictive urinary subpodocyte space. Journal of the American Society of Nephrology. 16 (5), 1223-1235 (2005).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medicine & Science. 4 (9), 429-434 (2012).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry. 162 (1), 156-159 (1987).
- Adembri, C., et al. Sepsis induces albuminuria and alterations in the glomerular filtration barrier: a morphofunctional study in the rat. Critical Care. 15 (6), R277 (2011).
- Ma, S. T., Liu, D. L., Deng, J. J., Niu, R., Liu, R. B. Effect of arctiin on glomerular filtration barrier damage in STZ-induced diabetic nephropathy rats. Phytotherapy Research. 27 (10), 1474-1480 (2013).
- Oltean, S., et al. Vascular endothelial growth factor-A165b is protective and restores endothelial glycocalyx in diabetic nephropathy. Journal of the American Society of Nephrology. 26 (8), 1889-1904 (2015).
- Zhang, H., et al. Podocyte-specific overexpression of GLUT1 surprisingly reduces mesangial matric expansion in diabetic nephropathy in mice. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 299 (1), F91-F98 (2010).
