Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Vurdering av nyrefunksjon i musen modeller av Glomerular sykdom

Published: June 30, 2018 doi: 10.3791/57764
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3
1Institute of Biomedical and Clinical Sciences, Medical School, University of Exeter, 2School of Physiology, Pharmacology and Neurosciences, University of Bristol, 3Bristol Renal, School of Clinical Sciences, University of Bristol

Summary

Denne protokollen beskriver en full nyre arbeidet opp som skal utføres i musen modeller av glomerular sykdom. Metodene gir detaljert funksjonelle, strukturelle og mekanistisk analyse av glomerular-funksjonen, som kan brukes på alle musen modeller av glomerular sykdom.

Abstract

Bruk av murine modeller å etterligne menneskelige nyresykdom er stadig mer vanlig. Vår forskning er fokusert på vurderingen av glomerular funksjonen i diabetiker nephropathy og podocyte-spesifikke VEGF-en bank-out mus; Derfor beskriver denne protokollen full nyre arbeid-opp brukes i vår lab til å vurdere disse musen modeller av glomerular sykdom, slik at en stor mengde informasjon om nyre og glomerular funksjonen skal hentes fra et enkelt museklikk. I forhold til alternative metoder i litteraturen å vurdere glomerular funksjonen, kan bruk av metoden beskrevet i dette dokumentet glomerular fenotypen evalueres fullt fra flere aspekter. På denne måten, kan forskeren bestemme nyre fenotypen av modellen og vurdere mekanisme som hvorfor fenotypen utvikler. Denne viktige informasjonen på mekanismen av sykdommen er nødvendig når undersøke potensielle terapeutiske avenyene i disse modellene. Metodene tillater detaljert funksjonelle vurdering av glomerular filtrering barrieren gjennom måling av urin albumin creatinine forholdet og personlige glomerular vann permeabilitet, samt både strukturelle og ultra strukturelle undersøkelse ved hjelp av periodiske Acid Schiff flekken og elektronmikroskop. Videre kan analyse av gener dysregulated på mRNA og protein mekanistisk analyse av glomerular funksjonen. Denne protokollen skisserer generiske men tilpasningsdyktige metodene som kan brukes på alle musen modeller av glomerular sykdom.

Introduction

Bruk av murine modeller å etterligne menneskelige nyresykdom er stadig mer vanlig. Slike murine modeller inkluderer spontan modeller som spontant Hypertensiv rotter (SHR)1, streptozotocin (STZ)-indusert diabetiker rotter og mus2og db/db type II diabetiker mus3, genmodifiserte modeller som primære podocyte-spesifikke fokal Segmentinformasjon glomerular sklerose (FSGS) modeller4, den podocyte-spesifikke vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF A) knock-out (VEGF-A KO) modell5, og Alport syndrom modeller6, og kjøpt modeller som 5/6 nephrectomy7 og ensidig ureteral hindringen (UUO) modell8. Det finnes flere teknikker for å vurdere de ulike aspektene av glomerular funksjonen i disse modellene. Formålet med utredningen metoden er å vise en omfattende arbeidet opp som skal utføres i musen modeller av nyresykdom for å fullt ut vurdere glomerular funksjon.

Begrunnelsen bak bruken av denne metoden er at den lar glomerular fenotypen evalueres fullt fra flere aspekter. Dette inkluderer vurdere glomerular permeabilitet, både protein og vann, glomerular strukturelle unormalt og endringer i uttrykk/skjøting av mRNAs og proteiner viktig for normal glomerular funksjon. På denne måten, er forskeren kjøpedyktig avgjøre nyre fenotypen av modellen og vurdere mekanisme som hvorfor fenotypen utvikler. Dette er viktig informasjon på mekanismen av sykdom, som kreves når undersøke potensielle terapeutiske avenyene i disse modellene.

I litteraturen er det en vanlig foreteelse presenteres med en musemodell av glomerular sykdom der fenotypen bestemmes av et forhøyet nivå av albumin i urinen. Men er det bevis som tyder på at en enkel metode for å bestemme glomerular funksjon ikke er alltid effektiv; måle urin albumin utskillelse hastigheten eller urin albumin creatinine forholdet (uACR) bare gir informasjon på totalt nyre-funksjon, og ikke av de individuelle glomeruli. Tidligere studier har vist at permeabilitet kan variere i ulike glomeruli fra samme nyre5,9,10. I tillegg er vurdering av permeabilitet av personlige glomeruli mer følsom måte vurdere glomerular funksjon; teknikken å måle personlige glomerular vann permeabilitet (LpA / Vjeg) har vist seg for å være mer følsomme for endringer i glomerular funksjon enn måle uACR9. Denne analysen er nyttig i musen modeller som er resistente mot proteinuria, slik som de på en c57BL/6 bakgrunn11. Fordelen med denne metoden utredningen er at den undersøker både totale nyre permeabilitet til albumin samt individuelle glomerular permeabilitet til vann.

Undersøkelse av glomerular strukturelle unormalt vurderes ofte av et batteri av flekker som periodisk Acid Schiff (PAS), trichrome, og sølv flekker. Dette aktiverer en utdannet nyre patologen å evaluere nyresykdom via en scoring metode. Selv om alle gode metoder, endringer i glomerular makro-strukturen ikke er alltid observert i modeller akutt nyre skader12. Denne metoden foreslår at i tillegg til å utføre nyre histology teknikkene ovenfor, glomerular ultra-strukturen bør også vurderes via elektronmikroskop (EM). En farget glomerulus kan se relativt normalt under vanlig lys mikroskop; men på vurderingen EM, små endringer i glomerular kjeller membran (GBM) bredde, er podocyte foten prosessen effacement endotelial fenestrations og sub-podocyte plass dekningen analysert. Derfor er det viktig at både glomerular ultra-struktur og mikro-strukturen er vurdert for å avgjøre mekanismen av glomerular dysfunksjon.

I tillegg til å vurdere glomerular strukturelle unormalt, bør endringer i mRNA protein uttrykk og skjøting, samt protein Aktivisering (f.eks, fosforylering) undersøkes for å belyse ytterligere mekanismer av glomerular sykdom. Når du ser på glomerular sykdom, eller, for eksempel når KO/over-expressing et gen spesielt i glomerular celler, som podocyte-spesifikke VEGF-A KO musen5, er det viktig at protein og mRNA endringene er undersøkt bare innenfor den glomerular celler, og ikke hele nyrene. Denne protokollen beskriver en metode der glomeruli er isolert fra mus nyre cortex, og protein/RNA er isolert. Dette gir bestemte analyse av protein/mRNA feilregulering i glomeruli av sykdom modell.

Denne protokollen beskriver en full nyre arbeidet opp som skal utføres i musen modeller av glomerular sykdom, slik at en stor mengde informasjon om nyre og glomerular funksjonen skal hentes fra et enkelt museklikk. Metodene gir detaljert funksjonelle, strukturelle og mekanistisk analyse av glomerular-funksjonen, som kan brukes på alle musen modeller av glomerular sykdom.

Protocol

Alle eksperimentene ble utført i henhold til britisk lovgivning og lokal etisk komité godkjenning. Dyrestudier ble godkjent av University of Bristol forskning etikk.

1. urin Albumin Creatinine forholdet (uACR)

Merk: UACR brukes til å vurdere permeabilitet av GFB til albumin. Tilstedeværelsen av albumin i urinen indikerer økt permeabilitet over GFB, som er normalisert til creatinine kontroll for variasjoner i urin flow rate. Albuminuria er en vanlig markør for kronisk nyresykdom.

  1. Samle urin ved den eksperimentelle baseline og regelmessig (når ukentlig til gang i måneden) til eksperimentelle sluttpunktet.
  2. Definere musen metabolske bur med vann og berikelse diett. Plasser mus (mannlige, i alderen 6-8 uker) i personlige bur for 6 h i et stille rom.
  3. Retur mus vanlige boliger og samle urin fra Tom merdene. Det kreves minst 50 µL.
    Merk: Hvis musen ikke produserer urin i tid, gjenta på en annen dag i et varmere rom.
  4. Sentrifuge urinen 500 x g for 10 min. samler urin og beholde sediment å vurdere podocyte tap. Lagre urin på 20 ° C på kort sikt på dette punktet.
  5. Fortynne urin inn i 1% bovin serum albumin (BSA) i 1 x Tris bufret saltvann (TBS pH 7.5) i en 1:500 til 1:10000 fortynning, avhengig av alvorlighetsgraden av albuminuria.
    Merk: Slutten volumet bør være > 400 µL. Optimaliser å bestemme riktig fortynning på hver tid rett.
  6. Kvantifisere urin albumin konsentrasjonen med en musen albumin enzym koblede immunosorbent analysen (ELISA) per produsentens instruksjoner.
    1. Kort pels ELISA platen, som er optimalisert for protein bindende, med 100 µL av anti-musen albumin primære antistoffer (10 µg/mL i 0,5 M carbonate-bikarbonat pH 9.6) 1t ved romtemperatur.
    2. Vask overflødig antistoff fra brønnene fem ganger med 1 x TBS pluss 0,05% Tween (pH 8.0), og legge til 200 µL av blokkering løsning (1 x TBS med 1% BSA pH 8.0) over natten i romtemperatur.
  7. Vaske platen fem ganger og legge 100 µL av standarder (seriell fortynning: 2000 µg/mL til 15.63 µg/mL i 1 x TBS med 1% BSA, pH 8.0), tomt og fortynnede prøvene i tre eksemplarer. La stå i 1 time ved romtemperatur deretter vaske platen fem ganger.
    1. Tilsett 100 µL HRP oppdagelsen antistoff hver brønn (10 ng/mL i 1xTBS med 1% BSA, pH 8.0) og ruge ved romtemperatur 1t.
    2. Vaske platen fem ganger og legge 100 µL av enzymet substratløsningen i hver brønn. La platen i mørket for å utvikle i 15 min og stoppe reaksjonen ved å legge til 100 µL av 0,18 M svovelsyre (H2SO4).
      FORSIKTIG: H2så4 er etsende.
  8. Bestemme albumin konsentrasjonen av hver prøve ved å lese platen på en absorbansen på 450 nm. Bruk standardkurven for å kvantifisere albumin i hver prøve. Hvis tekniske gjentakelser har en CV verdi større enn 5%, gjenta analysen for disse prøvene.
  9. Eventuelt vurdere urin albumin konsentrasjonen med geleelektroforese. Legge til 5 µL av 4 x protein eksempel lasting buffer 15 µL av urin. Varme prøver til 95 ° C i 10 min og deretter laste inn en 4-12% Tris precast gel.
    1. Kjør gel på 100 V og flekker over natten i Coomassie blå per produsentens protokollen.
    2. Etter bildebehandling gel, bruk densitometry å vurdere fold endre albumin konsentrasjon i forhold til kontrollen.
      Merk: Hvis ingen band observeres for albumin når forventet, vurdere protein konsentrasjonen av urin og justere volumet på urin lagt til gel.
  10. Fortynne den rå urinprøve i dH2O på 1:1, 1:5 og 1:10.
    Merk: Slutten volumet bør være > 70 µL. Optimaliser å bestemme riktig fortynning av hvert utvalg.
  11. Kvantifisere urin creatinine konsentrasjonen med en kjemisk analyse per kit instruksjonene. Kort, laste 20 µL av creatinine standarder, tomme, eller fortynnede urin til en 96 godt plate i tre eksemplarer.
  12. Bestemme creatinine konsentrasjonen av hver prøve ved å lese platen på en absorbansen av 490 nm før og etter tillegg av syre løsningen (forsiktighet, etsende, unngå kontakt med hud).
    Merk: Forskjellen mellom absorbansen verdiene er direkte proporsjonal med creatinine konsentrasjonen i hver prøve. En standardkurve er generasjon fra standardene. Hvis tekniske gjentakelser har en CV verdi større enn 5%, gjenta analysen for disse prøvene.
  13. Generere uACR (µg/mg). Normalisere data til verdien for planlagt av hver mus for grafisk fremstilling.

2. vev og blod samling

Merk: Nyrene og glomerular vev kan brukes til å vurdere strukturelle, protein og mRNA uttrykk markører for nyresykdom. Blodet kan brukes til å vurdere markører for nyre funksjon, for eksempel creatinine, som kan være opp-regulert i nyre sykdom, indikerer reduksjon filtrering kapasiteten av glomeruli.

  1. Klargjør følgende løsninger: frisk 2,5% glutaraldehyde i 0.1 M natrium cacodylate (pH 7.3), 4% paraformaldehyde i 1 x fosfat bufret saltvann (PBS), pattedyr Ringer i løsning (115 mM natriumklorid (NaCl), 10 mM natrium acetate (CH3COONa), 1.2 mM natrium fosfat (Na2HPO4), 25 MM natriumbikarbonat (NaHCO3), 1.2 mM Magnesiumsulfat (MgSO4), 1 mM veisalt (CaCl2), 5,5 D (+) glukose, pH 7.4) med 1% BSA og 1 x PBS.
    FORSIKTIG: 2,5% glutaraldehyde: giftig, følsom, irriterende; bruke en røyk skap. 0.1 M natrium cacodylate: giftig, bruk i røyk regjering. 4% PFA: bindemiddel, bruk i røyk skap
  2. Klargjør følgende materialer: isoflurane, små ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA)-belagt blod rør, 23-25G nåler, 5 mL EDTA belagt sprøyter, 10 mL hetteglass, 10 mL plast ampuller, 0,5 mL plast rør, disponibel vev muggsopp, tørris, flytende N 2, mus kirurgiske verktøy og optimal kutte medium (OCT).
  3. Plass musen under dyp anestesi, som er kontrollert av musen å være ikke-responsiv til en nål stikk til fot pad, bruker en isoflurane kammer eller tilsvarende ruter terminal bedøvelse som injiserbare bedøvende agenter (pentobarbital, 50 mg/kg intraperitoneal [IP]; avertin, 240 mg/kg IP), eller karbondioksid (CO2) eksponering (75% CO2/25% O2).
  4. Innhente musen via cardiac punktering i venstre ventrikkel og samle så mye blod som mulig. Overføre til EDTA-belagt blod røret opp til 4 h. Hvis foretrukket, kan mus bli hentet via cervical forvridning med omtanke ikke til ruptur vena jugularis.
  5. Dissekere ut nyrene gjennom magen og vask i isen kalde 1 x PBS.
  6. For å undersøke de kortikale glomeruli, fjerne en pol av nyre cortex og skåret i 1 mm3 stykker. For å undersøke de dype juxta-medullær glomeruli, gjenta den samme teknikken med vev fra margen. Sett i 5 mL 2,5% glutaraldehyde løsning i et hetteglass EM. Butikken på 4 ° C.
    FORSIKTIG: 2,5% glutaraldehyde løsning: giftig, følsom, irriterende; Bruk i en røyk skap
    Merk: prosessen innen 1 måned for best resultat.
  7. Histology, fjerne den høyeste tredjedelen av nyre, slik både kortikale og juxta-medullær glomeruli vil være tilstede, og fastsette i 5 mL av 4% paraformaldehyde på 4 ° C for 24 h. overføring til 5 mL av 70% EtOH i 24 timer før innebygging i parafin.
    FORSIKTIG: 4% PFA: bindemiddel, bruk i røyk skap
  8. For immunofluorescence, plasserer en tredjedel av nyrene å sikre både kortikale og medullær glomeruli vil være tilstede, i vev mold og strøk i oktober sted på tørris fryse og lagre på-80 ° C.
  9. For protein og RNA fryse sted 3 x 2 mm3 stykker av nyre cortex 0,5 mL plast rør og fest i flytende N2. Butikken på-80 ° C. For langsiktige vev lagring for RNA, plasserer vev i 5 mengder RNA stabilisering løsning og lagrer på-80 ° C.
  10. For isolering av glomeruli, skjære opp gjenværende nyre vev og plasser i 5 mL av pattedyr Ringer i løsning med 1% BSA på is. Forberede å sil glomeruli umiddelbart.

3. plasma Creatinine

Merk: Plasma creatinine kan opp-regulert i nyre sykdom, indikerer reduksjon filtrering kapasiteten av glomeruli. Blod urea nitrogen (BUN) nivåer kan også bli vurdert, selv om protokollen ikke er beskrevet her.

  1. Sentrifuge blodprøve på 500 x g i 15 min på 4 ° C.
  2. Samle plasma, som kan være lagret på 20 ° C på kort sikt på dette punktet.
  3. Kvantifisere plasma creatinine konsentrasjonen med en kjemisk creatinine analysen per instruksjonene ovenfor for urin creatinine i protokollen 1.11.
  4. Bestemme creatinine konsentrasjonen av hver prøve ved å lese platen på en absorbansen av 490 nm før og etter tillegg av syre løsningen.
    Merk: Forskjellen mellom disse absorbansen verdiene er direkte proporsjonal med creatinine konsentrasjonen i hver prøve. En standardkurve er generasjon fra standardene. Hvis tekniske gjentakelser har en CV verdi større enn 5%, gjenta analysen for disse prøvene.

4. isolering av Glomeruli

Merk: Glomeruli kan isoleres for å vurdere permeabilitet av personlige glomeruli ex vivo, samt uttrykk for bestemt protein og mRNA markører av glomerular sykdom.

  1. Ta nyre vev i pattedyr Ringer i løsning med 1% BSA og dissekere glomeruli bruker et standard sikting teknikk13. Kort, stables de 70 µm (nederst), 100 µm, 125 µm, 175 µm, 250 µm og 425 µm (øverst) sikter på et glass beger.
  2. Bland nyre, bruker en sprøytestempelet i 425 µm sil og presse gjennom isen kalde pattedyr Ringer løsning med 1% BSA. Som biter av nyre er presset gjennom, fjerne topp silen og fortsette å gjøre det samme på neste. Gjenta til bare 100 µm og 70 µm sikter fortsatt.
  3. Overføre glomerular innhøstingen beholdes av den 100 µm og 70 µm sikter til 10 mL av fersk pattedyr Ringer i løsning med 1% BSA, på is.
    Merk: Hvis glomeruli per mL Ringer i løsningen er få, redusere volumet av Ringer i løsningen brukes til å samle glomeruli fra de to siste sikter.
  4. Fjerne 5 mL av løsningen som inneholder glomeruli i to separate rør (2.5 mL hver) og sentrifuge 1000 x g for 10 min på 4 ° C. Fjern nedbryting og fest fryse glomeruli i væsken N2 før lagring ved-80 ° C i protein og RNA utvinning på et senere tidspunkt.
  5. Plasser de resterende løsningen som inneholder glomeruli i et vannbad på 37 ° C for måling av glomerular LpA / Vjegex vivo. Fullført innen 3 h å fjerne nyrene.

5. glomerular vann permeabilitet (LpA / Vjeg)

Merk: Glomerular LpA / Vjeg analysen gjør ex vivo måling av permeabilitet av personlige glomeruli i en rask en reproduserbar måte. En økning i glomerular LpA / Vjeg angir avbrudd i GFB, som er ladet av nyre sykdom.

  1. Definere glomerular LpA / Vjeg rigg som beskrevet i laks et al10. Se figur 1 for et detaljert diagram av oppsettet.
  2. Klargjør følgende løsninger: pattedyr Ringer i løsning med 1% BSA (pH 7.4) og pattedyr Ringer i løsning med 8% BSA (pH 7.4). Varme både 37 ° C.
  3. Trekke Mikropipetter fra BILLEDRØR kapillær (optisk tetthet: 1,2 mm). Generere en 5-8 µm aperture-tips ved å kutte brønnene under et mikroskop.
  4. Bruker du glomerular LpA / Vjeg rigg for å fange intakt individuelle glomeruli som er fri for Bowman's capsule og rørformede fragmenter på brønnene bruke sugekraft. En detaljert oversikt over oncometric analysen er funnet i laks et al10. I korte trekk, når et glomerulus er fanget og sikret på sug brønnene, begynne innspillingen video av glomerulus under mikroskop.
  5. For det første equilibrate glomerulus i 1% BSA Ringetonens løsning for 30 s før perifusate konsentrert 8% BSA Ringetonens løsning for 10 s. Deretter bytte til perifusate til 1% BSA Ringer i løsningen og stoppe innspillingen.
  6. Vask glomerulus bort og gjenta prosessen for 10-15 glomeruli per musen. Sikre perifusate flow priser er identiske og ikke rask (10 mL/min) for ikke å forvrenge glomerular strukturen.
  7. Måle den innledende rate av glomerular krymping beregne glomerular vann permeabilitet (LpA) normalisert glomerular volumet (Vjeg). Du finner detaljert informasjon om analysen i laks et al10.

6. periodiske Acid Schiff (PAS) flekken

Merk: PAS flekken vil markere kjelleren membraner av glomerular kapillær looper og rørformede epitel. Det kan detaljerte visualisering av glomerular celler, mesangial matrise og potensial ekspansjon og mulige endringer av GBM (dvs., jevning og uregelmessigheter).

  1. Delen parafin-innebygd, PFA-fast nyre cortex bruker en mikrotom på 5 µm tykkelse på poly-L-lysine belagt lysbilder. Tørr på 37 ° C i 1 h. Kontroller delen inneholder ikke noen kaster eller hull, som kan forvrenge morfologi under mikroskopet.
  2. Deparaffinize lysbilder av rugende to ganger i xylen (forsiktighet, irriterende, bruk i røyk kabinett) 3 minutter hver, to ganger i 100% EtOH for 3 min og deretter gang 95%, 70% og 50% EtOH i 3 minutter hver, alle ved romtemperatur. Nytt hydrat lysbildene i dH2O.
  3. Inkuber lysbildene i periodiske acid løsning (forsiktighet, irriterende, bruk i røyk kabinett) (1 g/dL) i 5 minutter, og deretter skyll lysbildene i flere endringer av dH2O. bruke en container med 100 mL dH2O ved romtemperatur.
    FORSIKTIG: periodiske acid løsning: irriterende; Bruk i røyk skap
  4. Inkuber lysbilder i Schiff's reagens (Parasoaniline HCl 6 finans og natrium metabisulfite 4% i HCl 0,25 mol/L) i 15 min ved romtemperatur. Vask lysbilder i rennende vann fra springen i 5 min.
  5. Counterstain med Hematoxylin for 3 før grundig skylling lysbilder i rennende vann fra springen i 15 min.
    Merk: Noen optimalisering kan pålegges å avgjøre det optimale tidspunktet for Hematoxylin flekker.
  6. Tørke lysbilder med baksiden av deparaffinization protokollen i trinn 6.2. Avslutt med xylen.
  7. Luften tørr lysbilder og montere med xylen-baserte monterer medier.
  8. Bildet lys mikroskop på 400 X forstørrelse å vurdere glomerular strukturer. Vurdere følgende: jevning og uregelmessigheter i GBM, skjuling av kapillær looper, fibrotiske vev, sklerose, mobilnettet spredning (endothelial, podocyte, og mesangial eller betennelsesceller infiltrere tuft).
    Merk: En omfattende evaluering av glomerular patofysiologi, lesjoner andre steder i nyrene bør være evaluerte, slik som på tubuli.

7. overføring elektronmikroskop (TEM)

Merk: TEM tillater undersøkelse av ultra strukturelle forandringer i nyrene som GBM, podocyte foten prosesser og endotelial fenestrations, som ikke er synlige med * lys. Dette er viktig i modeller der nyre skader ikke er så uttalt (dvs., albuminuria og store strukturelle unormalt).

  1. Ta 2,5% gluteraldehdye - fast terninger nyrene og etter fikse i 1% osmium tetroxide for 1 h. vask i 50 mL av 0.1 M cacodylate buffer (pH 7.3) og deretter 50 mL av dH2O (3 x 15 min endringer).
    FORSIKTIG: 2,5% glutaraldehyde: giftig, følsom, irriterende; bruke en røyk skap. 0.1 M natrium cacodylate: giftig, bruk i røyk regjering
  2. Tørke med EtOH og bygge i Araldite harpiks.
  3. Skjær deler på 50-100 nm tykkelse og flekker med 3% (vannbasert) uranyl acetate og Reynolds' føre citrate løsning.
  4. Ta digital micrographs over flere områder av glomerulus på 940 X 1250 X og 6200 X å forsikre det podocytes, GEnCs, GBM og mesangium kan identifiseres.
  5. Bruke ImageJ for å analysere blendet glomeruli. Angi skalaen for hver 6200 X mikroskop-bilde ved å tegne en linje mellom to punkter kjent avstand, som en linjal. Gå til å analysere, og angi deretter skalaen, der hvor linjen vises i piksler. Skriv inn i kjent distanse og enheter. Bruk protokollene nedenfor for måling av hver parameter.
    Merk: Denne analysen krever rundt 1 dag per musen. For tilstrekkelig statistisk styrke, bruk de gjennomsnittlige målingene fra 3 glomeruli fra 3 mus.
    1. For GBM, sette inn et fast digital rutenett (10 x 10) over 6200 X mikroskop-bilde og måle tykkelsen på GBM på punktet hvor rutenettlinjene krysse i GBM. Mål fra basale endothelial cellemembranen til basale podocyte foten prosessen cellemembranen i en vinkelrett tangenten til endothelial cellemembranen ved hjelp av verktøyet rett linje. Bestemme mener målene for hver glomerulus fra 10 enkeltmål.
    2. For hvor endothelial fenestration måle lengden av GBM i 6200 X mikroskop-bilde og antall endotelial fenestrations per enhet lengden på GBM. Ta et gjennomsnitt fra minst 4 micrographs per glomerulus.
    3. For podocyte fot prosessen bredde, sette inn et fast digital rutenett (10 x 10) over 6200 X mikroskop-bilde. Måle bredden på podocyte fot prosessene som krysser linjene i rutenettet. Måle bredden på den bredeste delen av foten hvor den møter GBM; Kontroller linjen er vinkelrett tangens av podocyte basale membranen. Bestemme mener målene for hver glomerulus fra 10 enkeltmål.
    4. Sette inn et fast digital rutenett (10 x 10) over 6200 X mikroskop-bilde for podocyte slit bredde. Mål vidden av podocyte slit stråling som krysser linjene i rutenettet. Dette er punktet hvor foten prosessene er nærmeste sammen på den bredeste delen av hver fot prosess, fra podocyte membran til membran. Kontroller målingen er vinkelrett tangens av podocyte basale membranen. Bestemme mener målene for hver glomerulus fra 10 enkeltmål.
    5. Av podocyte foten prosesser, måle lengden av GBM i 6200 X mikroskop-bilde og antall podocyte foten prosesser per enhet lengden på GBM. Ta et gjennomsnitt fra minst 4 micrographs per glomerulus.
    6. For sub-podocyte plass dekning, kan du se detaljert metode i Neal et al. 14.
  6. Bruker 940 X micrographs, undersøke glomeruli for tilstedeværelsen av unormal struktur, innskudd og infiltrerer av øyet.

8. immunofluorescence for Podocyte og Endothelial markører

Merk: Immunostaining kan visualisering av protein uttrykk mønstre, for eksempel endothelial kapillær looper, som kan skjule i glomerular sykdom.

  1. Plass OCT-mold som inneholder frosne nyre på 20 ° C for 2t før snitting. Sikre kuttet overflaten av nyre er nøye plassert mot bunnen av OCT-mold å aktivere godt orientert vev deler.
  2. Bruker en kryostaten, belagt delen vev på 5 µm tykkelse på poly-L-lysine lysbilder.
    Merk: Kontroller at det er ingen kaster eller hull i delen vev som kan forvrenge morfologi.
  3. Ved fjerning fra kryostaten, fikse lysbilder i 4% PFA for 10 min. vask lysbilder 3 x 5 minutter i en container med 100 mL av dH2O.
    FORSIKTIG: 4% PFA: bindemiddel, bruk i røyk skap
  4. For å minimere mengden av antistoff brukes, tegn rundt deler med en hydrofobe penn. Ikke la delene tørr.
  5. Inkuber i blokkering løsning (3% BSA og 5% normal serum i 1 x PBS) 1t ved romtemperatur.
  6. Fjern blokkering løsningen med en aspirator og ruge seksjoner med primære antistoff (Nephrin, podocin eller PECAM-1) fortynnet 1:250 (3% BSA på 1 x PBS). Plasser lysbilder i en fuktet kammer på 4 ° C over natten. Hvis en fuktig kammer ikke er tilgjengelig, lett sette en liten stripe av parafilm over antistoff lysbildet. Vær forsiktig når du fjerner dagen som ikke forstyrre delen.
  7. Vask lysbilder 3 x 5 min i 1 x PBS.
  8. Inkuber med passende fluorescerende sekundære antistoff fortynning 1:1000 (3% BSA på 1 x PBS) for 2 timer ved romtemperatur i mørket.
  9. Vask lysbilder 3 x 5 min i 1 x PBS. Montere med fluorescerende montering mediet som inneholder DAPI.
  10. Bildet lysbilder med fluorescerende mikroskop på 400 X forstørrelse vise i glomeruli. Sikre dette er blindet for å unngå skjevheter.
  11. Bruk ImageJ analysere flekker intensiteten, normalisert glomerular området og mønsteret av flekker, dvs., antall kapillær looper normalisert til glomerular området, på en blendet måte.

9. protein utvinning og vestlige Blotting

Merk: Vestlige blotting tillater oss å vurdere uttrykk proteiner kjent for å være dysregulated i nyre sykdom. En reduksjon i podocin og nephrin uttrykk angir for eksempel podocyte tap.

  1. Ekstra protein fra nyre cortex og soldet glomeruli; protokollen er den samme for hver og volumet av lyseringsbuffer justeres for vev.
  2. Tine nyre/glomeruli på is ør NP-40 lysis buffer (150 mM NaCl, 1% NP-40, 50 mM Tris pH 8) som inneholder protease og fosfatase hemmere. Homogenize prøven for 30 s.
  3. Inkuber homogenisert prøvene på is 30 min, vortexing med jevne mellomrom.
  4. Sentrifuge prøvene 10.000 x g i 15 min på 4 ° C.
  5. Fjerne nedbryting slik frisk på is.
    Merk: forvent å komme ca 1 mg protein per prøve.
  6. Denature proteiner bruker standard 4 x Laemmli bufferen. Koke blandingen på 95-100 ° C for 5 min.
  7. Vurdere uttrykket glomerular celle markør proteiner (Nephrin, Podocin, PECAM-1, osv.) og fosforylering og uttrykk for proteiner kjent/hypotetiske endres i nyre/glomeruli av sykdom modellen med Western blotting) standard metode; Mahmood og Yang15).
    Merk: Protokollen vil variere avhengig av størrelsen og overflod av protein av interesse.

10. RNA utvinning og polymerasekjedereaksjons (PCR)

Merk: mRNA uttrykk analyse tillater oss å bestemme hvordan gener er regulert i nyre sykdom, for eksempel endringer i genuttrykk og alternativ skjøting.

  1. Mens nyre cortex er fortsatt frosset, grundig grind i 3 mL fenol reagens bruker en morter. Hvis bruker glomerular ekstrakter, Legg 1 mL av fenol reagens og homogenize utvalget for 30 s.
    FORSIKTIG: TRIzol reagens: irriterende; Bruk i røyk skap
  2. Utføre en RNA utvinning med metoden beskrevet av Chomczynski og Sacchi16.
    Merk: Kommersielle RNA utvinning kits er tilgjengelig som et alternativ til denne metoden.
  3. Vurdere mengden og kvaliteten av får en av de ulike metodene tilgjengelig. RNA er aliquoted og lagret på-80 ° C på dette punktet. Unngå gjentakelse fryse tining.
    Merk: Hvis ny å denne metoden, sjekke kvaliteten på RNA før du fortsetter til neste trinn ved å kjøre RNA på en agarose gel å sikre en klar 28S og 18S ribosomal band. Forvente å komme seg mellom 2 til 5 µg av benytter denne metoden.
  4. DNase behandle 1 µg av RNA (volum opp til 10 µL med RNase-fritt vann pluss 1 µL av DNase og 1 µL av DNase buffer) 1t på 37 ° C. Stopp reaksjon med 1 µL DNase stopp løsning på 65 ° C i 10 min.
  5. Legg til 0,5 µL oligo (dT) og tilfeldig primere. Inkuber ved 70 ° C i 10 min.
  6. Slukke umiddelbart på is 5 min.
  7. Legg til følgende; MMLV revers transkriptase enzym (400 U, Erstatt med DEPC H2O i RT - kontroll prøven), MMLV buffer (1 x), dNTP mix (0,5 mM) og ribonuclease inhibitor (40 U); lage opptil 50 µL med DEPC vann.
  8. Inkuber reaksjonen blanding på 37 ° C 1t etterfulgt av 95 ° C i 5 min å deaktivere enzymet.
    Merk: For å generere en høyere avkastning av cDNA, ruge ved 37 ° C i opptil 3 h.
  9. Vurdere mengden og kvaliteten på cDNA ved hjelp av ulike metoder tilgjengelig.
  10. Bruk PCR å vurdere mRNA uttrykk og skjøting mønstre av gener hypotese skal dysregulated i glomerular sykdom modellen. Protokollen vil variere avhengig av genet av interesse.

Representative Results

Urin ble samlet inn ved hjelp av metabolske bur fra vill-type (WT), induserbart podocyte-spesifikke VEGF-en slå ut (VEGF-A KO) og VEGF-A KO X Neph-VEGF165b mus (VEGF-A KO mus som over uttrykke den menneskelige VEGF-en165b isoformen i podocytes i en grunnleggende måte). Ved måling av urin albumin creatinine forholdet uker 0, 4, 10 og 14 etter doxycycline induksjon av VEGF-A KO utviklet VEGF-A KO musene progressiv albuminuria 10 uker sammenlignet WT littermate kontroller. De absolutte verdiene kan ses i figur 2Aog den normaliserte til grunnlinjen for hver musen verdiene i figur 2B. Men albuminuria i ikke observert i VEGF-A X Neph-VEGF-A165b mus (figur 2), som indikerer at VEGF-en165b er beskyttende i modellen albuminuria5.

Den glomerular LpAVjeg ble målt i individuelle glomeruli soldet fra WT, VEGF-A KO og VEGF-A X Neph-VEGF-A165b nyrer. Et eksempel på hvordan et glomerulus er fanget og svinn observert når perifused med 8% BSA er vist i figur 3A. Denne krymping brukes deretter til å bestemme glomerular LpA / Vjeg for hver glomerulus (figur 3B). VEGF-en KO musene hadde en betydelig økt glomerular LpA / Vjeg på 14 uker post VEGF-KO induksjon sammenlignet WT kontroll glomeruli. Tross for lavere i VEGF-A X Neph-VEGF-A165b mus, økt glomerular LpA / Vjeg var ikke forhindret av over-uttrykk for VEGF-en165b på 14 uker5.

PAS farging av nyre cortex 14 uker etter innledningen av VEGF-A KO ikke avsløre noe glomerular strukturelle unormalt i VEGF-A KO eller VEGF-A X Neph-VEGF-A165b mus (figur 4A). Men på analyse av glomerular ultra-strukturen via EM, VEGF-A KO mus hadde utviklet en økt GBM bredden, redusert antall endotelial fenestrae, redusert SPS dekning og økt gjennomsnittlig podocyte slit bredde (figur 4C-4F ). Gjennomsnittlig podocyte foten behandle bredden og antallet åpninger forble uendret (figur 3B og 3 G). Over-uttrykk for VEGF-en165b i VEGF-A KO mus hindret endringene til GBM og kuttet bredde (figur 4C og 4F). Men hadde VEGF-en165b ingen effekt på endrede fenestrae antall og SPS dekning (Figur 4 d og 4E)5.

RT PCR på RNA utvunnet fra soldet glomeruli avslørt at den menneskelige VEGF-en165b mRNA er bare tilstede i VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165b mus (figur 5A). Når utdrager protein fra soldet glomeruli og vurdere nivåer av proteiner via Western blotting, ble glomerular protein uttrykk for VEGFR-2 funnet å være redusert i VEGF-A KO mus, som ble forhindret av over-uttrykk for VEGF-en165b ( Finne 5B og 5 C)5.

Figure 1
Figur 1. Diagrammatisk satt opp av glomerular permeabilitet (LpA) riggen. (A) glomerulus er fanget (B) brønnene i en holder bruke sugekraft, som er festet til en mount for stabilitet. (C) rektangulær microslide. (D) 4 X mål for et mikroskop med et videokamera. (E) 1% BSA løsning varmet til 37 ° C. (F) 8% BSA løsning varmet til 37 ° C. (G) Fjern trykk betydning to perifusate inneholder linjer, som tillater rask perifusate exchange. (H) ruten perifusate mot microslide, som deretter bader i glomerulus. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2. Urin albumin creatinine forholdet. (A) uACR verdiene på uker 0, 4, 10 og 14 etter induksjon av VEGF-A KO i WT, VEGF-A KO og VEGF-A X Neph-VEGF-A165b mus. (B) samme uACR verdier normalisert opprinnelig verdi (uke 0) av hver individuelle musen. UACR betydelig økt i VEGF-A KO mus uker 10 og 14 sammenlignet WT littermate kontroller, som ble hindret i VEGF-A X Neph-VEGF-A165b mus (* p < 0,05; Toveis VARIANSANALYSE, korreksjon for sammenligning mellom parene; n = 4-12 mus per punkt; feilfelt: standard feil av gjsnitt [SEM]). Dette tallet er endret fra Stevens et al5. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3. Måling av glomerular vann permeabilitet. (A) glomerulus er fanget på brønnene via sugekraft; perifusate er byttet fra 1% BSA (Ai) til 8% BSA (alle), og glomerular krymping er observert. (B) målinger tatt før og etter 8% BSA bryteren brukes til å fastsette den glomerular LpA / Vjeg. (C) VEGF-A KO mus utvikle en økt glomerular LpA / Vjeg på 14 uker post induksjon av VEGF-A KO sammenlignet WT kontroller. Dette var ikke betydelig forhindret i VEGF-A X Neph-VEGF-A165b mus (* p < 0,05; Enveis ANOVA, Bonferroni korreksjon for sammenligning mellom parene; n = 4-9 mus, 15-30 glomeruli; feilfelt: SEM). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4. Glomerular strukturelle analysen. (A) PAS flekker på nyre cortex inneholdt noen strukturelle forandringer i glomeruli fra WT, VEGF-A KO og VEGF-A X Neph-VEGF-A165b mus (Ai - iii). EM Avsløre Ultra strukturelle unormalt i VEGF-A KO glomeruli (Aiv - vi). (B) den gjennomsnittlige FPW ikke endre mellom grupper. (C) The GBM økte i VEGF-A KO-glomeruli som ble hindret av VEGF-A165b. (D) antall fenestrae ble redusert i VEGF-A KO glomeruli, som forble uendret av VEGF-A165b. (E) The SPS dekning var i VEGF-A KO glomeruli, som også forble uendret av VEGF-A165b. (F) gjennomsnittlig slit bredde ble økt i VEGF-A KO glomeruli, som ble hindret av VEGF-A165b. (G) hvor slit var uendret mellom de tre gruppene (* p < 0,05; Enveis ANOVA, Bonferroni korreksjon for sammenligning mellom parene; n = 3 mus, 9 glomeruli; feilfelt: SEM). Dette tallet er endret fra Stevens et al5. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5. mRNA og protein uttrykk for markører. (A) RT PCR viste at menneskelig VEGF-en165b mRNA uttrykk var bare tydelig i de soldet glomeruli fra VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165b mus. (B) vestlige blotting indikerte at VEGFR-2 protein uttrykk var ned-regulert i VEGF-A KO glomeruli, som ble forhindret i VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165b glomeruli (* p < 0,05; Enveis ANOVA, Bonferroni korreksjon for sammenligning mellom parene; n = 3 - 6 mus; feilfelt: SEM). Dette tallet er endret fra Stevens et al5. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Denne protokollen beskriver en full nyre arbeidet opp som skal utføres i musen modeller av glomerular sykdom, slik at en stor mengde informasjon om nyre og glomerular funksjonen skal hentes fra et enkelt museklikk. Kritisk trinnene i hver metode tillate detaljert funksjonelle, strukturelle og mekanistisk analyse av glomerular-funksjonen, inkludert vurdering av permeabilitet av nyrene som helhet (uACR og plasma creatinine målinger), permeabilitet av Personlige glomeruli (glomerular LpA / Vjeg), undersøkelse av strukturelle endringer (PAS Trichrome blå og EM), protein lokalisering (hvis) og glomerular genuttrykk (RT PCR og vestlige blotting). Disse metodene er nøkkelen til full vurdering av glomerular-funksjonen i musen modeller av nyre sykdom.

Når vurdere permeabilitet av GFB, har mange studier valgt for å bruke konvensjonelle uACR eller 24 h albumin utskillelse hastigheten som et effektivt tiltak17,18. Selv om disse teknikkene tillater vurdering av GFB permeabilitet som helhet, tillater den ikke for individuelle glomerular permeabilitet vurdering og variasjon blant glomeruli. Tidligere studier har funnet måling av glomerular LpA / Vjeg å være litt mer følsomme for den GFB permeabilitet5,9. Faktisk, i representative resultatene i dette papiret, på 14 uker innlegg induksjon av VEGF-A KO, VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165b mus har en betydelig lavere uACR sammenlignet med VEGF-A KO mus; men dette resultatet er ikke reflektert i glomerular LpA / Vjeg målinger, hvor VEGF-en165b ikke hindre betydelig øker i GFB permeabilitet (figur 1 og figur 2)5. Dette viser viktigheten av å bruke flere analyser for å vurdere både nyre permeabilitet og permeabilitet av personlige glomeruli. Videre glomerular LpA / Vjeg oncometric analysen antyder at permeabilitet av personlige glomeruli fra samme nyre kan variere sterkt, spesielt i sykdom modeller5,10, 19. en begrensning å måle glomerular LpA / Vjeg er at det kan bare utføres på den eksperimentelle end-point; vanlige uACR mål må derfor gi en indikasjon på den eksperimentelle sluttpunktet.

I tillegg til å vurdere funksjonelle fenotypen, oppfordrer metoden finnes også vurdering av strukturelle og ultrastructural fenotypen. Dette kan gjøres ved hjelp av et utvalg av flekker som PAS, trichrome, og sølv flekker; hver å vurdere ulike aspekter av glomerular morfologi. I akutt modeller av glomerular sykdom, som ofte er tilfelle i musen modeller, kan være vanskelig å oppdage noe store strukturelle unormalt bruker disse flekker med mindre du er en utdannet nyre patologen. Derfor er gjennomfører EM foreslått for å vurdere ultrastructure av GFB, hvilke innrømmer kvantitativ måling av parametere som GBM, endotelial fenestrae størrelse og antall og podocyte egenskaper. Slik mål krever minimal opplæring til å utføre og gir etterforskeren å finne celle-typer/strukturer påvirket på en sykdom modell. I eksemplet som vises i representant resultatene VEGF-A KO musen ble funnet å være en mild modell av glomerular sykdom, dermed var ingen store strukturelle forandringer tilstede ved PAS flekker. Podocyte-spesifikk VEGF-A KO imidlertid indusere endringer i GBM, podocytes og endotelceller når undersøke glomerular ultra-struktur5. Utarbeidelse av nyre for EM beskrevet i stede metoden aktiverer dessverre ikke påvisning av endotelial glycocalyx, som også er kjent å ha viktige effekter på permeabilitet av GFB19. For å måle glycocalyx dybden, bør nyre være perfuse-fast med 2,5% glutaraldehyde med 1% Alcian blå for endotelial glycocalyx merking, som beskrevet i Oltean et al19.

Når funksjonelle og strukturelle fenotypen har blitt vurdert, kan deretter uttrykk/aktivisering mønstre av ulike gener og veier vurderes spesielt i glomeruli. Tidligere ultra strukturelle vurdering kan gi noen informasjon om cellen typer/glomerular strukturer involvert, som angir om podocyte - eller endothelial-spesifikk gener/veier bør undersøkes. For eksempel i representant resultatene fra VEGF-A KO musene, ble en reduksjon i hvor endotelial fenestrae observert (figur 3D); Derfor ble glomerular protein uttrykk for en endothelial markør kjent være involvert i VEGF-en veien undersøkt; VEGFR-2 (figur 4B)5. I tillegg til uttrykket av proteiner i glomeruli, kan deres lokalisering også visualiseres med hvis. I en studie av Zhang et al20, ble podocyte-spesifikke overuttrykte GLUT1 bekreftet i podocytes av hvis co lokalisere den økte GLUT1 med podocin.

I forhold til alternative metoder i litteraturen å vurdere glomerular funksjonen, gjør bruk av metoden skissert i denne utredningen å vurdere nyrefunksjon i musen modeller av glomerular sykdom glomerular fenotypen evalueres fullt fra flere aspekter. På denne måten, er forskeren kjøpedyktig avgjøre nyre fenotypen av modellen og vurdere mekanisme som hvorfor fenotypen utvikler. Denne viktige informasjonen på mekanismen av sykdommen er nødvendig når undersøke potensielle terapeutiske avenyene i disse modellene. Denne metoden kan lett brukes på fremtidige etterforskning glomerular funksjonen både i vurderingen av sykdom fenotyper og potensielle therapeutics.

Avslutningsvis beskriver denne generiske og tilpasningsdyktig protokollen en full nyre arbeidet opp for musen modeller av glomerular sykdom, slik at en stor mengde informasjon om nyre og glomerular funksjonen skal hentes fra et enkelt museklikk. Metodene gir detaljert funksjonelle, strukturelle og mekanistisk analyse av glomerular-funksjonen, som kan brukes på alle musen modeller av glomerular sykdom.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av British Heart Foundation, Richard Bright VEGF Research Trust og MRC.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Metabolic Cages Harvard Apparatus 52-6731
Tris buffered saline (10x) Sigma-Aldrich T5912-1L
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A2058
Mouse Albumin ELISA Quantitation Set Bethyl Laboratories E90-134
TMB ELISA Substrate solution ThermoFisher Scientific 34028
Sulphuric acid Sigma-Aldrich 339741
SPECTRstar nano BMG Labtech SPECTRstar nano or equivalent
RNAlater stabilisation solution ThermoFisher Scientific AM7020
4-15% precast protein gel BIORAD 4568084
4x Laaemmli Sample buffer BIORAD 161-0747
Mini Trans-Blot cell BIORAD 1703930
10x Tris running buffer BIORAD 1610732
Coomassie Brilliant Blue Dye ThermoFisher Scientific 20278
Creatinine Companion Exocell 1012 Strip Plate
Glutaraldehyde Solution Sigma-Aldrich G5882
Sodium Cacodylate Sigma-Aldrich C0250
10x Phosphate Buffered Saline ThermoFisher Scientific AM9625
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S7653
Sodium Acetate Sigma-Aldrich S2889
Sodium Phosphate Sigma-Aldrich 342483
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S5761
Magnesium Sulfate Sigma-Aldrich M2643
Calcium Chloride Sigma-Aldrich C5670
D(+)Glucose Sigma-Aldrich G8270
EDTA Blood Collection tubes BD 367835
23-25G Needle BD PMC0735
EDTA Sigma-Aldrich E9884
10 ml Glass Vial Thomas Scientific 0914X10
Falcon 10 ml Polypropylene Tubes ThermoFisher Scientific 10110101
0.5 ml Tubes ThermoFisher Scientific 10681894
Disposable Tissue Molds ThermoFisher Scientific 22-363-553
Mouse Surgical Disection Kit ThermoFisher Scientific 13-005-204
Optimal Cutting Medium ThermoFisher Scientific 23-730-571
4% Paraformaldehyde ThermoFisher Scientific AAJ19943K2
Glass Capillary Tubes Harvard Apparatus EC1 64-0770
Glomerular Permeability Rig Built at the Univeristy of Bristol - not comercially available Citation of LpA rig: Salmon et al. 2006; J. Physiol
Stainless Steel Sieves Cole-Parmer WZ-59984
Periodic Acid-Schiff (PAS) Staining System Sigma-Aldrich 395B-1KT
Hematoxylin Sigma-Aldrich H3136
Xylene MerckMillipore 108298
Poly-Prep Slides Sigma-Aldrich P0425-72EA
Mounting Medium ThermoFisher Scientific 8030
Osmium tetroxide solution Sigma-Aldrich 75632
Aradite Resin Agar Scientific CY212
Uranyl Acetate Agar Scientific AGR1260A
Lead Citrate Agar Scientific AGR1210
Cryostat ThermoFisher Scientific e.g. 957000H
Hydrophobic Pen Abcam ab2601
Nephrin (1243-1256) Antibody Acris BP5030
Anti-Podocin Sigma-Aldrich P0372-200UL
Anti-CD31 BD Biosciences 550274
Alexa Fluor Secondary Antibody ThermoFisher Scientific A32732
Vectashield Mounting Medium with DAPI Vector Labs H-1200
NP40 Cell Lysis Buffer ThermoFisher Scientific FNN0021
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail ThermoFisher Scientific 78437X4
10x Transfer Buffer BIORAD 1610734
PVDF Membrane ThermoFisher Scientific LC2002
HRP-Conjugated Secondary Antibodies Abcam ab6721
ECF Substrate for Western Blotting Fisher 10713387
TRIzol ThermoFisher Scientific 15596018
Dnase I New England Biolabs M0303S
M-MLV Reverse Transcriptase New England Biolabs M053S
Oligo dT ThermoFisher Scientific 18418012
Random Primers ThermoFisher Scientific 48190011
dNTP ThermoFisher Scientific 18427088
Ribonuclease Inhibitor ThermoFisher Scientific 10777019
DEPC Water ThermoFisher Scientific AM9915G
Fluorescent Light Miscroscope Leica Microsystems
Image J Analysis Software Image J
PCR Thermocycler ThermoFisher Scientific
TEM Microscope Britannica

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Humtstrom, M. Development of structural kidney damage in spontaneously hypertensive rats. Journal of Hypertension. 30 (6), 1087-1091 (2012).
  2. Kitada, M., Ogura, Y., Koya, D. Rodent models of diabetic nephropathy: their utility and limitations. International Journal of Nephrology and Renovascular Disease. 14 (9), 279-290 (2016).
  3. Tesch, G. H., Lim, A. K. Recent insights into diabetic renal injury form the db/db mouse model of type 2 diabetic nephropathy. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 300 (2), F301-F310 (2011).
  4. Fogo, A. B. Animal models of FSGS: lessons for pathogenesis and treatment. Seminars in Nephrology. 23 (2), 161-171 (2003).
  5. Stevens, M., et al. VEGF-A165b protects against proteinuria in a mouse model with progressive depletion of all endogenous VEGF-A splice isoforms from the kidney. Journal of Physiology. 595 (19), 6281-6298 (2017).
  6. Cosgrove, D., Kalluri, R., Miner, J. H., Segal, Y., Borza, D. B. Choosing a mouse model to study the molecular pathobiology of Alport glomerulonephritis. Kindey International. 71 (7), 615-618 (2007).
  7. Kujal, P., Vernerova, Z. 5/6 nephrectomy as an experimental model of chronic renal failure and adaptation to reduced nephron number. Ceskoslenska Fysiologuie. 57 (4), 104-109 (2008).
  8. Chevalier, R. L., Forbes, M. S., Thornhill, B. A. Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy. Kidney International. 75 (11), 1145-1152 (2009).
  9. Oltean, S., et al. VEGF165b overexpression restores normal glomerular water permeability in VEGF164-overexpressing adult mice. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 303 (7), F1026-F1036 (2012).
  10. Salmon, A. H., Neal, C. R., Bates, D. O., Harper, S. J. Vascular endothelial growth factor increases the ultrafiltration coefficient in isolated intact Wistar rat glomeruli. Journal of Physiology. 570 (Pt 1), 141-156 (2006).
  11. Zheng, F., Striker, G. E., Esposito, C., Lupia, E., Striker, L. J. Strain differences rather than hyperglycemia determine the severity of glomerulosclerosis in mice. Kidney International. 54 (6), 1999-2007 (1998).
  12. Betz, B., Conway, B. R. An update on the use of animal models in diabetic nephropathy research. Current Diabetes Reports. 16 (18), (2016).
  13. Savin, V. J., Terreros, D. A. Filtration in single isolated mammalian glomeruli. Kidney International. 20 (2), 188-197 (1981).
  14. Neal, C. R., Crook, H., Bell, E., Harper, S. J., Bates, D. O. Three-dimensional reconstruction of glomeruli by electron microscopy reveals a distinct restrictive urinary subpodocyte space. Journal of the American Society of Nephrology. 16 (5), 1223-1235 (2005).
  15. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medicine & Science. 4 (9), 429-434 (2012).
  16. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry. 162 (1), 156-159 (1987).
  17. Adembri, C., et al. Sepsis induces albuminuria and alterations in the glomerular filtration barrier: a morphofunctional study in the rat. Critical Care. 15 (6), R277 (2011).
  18. Ma, S. T., Liu, D. L., Deng, J. J., Niu, R., Liu, R. B. Effect of arctiin on glomerular filtration barrier damage in STZ-induced diabetic nephropathy rats. Phytotherapy Research. 27 (10), 1474-1480 (2013).
  19. Oltean, S., et al. Vascular endothelial growth factor-A165b is protective and restores endothelial glycocalyx in diabetic nephropathy. Journal of the American Society of Nephrology. 26 (8), 1889-1904 (2015).
  20. Zhang, H., et al. Podocyte-specific overexpression of GLUT1 surprisingly reduces mesangial matric expansion in diabetic nephropathy in mice. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 299 (1), F91-F98 (2010).

Tags

Medisin problemet 136 Glomerular fenotype musen modeller av nyre sykdom glomerular permeabilitet glomerular ultra-struktur mekanismer av glomerular funksjonen VEGF-A
Vurdering av nyrefunksjon i musen modeller av Glomerular sykdom
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stevens, M., Oltean, S. Assessment… More

Stevens, M., Oltean, S. Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease. J. Vis. Exp. (136), e57764, doi:10.3791/57764 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter