Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

صبغ FM ركوب الدراجات في المشبك: مقارنة Depolarization البوتاسيوم عالية، الكهربائية وتحفيز تشانيلرهودوبسين

Published: May 24, 2018 doi: 10.3791/57765
Automatic Translation
1, 2
1Department of Biological Sciences, Vanderbilt University, 2Departments of Biological Sciences, Pharmacology, Cell and Developmental Biology, Kennedy Center for Research on Human Development, Vanderbilt University and Medical Center

Summary

حويصلة متشابك (SV) ركوب الدراجات هو الآلية الأساسية للاتصالات بين الخلايا في نهايات الخلايا العصبية. امتصاص صبغ FM وإطلاق سراح هي الوسيلة الأساسية للمعايرة الكمية SV إندو-والرقابة. هنا، نحن نقارن جميع أساليب التحفيز محرك FM1-43 ركوب الدراجات في المشبك نموذج الوصلات العصبية العضلية (NMJ) المورفولوجية .

Abstract

وتستخدم الأصباغ FM لدراسة دورة حويصلة متشابك (SV). هذه المسابر amphipathic تحتوي على رأسه ماء وذيل مسعور، جعلها للذوبان في الماء مع القدرة بشكل قابل للعكس الدخول والخروج غشاء دهني بليرس. هذه الأصباغ ستيريل نسبيا غير الفلورية في وسط مائي، ولكن أسباب الإدراج في المنشور الخارجي من غشاء البلازما > زيادة 40 س في الأسفار. في نهايات الخلايا العصبية، يتم استيعابه الأصباغ FM خلال SV الالتقام، الذين يتم الاتجار بهم داخل وبين تجمعات SV، وتم إصدارها مع الرقابة SV، توفير أداة قوية لتصور presynaptic مراحل كبيرة. يعتبر نموذج الجينية الأولية وضع المشبك جلوتاماتيرجيك والدالة المورفولوجية الوصلات العصبية العضلية (NMJ)، حيث صبغ FM التصوير قد استخدمت على نطاق واسع لقياس ديناميات SV في طائفة واسعة من الظروف المسخ. المحطة الطرفية متشابك NMJ يتم الوصول إليها بسهولة، مع مجموعة جميلة من boutons متشابك كبيرة مثالية لتطبيقات التصوير. هنا، يمكننا مقارنة وعلى النقيض من ثلاث طرق لتحفيز المورفولوجية NMJ محرك تعتمد على نشاط امتصاص صبغ FM1-43/الإفراج عن: 1) حمام تطبيق عالية [ك+] ديبولاريزي الأنسجة العضلية، 2) شفط العصب المحرك الكهربائي التحفيز ديبولاريزي الأعصاب presynaptic الطرفية، و 3) تستهدف التعبير المحورة وراثيا من المتغيرات تشانيلرهودوبسين للسيطرة المكانية، وحفز الضوء على ديبولاريزيشن. كل من هذه الأساليب على مزايا وعيوب لدراسة تأثيرات الطفرات الوراثية المتعلقة بدوره SV في المورفولوجية NMJ. وسوف نناقش هذه المزايا والعيوب لمساعدة اختيار النهج التحفيز، جنبا إلى جنب مع منهجيات محددة لكل استراتيجية. بالإضافة إلى تصوير فلوري، يمكن أن تكون الأصباغ FM فوتوكونفيرتيد إلى إشارات إلكترون كثيفة تصور استخدام مجهر إلكتروني (TEM) لدراسة آليات دورة SV على مستوى ultrastructural. نحن نقدم المقارنات من [كنفوكل] والمجهر الإلكتروني التصوير من أساليب مختلفة من التحفيز NMJ المورفولوجية ، للمساعدة في توجيه اختيار النماذج التجريبية المقبلة.

Introduction

وقد استخدمت تتميز جميل المورفولوجية اليرقات الوصلات العصبية العضلية (NMJ) جلوتاماتيرجيك المشبك نموذج لدراسة تشكيل المشبك والدالة مع طائفة واسعة من الاضطرابات الوراثية1. المحطة الطرفية العصبون يتكون من فروع إكسون متعددة، كل مع العديد من بتونس متشابك الموسع. هذه varicosities رحيب (تصل إلى 5 ميكرومتر في القطر) تحتوي على جميع الأجهزة كبيرة، بما في ذلك الحويصلات جلوتاماتيرجيك موحدة متشابك (SVs; ~ 40 نانومتر في القطر) في محمية سيتوسوليك وسهولة يمكن نشرة برك2. قفص الاتهام هذه الحويصلات في غشاء البلازما presynaptic الانصهار الموقع النشط المناطق (المزرعة)، حيث يتوسط الرقابة الإفراج العصبي الغلوتامات السكك-الاتصالات متشابك. وفي وقت لاحق، SVs يتم استردادها من غشاء البلازما عن طريق إعادة تدوير قبله، وتشغيل أو كلاثرين بوساطة الالتقام (CME) لدورات متكررة exo/الالتقام. المورفولوجية NMJ يسهل الوصول إليها ومناسبة تماما لعزل ووصف SV دورة طفرات على السواء. استخدام شاشات الجينية إلى الأمام، أدت الطفرات الرواية إلى تحديد الجينات الجديدة الحاسمة ل دورة SV3. وعلاوة على ذلك، أدت عكس النهج الوراثية بدءاً من الجينات معروفة بالفعل لاستيضاح SV دورة آليات جديدة من خلال الوصف الدقيق للمسخ ركوب الدراجات تعمل4. المورفولوجية NMJ مثالي تقريبا كإعداد متشابك تجريبية لتشريح آليات SV الالتقام والرقابة عن طريق أساليب بصريا حويصلة المسار الدراجات خلال كبيرة.

تسمح مجموعة من علامات مضيئة التعقب البصرية من الحويصلات أثناء ركوب الدراجات الديناميات، ولكن أكثر تنوعاً FM صبغ النظير الذي يتم تصنيعه أولاً قبل ماو، واو، وآخرون. 5-هيكلياً، تحتوي على صبغات FM رأسه ماء وذيل محبتين متصلاً من خلال عصابة عطرية، مع منطقة الوسطى منح الخواص الطيفية. ستيريل هذه الأصباغ التقسيم عكسية في الأغشية وليس 'التقلب المفاجىء' بين منشورات الغشاء وحتى لا تكون ابدأ حرة في سيتوسول، وهي أكثر بكثير من الفلورسنت في أغشية من المياه5. عكسها الإدراج إلى بلير دهن يؤدي زيادة محاطاً fluorescence6. في نهايات الخلايا العصبية، تتكون كلاسيك FM صبغ تجارب وضع العلامات للاستحمام إعداد متشابك مع الصبغ أثناء ديبولاريزينج التحفيز لتحميل صبغة عن طريق الالتقام SV. صبغ خارجي ثم جرفت ويلقي القبض عليه في دورة SV في حل خالية من الكالسيوم في المسابقة للصورة المحملة نهايات7. جولة ثانية من التحفيز في حمام خالية من صبغة مشغلات إطلاق سراح وزير الخارجية من خلال الرقابة، عملية التي يمكن اتباعها من قبل قياس انخفاض كثافة الأسفار. ويمكن السكان SV من حويصلة واحدة لحمامات السباحة التي تحتوي على مئات حويصلات كمياً رصد6،7. وقد استخدمت الأصباغ FM لتشريح وتعتمد على نشاط تعبئة متميزة وظيفيا SV برك، ومقارنة قبله وتشغيل مقابل CME ركوب8،9. تم تعديل الأسلوب لكل على حدة بالانزيم أثارت، دورة متشابك عفوية ومصغر الأنشطة (مع معدات حساسة للغاية للكشف عن تغييرات صغيرة جداً الأسفار والحد من فوتوبليتشينج)10. فحوصات يمكن تمديدها إلى مستوى ultrastructural قبل فوتوكونفيرتينج إشارة FM الفلورية إلى تسمية وحدة إلكترون كثيفة لانتقال الميكروسكوب الإلكتروني11،،من1213،14 .

تاريخيا، كانت الاستعدادات الاستحمام متشابك في تركيزات عالية من البوتاسيوم (يشار إليه فيما يلي "عالية [ك+]") الأسلوب المفضل للتحفيز لحمل SV ركوب الدراجات؛ ديبولاريزينج بدءاً من الضفدع اتروبين NMJ5، إلى مثقف القوارض الدماغ الخلايا العصبية هيبوكامبال15، إلى المورفولوجية جلوتاماتيرجيك NMJ النموذجي16،17. هذا النهج [ك+] عالية بسيط، يتطلب أي معدات متخصصة، وهو وبالتالي الوصول إلى معظم المعامل، ولكن قيود لتطبيق وتفسير البيانات. أسلوب أكثر بكثير من الناحية الفسيولوجية مناسبة لاستخدام الشفط الكهربائي التحفيز الكهربائي للعصب4،،من512. هذا النهج محركات نشر إمكانات العمل لحفز مباشرة للعصب بريسينابتيك المحطة الطرفية، ويمكن مقارنة النتائج مباشرة إلى فحوصات الكهربية كبيرة وظيفة13،14، 15، لكن يتطلب معدات متخصصة وتحديا تقنيا أكثر بكثير. ومع ظهور أوبتوجينيتيكس، استخدام تشانيلرهودوبسين الخلايا العصبية التحفيز على مزايا إضافية، بما في ذلك سيطرة الزمانية المكانية للتعبير قناة باستخدام نظام Gal4/UAS ثنائي20. هذا النهج هو من الناحية التقنية أسهل بكثير من التحفيز الكهربائي الشفط ويتطلب شيئا أكثر من مصدر ضوء LED رخيصة جداً. وهنا، نحن نوظف تصوير FM1-43 (N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(4-(dibutylamino)styryl) بيريدينيوم dibromide) لكل مقارنة وهذه ثلاثة أساليب التحفيز المختلفة في المورفولوجية NMJ: عالية بسيطة [ك+ ]، تحدي النهج تشانيلرهودوبسين الكهربائية وجديدة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-اليرقات الغراء تشريح

  1. مزيج دقيق 10 أجزاء من سيليكون الاستومر قاعدة مع جزء 1 من سيليكون الاستومر علاج عامل من مجموعة الاستومر (جدول المواد).
  2. معطف كوفيرسليبس الزجاج 22 × 22 ملم مع الاستومر وعلاج على صفيحة ساخنة في 75 ˚C لعدة ساعات (حتى لم يعد مثبت للمس).
  3. ضع ساترة واحد زجاج الاستومر المغلفة في قاعة تشريح الزجاج plexi مصنوعة خصيصا (الشكل 1، أسفل) تحضيرا لتشريح اليرقات.
  4. إعداد الماصات الغراء من زجاج البورسليكات الشعرية استخدام ساحبة ميكروليكترودي قياسية للحصول على الاستدقاق المرجوة وتلميح الحجم.
  5. كسر قبالة رأس ميكروبيبيتي، وفي الطرف الآخر بلطف، وإرفاق 2 متر أنابيب بلاستيكية مرنة (1/32 "قطرها الداخلي، معرف 3/32" خارج القطر، القطر الخارجي؛ 1/32 "الجدار؛ جدول المواد) مع الفم المناسب (نصيحة ماصة P2).
  6. ملء حاوية صغيرة (0.6 مل ايبندورف أنبوب cap) بحجم صغير (~ 20 ميليلتر) الغراء (جدول المواد) تحضيرا لتشريح اليرقات.
  7. ملء الدائرة مع المحلول الملحي (في مم): 128 كلوريد الصوديوم، 2 بوكل 4 مجكل2، كاكل 12, 70 السكروز وحمض 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic 5 (حبيس) الرقم الهيدروجيني 7.2.
  8. إضافة جسم البيروكسيديز (HRP) فجل الحصان المضادة مترافق إلى أليكسا فلور 647 (مكافحة-HRP:647؛ وتمييع 01:10 من مخزون 1 ملغ/مل) لوضع العلامات NMJ presynaptic الطرفية أثناء تشريح21،22.
  9. استخدام الرسام ما يرام (حجم 2)، إزالة تجول الطور ثالث من القنينة الغذاء ووضعه على الزجاج غطاء الاستومر المغلفة.
  10. ملء نصيحة ميكروبيبيتي الزجاج مع كمية صغيرة من الغراء باستخدام ضغط الهواء السلبي التي تم إنشاؤها عن طريق الفم مع المرفقات (الخطوة 1، 5).
  11. موقف يرقة الظهرية الجانب الأعلى مع الملقط والصمغ إسقاط الرأس ساترة الاستومر المغلفة مع صغيرة من الغراء باستخدام ضغط الهواء الإيجابي عن طريق الفم.
  12. كرر هذا الإجراء مع نهاية الخلفي لليرقة، مع التأكد من أن يتم تمدد الحيوان مشدود بين المرفقات الغراء اثنين.
  13. استخدام مقص (شفرات 3 مم؛ الجدول للمواد)، جعل قطع أفقي (~ 1 مم) في مؤخرة وقطع عمودي على طول خط الوسط الظهرية.
  14. برفق باستخدام الملقط غرامة (#5، الجدول للمواد)، إزالة الظهرية القصبة الهوائية والأمعاء، والدهون في الجسم والأجهزة الداخلية الأخرى التي تغطي العضلات.
  15. كرر الإجراء الالتصاق اللوحات جدار الجسم أربعة، والتأكد على امتداد الجدار الجسم بلطف أفقياً وعمودياً.
  16. رفع الحبل البطني العصب (فنك) باستخدام الملقط، قطع الأعصاب الحركية بعناية مع المقص، ومن ثم إزالتها تماما فنك.
  17. يستبدل المحلول الملحي تشريح Ca2 +-مجاناً المالحة (نفس المحلول الملحي تشريح أعلاه دون كاكل2) لوقف SV ركوب الدراجات.

2-الخيار 1: عالية [ك+] صبغة FM تحميل

  1. من حل أسهم FM1-43 (4 ملم)، إضافة ميليلتر 1 إلى 1 مل من 90 مم حل بوكل (عالية [ك+] في المحلول الملحي التشريح) لتركيز نهائي من 4 ميكرومتر.
  2. استخدام ماصة، استبدال Ca2 +-سالين مجاناً في قاعة التصوير مع الحل صبغ FM [ك+] عالية لتحفيز امتصاص صبغ الالتقام SV.
  3. البدء فورا في جهاز توقيت رقمي لمدة محددة سلفا للسامية [ك+] ديبولاريزينج فترة التحفيز (على سبيل المثال-، 5 دقيقة؛ الشكل 2).
  4. للتأكد من إعداد يرقات صحية، ملاحظة تقلصات قوية للعضلات لمدة فترة depolarization [ك+] عالية.
  5. عند انتهاء فترة الموقت، بسرعة إزالة الحل صبغ FM [ك+] عالية واستبدال مع Ca2 +-المالحة مجاناً لوقف SV ركوب الدراجات.
  6. أغسل في تتابع سريع مع Ca2 +-مجاناً المالحة (5 x ل 1 دقيقة) لضمان الحل صبغ FM [ك+] عالية هو إزالتها بالكامل.
  7. الحفاظ على إعداد اليرقات في كاليفورنيا الطازجة2 +-المالحة مجانية للتصوير الفوري مع المجهر [كنفوكل].

3-تصوير: [كنفوكل] مجهرية

  1. استخدام مجهر [كنفوكل] تستقيم مع 40 × الهدف غمر المياه إلى NMJ صورة صبغ الفلورية (يمكن استخدام المجاهر الأخرى).
  2. صورة العضلات NMJ 4 شرائح البطن 2-4 (يمكن تصويرها الأخرى نمجس) وجمع الصور باستخدام البرمجيات المناسبة (جدول المواد).
  3. استخدام ليزر زناد 633 نانومتر لإثارة HRP:647 (مع مرشح تمرير طويل > 635 نانومتر) والارجون 488 نانومتر ليزر إثارة FM1-43 (مع ممر الموجه مرشح 530-600 nm).
  4. عمليا تحديد الربح الأمثل والإزاحة لكل القنوات.
    ملاحظة: هذه الإعدادات سوف تظل ثابتة طوال بقية التجربة.
  5. تأخذ كدسة Z [كنفوكل] من خلال أسرة NMJ مختارة من أعلى علامات HRP إلى أسفل الصالة متشابك.
  6. تأخذ علما دقيقا ب NMJ المصورة (الجزء والجانب والعضلات) لضمان الزائدة إلى NMJ نفس الدقيق بعد صبغ FM وتفريغ.

4. عالية [ك+] التحفيز: FM صبغ تفريغ

  1. استبدال Ca2 +-سالين مجاناً مع ارتفاع المياه المالحة [ك+] (دون صبغ FM1-43) إلى محرك الأقراص ديبولاريزيشن، الإفراج عن الرقابة وصبغ SV.
  2. البدء فورا في جهاز توقيت رقمي لمدة محددة سلفا لفترة التحفيز [ك+] عالية (على سبيل المثال-، 2 دقيقة؛ الشكل 2).
  3. عند انتهاء فترة الموقت، فورا إزالة المياه المالحة [ك+] عالية واستبدال مع Ca2 +-سالين مجاناً لوقف SV ركوب الدراجات.
  4. أغسل في تتابع سريع مع Ca2 +-مجاناً المالحة (5 x ل 1 دقيقة) لضمان ارتفاع المياه المالحة [ك+] هو إزالتها بالكامل.
  5. الحفاظ على إعداد اليرقات في كاليفورنيا الطازجة2 +-المالحة مجانية للتصوير الفوري مع المجهر [كنفوكل].
  6. أن تكون معينة الصورة الفلورية صبغ FM1-43 في NMJ نفسها المشار إليها أعلاه باستخدام نفس الإعدادات [كنفوكل].

5-الخيار 2: التحفيز الكهربائي صبغة FM تحميل

  1. إعداد ماصة شفط استخدام ساحبة ميكرويليكترودي (جدول المواد) للحصول على تفتق المطلوبة وتلميح الحجم.
  2. النار-البولندية نصيحة ميكروليكترودي مع الصغرى-فورج حتى يمكن امتص عصب محرك واحد مع تناسب ضيق.
  3. الشريحة ماصة شفط على صاحب قطب كهربائي في ميكرومانيبولاتور ونعلق على أنبوب بلاستيكي طويلة مرنة والمحاقن.
  4. تعيين معلمات مشجعا (على سبيل المثال-، 15 الخامس 20 هرتز التردد ومدة 20 مللي ثانية والساعة من 5 دقيقة (الشكل 2) أو 1 دقيقة (الشكل 3)).
  5. استبدال Ca2 +-سالين مجاناً على إعداد اليرقات مع أعلى المحلول الملحي FM1-43 (4 ميكرومتر؛ كاكل 1 مم2) على تلاعب الكهربية.
  6. وضع التحضير في مرحلة مجهر ورفع المرحلة حتى اليرقة وماصة شفط في التركيز (40 X غمر المياه الهدف).
  7. تمتص حلقة من قطع العصب الحركي إينيرفاتينج هيميسيجمينت المحدد مع ضغط الهواء السلبي إنشاؤها بواسطة المحاقن في مسرى شفط.
  8. اختبار الدالة القطب شفط مع دفعة قصيرة من التحفيز أثناء الرصد بصريا لتقلص العضلات في هيميسيجمينت المحدد.
  9. تحفيز الأعصاب الحركية باستخدام المعلمات المحددة (الخطوة 5.4) محرك الأقراص الالتقام SV وامتصاص صبغ FM1-43 (الشكل 2).
  10. أغسل في تتابع سريع مع Ca2 +-مجاناً المالحة (5 x ل 1 دقيقة) لضمان الحل صبغ FM1-43 هو إزالتها بالكامل.
  11. الحفاظ على إعداد اليرقات في كاليفورنيا الطازجة2 +-المالحة مجانية للتصوير الفوري باستخدام البروتوكول [كنفوكل] التصوير من أعلى.
  12. تأخذ علما NMJ المصورة (الجزء والجانب والعضلات) لضمان الوصول إلى NMJ نفس الدقيق بعد تفريغ صبغ FM بعناية.

6-الكهربائية التحفيز: FM صبغ تفريغ

  1. استبدال Ca2 +-مجاناً المالحة مع المياه المالحة العادية (بدون صبغ FM1-43) ومكان الإعداد مرة أخرى في مرحلة تلاعب الكهربية.
  2. تعيين معلمات مشجعا للتفريغ (مثلاً، 15 ت، 20 هرتز التردد ومدة 20 مللي ثانية والساعة 2 دقيقة (الشكل 2) أو 20 s (الشكل 3)).
  3. تمتص العصب المحرك نفسه في مسرى نفس النحو الوارد أعلاه، وحفز ثم تفعيل الرقابة SV والإفراج عن صبغ FM1-43.
  4. أغسل في تتابع سريع مع Ca2 +-مجاناً المالحة (5 x ل 1 دقيقة) لضمان الصبغة الخارجية هو إزالتها بالكامل.
  5. الحفاظ على إعداد اليرقات في كاليفورنيا الطازجة2 +-المالحة مجانية للتصوير الفوري مع المجهر [كنفوكل].
  6. التأكد من الصورة في الأسفار صبغ FM1-43 في NMJ نفسها المشار إليها أعلاه باستخدام نفس الإعدادات [كنفوكل].

7-الخيار 3: تشاننيلرهودوبسين تحفيز صبغة FM تحميل

  1. رفع الإعراب عن ChR2 اليرقات في الأغذية التي تحتوي على الشبكية عبر كل عامل المشارك ChR2 (الذائبة في الإيثانول؛ 100 ميكرومتر التركيز النهائي).
  2. مكان إعداد اليرقات في قاعة شبكي في مرحلة مجهر تشريح مزودة بمنفذ كاميرا.
  3. إرفاق الصمام أزرق (470 نانومتر؛ جدول المواد) مشجعا لبرمجة باستخدام كبل coaxial ومكان الصمام بمنفذ الكاميرا.
  4. وتركز شعاع ضوء LED زرقاء على تشريح اليرقات الدالة استخدام الدالة تكبير المجهر.
  5. استبدال Ca2 +-سالين مجاناً على إعداد اليرقات مع أعلى المحلول الملحي FM1-43 (4 ميكرومتر؛ كاكل 1 مم2) في مرحلة أوبتوجينيتيك.
  6. تعيين المعلمات LED باستخدام مشجعا (مثلاً، 15 ت، 20 هرتز التردد ومدة 20 مللي ثانية والساعة من 5 دقيقة (الشكل 2)).
  7. ابدأ تحفيز الضوء وتتبع مع جهاز ضبط وقت لمدة محددة سلفا لفترة التحفيز أوبتوجينيتيك (مثلاً، 5 دقيقة؛ الشكل 2).
  8. عند إيقاف جهاز ضبط الوقت، بسرعة إزالة الحل صبغ FM واستبدال مع Ca2 +-المالحة مجاناً لوقف SV ركوب الدراجات.
  9. أغسل في تتابع سريع مع Ca2 +-مجاناً المالحة (5 x ل 1 دقيقة) لضمان الحل صبغ FM هو إزالتها بالكامل.
  10. الحفاظ على إعداد اليرقات في كاليفورنيا الطازجة2 +-المالحة مجانية للتصوير الفوري مع المجهر [كنفوكل] باستخدام بروتوكول التصوير من أعلى.
  11. تأخذ علما NMJ المصورة (الجزء والجانب والعضلات) لضمان الوصول إلى NMJ نفس الدقيق بعد تفريغ صبغ FM بعناية.

8-تشانيلرهودوبسين التحفيز: صبغ FM وتفريغ

  1. استبدال Ca2 +-سالين مجاناً مع المالحة العادية (بدون صبغ FM1-43) في مرحلة مجهر تشريح مع منفذ كاميرا LED ركزت على اليرقة.
  2. تعيين معلمات مشجعا للتفريغ (مثلاً 15 الخامس، 20 هرتز التردد ومدة 20 مللي ثانية والوقت من 2 دقيقة (الشكل 2)).
  3. ابدأ تحفيز الضوء وتتبع مع جهاز ضبط وقت لمدة محددة سلفا لفترة التحفيز أوبتوجينيتيك (مثلاً، 2 دقيقة؛ الشكل 2).
  4. عند انتهاء فترة الموقت، بسرعة إزالة الحل صبغ FM واستبدال مع Ca2 +-المالحة مجاناً لوقف SV ركوب الدراجات.
  5. أغسل في تتابع سريع مع Ca2 +-مجاناً المالحة (5 x ل 1 دقيقة) لضمان الصبغة الخارجية هو إزالتها بالكامل.
  6. الحفاظ على إعداد اليرقات في كاليفورنيا الطازجة2 +-المالحة مجانية للتصوير الفوري مع المجهر [كنفوكل].
  7. التأكد من الصورة في الأسفار صبغ FM1-43 في NMJ نفسها المشار إليها أعلاه باستخدام نفس الإعدادات [كنفوكل].

9-الأسفار الكمي

  1. لتحميل الصورة في "الصورة ي" (المعاهد الوطنية للصحة مفتوحة المصدر) وإنشاء إسقاط أقصى شدتها بالنقر فوق الصورة | مكدسات | المشروع Z.
  2. استخدام المضادة-قناة HRP:647، وانتقل إلى الصورة | ضبط | العتبة والشريحة شريط الأدوات أعلى حتى يتم تمييز فقط NMJ.
  3. باستخدام أداة العصا، انقر على NMJ. في حالة الانقطاع NMJ، اضغط الزر Shift وحدد جميع أجزاء.
  4. تغيير الصورة إلى القناة صبغ FM1-43 والذهاب إلى تحليل | تدبير الحصول على قياس الأسفار.
  5. كرر الخطوات من 9.1-9.4 في صورة "تفريغ" من NMJ نفسه (الجزء التي تم تحديدها، والجانب والعضلات).
  6. للحصول على النسبة المئوية للصبغة التي تم إلغاء تحميلها، تأخذ نسبة شدة الأسفار تفريغها أو تحميلها.
    ملاحظة: يمكن تعديل هذا الإجراء لتحليل الأسفار على أساس بوتون الواحدة بوتون باستخدام أما أدوات التحديد "البيضاوي" أو "يدوي". يمكن طرح الخلفية الفلورية بأخذ عينات من الأسفار العضلات. يمكن أيضا إضافة وكلاء للحد من هذه الخلفية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويبين الشكل 1 تدفق العمل لصبغ FM تعتمد على نشاط التصوير البروتوكول. التجربة يبدأ دائماً بتشريح الغراء اليرقات نفسها، بغض النظر عن أسلوب التحفيز المستخدمة في وقت لاحق. 1a الشكل تخطيطي ليرقة تشريح، عرض الحبل البطني العصب (فنك)، يشع الأعصاب ونمط العضلات هيميسيجمينتال المتكررة. تتم إزالة فنك والإعداد حمم في حل 4 ميكرومتر FM1-43 (الشكل 1b، الوردي). ثم هو حفز الإعداد حضور صبغ FM باستخدام واحد من ثلاثة خيارات ممكنة لتحميل الصبغة عبر تعتمد على نشاط SV الالتقام (1cI الشكلالثالث). المقبل، وصبغ FM ركوب الدراجات هو القبض استخدام Ca2 +-المالحة حرة ومحطة NMJ محددة التي تم تحميل مع صبغ FM هو تصويرها باستخدام مجهر [كنفوكل] ("تحميل الصورة"؛ د الشكل 1). وفي هذه الحالة، تحميل العضلات 4 NMJ محدداً مع موضع التخطيطي إظهار العصبية والمتفرعة من المحطة الطرفية NMJ FM boutons متشابك. هو حفز إعداد متشابك لمرة ثانية باستخدام نفس الأسلوب المحدد أعلاه، ولكن في غياب صبغة FM محرك SV الرقابة وإطلاق سراح FM1-43 (الشكل 1e). حدد نفس NMJ (العضلات NMJ 4 في هذا المثال) هو ثم إعادة تصويرها باستخدام التسمية HRP:647 متشابك وإشارة حويصلة FM1-43 المتبقية ("إلغاء تحميل الصورة"؛ الشكل 1-واو). يحدد المجرب قوة ومدة التحميل والتفريغ مراحل لتحسين القياسات للمقايسة محددة أو حالة المسخ. كثافة الأسفار هو كمياً بعد التحميل والتفريغ (الشكل 1 د، 1f)، للحصول على قياسات الالتقام صبغ متشابك، والرقابة، والنسبة المئوية لتحميل صبغ FM الإفراج. يمكن القيام بتحليلات لأسرة NMJ أو بتونس واحد.

صبغ FM ويمكن حفز ركوب الدراجات في ثلاث طرق: 1) عالية [ك+] depolarization المالحة من إعداد كامل، القطب 2) شفط تحفيز الأعصاب الحركية، أو تنشيط مدفوعة 3) خفيفة من تشانيلرهودوبسين المستهدفة (ChR2؛ الشكل 2). لمقارنة جنبا بجنب مباشرة جميع الطرق الثلاث، وحفز مع كل نهج لمدة 5 دقائق حضور FM1-43 (تحميل)، ومن ثم لمدة 2 دقيقة في الغياب FM1-43 (تفريغ)، وتصويرها نمجس المسمى برنامج الصحة الإنجابية باستخدام إعدادات مماثلة [كنفوكل] ( الشكل 2). ويتبع الأسلوب depolarization المالحة [ك+] عالية البروتوكول FM1-43 تستخدم على نطاق واسع المورفولوجية اليرقات NMJ23، إلا نستخدم الغراء بدلاً من دبابيس لتشريح اليرقات. الغراء يتجنب التدخل في أهداف مجهر ويتيح تحديد أدق لجدار الجسم التوتر، ولكن تتطلب منحنى التعلم معتدل. كل ثلاثة أساليب إنتاج إشارات نيون قوية ومتسقة في جميع أنحاء أربور بوتون متشابك NMJ وداخل boutons متشابك الفردية (insets). يؤدي أسلوب depolarization المالحة [ك+] ارتفاع جميع نمجس أن تكون محملة FM في جميع أنحاء اليرقة كما أنها ديبولاريزيس كل الخلايا العصبية في الحيوان (الشكل 2A، الأوسط). أسلوب التحفيز الكهربائي الشفط الكهربائي العصب محركات الأقراص فقط في هيميسيجمينت واحدة من اليرقات التي إينيرفاتينج المقابلة الأعصاب الحركية وقد حفزت (الشكل 2B، الأوسط). شرائح أونستيمولاتيد في الحيوان نفسه يمكن تمييزها باستخدام التسمية HRP لكن تحتوي على لا صبغة الفلورسنت يمكن ملاحظتها تحميل، وتكون بمثابة الضوابط الداخلية ممتازة. وتنتج أوبتوجينيتيك الأسلوب ChR2 depolarization المستهدفة تعتمد على محوره وراثيا Gal4 برنامج التشغيل المستخدمة (الشكل 2). هنا، كان السائق الناقل غلوتامات حويصلية (فجلة) Gal4، حيث يتم ديبولاريزيد كافة الخلايا العصبية جلوتاماتيرجيك مع تحفيز الضوء الأزرق، بما في ذلك كل من الخلايا العصبية الحركية جلوتاماتيرجيك. كنتيجة لذلك، يتم تحميل جميع نمجس مع صبغ FM1-43 في هذا المثال (الشكل 2، الأوسط). يمكن استخدام برامج التشغيل الخاصة بخلية لتسمية نمجس محددة وترك الآخرين غير مسمى لرقابة داخلية.

FM وتفريغ صبغ تحقق عن طريق نفس الأسلوب الذي تم استخدامه لتحميل صبغ. في الأسلوب الأول، كان ببساطة حمم إعداد اليرقات في عالية الملوحة [ك+] في غياب FM1-43 ديبولاريزي خلايا، محرك الأقراص SV الرقابة، وتفريغ المحطات متشابك (الشكل 2A، حق). نحن عادة بتحديد فترة تفريغ أقصر (2 دقيقة)، وحتى تفريغ جزئي والمحطات تبقى مرئية في قناة FM. قطب كهربائي شفط وتفريغ التحفيز الكهربائي إلى حد كبير أكثر تحديا، لأنه ينطوي على العودة إلى هيميسيجمينت نفسه، وتحديد العصب نفسه وإعادة تحفيز هذا العصب في غياب FM1-43 محرك صبغ التفريغ (الشكل 2B ، وحق). علما بأن تفريغ صبغ مرة أخرى جزئية. تفريغ ChR2 يستلزم فترة ثانية لإنارة LED زرقاء إعداد اليرقات في الغياب FM1-43 لتنشيط القنوات، ديبولاريزي الخلايا العصبية الحركية وحفز SV الرقابة صبغ الإصدار (الشكل 2، يمين). كل من هذه ديبولاريزيشن مع هذا المقياس الوقتى للتفريغ (2 دقيقة)، أساليب تفريغ نسبة من الصبغة FM1-43 تحميل، مع الارتفاع [ك+] أقوى و ChR2 أضعف في القيادة صبغ الإصدار (الشكل 2). قمنا بقياس الصمام شدة الضوء المستخدمة (140 ملم µW/2)، الذي كان في25،،من24مجموعة المنشورة (20-1000 µW/مم2)26. ChR2 أقصى تنشيط بواسطة ~ 1 ميغاواط الإضاءة من 50-200 ميغاواط مصادر الضوء، مع فعالية ChR2 تعتمد أيضا على تركيز ATR تغذية اليرقة27،28. وهكذا، يمكن التلاعب بها قوة التحفيز ChR2. وعلاوة على ذلك، قد لا تبقى العلاقة الحقيقية مع تحفيز نقاط القوة، والجداول الزمنية أو الأنماط الجينية الأخرى. إذا المجرب يعمل مع متحولة أن قد تضاءل الالتقام SV أو غير عادي بسرعة الرقابة، تحفيز المعلمات قد تحتاج إلى تغيير للحفاظ على إشارة يمكن ملاحظتها بعد تفريغ. التسمية المضادة-برنامج الصحة الإنجابية يسمح أحد لتحديد NMJ حتى في غياب إشارة FM كاملة، ولكن هذه ليست مثالية للقياس الكمي. من حيث المبدأ، يمكن أيضا تحفيز التفريغ من نوع مختلف من التحفيز التحميل.

ودرسنا مؤخرا فقد آثار نوتوم ديسيلاسي متشابك يفرز على دورة SV استخدام التحفيز الكهربائي4. وهنا، نتقدم بهذا التحليل لمقارنة 1) عالية [ك+] depolarization و 2) الشفط الكهربائي الأعصاب الحركية التحفيز الطرق (الشكل 3). ونجد أن كلا أساليب تعطي نتيجة مماثلة، عرض تخفيض صبغ FM1-43 تحميل في متحولة نوتوم لاغيا؛ بيد أن درجة النمط الظاهري متميزة بين هاتين الطريقتين. بعد depolarization مع ارتفاع المياه المالحة [ك+] لمدة خمس دقائق، هناك انخفاض كبير في كثافة تحميل الأسفار بين التحكم الخلفية الوراثية (w1118) مع مستويات عالية وطفرات نوتوم فارغة (نوتومكو ) مع مستويات منخفضة (الشكل 3 ألف، أعلى). في قياسات محددة كمياً، تطبيع كثافة fluorescence FM داخل محطات NMJ المبينة في برنامج الصحة الإنجابية انخفض انخفاضا كبيرا في غياب نوتوم (w1118 1.0 ± 0.05 مقابل نوتومكو 0.57 ± 0.07؛ n≥13، ف < 0.0001؛ الشكل 3). بعد التحفيز الكهربائي في 20 هرتز لمدة 1 دقيقة، نجد هناك انخفاضا ضئيلا في تحميل FM1-43 كثافة بين الضوابط والقيم الخالية نوتوم عند التحديد الكمي لأسرة NMJ الفلورية (w1118 1.0 ± 0.05 مقابل نوتومكو 0.86 ± 0.06؛ n = 8, p = 0.10؛ الشكل 3 ألف، باء). عند قياس صبغ التأسيس على أساس بوتون الواحدة بوتون، نجد انخفاضا كبيرا في صبغ محملة بكل الطرق. في القياسات الكمية بعد التحفيز مع ارتفاع [ك+] المالحة، يتناقص إلى حد كبير كثافة طبيعية للأسفار FM كل بوتون (w1118 1.0 ± 0.02 مقابل نوتومكو 0.52 ± 0.02؛ n≥241، ف< 0.0001؛ الشكل 3). بعد التحفيز الكهربائي، كثافة fluorescence تطبيع كل بوتون هو أيضا تناقص، أن كان ذلك بدرجة أقل (w1118 1.0 ± 0.02 مقابل نوتومكو 0.83 ± 0.02؛ n≥127، ف< 0.0001؛ الشكل 3).

يمكن أن تكون نتيجة الاختلافات بين نماذج التحفيز اثنين بسبب عدد من العوامل. أولاً، يفترض أن تكون أكبر قوة التحفيز هو مع ارتفاع [ك+] مقارنة بتحفيز العصب المحركات الكهربائية. لا يمكن إجراء التسجيلات الكهربية حضور المياه المالحة [ك+] عالية، ولكن نيوروموسكولاتوري اليرقات هو وضوح يجري قوة حفز، كذلك تقلصات عضلة قوية ومستمرة طوال فترة الاستحمام 5 دقيقة. ومع ذلك، نحن لا نعرف قوة أو تردد للتحفيز. وفي المقابل، تسيطر التحفيز الكهربائي أكثر بكثير مع المستخدم اختيار قوة الجهد الدقيق والتردد من التحفيز. ثانيا، كانت أطول مدة التحفيز مع ارتفاع [ك+] مقارنة بتحفيز العصب الكهربائية (الشكل 3). لقد اخترنا 1 دقيقة للتحفيز الكهربائي 20 هرتز بعد محاكمات المتكررة. بعد 1 دقيقة لتحميل صبغ، كان هناك FM1-43 إشارة قوية وموثوق بها، ولذلك اخترنا هذا النموذج ل الدراسة لدينا4، على الرغم من أن 5 دقيقة لتحفيز أعطى إشارة أقوى فلورسنت (الشكل 2). وهكذا، يرجح أن تسهم طول النموذج تنشيط حجم التغير في تحميل FM1-43 بين السامي [ك+] والتحفيز الكهربائي (الشكل 3، ج). على الرغم من أن الأسلوب [ك+] عالية أظهرت النمط الظاهري أكثر قوة لطفرات نوتوم ، لا تزال استخدمنا طريقة الكهربائية بسبب تحكم أكبر4. وهناك العديد من المعلمات للتحكم مثل القوة، وتواتر ومدة التحفيز، وهذه الإعدادات يجب أن يتقرر على أساس المسخ والمسألة. على سبيل المثال، قد يتوقف اختيار أسلوب التحفيز على بركة استجوب SV7 وآلية تعتمد على نشاط التحقيق10.

بعد FM1-43 تحميل إلى محطة NMJ، واحد يمكن أن تستخدم fluorescence صبغ فوتوكونفيرسيون لإنتاج إشارة إلكترون كثيفة الميكروسكوب الإلكتروني (الشكل 4). في هذا الأسلوب، إعداد تحميل صبغ يتعرضون لضوء الفلورسنت مكثفة حضور ديامينوبينزيديني (DAB)، مع الأنواع الأكسجين التفاعلية من الصبغة FM المؤكسدة الدأب لإنشاء متسرعا الظلام (الشكل 4 أ)11. الرجاء راجع مقالة جوف على فوتوكونفيرسيون أصباغ ستيريل للحصول على تفاصيل كاملة12. الاستفادة من هذا الأسلوب أن SVs وكشف الواضح على مستوى ultrastructural، على الرغم من أن دورة SV يلقي القبض عليه بالطبع مع التصوير بالمجهر الإلكتروني ثابتة. نظراً لغياب التحفيز، يتم تحميل boutons متشابك في المورفولوجية NMJ كثافة مع حويصلات (~ 40 نانومتر في القطر؛ الشكل 4B)، مع حدوث نادرة من العضيات الموسع (>100 نانومتر في القطر) يفترض أن يكون ركوب اندوسوميس. عالية [ك+] المالحة ديبولاريزينج التحفيز بقوة تغيير هذا التشكيل الجانبي، مع استنفاد جزئية من السكان SV والتراكم السريع للعديد من العضيات الموسع (>100 نانومتر في القطر) ويعتقد أن تستمد من المجمع الالتقام غشاء البلازما (الشكل 4، اليسار). بالرغم من وجود أماكن مماثلة في عناصر تحكم أونستيمولاتيد، كثافة عالية من هذه العضيات بعد ارتفاع depolarization المالحة [ك+] يثير القلق أن هذا قد يكون استجابة غير فسيولوجية. هو نسبيا أكثر كفاءة في السكان SV القطب شفط التحفيز الكهربائي للعصب المحرك ولا تنتج أكثر من الحويصلات اندوسومال الموسع (الشكل 4، اليسار). وهذا يوحي بأن الالتقام جل مدفوعا بارتفاع [ك+] depolarization يساعد في الحفاظ على السكان SV أثناء الطلب أكثر كثافة.

يمكن إنجاز فوتوكونفيرسيون FM1-43 باستخدام أما عالية depolarization المالحة [ك+] أو قطب كهربائي شفط التحفيز الكهربائي للأعصاب الحركية، لمقارنة أولتراستروكتوري متشابك بالنسبة بوتون يستريح (الشكل 4). مع ارتفاع [ك+] ديبولاريزينج التحفيز، SVs الفردية وحويصلات الموسع على حد سواء يمكن أن يكون المسمى (>100 نانومتر في القطر) مع إلكترون كثيفة الدأب المتعجل التالية يحركها الضوء فوتوكونفيرسيون (الشكل 4، حق). لأسباب غير معروفة، الغشاء حويصلة الموسع عادة أقل كثافة مسماة من الغشاء SV أصغر. وعلاوة على ذلك، غالباً ما تظهر SVs مليئة بترسبات الدأب، بدلاً من الغشاء فقط، ولكن هذا جعلها أسهل بكثير لتمييز من الحويصلات غير مسمى. مع قطب كهربائي شفط تحفيز الأعصاب الحركية، يمكن أيضا علامة السكان SV الدراجات بالنسبة إلى غير مسمى SVs (الشكل 4، حق). مع التحفيز الكهربائي، توسيع الحويصلات (>100 نانومتر في القطر) لا تتشكل ديتيكتابلي في بتونس، وباستمرار، الأغشية التي من المفترض لا تتم تسمية اندوسوميس من فوتوكونفيرسيون FM1-43. كما أعلاه، SVs ركوب عادة مليئة بالدأب متعجل بطريقة اللورنوني إلى حد ما، وذلك يمكن تمييزها بسهولة أكثر من SVs التي تكونت خلال التحفيز (الشكل 4، حق) لا. غير أننا حاولنا بعد فوتوكونفيرسيون بعد التحفيز ChR2. مع دورات زمنية مختلفة من التحفيز، يسمح FM1-43 صبغ فوتوكونفيرسيون واحدة لتحديد حيث يتم تشكيل SVs وكيف يتم الاتجار SVs، وتوقيت الحركة بين تجمعات مكانية مختلفة داخل بوتون متشابك. مقارنة عالية [ك+] وتحفيز العصب يسمح تشريح السائبة والآليات الالتقام سيفيرت واحد.

Figure 1
الشكل 1: مخطط انسيابي لصبغ FM1-43 تحميل البروتوكول في المورفولوجية NMJ. تشريح الغراء اليرقات تنتج إعداد نيوروموسكولاتوري الأرض، مع الحبل البطني العصب (فنك) إسقاط الأعصاب القطاعي من خط الوسط البطني (Vm) هيميسيجمينتالي المتكررة جدار الجسم العضلات صفائف (الخطوة). فنك قطع مجاناً، وهو ثم المحتضنة تشريح اليرقات كاملة في حل FM1-43 الوردي (4 ميكرومتر) تحضيرا للتحفيز (الخطوة ب). ثم يتم تحميل FM1-43 مع نموذج تحفيز مختارة (الخطوة 3)؛ مع خيارات عالية depolarization [ك+] من اليرقة كاملة (cI)، شفط التحفيز الكهربائي للأعصاب الحركية واحد (الاتحاد)، أو يحركها على ضوء تفعيل تشانيلرهودوبسين الغاية المستهدفة (سيي). إدراج FM1-43 هو القبض استخدام Ca2 +-المالحة مجاناً و NMJ محملة بصبغ تصويرها (الخطوة d). ثم يتم حفز ثانية دون FM1-43 في الحمام محرك صبغ حويصلة متشابك الرقابة (الخطوة e). ثم يتم إعادة تصويرها NMJ نفس الاعتداء في محطة تفريغ متشابك (الخطوة f). يتم قياس كثافة الفلورسنت من نمجس كل تحميل وإلغاء تحميل التحديد الكمي الالتقام SV ومستويات الرقابة SV. وتبين اللوحة السفلية معالم البناء وأبعاد للدائرة اﻷكريليك الشفافة المستخدمة لهذه الدراسات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: FM صبغ مقارنة التحميل والتفريغ لجميع أساليب التحفيز. مقارنة بين FM1-43 صبغ التحميل والتفريغ في الطور الثالث تجول NMJ مع ديبولاريزيشن 1) عالية [ك+] إعداد اليرقات كاملة (أعلى)، 2) الشفط الكهربائي التحفيز الكهربائي للأعصاب الحركية (الأوسط) و 3) الضوء يحركها تفعيل تشانيلرهودوبسين المستهدفة (ChR2) فقط في الخلايا العصبية الحركية (أسفل). (أ) اليرقات NMJ المسمى بمكافحة--HRP:647 غشاء بريسينابتيك ماركر (أزرق، اليسار)، محملة FM1-43 عبر depolarization [ك+] عالية لمدة 5 دقائق (الأوسط) وثم تفريغها عبر depolarization [ك+] عالية للحد الأدنى 2 (ب) مقارنة مع تحفيز العصب الكهربائية القطب شفط مع نفس الفترات المحفزات لكل صبغ FM1-43 والتفريغ. (ج) استهداف فجلوت-Gal4>التعبير UAS-ChR2-H134R في الخلايا العصبية الحركية المنشط باللون الأزرق (470 nm) الخفيفة لنفس الفترتين المحفزات لصبغ FM1-43 والتفريغ. تشير العلامات النجمية إلى insets عرض أعلى التكبير بتونس. شريط مقياس هو 10 ميكرومتر، مع boutons متشابك اقحم الموسع 3.5 X من الأفرقة الرئيسية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: نوتوم طفرات فارغة تظهر انخفاض صبغة FM تحميل في بوتونس متشابك. FM1-43 تحميلها في المحطات متشابك من التيه ثالث instar NMJ مقارنة عنصر التحكم الوراثي (w1118) إلى نوتوم طفرات فارغة (نوتومكو). (أ) NMJ بوتونس المسمى مع ارتفاع depolarization [ك+] لإعداد اليرقات كاملة (أعلى) أو التحفيز الكهربائي شفط العصب المحرك واحد (أسفل) في ث1118 (يسار) و نوتومكو (يمين). (ب) كمية تحميل الأسفار FM1-43 الواحدة NMJ كمؤامرة مبعثر مقارنة عالية [ك+] depolarization والتحفيز الكهربائي شفط في ضوابط ث1118 مقابل طفرات نوتومكو . (ج) كمية تحميل الأسفار على أساس بوتون الواحدة بوتون كقطعة مربع والخط الطولي مقارنة عالية [ك+] depolarization والتحفيز الكهربائي شفط في ضوابط ث1118 مقابل نوتومكو . ذو الذيل اثنين تي-الاختبارات الطالب أجريت لكل مقارنة مع فالقيم المعروضة على الرسوم البيانية. وتظهر أشرطة يعني ± ووزارة شؤون المرأة مع المنشور (الإصدار 7.0 لنظام التشغيل Windows). البيانات التحفيز الكهربائي قد تم تكييفه مع إذن من كوبكه et al., التنمية 144 (19): 3499-510، عام 2017. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: أولتراستروكتوري متشابك مع فوتوكونفيرسيون صبغ FM بمناسبة حويصلات. يمكن أن تكون نيون FM1-43 فوتوكونفيرتيد إلى متسرعا ديامينوبينزيديني المؤكسدة (DAB) إلكترون كثيفة للتصور عبر مجهر إلكتروني (TEM). (أ) برسم تخطيطي للأسلوب فوتوكونفيرسيون لتسمية NMJ المورفولوجية عقب صبغ FM1-43 النشاط-تعتمد على تحميل. (ب) تيم ممثل صورة wildtype بوتون متشابك في بقية (أونستيمولاتيد). ملاحظة كثافة السكان من الحجم زي SVs. (ج) متشابك بوتونس التي حفزت مع ارتفاع depolarization المالحة [ك+] لمدة 5 دقائق، دون فوتوكونفيرسيون (إلى اليسار) أو مع فوتوكونفيرسيون FM1-43 (يمين). ملاحظة وجود هياكل اندوسومال السائبة، المسماة وغير المسماة. (د) boutons متشابك التي حفزت كهربائياً مع عصب شفط القطب في 20 هرتز لمدة 5 دقائق مع لا فوتوكونفيرسيون (يسار) أو مع فوتوكونفيرسيون FM1-43 (يمين). لاحظ أن تظهر حويصلات محملة بصبغة أكثر قتامة من حويصلات تفريغ المتاخمة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

عالية التحفيز ديبولاريزينج المالحة [ك+] هو حتى الآن أسهل من الخيارات الثلاثة لصبغ FM تعتمد على نشاط ركوب الدراجات، ولكن يرجح أن الأقل الفسيولوجية29. هذه طريقة بسيطة ديبولاريزيس كل خلية موجوداً في الحيوان الكامل، وحتى لا يسمح للدراسات الموجهة. قد يكون من الممكن تطبيق محلياً عالية الملوحة [ك+] مع ميكروبيبيتي، ولكن هذا سوف لا يزال ديبولاريزي الخلايا قبل/بوستسينابتيك واحتمال إطلاق المرتبطة المشبك1. شاغلا رئيسيا آخر هو أن ارتفاع [ك+] depolarization محركات السريع تشكيل اندوسوميس السائبة التي ينظر إليها إلا نادراً في بتونس أونستيمولاتيد. ومع ذلك، تشكيل دخلول الجزء الأكبر إليه نشطة لحظره بواسطة الطفرات29، مما يشير إلى عملية فسيولوجية حقيقية. وهكذا، يمكن استخدام التصوير FM1-43 مع ارتفاع [ك+] ديبولاريزيشن للدراسة بشكل انتقائي الالتقام الأكبر في نهايات. قطب كهربائي شفط التحفيز الكهربائي للعصب المحرك أسلوب التحكم أكثر بكثير. أنها ميزة أن يتم تحفيز حزمة إكسون واحد فقط، وفقط تيرميني presynaptic هو depolarized مباشرة (بالطبع، الألياف العضلية هو ثم ديبولاريزيد بعمل جهاز الإرسال). ولذلك فإنه يوفر عنصر تحكم داخلية كبيرة من نمجس في نفس الحيوان الذي لا تحفز. هذا الأسلوب يسمح أحد لأحكام السيطرة على المعلمات التحفيز، خلافا لأسلوب التحفيز [ك+] عالية، مما يتيح إجراء مقارنة مباشرة مع التسجيلات الكهربية4. بيد أن هذا الأسلوب يتطلب معدات متخصصة وعلى مستوى عال إلى حد ما من المهارة التقنية، وهو لذلك يصعب الوصول إليها. ويمتاز يحركها على ضوء تفعيل تشانيلرهودوبسين المستهدفة (ChR2) تستهدف تحديد الخلايا العصبية30. هذا الأسلوب يتطلب لا الإلمام بأساليب الكهربية، ويمكن القيام به مع معدات رخيصة جداً في أي مختبر، ولكن هذا النهج يتطلب الإلمام الأساسي بالوراثة المورفولوجية .

اختيار المعلمات التحفيز له أهمية حاسمة لاختبار ديناميات دورة SV تساءل داخل طائفة من الأمراض الوراثية مع متغير جداً تعمل1. لجميع الأساليب، الخارجي [Ca2 +] تستخدم معلمة مفتاح السيطرة على القوة الدافعة ل SV ركوب الدراجات. مع أسلوب التحفيز [ك+] عالية، هو خيار هام [ك+] المستخدمة، التي تحدد درجة قوة ديبولاريزيشن. تبين القياسات المورفولوجية haemolymph [ك+] من 5 ملم، وهو 90 ملم عادة تركيز معظم الأحيان المحدد لنشاط التحفيز3،7،،من1517 , 31-ومع ذلك، قد استخدمت مجموعة [ك+] من 30-90 مم تختلف في التحفيز قوة5،،من1632. قرار المعلمة حاسم آخر هو طول تحفيز عالية [ك+] لكلا FM1-43 والتفريغ. فترة التحميل يحدد ما إذا كان يتم تحميل السكان SV ركوب فعلياً، أو مجموعة فرعية فقط من حويصلات النشطة7. فترة للمثل وتفريغ ما تمليه نسبة SVs تمر الرقابة في فترة التحفيز، التي يمكن أن تكشف أو تحجب متحولة تعمل اعتماداً على معدل التغيرات في SV ركوب الدراجات التردد2. مع تحفيز العصب المحركات الكهربائية الشفط الكهربائي، تشمل خيارات المعلمة أيضا الجهد التحفيز، والتردد، والفاصل الزمني المدة والنبض. وقتيا منقوشة النشاط محدداً رئيسيا ل SV ركوب الدراجات ديناميات7، وأنماط مختلفة من التحفيز بشكل انتقائي يمكن تعبئة مميزة SV برك. المستهدفة في التنشيط ChR2 يحركها الضوء، الخيارات التي تشمل جميع ما ورد أعلاه (مع متغيرات كثافة الضوء) وناقش الخيارات الإضافية المعدلة وراثيا في المقطع التالي. مع هذه المعلمة, تأتي خيارات التحكم أكثر تجريبية، ولكن أيضا زيادة التعقيد التقني.

تشاننيلرهودوبسين-2 (ChR2) قناة غشاء عن طريق بوابة الضوء نفاذية مونو-والاتصالات ديفالينت33. إذا تم تحديد التحفيز ChR2، هناك العديد من الخيارات بما في ذلك السائق Gal4 وبناء UAS ChR2 ومتغيرات مصدر الضوء لتفعيل قناة بذل. Gal4 السائقين وتتراوح في كل مكان محددة للغاية. على سبيل المثال، في كل مكان UH1-Gal4 (دوغتيرليس) تعرب عن ChR2 في كل خلية، بينما يدفع ككابر-Gal4 (جانيليا) ChR2 في العضلات NMJ 6/7 ولكن ليس العضلات 4 NMJ31،34. يمكن استخدام هذه الانتقائية كعنصر تحكم داخلية قوية. وبالمثل هناك العديد من المتغيرات UAS-ChR2، بما في ذلك35ChR2-H134R (المستخدمة هنا؛ تحور بقايا أسباب زيادة فوتوكورينتس)، VChR1، رئيس والعديد من أكثر من36. كل من هذه المتغيرات قناة له خصائص متميزة من الضوء النابضة، الموصلية وأيون انتقائية وحركية والحساسية. ملاحظة بعض ثوابت تحتوي على علامة نيون التي يمكن أن تتداخل مع تصوير FM. على سبيل المثال، هو معلم UAS-ChR2-H134R المستخدمة هنا مع مشري (السابقين: 587 نانومتر، م: 610 شمال البحر الأبيض المتوسط)، ولكن لا تنتج الانبعاثات المزودة مع FM1-43 (السابقين: 479 نانومتر، م: 598 nm) التصوير مرشحات. وتشمل خيارات المعلمة التقنية مصدر الضوء والطول الموجي وكثافة لتفعيل قناة. خيار المستخدم هنا هو الصمام الأزرق تلويثاً رخيصة، مع حفز بصريا أكده المعايرة تقلصات العضلات. ونجحنا أيضا في تفعيل ChR2 باستخدام ابيفلوريسسينسي، على الرغم من أن المسح ضوئي ليزر [كنفوكل] لم يكن كافياً. ابيفلوريسسينسي يمكن أن تستخدم في حفز المستهدفة (شرائح محددة بدلاً من الحيوان كله)، لكن تحفيز المعلمات من الصعب السيطرة عليها، بينما يغير LED متصلاً حتى مشجعا بسيطة بسهولة كل من مدة وتواتر الضوء البقول. مع التركيز على ضوء الصمام من خلال منفذ الكاميرا مجهر تشريح يسمح مزيد التحفيز الخفيفة التي تسيطر عليها، ومكثفة.

والأمر متروك المجرب أن تقرر ترك الحبل البطني العصب/الدماغ سليمة من خلال نموذج التحفيز أو عدمه. اخترنا لإزالة كامل الجهاز العصبي المركزي للمقارنة بين الأساليب الثلاثة المستخدمة هنا، ولكن في بعض الأحيان يتم ترك الأسلاك المنبع سليمة15. مضاعفات أن يحدث نشاط العصبية الذاتية كلما تركت الجهاز العصبي كله. درجة هذا النشاط متغير درجة عالية من الحيوان للحيوان، وتعتمد بدرجة كبيرة على خبرة المجرب تشريح. يمكن أن يسهم هذا النشاط متغير كمية صبغ FM1-43 التي يتم تحميلها وإلغاء تحميلها، ولذلك الذي لا يرجع فقط إلى الخارجية تحفيز العاملين15. هو تعقيدات تقنية ذات صلة أن اليرقات تشريح سليمة العقد العضلات في حركة وهمية، وهذا التشرد يتداخل إلى حد كبير مع تصوير NMJ. تخفيف هذه الحركة إذا تمت إزالة الجهاز العصبي المركزي، وأيضا من خلال تطبيق Ca2 +-سالين الحرة أثناء التصوير4. هذه النهوج المستخدمة هنا كافية لتمكين ممتازة صبغ FM1-43 التصوير في إعداد NMJ. ومع ذلك، بعض المجربون اختيار إضافة العقاقير تمنع تقلص العضلات (مثلاً، ريانوديني، فيلانثوتوكسين-433)، أو استخدام إمكانات العمل لسد (مثلاً، تيدرودوتاكسين)37،38. يمكن استخدام مجموعة من الأدوية للتلاعب بصورة انتقائية في دورة SV، بغية تسليط الضوء على خطوات معينة، أو إبراز تعمل متحولة لدراسة آليات كبيرة. على سبيل المثال، استخدمت بعض المجربون فيراتريديني (ينشط عن طريق بوابة الجهد قنوات Na+ 39) زيادة SV تحميل في تجمع الاحتياطي، السيكلوسبورين A (يثبط النشاط Calcineurin40) لتعزيز SV الالتقام، و فورسكولين (ينشط adenylyl cyclase41، مما يعزز انتقال متشابك42) زيادة في أكسو/إندو ركوب تجمع7،43،44. يمكن أن توفر مثل هذه المعالجات الدوائية أفكاراً إضافية. وأخيراً، يمكن أن يحدث الخلفية FM1-43 بدرجات متفاوتة استناداً إلى نوعية للتشريح، الغسيل البروتوكول فعالية والتحفيز. بعض إضافة مشتق سولفوبوتيلاتيد β-سيكلوديكسترين أدفاسيب-745، أو فلوروفوري المائية سولفورهوداميني46، إخماد الأسفار غير محدد، وتحسين نسبة الإشارة إلى الخلفية.

وهناك العديد من التقنيات التي يمكن أن تصاحب FM الفلورسنت التصوير إلى زيادة فهم دورة SV (مثلاً، الكهربية، سينابتوفلورين، والمجهر الإلكتروني). مثال يظهر هنا هو فوتوكونفيرسيون fluorescence FM يستخدم للتحقيق SV دورة بالتفصيل ultrastructural. يتم تنظيم SVs في العديد من حمامات التي تعتبر متميزة وظيفيا ومكانيا2. تجمع سهولة يمكن نشرة (RRP) يحتوي على حويصلات الإفراج عنه فورا عند تنشيط الحادة. وتحتفظ مجموعة إعادة تدوير أكبر SV الإفراج تحت ظروف النشاط المعتدل. يتم تجنيد بركة احتياطي داخلي (RP) فقط مع التحفيز القوى (على ما يبدو بالقرب من غير الفسيولوجية)2. برك SV التي يتم تنشيطها تعتمد على النوع من التحفيز تستخدم47، وقد كشفت التقارير الواردة من NMJ المورفولوجية استخدام فوتوكونفيرسيون FM أفكاراً رئيسية في الخصائص المكانية والوظيفية لهذه المجمعات SV مختلفة48. يمكن استخدام فوتوكونفيرسيون FM لدراسة تجمعات SV المنشط تحت نماذج مختلفة من التحفيز، والأسئلة استعلام مثل التفاعل الاتجار مناقشة طويلة بين اندوسوميس و SVs49. إذا كان مهتما بتصوير FM في تركيبة مع تغييرات أخرى تعتمد على النشاط في المشبك المجرب، هناك تناظرية يمكن حلها يقال صبغ FM1-43 (FM1-43FX). هذا التحقيق يجب أن تسمح بإصلاح المورفولوجية NMJ بعد صبغ تعتمد على نشاط تحميل، وثم متابعة مع جسم وسم لاختبار للعلاقات المتبادلة بين مستوى النشاط بوتون (FM صبغ الأسفار) وتعتمد على نشاط التعبير عن بروتين فائدة. في المستقبل، سوف تكون مفيدة للغاية لاستكشاف طرق إضافية يمكن أن تتيح الجمع بين صبغ FM التصوير مع نهوج أخرى التصوير في المشبك نموذج NMJ المورفولوجية الجميلة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب يعلن لا تضارب المصالح.

Acknowledgments

ونشكر أعضاء مختبر برودي للمساهمات لهذه المادة. ودعمت هذا العمل MH096832 R01s المعاهد الوطنية للصحة و MH084989 إلى كيلوبايت، والمعاهد الوطنية للصحة بريدوكتورال زمالة F31 MH111144 D.L.K.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SylGard 184 Silicone Elastomer Kit Fisher Scientific NC9644388 To put on cover glass for dissections
Microscope Cover Glass 22x22-1 Fisherbrand 12-542-B To put SylGard on for dissections
Aluminum Top Hot Plate Type 2200 Thermolyne HPA2235M To cure the SylGard
Plexi glass dissection chamber N/A N/A Handmade
Borosilicate Glass Capillaries WPI 1B100F-4 To make suction and glue micropipettes
Laser-Based Micropipette Puller Sutter Instrument P-2000 To make suction and glue micropipettes
Tygon E-3603 Laboratory Tubing Component Supply Co. TET-031A For mouth and suction pipette
P2 pipette tip USA Scientific 1111-3700 For mouth pipette
0.6-mL Eppendorf tube cap Fisher Scientific 05-408-120 Used to put glue in for dissection
Vetbond 3M WPI vetbond Glue used for dissections
Potassium Chloride Fisher Scientific P-217 Forsaline
Sodium Chloride Millipore Sigma S5886 For saline
Magnesium Chloride Fisher Scientific M35-500 For saline
Calcium Chloride Dihydrate Millipore Sigma C7902 For saline
Sucrose Fisher Scientific S5-3 For saline
HEPES Millipore Sigma H3375 For saline
HRP:Alexa Fluor 647 Jackson ImmunoResearch 123-605-021 To label neuronal membranes
Paintbrush Winsor & Newton 94376864793 To manipulate the larvae
Dumont Dumostar Tweezers #5 WPI 500233 Used during dissection
7 cm McPherson-Vannas Microscissors (blades 3 mm) WPI 14177 Used during dissection 
FM1-43 Fisher Scientific T35356 Fluorescent styryl dye
Digital Timer VWR 62344-641 For timing FM dye load/unload 
LSM 510 META laser-scanning confocal microscope Zeiss For imaging the fluorescent markers
Zen 2009 SP2 version 6.0 Zeiss Software for imaging on confocal
HeNe 633nm laser Lasos To excite HRP:647 during imaging
Argon 488nm laser Lasos To excite the FM dye during imaging
Micro-Forge WPI MF200 To fire polish glass micropipettes
20mL Syringe Slip Tip BD 301625 To suck up the axon for electrical stimulation.
Micro Manipulator (magnetic base) Narishige MMN-9 To control the suction electrode for electrical stimulation
Stimulator Grass S48 To control the LED and electrical stimulation
Zeiss Axioskop Microscope Zeiss Used during electrical stimulation.
40X Achroplan Water Immersion Objective Zeiss Used during electrical stimulation and confocal imaging
All-trans Retinal Millipore Sigma R2500 Essential co-factor for ChR2
Zeiss Stemi Microscope with camera port Zeiss 2000-C Used during channelrhodopsin stimulation
LED 470nm ThorLabs M470L2 Used for ChR activation
T-Cube LED Driver ThorLabs LEDD1B To control the LED
LED Power Supply Cincon Electronics Co. TR15RA150 To power the LED
Optical Power and Energy Meter ThorLabs PM100D To measure LED intensity

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Menon, K. P., Carrillo, R. A., Zinn, K. Development and plasticity of the Drosophila larval neuromuscular junction. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 647-670 (2013).
  2. Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Synaptic vesicle pools. Nat Rev Neurosci. 6 (1), 57-69 (2005).
  3. Long, A. A., et al. Presynaptic calcium channel localization and calcium-dependent synaptic vesicle exocytosis regulated by the Fuseless protein. J Neurosci. 28 (14), 3668-3682 (2008).
  4. Kopke, D. L., Lima, S. C., Alexandre, C., Broadie, K. Notum coordinates synapse development via extracellular regulation of Wingless trans-synaptic signaling. Development. 144 (19), 3499-3510 (2017).
  5. Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. J Neurosci. 12 (2), 363-375 (1992).
  6. Richards, D. A., Bai, J., Chapman, E. R. Two modes of exocytosis at hippocampal synapses revealed by rate of FM1-43 efflux from individual vesicles. J Cell Biol. 168 (6), 929-939 (2005).
  7. Verstreken, P., Ohyama, T., Bellen, H. J. FM 1-43 labeling of synaptic vesicle pools at the drosophila neuromuscular junction. Methods Mol Biol. 440, 349-369 (2008).
  8. Dickman, D. K., Horne, J. A., Meinertzhagen, I. A., Schwarz, T. L. A Slowed Classical Pathway Rather Than Kiss-and-Run Mediates Endocytosis at Synapses Lacking Synaptojanin and Endophilin. Cell. 123 (3), 521-533 (2005).
  9. Verstreken, P., et al. Endophilin Mutations Block Clathrin-Mediated Endocytosis but Not Neurotransmitter Release. Cell. 109 (1), 101-112 (2002).
  10. Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J. -Y., Goodman, K. M., Harata, N. C. Examination of synaptic vesicle recycling using FM dyes during evoked, spontaneous, and miniature synaptic activities. J Vis Exp. (85), (2014).
  11. Sandell, J. H., Masland, R. H. Photoconversion of some fluorescent markers to a diaminobenzidine product. J Histochem Cytochem. 36 (5), 555-559 (1988).
  12. Opazo, F., Rizzoli, S. O. Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes. J Vis Exp. (36), e1790 (2010).
  13. Sabeva, N. S., Bykhovskaia, M. FM1-43 Photoconversion and Electron Microscopy Analysis at the Drosophila Neuromuscular Junction. Bio-protocol. 7 (17), (2017).
  14. Sabeva, N., Cho, R. W., Vasin, A., Gonzalez, A., Littleton, J. T., Bykhovskaia, M. Complexin Mutants Reveal Partial Segregation between Recycling Pathways That Drive Evoked and Spontaneous Neurotransmission. J Neurosci. 37 (2), 383-396 (2017).
  15. Ryan, T. A., Reuter, H., Wendland, B., Schweizer, F. E., Tsien, R. W., Smith, S. J. The kinetics of synaptic vesicle recycling measured at single presynaptic boutons. Neuron. 11 (4), 713-724 (1993).
  16. Ramaswami, M., Krishnan, K. S., Kelly, R. B. Intermediates in synaptic vesicle recycling revealed by optical imaging of Drosophila neuromuscular junctions. Neuron. 13 (2), 363-375 (1994).
  17. Trotta, N., Rodesch, C. K., Fergestad, T., Broadie, K. Cellular bases of activity-dependent paralysis in Drosophila stress-sensitive mutants. J Neurobiol. 60 (3), 328-347 (2004).
  18. Long, A. A., et al. The nonsense-mediated decay pathway maintains synapse architecture and synaptic vesicle cycle efficacy. J Cell Sci. 123 (Pt 19), 3303-3315 (2010).
  19. Parkinson, W., Dear, M. L., Rushton, E., Broadie, K. N-glycosylation requirements in neuromuscular synaptogenesis. Development. 140 (24), 4970-4981 (2013).
  20. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), (1993).
  21. Jan, L. Y., Jan, Y. N. Antibodies to horseradish peroxidase as specific neuronal markers in Drosophila and in grasshopper embryos. Proc Natl Acad Sci. 79 (8), (1982).
  22. Paschinger, K., Rendić, D., Wilson, I. B. H. Revealing the anti-HRP epitope in Drosophila and Caenorhabditis. Glycoconj J. 26 (3), 385-395 (2009).
  23. Ramachandran, P., Budnik, V. Fm1-43 labeling of Drosophila larval neuromuscular junctions. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (8), (2010).
  24. Yawo, H., Kandori, H., Koizumi, A. Optogenetics: light-sensing proteins and their applications. , (2015).
  25. Pulver, S. R., Pashkovski, S. L., Hornstein, N. J., Garrity, P. A., Griffith, L. C. Temporal dynamics of neuronal activation by Channelrhodopsin-2 and TRPA1 determine behavioral output in Drosophila larvae. J Neurophysiol. 101 (6), 3075-3088 (2009).
  26. Hornstein, N. J., Pulver, S. R., Griffith, L. C. Channelrhodopsin2 Mediated Stimulation of Synaptic Potentials at Drosophila Neuromuscular Junctions. J Vis Exp. (25), e1133 (2009).
  27. Britt, J. P., McDevitt, R. A., Bonci, A. Use of channelrhodopsin for activation of CNS neurons. Curr Protoc Neurosci. , Chapter 2, Unit 2.16 (2012).
  28. Lin, J. Y. A user's guide to channelrhodopsin variants: features, limitations and future developments. Exp Physiol. 96 (1), 19-25 (2011).
  29. Vijayakrishnan, N., Woodruff, E. A., Broadie, K. Rolling blackout is required for bulk endocytosis in non-neuronal cells and neuronal synapses. J Cell Sci. 122, 114-125 (2009).
  30. Honjo, K., Hwang, R. Y., Tracey, W. D. Optogenetic manipulation of neural circuits and behavior in Drosophila larvae. Nat Protoc. 7 (8), 1470-1478 (2012).
  31. Dear, M. L., Shilts, J., Broadie, K. Neuronal activity drives FMRP- and HSPG-dependent matrix metalloproteinase function required for rapid synaptogenesis. Sci Signal. 10 (504), (2017).
  32. Baldwin, M. L., Rostas, J. A. P., Sim, A. T. R. Two modes of exocytosis from synaptosomes are differentially regulated by protein phosphatase types 2A and 2B. J Neurochem. 85 (5), 1190-1199 (2003).
  33. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 13940-13945 (2003).
  34. Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9715-9720 (2008).
  35. Nagel, G., Brauner, M., Liewald, J. F., Adeishvili, N., Bamberg, E., Gottschalk, A. Light Activation of Channelrhodopsin-2 in Excitable Cells of Caenorhabditis elegans Triggers Rapid Behavioral Responses. Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).
  36. Lin, J. Y. A user's guide to channelrhodopsin variants: features, limitations and future developments. Exp Physiol. 96 (1), 19-25 (2011).
  37. Sullivan, K. M., Scott, K., Zuker, C. S., Rubin, G. M. The ryanodine receptor is essential for larval development in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (11), 5942-5947 (2000).
  38. Narahashi, T., Moore, J. W., Scott, W. R. Tetrodotoxin Blockage of Sodium Conductance Increase in Lobster Giant Axons. J Gen Physiol. 47 (5), 965-974 (1964).
  39. Narahashi, T. Chemicals as tools in the study of excitable membranes. Physiol Rev. 54 (4), 813-889 (1974).
  40. Kuromi, H., Yoshihara, M., Kidokoro, Y. An inhibitory role of calcineurin in endocytosis of synaptic vesicles at nerve terminals of Drosophila larvae. Neurosci Res. 27 (2), 101-113 (1997).
  41. Seamon, K. B., Daly, J. W. Forskolin, cyclic AMP and cellular physiology. Trends Pharmacol Sci. 4, 120-123 (1983).
  42. Zhang, D., Kuromi, H., Kidokoro, Y. Synaptic Transmission at the Drosophila Neuromuscular Junction: Effects of Metabotropic Glutamate Receptor Activation. Slow Synaptic Responses Modul. , 260-265 (2000).
  43. Kuromi, H., Kidokoro, Y. The optically determined size of exo/endo cycling vesicle pool correlates with the quantal content at the neuromuscular junction of Drosophila larvae. J Neurosci. 19 (5), 1557-1565 (1999).
  44. Kuromi, H., Kidokoro, Y. Selective Replenishment of Two Vesicle Pools Depends on the Source of Ca2+ at the Drosophila Synapse. Neuron. 35 (2), 333-343 (2002).
  45. Kay, A. R., et al. Imaging Synaptic Activity in Intact Brain and Slices with FM1-43 in C. elegans, Lamprey, and Rat. Neuron. 24 (4), 809-817 (1999).
  46. Pyle, J. L., Kavalali, E. T., Choi, S., Tsien, R. W. Visualization of Synaptic Activity in Hippocampal Slices with FM1-43 Enabled by Fluorescence Quenching. Neuron. 24 (4), 803-808 (1999).
  47. Denker, A., Rizzoli, S. O. Synaptic vesicle pools: an update. Front Synaptic Neurosci. 2, 135 (2010).
  48. Denker, A., Kröhnert, K., Rizzoli, S. O. Revisiting synaptic vesicle pool localization in the Drosophila neuromuscular junction. J Physiol. 587 (12), 2919-2926 (2009).
  49. Wucherpfennig, T., Wilsch-Bräuninger, M., Gonz ález-Gait án, M. Role of Drosophila Rab5 during endosomal trafficking at the synapse and evoked neurotransmitter release. J Cell Biol. 161 (3), 609-624 (2003).

Tags

علم الأعصاب، 135 قضية، و المورفولوجية، والوصلات العصبية العضلية، FM1-43، الكهربية، فوتوكونفيرسيون، ومجهر إلكتروني
صبغ FM ركوب الدراجات في المشبك: مقارنة Depolarization البوتاسيوم عالية، الكهربائية وتحفيز تشانيلرهودوبسين
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kopke, D. L., Broadie, K. FM Dye… More

Kopke, D. L., Broadie, K. FM Dye Cycling at the Synapse: Comparing High Potassium Depolarization, Electrical and Channelrhodopsin Stimulation. J. Vis. Exp. (135), e57765, doi:10.3791/57765 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter