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Medicine

Glomerular रोग के माउस मॉडलों में गुर्दे समारोह का आकलन

Published: June 30, 2018 doi: 10.3791/57764
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3
1Institute of Biomedical and Clinical Sciences, Medical School, University of Exeter, 2School of Physiology, Pharmacology and Neurosciences, University of Bristol, 3Bristol Renal, School of Clinical Sciences, University of Bristol

Summary

इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक पूर्ण गुर्दे का काम है कि बाहर glomerular रोग के माउस मॉडल में किया जाना चाहिए । तरीकों विस्तृत कार्यात्मक, संरचनात्मक, और glomerular समारोह है, जो glomerular रोग के सभी माउस मॉडल के लिए लागू किया जा सकता है की यंत्रवत विश्लेषण के लिए अनुमति देते हैं ।

Abstract

मानव गुर्दे की बीमारी की नकल करने के लिए murine मॉडलों का उपयोग तेजी से आम होता जा रहा है । हमारे शोध मधुमेह नेफ्रोपैथी और podocyte-विशिष्ट वीईजीएफ़-एक दस्तक चूहों में glomerular समारोह के आकलन पर ध्यान केंद्रित किया है; इसलिए, इस प्रोटोकॉल का वर्णन पूर्ण गुर्दे काम अप हमारे प्रयोगशाला में इस्तेमाल के लिए glomerular रोग के इन माउस मॉडल का आकलन, गुर्दे और glomerular समारोह के बारे में जानकारी का एक विशाल राशि को सक्षम करने के लिए एक ही माउस से प्राप्त किया जाएगा । glomerular फ़ंक्शन का मूल्यांकन करने के लिए साहित्य में प्रस्तुत वैकल्पिक तरीकों की तुलना में, इस पत्र में उल्लिखित विधि का उपयोग glomerular phenotype को अनेक पहलुओं से पूर्णतः मूल्यांकित करने में सक्षम बनाता है. इस विधि का उपयोग करके शोधकर्ता मॉडल के गुर्दा phenotype का निर्धारण कर सकते हैं और तंत्र का आकलन करते हैं कि phenotype क्यों विकसित होता है । रोग के तंत्र पर यह महत्वपूर्ण जानकारी जब इन मॉडलों में संभावित चिकित्सीय रास्ते की जांच की आवश्यकता है । तरीके मूत्र एल्ब्युमिन क्रिएटिनिन अनुपात और व्यक्तिगत glomerular पानी पारगम्यता, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से दोनों संरचनात्मक और अल्ट्रा संरचनात्मक परीक्षा के माप के माध्यम से glomerular निस्पंदन बाधा के विस्तृत कार्यात्मक मूल्यांकन के लिए अनुमति आवधिक अम्ल Schiff दाग और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करना. इसके अलावा, mRNA और प्रोटीन स्तर पर dysregulated जीन का विश्लेषण glomerular समारोह के यंत्रवत विश्लेषण में सक्षम बनाता है । इस प्रोटोकॉल जेनेरिक लेकिन अनुकूलनीय तरीकों कि glomerular रोग के सभी माउस मॉडलों के लिए लागू किया जा सकता रूपरेखा ।

Introduction

मानव गुर्दे की बीमारी की नकल करने के लिए murine मॉडलों का उपयोग तेजी से आम होता जा रहा है । इस तरह के murine मॉडल सहज मॉडल जैसे सहज ग्रस्त चूहों (SHR)1, streptozotocin (STZ)-प्रेरित मधुमेह चूहों और चूहों2, और db/db प्रकार द्वितीय मधुमेह चूहों3, आनुवंशिक रूप से इंजीनियर मॉडल जैसे शामिल प्राथमिक podocyte-विशिष्ट फोकल फॉल्ट glomerular स्केलेरोसिस (FSGS) मॉडल4, podocyte-विशिष्ट संवहनी endothelial वृद्धि कारक एक (वीईजीएफ़-a) नॉक आउट (वीईजीएफ़-a KO)5मॉडल, और Alport सिंड्रोम मॉडल6, और अधिग्रहीत मॉडल जैसे 5/6 nephrectomy7 और एकतरफा ureteral रुकावट (UUO) मॉडल8। आदेश में इन मॉडलों में glomerular समारोह के विभिंन पहलुओं का आकलन करने के लिए, कई तकनीकों उपलब्ध हैं । इस विधि कागज के प्रयोजन के लिए एक व्यापक काम अप कि गुर्दे की बीमारी के माउस मॉडलों में प्रदर्शन किया जाना चाहिए के लिए पूरी तरह से glomerular समारोह का आकलन है ।

इस विधि के उपयोग के पीछे तर्क यह है कि यह glomerular phenotype को पूरी तरह से कई पहलुओं से मूल्यांकन किया जा करने के लिए सक्षम बनाता है । यह glomerular पारगम्यता का आकलन शामिल है, दोनों प्रोटीन और पानी के लिए, glomerular संरचनात्मक विषमता, और अभिव्यक्ति में परिवर्तन/mRNAs और सामान्य glomerular समारोह के लिए आवश्यक प्रोटीन के ब्याह/ इस विधि का उपयोग करके शोधकर्ता मॉडल की किडनी phenotype का निर्धारण करने में सक्षम होता है और तंत्र का आकलन कर phenotype को विकसित क्यों करता है । यह रोग है, जो जब इन मॉडलों में संभावित चिकित्सीय रास्ते की जांच की आवश्यकता है की व्यवस्था पर महत्वपूर्ण जानकारी है ।

साहित्य में, glomerular रोग के माउस मॉडल के साथ प्रस्तुत किया जाना एक आम घटना है जहां phenotype मूत्र में एल्ब्युमिन के एक वृद्धि स्तर से निर्धारित होता है । हालांकि, glomerular फ़ंक्शन का निर्धारण करने के लिए कोई एकल पद्धति हमेशा प्रभावी नहीं है कि सुझाव देने के लिए सबूत है; मूत्र एल्ब्युमिन उत्सर्जन दर या मूत्र एल्ब्युमिन क्रिएटिनिन अनुपात (uACR) को मापने केवल कुल गुर्दे समारोह के बारे में जानकारी प्रदान करता है, और नहीं व्यक्तिगत glomeruli की । पिछले अध्ययनों से यह प्रदर्शित किया है कि पारगम्यता अलग glomeruli में एक ही गुर्दे से भिन्न हो सकते हैं5,9,10. इसके अलावा, व्यक्तिगत glomeruli की पारगम्यता का आकलन glomerular समारोह का आकलन करने का एक अधिक संवेदनशील तरीका है; व्यक्तिगत glomerular जल पारगम्यता को मापने की तकनीक (एलपीए/मैं9uACR को मापने से glomerular समारोह में परिवर्तन के लिए और अधिक संवेदनशील होना दिखाया गया है । इस परख माउस मॉडल है कि proteinuria के लिए प्रतिरोधी रहे है में लाभप्रद है, ऐसे c57BL पर उन लोगों केरूप में/ वर्तमान विधि कागज का लाभ यह है कि यह दोनों कुल गुर्दे पारगम्यता एल्ब्युमिन करने के लिए जांच के रूप में के रूप में अच्छी तरह से व्यक्ति glomerular पारगम्यता पानी के लिए.

glomerular संरचनात्मक विषमताओं की परीक्षा अक्सर ऐसे आवधिक एसिड Schiff (क़दम), trichrome, और चांदी के दाग के रूप में दाग की एक बैटरी द्वारा मूल्यांकन किया जाता है । ये एक प्रशिक्षित गुर्दे पैथोलॉजिस्ट एक स्कोरिंग विधि के माध्यम से गुर्दे की बीमारी के स्तर का मूल्यांकन करने के लिए सक्षम. हालांकि सभी अच्छे तरीके, glomerular स्थूल संरचना में परिवर्तन हमेशा तीव्र गुर्दे की चोट मॉडल12में नहीं मनाया जाता है । इस विधि का प्रस्ताव है कि बाहर ले जाने के अलावा गुर्दे प्रोटोकॉल तकनीकों ऊपर वर्णित है, glomerular अल्ट्रा संरचना भी इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (EM) के माध्यम से मूल्यांकन किया जाना चाहिए । एक दाग glomerulus एक नियमित रूप से प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत अपेक्षाकृत सामान्य देख सकते हैं; हालांकि, आकलन पर उंहें, glomerular तहखाने झिल्ली में छोटे परिवर्तन (जीबीएम) चौड़ाई, podocyte पैर प्रक्रिया effacement, endothelial fenestrations, और उप podocyte अंतरिक्ष कवरेज का विश्लेषण किया है । इसलिए, यह महत्वपूर्ण है कि दोनों glomerular अल्ट्रा संरचना और सूक्ष्म संरचना glomerular शिथिलता के तंत्र का निर्धारण करने के लिए मूल्यांकन किया है ।

glomerular संरचनात्मक विषमताओं का आकलन करने के अलावा, mRNA और प्रोटीन अभिव्यक्ति और ब्याह में परिवर्तन, साथ ही साथ प्रोटीन सक्रियण (जैसे, फास्फारिलीकरण), glomerular रोग के तंत्र स्पष्ट आगे की जांच की जानी चाहिए । जब glomerular रोग में देख, या, उदाहरण के लिए, जब ko/glomerular कोशिकाओं में विशेष रूप से एक जीन व्यक्त, जैसे podocyte में विशेष वीईजीएफ़-एक को माउस5, यह महत्वपूर्ण है कि प्रोटीन और mRNA परिवर्तन के भीतर ही जांच कर रहे है glomerular कोशिकाओं, और नहीं पूरी किडनी । इस प्रोटोकॉल जिसमें glomeruli माउस गुर्दे प्रांतस्था से अलग कर रहे हैं एक विधि का वर्णन करता है, और फिर प्रोटीन/आरएनए अलग कर रहे हैं । यह रोग मॉडल के glomeruli में प्रोटीन/mRNA dysregulation के विशिष्ट विश्लेषण की अनुमति देता है ।

इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक पूर्ण गुर्दे का काम है कि बाहर glomerular रोग के माउस मॉडल में किया जाना चाहिए, गुर्दे और glomerular समारोह के बारे में जानकारी का एक विशाल राशि को सक्षम करने के लिए एक ही माउस से प्राप्त किया जाना है । तरीकों विस्तृत कार्यात्मक, संरचनात्मक, और glomerular समारोह है, जो glomerular रोग के सभी माउस मॉडल के लिए लागू किया जा सकता है की यंत्रवत विश्लेषण के लिए अनुमति देते हैं ।

Protocol

सभी प्रयोगों ब्रिटेन कानून और स्थानीय नैतिक समिति की मंजूरी के अनुसार आयोजित किया गया । यूनिवर्सिटी ऑफ ब्रिस्टल रिसर्च एथिक्स कमेटी द्वारा पशु अध्ययन को मंजूरी दी गई ।

1. मूत्र एल्ब्युमिन क्रिएटिनिन अनुपात (uACR)

नोट: uACR के लिए GFB की पारगम्यता का आकलन करने के लिए उपयोग किया जाता है एल्ब्युमिन. मूत्र में एल्ब्युमिन की उपस्थिति GFB भर में वृद्धि हुई पारगम्यता इंगित करता है, जो मूत्र प्रवाह की दर में बदलाव के लिए नियंत्रण करने के लिए क्रिएटिनिन करने के लिए सामान्यीकृत है. Albuminuria क्रोनिक गुर्दे की बीमारी के लिए एक आम मार्कर है ।

  1. प्रयोगात्मक आधार रेखा पर और नियमित अंतराल पर (एक बार साप्ताहिक एक बार मासिक) ऊपर प्रयोगात्मक समापन बिंदु तक मूत्र ले लीजिए ।
  2. पानी और संवर्धन आहार के साथ माउस चयापचय पिंजरों की स्थापना की । जगह चूहों (पुरुष, 6-8 सप्ताह आयु वर्ग) के लिए व्यक्तिगत पिंजरों में 6 एक शांत कमरे में ज ।
  3. चूहों को नियमित आवास पर लौटें और खाली पिंजरों से मूत्र इकट्ठा करें । न्यूनतम ५० µ l की आवश्यकता है ।
    नोट: यदि माउस दिए गए समय में मूत्र का उत्पादन नहीं करता है, एक गर्म कमरे में दूसरे दिन पर दोहराएं ।
  4. 10 मिनट के लिए ५०० x g में मूत्र केंद्रापसारक । मूत्र इकट्ठा और podocyte नुकसान का आकलन करने के लिए तलछट को बनाए रखने । इस बिंदु पर कम अवधि में-20 डिग्री सेल्सियस पर मूत्र की दुकान ।
  5. 1% में मूत्र पतला सीरम एल्ब्युमिन (BSA) में 1x Tris बफर खारा (टीबीएस पीएच ७.५) में एक 1:500 करने के लिए 1:10000 कमजोर पड़ने, albuminuria की गंभीरता पर निर्भर करता है ।
    नोट: अंत मात्रा होना चाहिए > 400 µ एल अनुकूलन हर समय बिंदु पर सही कमजोर पड़ने का निर्धारण करने के लिए ।
  6. मूत्र एल्ब्युमिन एकाग्रता का उपयोग करते हुए एक माउस एल्ब्युमिन एंजाइम लिंक्ड immunosorbent परख (एलिसा) निर्माता के निर्देशों के अनुसार ।
    1. संक्षेप में, कोट एलिसा थाली, जो प्रोटीन बाध्यकारी के लिए अनुकूलित है, विरोधी माउस एल्ब्युमिन प्राथमिक एंटीबॉडी के १०० µ एल के साथ (10 µ g/एमएल में ०.५ मीटर कार्बोनेट-बिकारबोनिट पीएच ९.६) कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए ।
    2. धो अतिरिक्त एंटीबॉडी कुओं से पांच बार 1x टीबीएस प्लस ०.०५% के बीच (पीएच ८.०) के साथ, और अवरुद्ध समाधान के २०० µ एल जोड़ें (1% BSA पीएच ८.० के साथ 1x टीबीएस) कमरे के तापमान पर रातोंरात ।
  7. धो प्लेट पांच बार और मानकों के १०० µ एल जोड़ें (सीरियल कमजोर पड़ने: २००० µ g/एमएल करने के लिए १५.६३ µ g/एमएल के साथ 1x टीबीएस में 1% BSA, पीएच ८.०), खाली, और तपसिल में पतला नमूने । कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए छोड़ दो तो थाली धो पांच बार ।
    1. एचआरपी का पता लगाने एंटीबॉडी के १०० µ एल जोड़ें एक अच्छी तरह से (10 1xTBS में एनजी/एमएल 1% BSA, पीएच ८.० के साथ) और 1 एच के लिए कमरे के तापमान पर गर्मी ।
    2. प्लेट धो पांच बार और एंजाइम सब्सट्रेट समाधान के १०० µ एल जोड़ने के लिए एक अच्छी तरह से । अंधेरे में थाली छोड़ 15 मिनट के लिए विकसित करने के लिए और ०.१८ एम सल्फर एसिड (एच2इतना4) के १०० µ एल जोड़कर प्रतिक्रिया बंद करो ।
      चेतावनी: एच2तो4 संक्षारक है ।
  8. ४५० एनएम के एक अवशोषक में थाली पढ़ने के द्वारा प्रत्येक नमूने के एल्ब्युमिन एकाग्रता का निर्धारण । प्रत्येक नमूने में मौजूद एल्ब्युमिन को बढ़ाता है मानक वक्र का उपयोग करें । यदि तकनीकी दोहराता एक CV मूल्य से अधिक 5% है, उन नमूनों के लिए परख दोहराने ।
  9. वैकल्पिक रूप से, ट्रो का उपयोग मूत्र एल्ब्युमिन एकाग्रता का आकलन. 5 µ एल जोड़ें 4x प्रोटीन नमूना लोड हो रहा है बफर के लिए 15 µ l मूत्र की. 10 मिनट के लिए ९५ ° c के लिए हीट नमूने और फिर एक 4-12% Tris कास्ट जेल में लोड ।
    1. १०० V पर जेल चलाने के लिए और निर्माता के प्रोटोकॉल प्रति Coomassie नीले रंग में रातोंरात दाग ।
    2. इमेजिंग जेल के बाद, नियंत्रण के सापेक्ष एल्ब्युमिन एकाग्रता गुना परिवर्तन का आकलन करने के लिए densitometry का उपयोग करें ।
      नोट: यदि कोई बैंड एल्ब्युमिन के लिए मनाया जाता है जब उंमीद है, मूत्र के प्रोटीन एकाग्रता का आकलन और मूत्र की मात्रा को समायोजित जेल में जोड़ा ।
  10. 1:1, 1:5, और 1:10 में डीएच2हे में कच्चे मूत्र का नमूना पतला ।
    नोट: अंत खंड होना चाहिए > 70 µ एल अनुकूलन प्रत्येक नमूने के सही कमजोर पड़ने का निर्धारण करने के लिए ।
  11. किट निर्देश के अनुसार एक रासायनिक परख का उपयोग मूत्र क्रिएटिनिन एकाग्रता यों तो । संक्षेप में, तपसिल में एक ९६ अच्छी थाली के लिए क्रिएटिनिन मानकों, खाली, या पतला मूत्र के 20 µ एल लोड ।
  12. ४९० एनएम के एक अवशोषक से पहले और बाद में एसिड समाधान (सावधानी, संक्षारक, त्वचा के साथ संपर्क से बचें) के एक अवशोषण पर प्लेट पढ़ने के द्वारा प्रत्येक नमूने के क्रिएटिनिन एकाग्रता का निर्धारण ।
    नोट: अवशोषित मूल्यों के बीच अंतर सीधे प्रत्येक नमूने में क्रिएटिनिन एकाग्रता के लिए आनुपातिक है । एक मानक वक्र मानकों से पीढ़ी है । यदि तकनीकी दोहराता एक CV मूल्य से अधिक 5% है, उन नमूनों के लिए परख दोहराने ।
  13. uACR (µ g/mg) जनरेट करें । ग्राफ़िकल प्रतिनिधित्व के लिए प्रत्येक माउस की आधारभूत मान के लिए डेटा को सामान्य करें ।

2. ऊतक और रक्त संग्रह

नोट: गुर्दे और glomerular ऊतक संरचनात्मक, प्रोटीन का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता, और गुर्दे की बीमारी के mRNA अभिव्यक्ति मार्करों. रक्त गुर्दे समारोह के मार्करों का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, क्रिएटिनिन के रूप में, जो अप किया जा सकता है गुर्दा रोग में विनियमित, glomeruli की निस्पंदन क्षमता में कमी का संकेत है ।

  1. निंन समाधान तैयार करें: ताजा २.५% glutaraldehyde में ०.१ एम सोडियम cacodylate (pH ७.३), 4% paraformaldehyde में 1x फास्फेट बफर खारा (पंजाब), स्तनधारी रिंगर समाधान (११५ mM सोडियम क्लोराइड (NaCl), 10 मिमी सोडियम एसीटेट (CH3COONa), १.२ मिमी सोडियम फॉस्फेट (न2HPO4), 25 मिमी सोडियम बिकारबोनिट (NaHCO3), १.२ मिमी मैग्नीशियम सल्फेट (MgSO4), 1 मिमी कैल्शियम क्लोराइड (CaCl2), ५.५ मिमी डी (+) ग्लूकोज, पीएच ७.४) 1% BSA के साथ, और 1x पंजाबियों.
    चेतावनी: २.५% glutaraldehyde: विषाक्त, संवेदी, अड़चन; एक धुएं कैबिनेट में प्रयोग करें । ०.१ एम सोडियम cacodylate: विषाक्त, एक धुएं कैबिनेट में उपयोग करें । 4% पीएफए: निर्धारण, धुआं कैबिनेट में उपयोग
  2. निम्नलिखित सामग्री तैयार करें: isoflurane, छोटा ethylenediaminetetraacetic अम्ल (EDTA)-लेपित रक्त नलियों, २३-25G सुई, ५ मिलीलीटर EDTA लेपित सीरिंज, १० मिलीलीटर काँच की शीशियों, १० मिलीलीटर प्लास्टिक शीशियों, ०.५ मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूब, डिस्पोजेबल ऊतक मोल्ड्स, ड्राई आइस, लिक्विड एन 2, माउस शल्य चिकित्सा उपकरण, और इष्टतम काटने मध्यम (OCT) ।
  3. गहरी संज्ञाहरण के तहत माउस प्लेस, जो जा रहा है गैर पैर पैड को सुई चुभन के लिए उत्तरदाई माउस से सत्यापित है, एक isoflurane चैंबर, या इंजेक्शन संवेदनाहारी एजेंटों के रूप में टर्मिनल संज्ञाहरण के समकक्ष मार्गों का उपयोग कर (pentobarbital, ५० मिलीग्राम/ intraperitoneal [IP]; avertin, २४० मिलीग्राम/kg IP), या कार्बन डाइऑक्साइड (co2) एक्सपोज़र (७५% co2/25% हे2) ।
  4. चुनना बाईं निलय में हृदय पंचर के माध्यम से माउस और जितना संभव हो उतना रक्त इकट्ठा । 4 एच के लिए EDTA-लेपित रक्त ट्यूब के लिए स्थानांतरण । यदि पसंद है, चूहों jugular नस टूटना नहीं लिया देखभाल के साथ गर्भाशय ग्रीवा के विस्थापन के माध्यम से अख़बारों जा सकता है ।
  5. पेट के जरिए किडनी को बाहर काटना और आइस कोल्ड 1x पंजाबियों में धोएं ।
  6. cortical glomeruli की जांच करने के लिए, गुर्दे प्रांतस्था के एक पोल को निकालें और 1 मिमी3 टुकड़ों में काट लें । गहरी juxta-दिमाग़ी glomeruli की जांच करने के लिए, मज्जा से ऊतक के साथ एक ही तकनीक दोहराएं । एक गिलास EM शीशी में २.५% glutaraldehyde समाधान के 5 मिलीलीटर में प्लेस । 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
    चेतावनी: २.५% glutaraldehyde समाधान: विषाक्त, संवेदी, अड़चन; एक धुएं कैबिनेट में प्रयोग करें
    नोट: सबसे अच्छा परिणाम के लिए 1 महीने के भीतर प्रक्रिया ।
  7. प्रोटोकॉल के लिए, एक गुर्दा के ऊपरी तीसरे को दूर करने के लिए, दोनों cortical और juxta-दिमाग़ी glomeruli सुनिश्चित करने के लिए मौजूद हो जाएगा, और 4% paraformaldehyde के 5 मिलीलीटर में 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए ७०% ेतोः के 5 मिलीलीटर के लिए स्थानांतरण से पहले आयल में embedding ।
    चेतावनी: 4% पीएफए: निर्धारण, धुआं कैबिनेट में उपयोग
  8. इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए, गुर्दे की एक तिहाई जगह, दोनों cortical और दिमाग़ी glomeruli यह सुनिश्चित करने के लिए मौजूद होंगे, में ऊतक मोल्ड और कोट में OCT. प्लेस सूखी बर्फ पर फ्रीज और स्टोर करने के लिए-८० ° c ।
  9. प्रोटीन और आरएनए के लिए, 3 x 2 मिमी3 गुर्दे प्रांतस्था के टुकड़े ०.५ मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूबों और तरल एन2में स्नैप फ्रीज में रखें । पर स्टोर-८० ° c । आरएनए के लिए दीर्घकालिक ऊतक भंडारण के लिए, आरएनए स्थिरीकरण समाधान के 5 संस्करणों में जगह ऊतक और-८० डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
  10. glomeruli के अलगाव के लिए, शेष गुर्दे के ऊतकों को टुकड़ा और बर्फ पर 1% BSA के साथ स्तनधारी है घंटी समाधान के 5 मिलीलीटर में जगह । छलनी glomeruli को तुरंत तैयार कर लें.

3. प्लाज्मा क्रिएटिनिन

नोट: प्लाज्मा क्रिएटिनिन अप किया जा सकता है-गुर्दे की बीमारी में विनियमित, glomeruli की निस्पंदन क्षमता में कमी का संकेत है । हालांकि यहां प्रोटोकॉल नहीं बताया गया है, ब्लड यूरिया नाइट्रोजन (रोटी) के स्तर का भी आकलन किया जा सकता है ।

  1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए ५०० x g पर रक्त का नमूना केंद्रापसारक ।
  2. इस बिंदु पर कम अवधि में-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है जो प्लाज्मा, इकट्ठा ।
  3. १.११ प्रोटोकॉल में मूत्र क्रिएटिनिन के लिए ऊपर दिए गए निर्देशों के अनुसार एक रासायनिक क्रिएटिनिन परख का उपयोग प्लाज्मा क्रिएटिनिन एकाग्रता को बढ़ाता है ।
  4. पहले और बाद में एसिड समाधान के अलावा ४९० एनएम के एक अवशोषक पर प्लेट पढ़ने के द्वारा प्रत्येक नमूने के क्रिएटिनिन एकाग्रता का निर्धारण ।
    नोट: इन अवशोषित मूल्यों के बीच अंतर सीधे प्रत्येक नमूने में क्रिएटिनिन एकाग्रता के लिए आनुपातिक है । एक मानक वक्र मानकों से पीढ़ी है । यदि तकनीकी दोहराता एक CV मूल्य से अधिक 5% है, उन नमूनों के लिए परख दोहराने ।

4. Glomeruli का अलगाव

नोट: Glomeruli अलग Glomeruli पूर्व vivo, साथ ही विशिष्ट प्रोटीन और glomerular रोग के mRNA मार्कर की अभिव्यक्ति की पारगम्यता का आकलन करने के लिए अलग किया जा सकता है ।

  1. 1% BSA और काटना glomeruli एक मानक sieving तकनीक13का उपयोग कर के साथ स्तनधारी घंटी के समाधान में रखा गुर्दे ऊतक ले लो । संक्षेप में, ढेर ७० µm (नीचे), १०० µm, १२५ µm, १७५ µm, २५० µm, और ४२५ µm (ऊपर) चलनी पर एक गिलास चोंच ।
  2. गुर्दे मैश, एक सिरिंज गोताख़ोर का उपयोग कर, ४२५ µm छलनी में और 1% BSA के साथ बर्फ ठंड स्तनधारी है घंटी समाधान का उपयोग कर के माध्यम से धक्का । के रूप में गुर्दे के बिट्स के माध्यम से धकेल रहे हैं, ऊपर छलनी निकालें और अगले पर एक ही करना आगे बढ़ना । दोहराएं जब तक केवल १०० µm और ७० µm छलनी रहते हैं ।
  3. 1% BSA के साथ ताजा स्तनधारी घंटी के समाधान के 10 मिलीलीटर के लिए १०० µm और ७० µm छलनी द्वारा बनाए रखा glomerular फसल हस्तांतरण, बर्फ पर ।
    नोट: यदि glomeruli प्रति मिलीलीटर रिंगर समाधान की संख्या कुछ है, रिंगर के समाधान की मात्रा को कम करने के लिए पिछले दो छलनी से glomeruli इकट्ठा किया ।
  4. दो अलग ट्यूबों (२.५ मिलीलीटर प्रत्येक) में glomeruli युक्त समाधान के 5 मिलीलीटर निकालें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए १,००० x g पर केंद्रापसारक । supernatant निकालें और एक बाद की तारीख में प्रोटीन और आरएनए निष्कर्षण के लिए ८० डिग्री सेल्सियस पर भंडारण से पहले तरल एन2 में glomeruli फ्रीज स्नैप ।
  5. glomerular एलपीए की माप के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक जल स्नान में glomeruli युक्त शेष समाधान रखें। गुर्दे को हटाने के 3 ज के भीतर पूरा करें ।

5. Glomerular जल पारगम्यता (एलपीए/

नोट: glomerular एलपीए/वीमैं परख एक तेजी से एक reproducible तरीके से व्यक्तिगत glomeruli की पारगम्यता के पूर्व vivo माप सक्षम बनाता है । glomerular एलपीए/वी में वृद्धिमैं GFB, जो गुर्दे की बीमारी का सुझाव है की व्यवधान इंगित करता है ।

  1. सामन एट अल10में वर्णित के रूप में glomerular एलपीए/ कृपया सेट अप की एक विस्तृत आरेख के लिए चित्रा 1 देखें ।
  2. निंन समाधान तैयार करें: स्तनधारी रिंगर का समाधान 1% BSA (ph ७.४) और स्तनधारी रिंगर के साथ 8% BSA (ph ७.४) के साथ समाधान । दोनों ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए गर्म ।
  3. ग्लास केशिका ट्यूबों (ऑप्टिकल घनत्व: १.२ mm) से micropipettes खींचो । एक खुर्दबीन के नीचे micropipette काटने से एक 5-8 µm एपर्चर टिप उत्पंन करते हैं ।
  4. glomerular एलपीए/वीमैं रिग का उपयोग करने के लिए बरकरार व्यक्तिगत glomeruli है कि है बोमन कैप्सूल और ट्यूबलर टुकड़े से मुक्त कर रहे है चूषण का उपयोग micropipette पर पकड़ । oncometric परख का एक विस्तृत सारांश सामन एट अल10में पाया जाता है । संक्षेप में, एक बार एक glomerulus पकड़ा और चूषण micropipette पर सुरक्षित है, माइक्रोस्कोप के तहत glomerulus के वीडियो रिकॉर्डिंग शुरू करते हैं ।
  5. सबसे पहले, equilibrate 1% BSA रिंगर समाधान में glomerulus 10 एस के लिए केंद्रित 8% BSA है घंटी समाधान करने के लिए perifusate स्विचन से पहले 30 एस के लिए । फिर perifusate वापस 1% BSA घंटी के समाधान के लिए स्विच और रिकॉर्डिंग बंद करो ।
  6. glomerulus दूर धोने और माउस प्रति 10-15 glomeruli के लिए प्रक्रिया को दोहराने । सुनिश्चित करें perifusate प्रवाह दर समान है और नहीं करने के लिए तेजी से (10 मिलीलीटर/तो glomerular संरचना को विकृत करने के लिए नहीं ।
  7. glomerular पानी पारगम्यता (एलपीए) की गणना करने के लिए glomerular की प्रारंभिक दर को मापने glomerular मात्रा (वीमैं) के लिए सामान्यीकृत. विश्लेषण के बारे में विस्तृत जानकारी सामन एट अल10में पाया जा सकता है ।

६. मुलांच्या अम्ल Schiff (प्राधान्य) दाग

नोट: इस क़दम दाग glomerular केशिका छोरों और ट्यूबलर उपकला के तहखाने झिल्ली पर प्रकाश डाला जाएगा. यह glomerular कोशिकाओं, mesangial मैट्रिक्स और संभावित विस्तार, और जीबीएम के संभावित परिवर्तन (यानी, और अधिक मोटा होना और अनियमितताओं) का विस्तृत दृश्य सक्षम बनाता है ।

  1. धारा तेल-एंबेडेड, पीएफए-फिक्स्ड गुर्दे प्रांतस्था पाली-एल lysine लेपित स्लाइड पर 5 µm मोटाई में एक microtome का उपयोग कर । 1 घंटे के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर सूखी सुनिश्चित करें कि अनुभाग में किसी भी परतों या छेद, जो माइक्रोस्कोप के तहत आकृति विज्ञान विकृत कर सकते हैं शामिल नहीं है ।
  2. xylene में दो बार मशीन द्वारा Deparaffinize स्लाइड (सावधानी, अड़चन; धुएं कैबिनेट में उपयोग) 3 मिनट प्रत्येक के लिए, १००% ेतोः में दो बार 3 मिनट के लिए प्रत्येक, और फिर एक बार में ९५%, ७०%, और ५०% ेतोः के लिए 3 मिनट प्रत्येक, कमरे के तापमान पर सभी । फिर से हाइड्रेट डीएच2ओ में स्लाइड.
  3. आवधिक एसिड समाधान में स्लाइडें (सावधानी, अड़चन; धुएं कैबिनेट में उपयोग) (1 जी/डीएल) 5 मिनट के लिए, और फिर डीएच2के कई परिवर्तनों में स्लाइड कुल्ला हे । कमरे के तापमान पर १०० मिलीलीटर डीएच2हे के साथ एक कंटेनर का प्रयोग करें ।
    सावधानी: आवधिक एसिड समाधान: अड़चन; धुएं में इस्तेमाल करें कैबिनेट
  4. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए Schiff के रिएजेंट (Parasoaniline hcl 6 g/l और सोडियम metabisulfite 4% में एचसीएल ०.२५ मॉल/ 5 मिनट के लिए नल का पानी चलाने में स्लाइड धो लें ।
  5. Counterstain 3 एस के लिए Hematoxylin के साथ अच्छी तरह से 15 मिनट के लिए नल का पानी चलाने में स्लाइड धोने से पहले ।
    नोट: कुछ अनुकूलन Hematoxylin धुंधला के लिए इष्टतम समय निर्धारित करने के लिए आवश्यक हो सकता है ।
  6. चरण ६.२ में deparaffinization प्रोटोकॉल के रिवर्स का उपयोग कर स्लाइड निर्जलीकरण । xylene के साथ समाप्त करें ।
  7. एयर शुष्क स्लाइड और माउंट xylene आधारित बढ़ते मीडिया के साथ ।
  8. glomerular संरचनाओं का आकलन करने के लिए 400X आवर्धन पर एक प्रकाश माइक्रोस्कोप पर छवि । निम्नलिखित का मूल्यांकन करें: जीबीएम की अधिकता और अनियमितताओं, केशिका छोरों, fibrotic ऊतक, स्केलेरोसिस, सेलुलर प्रसार (endothelial, podocyte, और mesangial, या गुच्छा घुसपैठ भड़काऊ कोशिकाओं) के टूट.
    नोट: glomerular pathophysiology के एक व्यापक मूल्यांकन के लिए, गुर्दे में कहीं घावों का मूल्यांकन किया जाना चाहिए, जैसे कि नलिकाओं में.

7. ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (उनि)

ध्यान दें: उनि इस तरह के जीबीएम, podocyte पैर प्रक्रियाओं, और endothelial fenestrations, जो प्रकाश माइक्रोस्कोपी के साथ दिखाई नहीं दे रहे हैं के रूप में गुर्दे में अल्ट्रा संरचनात्मक असामान्यताओं की परीक्षा की अनुमति देता है । इस मॉडल में महत्वपूर्ण है जहां गुर्दे की क्षति नहीं है तो स्पष्ट (यानी, नहीं albuminuria और प्रमुख संरचनात्मक विषमता) ।

  1. २.५% gluteraldehdye-फिक्स्ड पासा गुर्दे और पोस्ट-फिक्स 1% आज़मियम tetroxide में 1 घंटे के लिए ०.१ मीटर cacodylate बफर (पीएच ७.३) के ५० मिलीलीटर में और फिर ५० एमएल डीएच2ओ (3 x 15 मिनट परिवर्तन) के लिए ले लो ।
    चेतावनी: २.५% glutaraldehyde: विषाक्त, संवेदी, अड़चन; एक धुएं कैबिनेट में प्रयोग करें । ०.१ एम सोडियम cacodylate: विषाक्त, एक धुएं कैबिनेट में उपयोग
  2. ेतोः के साथ निर्जलीकरण और Araldite राल में एंबेड ।
  3. ५०-१०० एनएम मोटाई पर वर्गों में कटौती और 3% (जलीय) uranyl एसीटेट और ' रेनॉल्ड्स लीड साइट्रेट समाधान के साथ दाग ।
  4. 940X, 1250X, और 6200X पर glomerulus के कई क्षेत्रों पर डिजिटल माइक्रोग्राफ लो यकीन है कि podocytes, GEnCs, जीबीएम, और mesangium की पहचान की जा सकती है ।
  5. अंधे glomeruli का विश्लेषण करने के लिए ImageJ का प्रयोग करें । ज्ञात दूरी, जैसे कोई मापनी के दो बिंदुओं के बीच कोई रेखा आरेखित करके प्रत्येक 6200X micrograph के लिए स्केल सेट करें । विश्लेषण करने के लिए जाओ, और फिर सेट पैमाने, जहां लाइन की लंबाई पिक्सल में प्रदर्शित किया जाएगा । ज्ञात दूरी और माप की इकाइयों में टाइप करें । प्रत्येक पैरामीटर के माप के लिए नीचे सूचीबद्ध प्रोटोकॉल का उपयोग करें ।
    नोट: यह विश्लेषण प्रति माउस 1 दिन के आसपास की आवश्यकता है । पर्याप्त सांख्यिकीय शक्ति के लिए, 3 चूहों से 3 glomeruli से औसत माप का उपयोग करें ।
    1. जीबीएम के लिए, 6200X micrograph पर एक निश्चित डिजिटल ग्रिड (10 x 10) डालें और जीबीएम की मोटाई को मापने के बिंदु पर जहां ग्रिड लाइनों जीबीएम पार । बेसल endothelial सेल झिल्ली से बेसल podocyte पैर प्रक्रिया सेल झिल्ली के लिए एक सीधा स्पर्श में endothelial कोशिका झिल्ली सीधी रेखा उपकरण का उपयोग करने के लिए उपाय । 10 व्यक्तिगत माप से प्रत्येक glomerulus के लिए मतलब माप का निर्धारण ।
    2. endothelial fenestration संख्या के लिए, 6200X micrograph में मौजूद जीबीएम की लम्बाई को मापने और endothelial की प्रति इकाई लम्बाई fenestrations जीबीएम की संख्या की गणना करें । एक औसत से कम 4 माइक्रोग्राफ प्रति glomerulus ले लो ।
    3. podocyte पैर प्रक्रिया चौड़ाई के लिए, 6200X micrograph पर एक निश्चित डिजिटल ग्रिड (10 x 10) डालें । ग्रिड लाइनों को पार podocyte फुट प्रक्रियाओं की चौड़ाई को मापने । पैर की प्रक्रिया के व्यापक भाग पर चौड़ाई को मापने जहां यह जीबीएम मिलता है; सुनिश्चित करें कि लाइन podocyte बेसल झिल्ली के स्पर्श करने के लिए सीधा है । 10 व्यक्तिगत माप से प्रत्येक glomerulus के लिए मतलब माप का निर्धारण ।
    4. podocyte भट्ठा चौड़ाई के लिए, 6200X micrograph पर एक निश्चित डिजिटल ग्रिड (10 x 10) डालें । podocyte भट्ठा डायाफ्राम कि ग्रिड लाइनों को पार की चौड़ाई को मापने । इस बिंदु जहां पैर प्रक्रियाओं एक साथ निकटतम रहे हैं, प्रत्येक पैर प्रक्रिया के व्यापक भाग में, podocyte झिल्ली से झिल्ली के लिए है । सुनिश्चित करें कि माप podocyte बेसल झिल्ली के स्पर्श करने के लिए सीधा है । 10 व्यक्तिगत माप से प्रत्येक glomerulus के लिए मतलब माप का निर्धारण ।
    5. podocyte पैर प्रक्रियाओं की संख्या के लिए, 6200X micrograph में मौजूद जीबीएम की लंबाई को मापने और podocyte की इकाई लंबाई प्रति जीबीएम पैर प्रक्रियाओं की संख्या की गणना । एक औसत से कम 4 माइक्रोग्राफ प्रति glomerulus ले लो ।
    6. उप podocyte अंतरिक्ष कवरेज के लिए, नील एट अलमें विस्तृत विधि देखें । 14.
  6. 940X माइक्रोग्राफ का प्रयोग, असामान्य संरचना की उपस्थिति के लिए glomeruli की जांच, जमा, और आँख से घुसपैठ.

8. Podocyte और Endothelial मार्कर के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस

नोट: Immunostaining इस तरह के endothelial केशिका छोरों, जो glomerular रोग में गिर सकता है के रूप में प्रोटीन अभिव्यक्ति पैटर्न, के दृश्य की अनुमति देता है ।

  1. अक्टूबर-मोल्ड पर जमे हुए गुर्दे युक्त प्लेस-20 डिग्री सेल्सियस के लिए 2 ज से पहले खोदी । गुर्दे की कटौती की सतह को ध्यान से अक्टूबर के नीचे के खिलाफ रखा है सुनिश्चित करें-मोल्ड अच्छी तरह से केंद्रित ऊतक वर्गों को सक्षम करने के लिए ।
  2. पाली-L-lysine लेपित स्लाइड पर एक 5 µm मोटाई पर एक cryostat, अनुभाग ऊतक का उपयोग करना ।
    नोट: यह सुनिश्चित करना कि आकृति विज्ञान को विकृत कर सकते हैं, ऊतक अनुभाग में कोई परतों या छेद कर रहे हैं.
  3. cryostat से हटाने पर, 10 मिनट के लिए 4% पीएफए में स्लाइड को ठीक करें । स्लाइड धो 3 एक्स 5 मिन डीएच2ओ की १०० मिलीलीटर के साथ एक कंटेनर में ।
    चेतावनी: 4% पीएफए: निर्धारण, धुआं कैबिनेट में उपयोग
  4. इस्तेमाल किया एंटीबॉडी की मात्रा को कम करने के लिए, एक hydrophobic पेन के साथ वर्गों के आसपास ड्रा. वर्गों सूखी मत देना ।
  5. समाधान अवरुद्ध में मशीन (3% BSA और 1x पंजाब में 5% सामांय सीरम) कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए ।
  6. एक aspirator और प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ मशीन वर्गों के साथ अवरुद्ध समाधान निकालें (Nephrin, podocin, या PECAM-1) 1:250 पतला (1x पंजाब में 3% BSA) । रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर एक humidified चैंबर में स्लाइड रखें । यदि एक आर्द्र कक्ष उपलब्ध नहीं है, हल्के से एंटीबॉडी-लेपित स्लाइड पर parafilm की एक छोटी सी पट्टी जगह है । अनुभाग को बाधित न करने के लिए अगले दिन को निकालते समय ध्यान रखें ।
  7. 1x पंजाब में स्लाइड 3 x 5 मिनट धो लें ।
  8. अंधेरे में कमरे के तापमान पर 2 ज के लिए उपयुक्त फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी कमजोर पड़ने 1:1000 (1x पंजाब में 3% BSA) के साथ मशीन ।
  9. 1x पंजाब में स्लाइड 3 x 5 मिनट धो लें । DAPI युक्त फ्लोरोसेंट बढ़ते मीडिया के साथ माउंट ।
  10. 400X आवर्धन पर एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के साथ छवि स्लाइड glomeruli देखने के लिए । यह सुनिश्चित करने के लिए पूर्वाग्रह से बचने अंधा है ।
  11. का प्रयोग करें ImageJ धुंधला तीव्रता का विश्लेषण करने के लिए, glomerular क्षेत्र के लिए सामान्यीकृत, और धुंधला के पैटर्न, यानी, केशिकाओं की संख्या glomerular क्षेत्र के लिए सामान्यीकृत छोरों, एक अंधा तरीके से ।

9. प्रोटीन निष्कर्षण और पश्चिमी सोख्ता

नोट: पश्चिमी सोख्ता हमें अभिव्यक्ति प्रोटीन गुर्दे की बीमारी में dysregulated जाना ज्ञात का आकलन करने के लिए अनुमति देता है । उदाहरण के लिए, podocin और nephrin अभिव्यक्ति में कमी podocyte हानि को इंगित करती है ।

  1. गुर्दे प्रांतस्था और छलनी glomeruli से प्रोटीन निकालने; प्रोटोकॉल प्रत्येक के लिए एक ही है और lysis बफ़र की मात्रा ऊतक की मात्रा के लिए समायोजित है ।
  2. glomeruli-४० lysis बफर (१५० mm NaCl, 1% np-४०, ५० mm Tris pH 8) को छेड़ने और फॉस्फेट अवरोधकों से जोड़ने से पहले गल किडनी/ Homogenize 30 एस के लिए नमूने लिए ।
  3. 30 मिनट के लिए बर्फ पर homogenized नमूनों की मशीन, नियमित अंतराल पर भंवर ।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए १०,००० x g पर नमूने केंद्रापसारक ।
  5. बर्फ पर एक ताजा ट्यूब के लिए supernatant निकालें ।
    नोट: नमूना प्रति लगभग 1 मिलीग्राम प्रोटीन ठीक करने की अपेक्षा.
  6. मानक 4x Laemmli बफर का उपयोग प्रोटीन स्वभाव । 5 मिनट के लिए ९५-१०० डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण उबाल लें ।
  7. glomerular सेल मार्कर प्रोटीन की अभिव्यक्ति का आकलन (Nephrin, Podocin, PECAM-1, आदि) और फास्फारिलीकरण और प्रोटीन की अभिव्यक्ति ज्ञात/पश्चिमी glomeruli का उपयोग कर रोग मॉडल के गुर्दे/सोख्ता में बदल सकता है ( मानक विधि; महमूद और यांग15) ।
    नोट: प्रोटोकॉल के आकार और ब्याज की प्रोटीन की बहुतायत के आधार पर भिंन होगा ।

10. आरएनए निष्कर्षण और पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर)

नोट: mRNA अभिव्यक्ति विश्लेषण हमें यह निर्धारित करने के लिए अनुमति देता है कि जीन गुर्दे की बीमारी में विनियमित रहे हैं, जैसे जीन अभिव्यक्ति और वैकल्पिक ब्याह में परिवर्तन के रूप में ।

  1. Whilst गुर्दे प्रांतस्था अभी भी जमे हुए है, अच्छी तरह से एक मूसल और मोर्टार का उपयोग phenol एजेंट के 3 मिलीलीटर में पीसने । यदि glomerular अर्क का उपयोग कर, phenol रिएजेंट की 1 मिलीलीटर जोड़ें और homogenize 30 एस के लिए नमूना है ।
    चेतावनी: TRIzol एजेंट: अड़चन; धुएं में इस्तेमाल करें कैबिनेट
  2. Chomczynski और Sacchi16द्वारा वर्णित विधि का उपयोग कर एक आरएनए निष्कर्षण निष्पादित करें ।
    नोट: वाणिज्यिक आरएनए निष्कर्षण किट इस विधि के लिए एक विकल्प के रूप में उपलब्ध हैं ।
  3. उपलब्ध विभिन्न विधियों में से एक का उपयोग कर प्राप्त आरएनए की मात्रा और गुणवत्ता का आकलन करें । आरएनए aliquoted है और इस बिंदु पर-८० ° c में संग्रहित है । दोहराने फ्रीज गल से बचें ।
    नोट: इस विधि के लिए नया है, तो एक स्पष्ट 28S और 18S राइबोसोमल बैंड सुनिश्चित करने के लिए एक agarose जेल पर आरएनए चलाकर अगले कदम के लिए आगे बढ़ने से पहले आरएनए की गुणवत्ता की जाँच करें । इस विधि का उपयोग कर आरएनए के 2 से 5 µ g के बीच पुनर्प्राप्त करने की अपेक्षा ।
  4. DNase 1 µ जी आरएनए का इलाज (RNase के साथ 10 µ एल करने के लिए मात्रा बनाने-मुक्त पानी प्लस 1 µ एल के DNase और 1 µ एल के DNase बफर) 1 के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर. 10 मिनट के लिए ६५ ° c पर DNase रोकें समाधान के 1 µ l के साथ प्रतिक्रिया रोकें ।
  5. oligo (डीटी) और यादृच्छिक प्राइमरों के ०.५ µ एल जोड़ें । 10 मिनट के लिए ७० ° c पर मशीन ।
  6. तुरंत 5 मिनट के लिए बर्फ पर बुझाना ।
  7. निंन जोड़ें; MMLV रिवर्स transcriptase एंजाइम (४०० यू; आरटी-नियंत्रण नमूने में DEPC एच2ओ के साथ बदलें), MMLV बफर (1x), dNTP मिश्रण (०.५ मिमी), और ribonuclease अवरोध करनेवाला (४० यू); DEPC पानी के साथ ५० µ l तक बनाएं ।
  8. 1 एच के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर गर्मी प्रतिक्रिया मिश्रण 5 एंजाइम को निष्क्रिय करने के लिए मिनट के लिए ९५ ° c के बाद ।
    नोट: सीडीएनए के एक उच्च उपज उत्पंन करने के लिए, ३७ ° c के लिए 3 एच के लिए पर मशीन ।
  9. उपलब्ध विभिंन तरीकों का उपयोग कर सीडीएनए की मात्रा और गुणवत्ता का आकलन करें ।
  10. glomerular रोग मॉडल में dysregulated होने के लिए परिकल्पना की गई जीन की mRNA अभिव्यक्ति और ब्याह पैटर्न का आकलन करने के लिए पीसीआर का उपयोग करें । प्रोटोकॉल ब्याज की जीन के आधार पर भिंन होगा ।

Representative Results

मूत्र जंगली प्रकार (WT) से चयापचय पिंजरों का उपयोग कर एकत्र किया गया था, inducible podocyte-विशिष्ट वीईजीएफ़-एक को बाहर दस्तक (वीईजीएफ़-a ko), और वीईजीएफ़-a ko X Neph-वीईजीएफ़१६५b चूहों (वीईजीएफ़-a ko चूहों कि ओवर-एक्सप्रेस मानव वीईजीएफ़-एक१६५में isoform में बी podocytes गठित तरीके से). सप्ताह 0, 4, 10, और 14 में मूत्र एल्ब्युमिन क्रिएटिनिन अनुपात की माप पर वीईजीएफ़ के doxycycline प्रेरण के बाद-a ko, वीईजीएफ़-a ko चूहों albuminuria WT नियंत्रण की तुलना में 10 सप्ताह तक प्रगतिशील littermate विकसित की है । निरपेक्ष मान चित्र 2aमें देखा जा सकता है, और प्रत्येक माउस मान के आधार रेखा में आकृति b. normal करने के लिए । हालांकि, albuminuria में नहीं मनाया में वीईजीएफ़-a X Neph-वीईजीएफ़-a१६५b चूहों (चित्रा 2), यह दर्शाता है कि वीईजीएफ़-a१६५b albuminuria5के मॉडल में सुरक्षात्मक है ।

glomerular एलपीए वीमैं व्यक्तिगत glomeruli WT से छलनी में मापा गया था, वीईजीएफ़-एक KO, और वीईजीएफ़-a X Neph-वीईजीएफ़-a१६५b गुर्दे । कैसे एक glomerulus पकड़ा है और सिकुड़ी जब 8% BSA के साथ perifused चित्र 3ए में दिखाया गया है का एक उदाहरण । इस सिकुड़ना तो glomerular एलपीए के लिए निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जाता है/ वीईजीएफ़-a को चूहों एक काफी बढ़ glomerular एलपीए/वीमैं 14 सप्ताह के बाद वीईजीएफ़-KO प्रेरण WT नियंत्रण glomeruli की तुलना में । हालांकि वीईजीएफ़ में कम-a X Neph-वीईजीएफ़-a१६५b चूहों, बढ़ी हुई glomerular Lpa/मैं द्वारा रोका नहीं गया था पर-अभिव्यक्ति की वीईजीएफ़-a१६५b पर 14 सप्ताह5.

वीईजीएफ़ के प्रेरण के बाद गुर्दा प्रांतस्था वर्गों के 14 सप्ताह के क़दम-एक ko वीईजीएफ़ में किसी भी glomerular संरचनात्मक विषमता प्रकट नहीं किया-a ko या वीईजीएफ़-a X Neph-वीईजीएफ़-a१६५b चूहों (चित्रा 4a). हालांकि, glomerular अल्ट्रा के विश्लेषण पर उंहें के द्वारा संरचना, वीईजीएफ़-A को चूहों को एक बढ़ा जीबीएम चौड़ाई विकसित की थी, endothelial fenestrae की संख्या में कमी आई, एसपीएस कवरेज में कमी आई है, और औसत podocyte भट्ठा चौड़ाई (आंकड़ा 4c-4F वृद्धि हुई ). औसत podocyte पैर प्रक्रिया की चौड़ाई और slits की संख्या अपरिवर्तित बनी रही (आंकड़ा 3 बी और 3g) । ओवर-एक्सप्रेशन ऑफ वीईजीएफ़-अ१६५बी इन वीईजीएफ़-a KO चूहों ने जीबीएम और भट्ठा की चौड़ाई में परिवर्तन को रोका (फिगर 4c और 4F). हालांकि, वीईजीएफ़-A१६५b बदल fenestrae संख्या और एसपीएस कवरेज (चित्रा 4d और 4E)5पर कोई प्रभाव नहीं था ।

आरटी-पीसीआर ने छलनी किए गए glomeruli से निकाला आरएनए का पता चला कि मानव वीईजीएफ़-a१६५b mRNA केवल वीईजीएफ़ में मौजूद है-a KO X Neph-वीईजीएफ़-a१६५b चूहों (चित्र 5ए) । जब glomeruli से प्रोटीन निकालने और पश्चिमी सोख्ता के माध्यम से प्रोटीन के स्तर का आकलन, VEGFR-2 के glomerular प्रोटीन अभिव्यक्ति वीईजीएफ़ में कमी हो पाया था-a KO चूहों, जो वीईजीएफ़-a१६५b की ओवर-एक्सप्रेशन द्वारा रोका गया था ( चित्रा 5B और 5C)5.

Figure 1
चित्र 1. Diagrammatic glomerular पारगम्यता (एलपीए) रिग की स्थापना की. (क) glomerulus पर पकड़ा जाता है (ख) सक्शन का उपयोग कर एक धारक के भीतर micropipette, जो स्थिरता के लिए एक माउंट पर clamped है । (ग) आयताकार microslide. (घ) एक वीडियो कैमरा के साथ एक खुर्दबीन के 4x उद्देश्य । (ङ) 1% BSA ३७ ° c के लिए गर्म समाधान । (च) 8% BSA ३७ ° c के लिए गर्म समाधान । (छ) दूरस्थ नल दो perifusate युक्त लाइनों, जो तेजी से perifusate विनिमय परमिट का असर । (ज) microslide के प्रति perifusate का मार्ग, जो फिर glomerulus को मलते हैं. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2. मूत्र एल्ब्युमिन क्रिएटिनिन अनुपात. (क) uACR मूल्यों पर सप्ताह 0, 4, 10, और 14 वीईजीएफ़ की प्रेरण के बाद-WT में एक ko, वीईजीएफ़-a ko, and वीईजीएफ़-a X Neph-वीईजीएफ़-a१६५b चूहों. (B) एक ही uACR मान प्रत्येक व्यक्ति माउस के आधार रेखा मान (0 सप्ताह) के लिए normaled । uACR काफी वीईजीएफ़ में बढ़-एक KO चूहों पर सप्ताह 10 और 14 WT littermate नियंत्रण है, जो वीईजीएफ़ में रोका गया था की तुलना में-a X Neph-वीईजीएफ़-a१६५b चूहों (* p < 0.05; दो तरह के ANOVA, जोड़े के बीच तुलना के लिए सुधार; n = 4-12 समय बिंदु प्रति चूहों; त्रुटि पट्टियां: माध्य [SEM]) के मानक त्रुटि । यह आंकड़ा स्टीवंस एट अल5से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3. glomerular पानी पारगम्यता का मापन. (क) glomerulus को सक्शन के जरिए micropipette पर पकड़ा जाता है; perifusate 1% BSA (Ai) से 8% BSA (Aii) पर स्विच है, और glomerular संकोचन मनाया जाता है । (ख) 8% BSA स्विच से पहले और बाद में लिया गया माप glomerular एलपीए/ (ग) वीईजीएफ़-a ko चूहों एक वृद्धि हुई glomerular एलपीएक/वीमैं 14 सप्ताह के बाद वीईजीएफ़ के प्रेरण-WT नियंत्रण की तुलना में एक ko में विकसित । यह काफी वीईजीएफ़-a X Neph-वीईजीएफ़-a१६५b चूहों में रोका नहीं गया था (* p < 0.05; एक ही रास्ता ANOVA, जोड़े के बीच तुलना के लिए Bonferroni सुधार; n = 4-9 चूहों, 15-30 glomeruli; त्रुटि पट्टियां: SEM) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4. Glomerular संरचनात्मक विश्लेषण. (क) गुर्दा प्रांतस्था का प्राधान्य दाग WT से glomeruli में किसी भी संरचनात्मक विषमता का संकेत नहीं था, वीईजीएफ़-a KO, and वीईजीएफ़-a X Neph-वीईजीएफ़-a१६५b चूहों (ऐ-iii). EM वीईजीएफ़ में अल्ट्रा संरचनात्मक विषमता से पता चला-A KO glomeruli (Aiv-vi) । (B) औसत FPW समूहों के बीच परिवर्तित नहीं हुआ । (ग) वीईजीएफ़-ए ko glomeruli में जीबीएम वृद्धि हुई, जिसे वीईजीएफ़-ए१६५बी ने रोका था. (घ) fenestrae की संख्या में कमी आई थी वीईजीएफ़-a ko glomeruli, जो वीईजीएफ़ द्वारा अनछुए रह-ए१६५बी. (ङ) एसपीएस कवरेज वीईजीएफ़ में कमी आई-a ko glomeruli, जो भी वीईजीएफ़ द्वारा अपरिवर्तित रहा-a१६५b. (F) औसत भट्ठा चौड़ाई वीईजीएफ़ में वृद्धि हुई-एक ko glomeruli, जो वीईजीएफ़ द्वारा रोका गया था-a१६५b. (G) भट्ठा संख्या अपरिवर्तित थी तीन समूहों के बीच (* p < 0.05; एक ही रास्ता ANOVA, जोड़े के बीच तुलना के लिए Bonferroni सुधार; n = 3 चूहों, 9 glomeruli; त्रुटि पट्टियां: SEM) । यह आंकड़ा स्टीवंस एट अल5से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5. मार्करों की mRNA और प्रोटीन अभिव्यक्ति । (a) RT-पीसीआर से पता चला कि मानव वीईजीएफ़-a१६५b mRNA अभिव्यक्ति केवल वीईजीएफ़ से छलनी glomeruli में स्पष्ट था-a KO X Neph-वीईजीएफ़-a१६५b चूहों. (ख) पश्चिमी सोख्ता संकेत दिया कि VEGFR-2 प्रोटीन अभिव्यक्ति नीचे था वीईजीएफ़ में विनियमित-a ko glomeruli, जो वीईजीएफ़ में रोका गया था-a ko X Neph-वीईजीएफ़-a१६५B glomeruli (* p < 0.05; एक ही रास्ता ANOVA, जोड़े के बीच तुलना के लिए Bonferroni सुधार; n = 3-6 चूहों; त्रुटि पट्टियां: SEM) । यह आंकड़ा स्टीवंस एट अल5से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक पूर्ण गुर्दे का काम है कि बाहर glomerular रोग के माउस मॉडल में किया जाना चाहिए, गुर्दे और glomerular समारोह के बारे में जानकारी का एक विशाल राशि को सक्षम करने के लिए एक ही माउस से प्राप्त किया जाना है । प्रत्येक विधि में महत्वपूर्ण कदम विस्तृत कार्यात्मक, संरचनात्मक, और एक पूरे (uACR और प्लाज्मा क्रिएटिनिन माप) के रूप में गुर्दे की पारगम्यता का आकलन सहित glomerular समारोह के यंत्रवत विश्लेषण के लिए अनुमति देते हैं, की पारगम्यता व्यक्तिगत glomeruli (glomerular एलपीए/वीमैं), संरचनात्मक परिवर्तन की परीक्षा (क़दम, Trichrome नीला, और EM), प्रोटीन स्थानीयकरण (यदि), और glomerular जीन अभिव्यक्ति (आरटी-पीसीआर और पश्चिमी सोख्ता) । इन पद्धतियों गुर्दे की बीमारी के माउस मॉडल में glomerular समारोह का पूरा आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण हैं ।

जब GFB की पारगम्यता का आकलन, कई अध्ययनों से एक प्रभावी उपाय17,18के रूप में पारंपरिक uACR या 24 एच एल्ब्युमिन उत्सर्जन दर का उपयोग करने के लिए चुना है. हालांकि इन तकनीकों के एक पूरे के रूप में GFB पारगम्यता के आकलन की अनुमति, यह व्यक्तिगत glomerular पारगम्यता मूल्यांकन और glomeruli के बीच भिन्नता के लिए अनुमति नहीं है. पिछले अध्ययन glomerular एलपीए/वीमैं GFB पारगम्यता5,9के लिए परिवर्तन का एक और अधिक संवेदनशील उपाय हो की माप पाया है । वास्तव में, प्रतिनिधि परिणामों में इस पत्र में प्रदर्शन किया, 14 सप्ताह में वीईजीएफ़ की प्रेरण-एक ko, वीईजीएफ़-a ko X Neph-वीईजीएफ़-a१६५बी चूहों uACR की तुलना में एक काफी कम वीईजीएफ़-a को चूहों; हालांकि, इस परिणाम में प्रतिबिंबित नहीं है glomerular Lpa/Vi माप, जहां वीईजीएफ़-a१६५b काफी GFB पारगम्यता में वृद्धि को रोकने नहीं किया है (चित्रा 1 और चित्रा 2)5. यह कई परख का उपयोग करने के लिए दोनों गुर्दे पारगम्यता और व्यक्तिगत glomeruli की पारगम्यता का आकलन करने के महत्व से पता चलता है. इसके अलावा, glomerular एलपीए/वीमैं oncometric परख पता चलता है कि एक ही गुर्दे से व्यक्तिगत glomeruli की पारगम्यता बहुत भिंन हो सकते हैं, विशेष रूप से रोग मॉडल में5,10, 19. glomerular को मापने के लिए एक सीमा एलपीए/मैं यह है कि यह केवल प्रयोगात्मक अंत बिंदु पर प्रदर्शन किया जा सकता है; इस प्रकार, नियमित uACR माप प्रयोगात्मक अंत बिंदु का एक संकेत देने के लिए आवश्यक हैं ।

कार्यात्मक phenotype का आकलन करने के अलावा, वर्तमान विधि संरचनात्मक और ultrastructural phenotype के आकलन को भी प्रोत्साहित करती है । इस तरह के क़दम, trichrome, और चांदी के दाग के रूप में दाग के चयन का उपयोग किया जा सकता है; प्रत्येक glomerular आकृति विज्ञान के विभिन्न पहलुओं का आकलन करने के लिए. glomerular रोग है, जो अक्सर माउस मॉडल में मामला है की तीव्र मॉडल में, इन दाग का उपयोग कर किसी भी प्रमुख संरचनात्मक असामान्यताओं का पता लगाने के लिए मुश्किल हो सकता है जब तक आप एक प्रशिक्षित गुर्दे पैथोलॉजिस्ट हैं । इसलिए, उंहें ले जाने के लिए GFB, जो जैसे जीबीएम, endothelial fenestrae आकार और संख्या, और podocyte विशेषताओं के रूप में मानकों के मात्रात्मक माप की अनुमति देता है की ultrastructure का आकलन करने का सुझाव दिया है । इस तरह के मापन के लिए प्रदर्शन करने के लिए न्यूनतम प्रशिक्षण की आवश्यकता है और एक रोग मॉडल में प्रभावित कोशिका-प्रकारों/संरचनाओं का निर्धारण करने के लिए जांचकर्ता सक्षम बनाता है । प्रतिनिधि परिणामों में दिखाया उदाहरण में, वीईजीएफ़-एक को माउस glomerular रोग का एक हल्का मॉडल, इस प्रकार पाया गया था, कोई बड़ी संरचनात्मक विषमता क़दम धुंधला पर मौजूद थे । हालांकि, podocyte-विशिष्ट वीईजीएफ़-एक KO जीबीएम, podocytes, और endothelial जब glomerular अल्ट्रा संरचना5की जांच कोशिकाओं में परिवर्तन प्रेरित किया । दुर्भाग्य से, उंहें वर्तमान विधि में वर्णित के लिए गुर्दे की तैयारी endothelial glycocalyx, जो भी GFB19की पारगम्यता पर महत्वपूर्ण प्रभाव है जाना जाता है का पता लगाने के लिए सक्षम नहीं है । आदेश में सही glycocalyx गहराई उपाय करने के लिए, गुर्दे perfuse-1% के साथ २.५% glutaraldehyde के साथ तय किया जाना चाहिए Alcian ब्लू endothelial glycocalyx लेबलिंग के लिए, के रूप में Oltean एट अल19में वर्णित है ।

एक बार कार्यात्मक और संरचनात्मक phenotype का मूल्यांकन किया गया है, अलग जीन और रास्ते की अभिव्यक्ति/सक्रियकरण पैटर्न तो glomeruli में विशेष रूप से मूल्यांकन किया जा सकता है । पहले अल्ट्रा संरचनात्मक मूल्यांकन कुछ सेल प्रकार के बारे में जानकारी दे सकता/glomerular संरचनाओं शामिल है, यह दर्शाता है कि क्या podocyte-या endothelial-विशिष्ट जीन/ उदाहरण के लिए, वीईजीएफ़-a KO चूहों से प्रतिनिधि परिणामों में, endothelial fenestrae संख्या में कमी (चित्रा 3 डी) मनाया गया था; इसलिए, एक endothelial मार्कर के glomerular प्रोटीन अभिव्यक्ति वीईजीएफ़ में शामिल होने के लिए जाना जाता है-एक मार्ग की जांच की थी; VEGFR-2 (figure 4B)5. glomeruli में प्रोटीन की अभिव्यक्ति के अलावा, उनके स्थानीयकरण भी अगर का उपयोग कर visualized किया जा सकता है । झांग एट अल20, podocyte-GLUT1 के विशेष एक्सप्रेस द्वारा एक अध्ययन में podocytes में पुष्टि की थी अगर सह podocin के साथ बढ़ा GLUT1 स्थानीयकृत ।

glomerular फ़ंक्शन का मूल्यांकन करने के लिए साहित्य में प्रस्तुत वैकल्पिक तरीकों की तुलना में, glomerular रोग के माउस मॉडलों में गुर्दे के कार्य का आकलन करने के लिए इस पत्र में उल्लिखित विधि का उपयोग glomerular phenotype से पूर्णतः मूल्यांकित होने के लिए सक्षम करता है कई पहलुओं । इस विधि का उपयोग करके शोधकर्ता मॉडल की किडनी phenotype का निर्धारण करने में सक्षम होता है और तंत्र का आकलन कर phenotype को विकसित क्यों करता है । रोग के तंत्र पर यह महत्वपूर्ण जानकारी जब इन मॉडलों में संभावित चिकित्सीय रास्ते की जांच की आवश्यकता है । इस विधि glomerular समारोह में दोनों रोग phenotypes और संभावित चिकित्सकीय के आकलन में भविष्य की जांच करने के लिए आसानी से लागू किया जा सकता है ।

अंत में, इस सामांय और अनुकूलनीय प्रोटोकॉल एक पूर्ण गुर्दे glomerular रोग के माउस मॉडल के लिए काम अप का वर्णन, गुर्दे और glomerular समारोह के बारे में जानकारी का एक विशाल राशि को सक्षम करने के लिए एक ही माउस से प्राप्त किया जाएगा । तरीकों विस्तृत कार्यात्मक, संरचनात्मक, और glomerular समारोह है, जो glomerular रोग के सभी माउस मॉडल के लिए लागू किया जा सकता है की यंत्रवत विश्लेषण के लिए अनुमति देते हैं ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को ब्रिटिश हार्ट फाउंडेशन, रिचर्ड ब्राइट वीईजीएफ़ रिसर्च ट्रस्ट, और MRC ने सपोर्ट किया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Metabolic Cages Harvard Apparatus 52-6731
Tris buffered saline (10x) Sigma-Aldrich T5912-1L
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A2058
Mouse Albumin ELISA Quantitation Set Bethyl Laboratories E90-134
TMB ELISA Substrate solution ThermoFisher Scientific 34028
Sulphuric acid Sigma-Aldrich 339741
SPECTRstar nano BMG Labtech SPECTRstar nano or equivalent
RNAlater stabilisation solution ThermoFisher Scientific AM7020
4-15% precast protein gel BIORAD 4568084
4x Laaemmli Sample buffer BIORAD 161-0747
Mini Trans-Blot cell BIORAD 1703930
10x Tris running buffer BIORAD 1610732
Coomassie Brilliant Blue Dye ThermoFisher Scientific 20278
Creatinine Companion Exocell 1012 Strip Plate
Glutaraldehyde Solution Sigma-Aldrich G5882
Sodium Cacodylate Sigma-Aldrich C0250
10x Phosphate Buffered Saline ThermoFisher Scientific AM9625
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S7653
Sodium Acetate Sigma-Aldrich S2889
Sodium Phosphate Sigma-Aldrich 342483
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S5761
Magnesium Sulfate Sigma-Aldrich M2643
Calcium Chloride Sigma-Aldrich C5670
D(+)Glucose Sigma-Aldrich G8270
EDTA Blood Collection tubes BD 367835
23-25G Needle BD PMC0735
EDTA Sigma-Aldrich E9884
10 ml Glass Vial Thomas Scientific 0914X10
Falcon 10 ml Polypropylene Tubes ThermoFisher Scientific 10110101
0.5 ml Tubes ThermoFisher Scientific 10681894
Disposable Tissue Molds ThermoFisher Scientific 22-363-553
Mouse Surgical Disection Kit ThermoFisher Scientific 13-005-204
Optimal Cutting Medium ThermoFisher Scientific 23-730-571
4% Paraformaldehyde ThermoFisher Scientific AAJ19943K2
Glass Capillary Tubes Harvard Apparatus EC1 64-0770
Glomerular Permeability Rig Built at the Univeristy of Bristol - not comercially available Citation of LpA rig: Salmon et al. 2006; J. Physiol
Stainless Steel Sieves Cole-Parmer WZ-59984
Periodic Acid-Schiff (PAS) Staining System Sigma-Aldrich 395B-1KT
Hematoxylin Sigma-Aldrich H3136
Xylene MerckMillipore 108298
Poly-Prep Slides Sigma-Aldrich P0425-72EA
Mounting Medium ThermoFisher Scientific 8030
Osmium tetroxide solution Sigma-Aldrich 75632
Aradite Resin Agar Scientific CY212
Uranyl Acetate Agar Scientific AGR1260A
Lead Citrate Agar Scientific AGR1210
Cryostat ThermoFisher Scientific e.g. 957000H
Hydrophobic Pen Abcam ab2601
Nephrin (1243-1256) Antibody Acris BP5030
Anti-Podocin Sigma-Aldrich P0372-200UL
Anti-CD31 BD Biosciences 550274
Alexa Fluor Secondary Antibody ThermoFisher Scientific A32732
Vectashield Mounting Medium with DAPI Vector Labs H-1200
NP40 Cell Lysis Buffer ThermoFisher Scientific FNN0021
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail ThermoFisher Scientific 78437X4
10x Transfer Buffer BIORAD 1610734
PVDF Membrane ThermoFisher Scientific LC2002
HRP-Conjugated Secondary Antibodies Abcam ab6721
ECF Substrate for Western Blotting Fisher 10713387
TRIzol ThermoFisher Scientific 15596018
Dnase I New England Biolabs M0303S
M-MLV Reverse Transcriptase New England Biolabs M053S
Oligo dT ThermoFisher Scientific 18418012
Random Primers ThermoFisher Scientific 48190011
dNTP ThermoFisher Scientific 18427088
Ribonuclease Inhibitor ThermoFisher Scientific 10777019
DEPC Water ThermoFisher Scientific AM9915G
Fluorescent Light Miscroscope Leica Microsystems
Image J Analysis Software Image J
PCR Thermocycler ThermoFisher Scientific
TEM Microscope Britannica

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References

  1. Humtstrom, M. Development of structural kidney damage in spontaneously hypertensive rats. Journal of Hypertension. 30 (6), 1087-1091 (2012).
  2. Kitada, M., Ogura, Y., Koya, D. Rodent models of diabetic nephropathy: their utility and limitations. International Journal of Nephrology and Renovascular Disease. 14 (9), 279-290 (2016).
  3. Tesch, G. H., Lim, A. K. Recent insights into diabetic renal injury form the db/db mouse model of type 2 diabetic nephropathy. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 300 (2), F301-F310 (2011).
  4. Fogo, A. B. Animal models of FSGS: lessons for pathogenesis and treatment. Seminars in Nephrology. 23 (2), 161-171 (2003).
  5. Stevens, M., et al. VEGF-A165b protects against proteinuria in a mouse model with progressive depletion of all endogenous VEGF-A splice isoforms from the kidney. Journal of Physiology. 595 (19), 6281-6298 (2017).
  6. Cosgrove, D., Kalluri, R., Miner, J. H., Segal, Y., Borza, D. B. Choosing a mouse model to study the molecular pathobiology of Alport glomerulonephritis. Kindey International. 71 (7), 615-618 (2007).
  7. Kujal, P., Vernerova, Z. 5/6 nephrectomy as an experimental model of chronic renal failure and adaptation to reduced nephron number. Ceskoslenska Fysiologuie. 57 (4), 104-109 (2008).
  8. Chevalier, R. L., Forbes, M. S., Thornhill, B. A. Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy. Kidney International. 75 (11), 1145-1152 (2009).
  9. Oltean, S., et al. VEGF165b overexpression restores normal glomerular water permeability in VEGF164-overexpressing adult mice. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 303 (7), F1026-F1036 (2012).
  10. Salmon, A. H., Neal, C. R., Bates, D. O., Harper, S. J. Vascular endothelial growth factor increases the ultrafiltration coefficient in isolated intact Wistar rat glomeruli. Journal of Physiology. 570 (Pt 1), 141-156 (2006).
  11. Zheng, F., Striker, G. E., Esposito, C., Lupia, E., Striker, L. J. Strain differences rather than hyperglycemia determine the severity of glomerulosclerosis in mice. Kidney International. 54 (6), 1999-2007 (1998).
  12. Betz, B., Conway, B. R. An update on the use of animal models in diabetic nephropathy research. Current Diabetes Reports. 16 (18), (2016).
  13. Savin, V. J., Terreros, D. A. Filtration in single isolated mammalian glomeruli. Kidney International. 20 (2), 188-197 (1981).
  14. Neal, C. R., Crook, H., Bell, E., Harper, S. J., Bates, D. O. Three-dimensional reconstruction of glomeruli by electron microscopy reveals a distinct restrictive urinary subpodocyte space. Journal of the American Society of Nephrology. 16 (5), 1223-1235 (2005).
  15. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medicine & Science. 4 (9), 429-434 (2012).
  16. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry. 162 (1), 156-159 (1987).
  17. Adembri, C., et al. Sepsis induces albuminuria and alterations in the glomerular filtration barrier: a morphofunctional study in the rat. Critical Care. 15 (6), R277 (2011).
  18. Ma, S. T., Liu, D. L., Deng, J. J., Niu, R., Liu, R. B. Effect of arctiin on glomerular filtration barrier damage in STZ-induced diabetic nephropathy rats. Phytotherapy Research. 27 (10), 1474-1480 (2013).
  19. Oltean, S., et al. Vascular endothelial growth factor-A165b is protective and restores endothelial glycocalyx in diabetic nephropathy. Journal of the American Society of Nephrology. 26 (8), 1889-1904 (2015).
  20. Zhang, H., et al. Podocyte-specific overexpression of GLUT1 surprisingly reduces mesangial matric expansion in diabetic nephropathy in mice. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 299 (1), F91-F98 (2010).

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चिकित्सा मुद्दा १३६ Glomerular phenotype गुर्दे की बीमारी के माउस मॉडल Glomerular पारगम्यता Glomerular अल्ट्रा संरचना Glomerular समारोह के तंत्र वीईजीएफ़-A
Glomerular रोग के माउस मॉडलों में गुर्दे समारोह का आकलन
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Stevens, M., Oltean, S. Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease. J. Vis. Exp. (136), e57764, doi:10.3791/57764 (2018).

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