Summary
שלפוחית סינפטית (SV) רכיבה על אופניים היא מנגנון הליבה של המערכת הסנסור הסינפסות עצביים. FM לצבוע ספיגת המחפשים לשלב בין טיפול אלטרנטיבי ונוחות האמצעי העיקרי של באופן כמותי assaying SV אנדו - ו אקסוציטוזה שחרור. כאן, אנו משווים את כל השיטות גירוי לנהוג FM1-43 רכיבה על הסינפסה דגם צומת עצב-שריר (NMJ) דרוזופילה .
Abstract
FM צבעים משמשים כדי ללמוד את מחזור שלפוחית סינפטית (SV). הגששים amphipathic אלה יש הידרופילית בראש וזנב הידרופובי, הפיכתם מסיסים במים עם היכולת להיכנס ולצאת ממברנה השומנים bilayers הפיכה. צבעי styryl אלה הם יחסית ללא-פלורסנט במדיום מימית, אבל הכניסה לתוך העלעל החיצוני של קרום פלזמה גורם > 40 X לודיג זריחה. ב הסינפסות עצביים, צבעי FM הם הפנימו במהלך SV אנדוציטוזה, אקסוציטוזה SV הנסחרות הן בתוך והן בין בריכות SV, ואשר פורסמו עם, מתן כלי רב עוצמה כדי להמחיש presynaptic שלבי עצבית. מודל גנטי העיקרי של glutamatergic סינפסה התפתחות ותפקוד היא דרוזופילה צומת עצב-שריר (NMJ), איפה FM לצבוע הדמיה שימש בהרחבה לכמת SV dynamics במגוון רחב של תנאים מוטציה. הטרמינל סינפטית NMJ הינו נגיש בקלות, עם מגוון יפה של גדול סינפטית עם העיתון ons אידיאלי עבור הדמיה יישומים. כאן, אנו משווים חדות משלוש דרכים לעורר את דרוזופילה NMJ לנהוג תלויי-פעילות FM1-43 צבע ספיגת/שחרור...: אמבט 1) יישום של גבוהה [K+] depolarize רקמות עצב-שריר, 2) יניקה עצבים מוטוריים אלקטרודה גירוי depolarize העצב presynaptic מסוף, ו 3) לפלח הטרנסגניים ביטוי של משתנים channelrhodopsin עבור שליטה גירוי האור, המרחבי של דפולריזציה. כל השיטות האלה יש יתרונות וחסרונות לחקר השפעות מוטציה גנטית על מחזור SV- דרוזופילה NMJ. נדון אלה יתרונות וחסרונות לסייע הבחירה של הגישה גירוי, יחד עם מתודולוגיות ספציפיות לכל אסטרטגיה. בנוסף הדמיה פלורסנט, FM צבע יכול להיות photoconverted לאותות צפיפות אלקטרונים visualized באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים הילוכים (TEM) ללמוד SV מנגנונים מחזור ברמה ultrastructural. אנו מספקים את ההשוואות של קונאפוקלית ואלקטרון הדמיה של השיטות השונות של גירוי דרוזופילה NMJ, כמדריך הבחירה של פרדיגמות ניסיוני בעתיד.
Introduction
מאופיין להפליא דרוזופילה צומת עצב-שריר זחל (NMJ) glutamatergic סינפסה הדגם שימש ללמוד סינפסה היווצרות ותפקוד עם מגוון עצום של לפליטת גנטי1. הטרמינל מוטור נוירון מורכב רב ענפים האקסון, כל אחד עם העיתון ons מוגדלת סינפטיים רבים. אלה varicosities מרווח (עד 5 מיקרומטר בקוטר) לכלול את כל המנגנון עצבית, כולל הסינפטיות glutamatergic אחיד (SVs; ~ 40 ננומטר בקוטר) שמורת cytosolic ובריכות בקלות releasable2. שלפוחית אלה עוגנות קרום פלזמה presynaptic פיוז'ן אתר פעיל אזורי (AZs), שבו אקסוציטוזה שמתווכת שחרור נוירוטרנסמיטר גלוטמט עבור טרנס-סינפטית תקשורת. לאחר מכן, SVs מאוחזרות של קרום פלזמה דרך נשיקה-וברח מיחזור או בתיווך clathrin אנדוציטוזה (CME) מחזורים חוזרים ונשנים exo/אנדוציטוזה. דרוזופילה NMJ ונגיש בקלות מתאים היטב הן בידוד ואפיון מוטנטים מחזור SV. באמצעות מסכי גנטי קדימה, מוטציות הרומן הובילו זיהוי גנים חדשים קריטיים עבור מחזור SV3. יתר על כן, הפוך גישות גנטיות מתחיל עם הגנים ידוע כבר הובילו הבהרה של מנגנוני מחזור SV חדשים דרך התיאור זהיר של מוטציה רכיבה על אופניים פנוטיפים4. דרוזופילה NMJ אידיאלי כמעט כהכנה סינפטית ניסיוני ניקוד אנדוציטוזה SV מנגנונים אקסוציטוזה באמצעות שיטות שטיחות שלפוחית מסלול רכיבה על אופניים במהלך עצבית.
מגוון של סמנים פלורסנט לאפשר מעקב ויזואלי של שלפוחית במהלך רכיבה על אופניים dynamics, אבל הרב-גוניים ביותר הם תחליפי לצבוע FM אשר הוא קודם מסונתז על ידי מאו,. פ, ואח. 5. מבחינה מבנית, FM צבעים מכילים הידרופילית ראש וזנב lipophilic מחובר באמצעות טבעת ארומטית, עם אזור מרכזי היוועצות ספקטראליות. אלה styryl צבעי למחיצות הפיכה של ממברנות, לא 'משתנים' בין קרום פליירים, וכך גם אף פעם לא להכניס ציטוזול, ויש הרבה יותר פלורסנט בתוך ממברנות יותר מים5. הכניסה הפיך לתוך ליפידית גורמת עלייה 40-fold קרינה פלואורסצנטית6. ב הסינפסות עצביים, ניסויים תיוג לצבוע FM קלאסי מורכב רחצה ההכנה סינפטית עם לצבוע במהלך depolarizing גירוי לטעון לצבוע באמצעות SV אנדוציטוזה. צבע חיצוני ואז נשטף הרחק, מחזור SV נעצר בפתרון צלצול נטולת סידן לשיקוף הסינפסות טעון7. סיבוב שני של גירוי באמבט ללא צבע מעורר שחרור FM דרך אקסוציטוזה, תהליך זה יכול להיות מלווה מדידה הירידה עוצמת קרינה פלואורסצנטית. אוכלוסיות SV מן שלפוחית יחיד אל בריכות המכיל מאות שלפוחית יכול להיות מנוטרים באופן כמותי6,7. צבעי FM שימשו לנתח תלויי-פעילות גיוס של בריכות SV נפרדים פונקציונלית, והשווה נשיקה-וברח לעומת CME רכיבה8,9. השיטה שונתה כדי בנפרד assay עורר, ספונטנית, זעיר סינפטית מחזור פעילות (עם ציוד רגישה מאוד לזהות שינויים קטנים מאוד פלורסצנטיות ולהפחית את photobleaching)10. מבחני ניתן להרחיב את רמת ultrastructural על ידי photoconverting האות FM פלורסנט לתוך תווית צפיפות אלקטרונים עבור שידור מיקרוסקופ אלקטרונים11,12,13,14 .
מבחינה היסטורית, רחצה ההכנות סינפטית בריכוז גבוה של אשלגן (ןלהל "גבוהה [K+]") הייתה השיטה של בחירה עבור depolarizing גירוי לזירוז SV רכיבה על אופניים; החל הצפרדע שימוש NMJ5, מחונן המוח מכרסמים נוירונים בהיפוקמפוס15, דרוזופילה glutamatergic NMJ דגם16,17 הגישה [K+] גבוהה זו היא פשוטה, דורש אין ציוד מיוחד, ולא נגיש ולכן רוב מעבדות, אבל יש מגבלות עבור היישום והן פרשנות הנתונים. שיטה המתאימה יותר מבחינה פיזיולוגית היא להשתמש אלקטרודה היניקה גירוי חשמלי של עצב4,5,12. גישה זו נוהג פוטנציאל הפעולה הפצת לגירוי ישיר של העצב presynaptic מסוף, ואת התוצאות ניתן להשוות ישירות אל מבחני אלקטרופיזיולוגיות עצבית פונקציה13,14, 15, אבל דורש ציוד מיוחד, היא טכנית הרבה יותר מאתגר. עם כניסתו של optogenetics, השימוש של גירויים עצביים channelrhodopsin יש יתרונות נוספים, כולל שליטה הדוקה ייתכן ערוץ ביטוי באמצעות מערכת Gal4/UAS בינארי20. גישה זו טכנית הרבה יותר קל מאשר שאיבה אלקטרודה לגירוי ואינו דורש לא יותר מאשר מקור אור LED זול מאוד. כאן, אנו מעסיקים הדמיה של FM1-43 (N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(4-(dibutylamino)styryl) pyridinium dibromide) לעשות הן השוואות אלה שלוש שיטות שונות גירוי- דרוזופילה NMJ: high פשוטים [K+ ], מאתגר גישות channelrhodopsin חשמל וחדשים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. זחל דבק לנתיחה
- ביסודיות מערבבים 10 חלקים elastomer סיליקון הבסיס עם חלק 1 של סיליקון elastomer אשפרה הסוכן הערכה אלסטומר (טבלה של חומרים).
- מעיל coverslips זכוכית דקה 22 x 22 מ מ עם elastomer, התרופה על פלטה חמה ב- 75 הלעפה תרוטרפמט למשך מספר שעות (עד כבר לא דביק למגע).
- הצב coverslip זכוכית מצופים elastomer יחיד של החדרה plexi מחוייט זכוכית לנתיחה (איור 1, התחתון) לקראת הקרע זחל.
- הכינו את פיפטות דבק של נימי זכוכית בורוסיליקט באמצעות פולר microelectrode סטנדרטיים כדי להשיג את להתחדד הרצוי ואת עצה גודל.
- בעדינות לשבור את הטיפ micropipette, וכניסה אל הקצה האחר, לצרף 2 מטרים של צינור פלסטיק גמיש (1/32" קוטר פנים, מזהה; 3/32" מחוץ קוטר, OD; 1/32" קיר; טבלה של חומרים) עם הפה הולם (P2 פיפטה tip).
- למלא מיכל קטן (0.6 מ"ל גלאים הצינורית) עם נפח קטן (µL ~ 20) של דבק (טבלה של חומרים) לקראת הקרע זחל.
- למלא את החדר עם תמיסת מלח (במ מ): 128 NaCl, 2 אשלגן כלורי, 4 MgCl2, 1 CaCl2, סוכרוז 70 ו חומצה 5 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic (HEPES) pH 7.2.
- הוספת נוגדן peroxidase (HRP) נגד חזרת מצומדת כדי אלקסה עבור חיל הים 647 (anti-HRP:647; 1:10 שתדללו מניה 1 מ"ג/מ"ל) עבור תיוג NMJ את טרמינל presynaptic במהלך ניתוח21,22.
- שימוש במכחול בסדר (גודל 2), להסיר לחלל השלישי נודד של המבחנה מזון ומניחים על גבי הזכוכית מצופה elastomer כיסוי.
- למלא את הטיפ micropipette זכוכית עם נפח קטן של דבק באמצעות לחץ אוויר שלילי שנוצר על ידי הפה עם קובץ מצורף (שלב 1.5).
- מיקום זחל בצידו הגבי למעלה עם מלקחיים דבק לראש coverslip מצופים elastomer עם קטן טיפת דבק באמצעות לחץ אוויר חיובי על ידי הפה.
- חזור על הליך זה בקצה האחורי של הזחל, מוודא כי החיה נמתחת מתוח בין הקבצים המצורפים דבק שני.
- בעזרת מספריים (להבים 3 מ מ; טבלה של חומרים), עושים חתך אופקי (~ 1 מ מ) את ישבנה ואת חתך אנכי לאורך הקו האמצעי הגבי.
- בעזרת מלקחיים בסדר (מס ' 5, טבלה של חומרים), בעדינות להסיר את קנה הנשימה הגבי, הבטן, הגוף השמן ובאיברים פנימיים אחרים המכסים את מערכת השרירים.
- חזור על הפעולות הדבקה לכנפיים לגוף החומה 4, מוודא למתוח בעדינות את הקיר הגוף אופקית ואנכית.
- להרים את חוט עצבי הגחון (VNC) באמצעות מלקחיים, לחתוך בזהירות את העצבים המוטוריים עם המספריים ולאחר מכן להסיר לחלוטין את VNC.
- החלף את תמיסת המלח לנתיחה Ca2 +-חינם תמיסת מלח (כמו מלוחים לנתיחה לעיל מבלי CaCl2) להפסיק SV רכיבה על אופניים.
2. אפשרות 1: גבוהה [K+] צבע FM טעינה
- מפתרון FM1-43 מניות (4 מ מ), להוסיף 1 µL 1 מ"ל של 90 מ מ פתרון אשלגן כלורי (גבוהה [K+] בתוך הקרע תמיסת מלח) ריכוז סופי של 4 מיקרומטר.
- באמצעות פיפטה של, להחליף את Ca2 +-תמיסת מלח חינם בבית הבליעה הדמיה עם הפתרון צבע [K+] FM גבוהה לעורר SV אנדוציטוזה לצבוע ספיגת.
- מיד להתחיל טיימר דיגיטלי משך זמן שנקבע מראש הגבוה [K+] depolarizing גירוי תקופה (למשל., 5 דקות; איור 2).
- כדי לוודא הכנה זחל בריא, שימו לב את התכווצויות חזקות של מערכת השרירים למשך כל תקופת דפולריזציה גבוהה [K+].
- כאשר מסתיימת תקופת שעון עצר, להסיר הפתרון צבע [K+] FM גבוהה ובמהירות להחליף2 +Ca-תמיסת מלח חינם להפסיק SV רכיבה על אופניים.
- תשטוף ברצף מהיר עם Ca2 +-חינם תמיסת מלח (5 x עבור 1 דקות) כדי להבטיח הפתרון צבע גבוהה [K+] FM מוסר לחלוטין.
- לשמור על הכנת זחל ב Ca טריים2 +-תמיסת מלח חינם עבור הדמיה מיידית עם מיקרוסקופ קונפוקלי.
3. הדמיה: מיקרוסקופיה קונפוקלית
- השתמש מיקרוסקופ קונפוקלי זקוף עם 40 X המטרה טבילה במים כדי התמונה NMJ לצבוע קרינה פלואורסצנטית (מיקרוסקופים אחרים ניתן להשתמש).
- התמונה שריר NMJ 4 מקטעי בטן 2-4 (NMJs אחרים יכולים לדימות) לאסוף תמונות בעזרת תוכנה מתאימה (טבלה של חומרים).
- השתמש הנה 633 ננומטר לייזר כדי לעורר HRP:647 (עם מסנן לעבור זמן > 635 nm), של ארגון 488 ננומטר לייזר כדי לרגש FM1-43 (עם bandpass מסנן 530-600 ננומטר).
- מבצעית לקבוע רווח אופטימלי וההיסט עבור שני ערוצים.
הערה: הגדרות אלה יישארו קבועים במהלך המשך הניסוי. - לקחת את Z-ערימה קונאפוקלית דרך כל NMJ שנבחרו מן הפסגה המסומן HRP לחלק התחתון של הטרמינל סינפטית.
- שימו לב זהירה NMJ עם תמונה (קטע, לצד ושרירים) כדי להבטיח עודף NMJ באותו המדויק לאחר FM לצבוע פריקה.
4. גבוהה [K+] גירוי: FM דיי פריקה
- להחליף Ca2 +-תמיסת מלח חינם עם תמיסת המלח [K+] גבוהה (ללא צבען FM1-43) כדי נסיעה דפולריזציה, שחרור אקסוציטוזה וצבע SV.
- מיד להתחיל טיימר דיגיטלי עבור משך תקופת גירוי גבוה [K+] שנקבע מראש (למשל., 2 דקות; איור 2).
- כאשר מסתיימת תקופת שעון עצר, מיד להסיר את תמיסת המלח [K+] גבוהה ולהחליף עם Ca2 +-תמיסת מלח חינם להפסיק SV רכיבה על אופניים.
- תשטוף ברצף מהיר עם Ca2 +-חינם תמיסת מלח (5 x עבור 1 דקות) כדי להבטיח תמיסת המלח גבוהה [K+] מוסר לחלוטין.
- לשמור על הכנת זחל ב Ca טריים2 +-תמיסת מלח חינם עבור הדמיה מיידית עם מיקרוסקופ קונפוקלי.
- להיות בטוח תמונה של זריחה לצבוע FM1-43 ב NMJ זהה שצוין לעיל באמצעות אותן הגדרות קונפוקלי
5. אפשרות 2: גירוי חשמלי FM לצבוע טעינה
- הכן על פיפטה יניקה באמצעות את פולר microelectrode (טבלה של חומרים) כדי להשיג את להתחדד נדרש ואת עצה גודל.
- אש-פולין הטיפ microelectrode עם מיקרו-פורג עד עצבים מוטוריים יחיד יכול להישאב עם צפוף.
- תחליק פיפטה יניקה על המחזיק אלקטרודה micromanipulator, לצרף את צינור פלסטיק גמיש ארוך ומזרק.
- הגדרת פרמטרים ממריץ (למשל., 15 V, תדירות 20 Hz, משך 20 ms, זמן של 5 דקות (איור 2) או 1 דקות (איור 3)).
- להחליף את Ca2 +-תמיסת מלח חינם על הכנת זחל עם מעל תמיסת FM1-43 (4 מיקרומטר; CaCl 1 מ2) על האסדה אלקטרופיזיולוגיה.
- לשים ההכנה על הבמה מיקרוסקופ ולגדל את הבמה עד זחל של פיפטה היניקה בפוקוס (40 X טבילה במי המטרה).
- להתחנף לולאה של חתוך עצבים מוטוריים innervating את hemisegment שנבחר עם לחץ אוויר שליליים שנוצרו על-ידי המזרק אל האלקטרודה היניקה.
- מבחן הפונקציה אלקטרודה יניקה עם פרץ קצר של גירוי תוך פיקוח באופן חזותי להתכווצות השריר ב hemisegment שנבחר.
- לעורר את עצבים מוטוריים באמצעות הפרמטרים שנבחרו (שלב 5.4) לנהוג SV אנדוציטוזה ואת ספיגת לצבוע FM1-43 (איור 2).
- תשטוף ברצף מהיר עם Ca2 +-חינם תמיסת מלח (5 x עבור 1 דקות) כדי להבטיח הפתרון לצבוע FM1-43 מוסר לחלוטין.
- לשמור על הכנת זחל ב Ca טריים2 +-תמיסת מלח חינם עבור הדמיה מיידית באמצעות פרוטוקול הדמיה קונאפוקלית מלמעלה.
- שימו לב זהירה NMJ עם תמונה (קטע, צד, שרירים) כדי להבטיח גישה NMJ באותו המדויק לאחר פריקת לצבוע FM.
6. גירוי חשמלי: FM דיי פריקה
- להחליף את Ca2 +-חינם תמיסת מלח עם תמיסת מלח רגיל (ללא צבען FM1-43) ומניחים ההכנה חזרה לבמה לבוש אלקטרופיזיולוגיה.
- קבע את הפרמטרים ממריץ לפריקת (למשל, 15 V, 20 Hz התדר, 20 ms משך זמן של 2 דקות (איור 2) או 20 s (איור 3)).
- למצוץ את עצבים מוטוריים אותו לתוך האלקטרודה אותה כמתואר לעיל ולאחר מכן לעורר להפעלת SV אקסוציטוזה ושחרור לצבוע FM1-43.
- תשטוף ברצף מהיר עם Ca2 +-חינם תמיסת מלח (5 x עבור 1 דקות) כדי להבטיח הצבע החיצוני יוסר לחלוטין.
- לשמור על הכנת זחל ב Ca טריים2 +-תמיסת מלח חינם עבור הדמיה מיידית עם מיקרוסקופ קונפוקלי.
- להבטיח תמונה של זריחה לצבוע FM1-43 ב NMJ זהה שצוין לעיל באמצעות אותן הגדרות קונפוקלי.
7. אפשרות 3: Channelrhodopsin גירוי FM לצבוע טעינה
- העלאת לבטא ChR2 הזחלים על מזון המכיל את ChR2 גורם משותף כל טרנס רשתית (אתנול מומס ב; 100 מיקרומטר הריכוז הסופי).
- מקום הכנת זחל תא פלקסיגלס על הבמה מיקרוסקופ לנתיחה מצויד עם יציאת המצלמה.
- לצרף LED כחול (470 ננומטר; טבלה של חומרים) ממריץ לתכנות באמצעות כבל קואקסיאלי, למקם את ה-LED יציאת המצלמה.
- ממקדים את הקרן אור LED כחול על גבי הפונקציה זחל ביתור שימוש בפונקציה זום מיקרוסקופים.
- להחליף את Ca2 +-תמיסת מלח חינם על הכנת זחל עם מעל תמיסת מלח FM1-43 (4 מיקרומטר; CaCl 1 מ2) על הבמה optogenetic.
- להגדיר את הפרמטרים LED באמצעות ממריץ את (למשל, 15 V, תדירות, משך 20 ms וזמן של 5 דקות (איור 2) 20 הרץ).
- להתחיל את גירוי האור ולעקוב עם שעון עצר עבור משך הזמן שנקבע מראש של תקופת גירוי optogenetic (למשל, 5 דקות; איור 2).
- כאשר הטיימר מפסיק, במהירות להסיר הפתרון לצבוע FM ולהחליף עם Ca2 +-תמיסת מלח חינם כדי לעצור את ה-SV רכיבה על אופניים.
- תשטוף ברצף מהיר עם Ca2 +-חינם תמיסת מלח (5 x עבור 1 דקות) כדי להבטיח הפתרון לצבוע FM מוסר לחלוטין.
- לשמור על הכנת זחל ב Ca טריים2 +-תמיסת מלח חינם עבור הדמיה מיידית עם מיקרוסקופ קונפוקלי באמצעות פרוטוקול הדמיה מלמעלה.
- שימו לב זהירה NMJ עם תמונה (קטע, צד, שרירים) כדי להבטיח גישה NMJ באותו המדויק לאחר פריקת לצבוע FM.
8. Channelrhodopsin גירוי: FM דיי פריקה
- להחליף Ca2 +-תמיסת מלח חינם עם תמיסת מלח רגיל (ללא צבען FM1-43) על הבמה מיקרוסקופ הקרע עם יציאת המצלמה LED התמקדו הזחל.
- להגדיר את הפרמטרים ממריץ עבור פריקה (למשל, 15 V, תדירות, משך 20 ms וזמן של 2 דקות (איור 2) 20 הרץ).
- להתחיל את גירוי האור ולעקוב עם שעון עצר עבור משך תקופת גירוי optogenetic שנקבע מראש (למשל, 2 דקות; איור 2).
- כאשר מסתיימת תקופת שעון עצר, במהירות להסיר הפתרון לצבוע FM ולהחליף עם Ca2 +-תמיסת מלח חינם כדי לעצור את ה-SV רכיבה על אופניים.
- תשטוף ברצף מהיר עם Ca2 +-חינם תמיסת מלח (5 x עבור 1 דקות) כדי להבטיח הצבע החיצוני יוסר לחלוטין.
- לשמור על הכנת זחל ב Ca טריים2 +-תמיסת מלח חינם עבור הדמיה מיידית עם מיקרוסקופ קונפוקלי.
- להבטיח תמונה של זריחה לצבוע FM1-43 ב NMJ זהה שצוין לעיל באמצעות אותן הגדרות קונפוקלי.
9. זריחה כמת
- טען את התמונה ב- J תמונה (NIH קוד פתוח), ליצור הקרנה העוצמה המקסימלית על-ידי לחיצה על תמונה | ערימות | פרויקט Z.
- באמצעות מלחמה-ערוץ HRP:647, עבור אל התמונה | התאם | סף והחלק סרגל הכלים העליון עד רק NMJ מודגשת.
- באמצעות הכלי מטה, לחץ על NMJ. אם NMJ מקוטע, לחיצה ארוכה על לחצן מקש shift לחוץ ובחר כל החלקים.
- לשנות את התמונה לערוץ צבע FM1-43 וללכת על נתח | למדוד כדי לקבל מדידת קרינה פלואורסצנטית.
- חזור על צעדים 9.1-9.4 עבור התמונה "לפרוק" NMJ אותו (קטע מזוהה, לצד ושרירים).
- כדי לקבל את אחוז צבע זה היה לפרוק, לקחת את היחס בין עוצמות קרינה פלואורסצנטית שהמכולה/לטעון.
הערה: הליך זה יכול להיות שונה כדי לנתח זריחה על בסיס בוטון-לכל-בוטון באמצעות כלי הבחירה "אליפסה" או "חופשי" או. ניתן להפחית קרינה פלואורסצנטית רקע באמצעות דגימת קרינה פלואורסצנטית את השריר. ניתן להוסיף סוכני גם כדי להפחית את הרקע הזה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1 מציג את זרימת העבודה עבור פעילות תלוית FM לצבוע הדמיה פרוטוקול. הניסוי מתחיל תמיד עם הקרע דבק זחל זהה, ללא קשר גירוי לשיטת לאחר מכן. איור 1a הוא תיאור סכמטי של זחל גזור, מציג את חוט עצבי הגחון (VNC), מקרין העצבים ותבנית שריר hemisegmental חוזרות ונשנות. VNC יוסר ושטף את ההכנה בפתרון 4 מיקרומטר של FM1-43 (איור 1b, ורוד). הכנת ואז מגורה בנוכחות FM לצבוע באמצעות אחד שלוש אופציות אפשריות לטעון לצבוע באמצעות פעילות תלוית SV אנדוציטוזה (איור 1cI-III). הבא, צבען FM רכיבה על אופניים נעצר באמצעות Ca2 +-תמיסת מלח חינם, מסוף NMJ ספציפית נטען עם צבע FM הוא עם תמונה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי ("תמונה שנטענה"; איור 1 d). במקרה זה, השריר ש-NMJ 4 נבחרה עם המיקום מראה סכימטי של עצב, NMJ מסוף מסעף ו FM טעון עם העיתון ons סינפטית. הכנת סינפטית מגורה בפעם השנייה באמצעות אותה שיטה שבה נבחר לעיל, אך בהיעדר FM לצבוע לנהוג SV אקסוציטוזה ושחרור FM1-43 (איור 1e). אותו זיהה NMJ (שריר NMJ 4 בדוגמה זו) הוא ואז מחדש עם תמונה באמצעות תווית סינפטית HRP:647 FM1-43 שיורית שלפוחית אות ("תמונה לפרוק"; איור 1f). הנסיין קובע את הכוח ואת משך טעינה ופריקה שלבים כדי למטב את המידות assay ספציפי או תנאי מוטציה. עוצמת קרינה פלואורסצנטית הוא לכמת לאחר העמסה ופריקה (איור 1 d, 1f), כדי להשיג את המידות של צבען סינפטית אנדוציטוזה, אקסוציטוזה האחוז טעון שפורסמו צבען FM ניתן לבצע ניתוחים NMJ כולו או עם העיתון ons יחיד.
FM לצבוע טיולי אפניים יכול להיות מגורה בשלוש דרכים: 1) גבוהה [K+] דפולריזציה מלוחים ההכנה כולו, אלקטרודה 2) היניקה גירוי של העצב המוטוריים, או 3) אור מונע הפעלה של יישוב channelrhodopsin (ChR2; איור 2). להשוואה ישירה side-by-side של שלוש השיטות, מגורה בגישה כל 5 דקות בנוכחות FM1-43 (טעינת) ואחר כך למשך 2 דקות בהיעדרו של FM1-43 (פריקה), ואנו עם תמונה NMJs התווית על-ידי HRP באמצעות הגדרות קונאפוקלית זהה ( איור 2). בשיטה הגבוהה מלוחים דפולריזציה [K+] כדלקמן פרוטוקול FM1-43 נפוץ עבור דרוזופילה זחל NMJ23, אלא אנו משתמשים דבק במקום סיכות רוברט זחל. הדבק ימנע את ההתערבות עם יעדי המיקרוסקופ מאפשר קביעה מדויקת יותר של מתח לגוף החומה, אך דורשים עקומת למידה משמעותית. שלוש השיטות להפיק אותות פלואורסצנט חזקה ועקבית לאורך את סוכת בוטון סינפטית NMJ ובתוך בודדים עם העיתון ons סינפטית (כניסות). בשיטה הגבוהה מלוחים דפולריזציה [K+] גורם כל NMJs להיות טעון FM לאורך כל הזחל כמו זה depolarizes כל ניורון במערכות החיה (איור 2 א, התיכון). שיטת גירוי חשמלי אלקטרודה היניקה העצב מניע רק ב hemisegment יחיד של הזחלים עבורו המקביל innervating עצבים מוטוריים כבר מגורה (איור 2B, התיכון). קטעים unstimulated של אותה חיה להבדיל באמצעות התווית HRP אבל מכילים אין הפלורסנט הנצפה טעינה, לשמש כפקדי פנימית מעולה. Optogenetic שיטת ChR2 מייצרת תלויה מנהל ההתקן Gal4 הטרנסגניים המועסקים (איור 2C) יישוב דפולריזציה. . הנה, הנהג היה נהג גלוטמט vesicular (vglut) Gal4, אז כל הנוירונים glutamatergic הן depolarized עם גירוי אור כחול, כולל כל הנוירונים מנוע glutamatergic. כתוצאה מכך, כל NMJs נטענים עם צבע FM1-43 בדוגמה זו (איור 2C, התיכון). מנהלי התקנים ספציפיים התא יכול לשמש תווית ספציפי NMJs ולעזוב את האחרים ללא תווית עבור פקד פנימי.
FM דיי פריקה הושג באמצעות באותה שיטה שבה השתמשת כדי לטעון לצבוע. בשיטה הראשונה, הכנת זחל שחו פשוט בתוך תמיסת מלח גבוהה [K+] בהיעדר FM1-43 כדי depolarize תאים, כונן SV אקסוציטוזה, ולפרוק את מסופי סינפטית (איור 2 א, נכון). אנחנו בדרך כלל לסמן פריקה קצר (2 דקות) אז פריקה חלקית, מסופי יישארו גלויים בערוץ FM. אלקטרודה היניקה גירוי חשמלי פריקה הוא במידה ניכרת יותר מאתגרת, כי זה קשור חוזרים שוב ושוב אל hemisegment זהה, זיהוי העצב באותו ועירור מחדש האומץ כזה, בהעדר FM1-43 לנהוג דיי פריקה (איור 2B , נכון). שימו לב כי פריקת לצבוע שוב היה חלקי. פריקת ChR2 מצריכה תקופה נוספת של תאורה LED כחול של הכנת זחל בהיעדר FM1-43 כדי להפעיל את הערוצים, depolarize הנוירונים מנוע ולעורר SV אקסוציטוזה לצבוע שחרור (איור 2C, נכון). עם זה ציר הזמן של פריקה (2 דקות), שכל אחד מהם depolarization שיטות פרקו רק אחוז של לצבוע FM1-43 טעון, עם הערך הגבוה [K+] החזק ביותר, ChR2. החלשה נהיגה שחרור צבע (איור 2). מדדנו LED עוצמת האור בשימוש (140 מ"מ2), אשר היה שפורסם טווח (20-1000 מ"מ2)24,25,26. ChR2 מופעלת מקסימאלית על ידי תאורה mW ~ 1 50-200 mW מקורות אור, עם יעילות ChR2 תלויה גם ריכוז ATR למאכל זחלי27,28. לפיכך, ChR2 גירוי כוח ניתן לטפל. יתר על כן, הקשר עלול להישאר כך עם גירוי נקודות החוזק, צירי זמן או אחרים אחרים. אם הנסיין עובד עם מוטציה זה פחתה אנדוציטוזה SV או מהיר בצורה יוצאת דופן אקסוציטוזה, ייתכן שיהיה עליך הפרמטרים גירוי על מנת לשמור על אות הנצפה לאחר פריקת. התווית נגד-HRP מאפשר לזהות את NMJ גם בהיעדר מוחלט של אות FM, אבל זה לא אידיאלי עבור כימות. בעקרון, גירוי פריקה יכול להיות גם מסוג שונה מן הגירוי טעינה.
למדנו לאחרונה האובדן של ההשפעות Notum המופרש deacylase סינפטית על מחזור SV באמצעות גירוי חשמלי4. כאן, אנו להרחיב את ניתוח זה כדי להשוות בין 1) גבוה [K+] דפולריזציה שאיבה 2) אלקטרודה עצבים מוטוריים גירוי ושיטות (איור 3). אנו מוצאים כי הן שיטות לתת תוצאה דומה, מראה מופחתת FM1-43 צבע טעינה במוטציה null Notum ; אולם, מידת הסיכון פנוטיפ היא ברורה בין שתי השיטות. אחרי דפולריזציה בתמיסת [K+] גבוהה למשך חמש דקות, יש ירידה גדולה עוצמת קרינה פלואורסצנטית טעון בין הרקע הגנטי שליטה (w1118) עם רמות גבוהות של מוטציות null Notum (NotumKO ) עם רמות נמוכות (איור 3A, העליון). במדידות כימות, עוצמת קרינה פלואורסצנטית FM מנורמל בתוך NMJ המתוארים HRP מסופי פוחת באופן משמעותי בהיעדרו של Notum (w1118 1.0 ± 0.05 לעומת ± NotumKO 0.57 0.07; n≥13, p < 0.0001; איור 3B). לאחר גירוי חשמלי ב 20 הרץ עבור 1 דקות, שנמצא על ירידה חשיבות בעוצמתם FM1-43 טעון בין הפקדים Notum ערכי null כאשר לכימות NMJ כל זריחה (w1118 1.0 ± 0.05 לעומת NotumKO ± 0.86 0.06; n = 8, p = 0.10; איור 3 א, ב'). כאשר מודדים את צבען ההתאגדות על בסיס בוטון-לכל-בוטון, אנו מוצאים ירידה משמעותית צבע טעון עם שתי השיטות. במדידות כימות לאחר גירוי בתמיסת [K+] גבוהה, עוצמת קרינה פלואורסצנטית FM מנורמל לכל בוטון יופחתו במידה משמעותית (w1118 1.0 ± 0.02 לעומת ± NotumKO 0.52 0.02; n≥241, p< 0.0001; איור 3C). לאחר גירוי חשמלי, עוצמת קרינה פלואורסצנטית מנורמל לכל בוטון גם יופחתו במידה משמעותית, אם כי במידה נמוכה יותר (w1118 1.0 ± 0.02 לעומת ± NotumKO 0.83 0.02; n≥127, p< 0.0001; איור 3C).
תוצאת ההבדלים בין הפארדיגמות גירוי שני יכול להיות בגלל מספר גורמים. ראשית, עוצמת גירוי המשוער להיות גדול עם גבוה [K+] לעומת גירוי עצבי מנוע חשמלי. אלקטרופיזיולוגיה הקלטות לא יכול להיעשות בנוכחות תמיסת המלח [K+] גבוהה, אבל neuromusculature הזחל בבירור מקבל robustly גירוי, כמו התכווצות שרירים חזקים ובלתי מתמשך לאורך כל תקופת בגד ים 5 דקות. עם זאת, אנחנו לא יודעים את העוצמה או התדירות של הגירוי. לעומת זאת, גירוי חשמלי נשלט הרבה יותר עם המשתמש בוחר את הכוח מתח המדויק ואת התדירות של גירוי. שנית, משך גירוי היה ארוך עם גבוה [K+] לעומת גירוי עצבי חשמלי (איור 3). בחרנו 1 דקות של גירוי חשמלי 20 הרץ לאחר מבחנים חוזרים ונשנים. אחרי 1 דקות של טעינה לצבוע, היה אות FM1-43 אמין וחזק, ולכן בחרנו את פרדיגמת המחקר שלנו4, למרות 5 דקות של גירוי נתן אות ניאון חזקה (איור 2). לפיכך, האורך של הפרדיגמה גירוי סביר מאיצה את ההשתנות בסולם ריכטר, טוען FM1-43 בין גבוה [K+] גירוי חשמלי (איור 3B, ג). למרות השיטה [K+] גבוהה הראה הפנוטיפ עמידים יותר למוטאנטים Notum , עדיין השתמשנו בשיטת חשמל בגלל שליטה רבה יותר4. ישנם פרמטרים רבים כדי לשלוט כגון חוזק, התדירות והמשך של גירוי, הגדרות אלה חייבים להיות החליטה מבוססת על החשבונאי, השאלה. לדוגמה, בחירת שיטת גירוי תלויים הבריכה נחקר SV7 , מנגנון תלויי-פעילות חקר10.
לאחר FM1-43 טעינת בטרמינל NMJ, אחד יכול להעסיק זריחה photoconversion דיי לייצר האות צפופת אלקטרון מיקרוסקופ אלקטרונים (איור 4). בשיטה זו, הכנת צבע טעון חשופים אינטנסיבי אור ניאון בנוכחות diaminobenzidine (DAB), עם מינים חמצן תגובתי מ לצבוע FM מחמצן את DAB כדי ליצור את התמיסה כהה (איור 4A)11. אנא ראה את המאמר יופיטר על photoconversion של styryl צבעני פרטים מלאים12. היתרון של שיטה זו הוא כי SVs מתגלים בבירור ברמה ultrastructural, למרות מחזור SV כמובן נעצר עם מיקרוסקופ אלקטרונים סטטי הדמיה. בהיעדר גירוי, סינפטית עם העיתון ons- דרוזופילה NMJ נטענים בצפיפות עם שלפוחית (~ 40 ננומטר בקוטר; איור 4B), עם התרחשות נדירה של organelles מוגדלת (^100 ננומטר בקוטר) מניחים שהן endosomes רכיבה על אופניים. תמיסת מלח גבוהה [K+] depolarizing גירוי חזק משתנה פרופיל זה, עם דלדול חלקית של האוכלוסייה SV, הצטברות מהירה של רבים organelles מוגדלת (^100 ננומטר בקוטר) חשבתי לנבוע בצובר אנדוציטוזה של קרום פלזמה (איור 4C, משמאל). למרות תאים דומים קיימים פקדים unstimulated, צפיפות גבוהה של אלה organelles לאחר גבוהה דפולריזציה מלוחים [K+] מעלה את החשש כי זה עשוי להיות לתגובה הלא-פיזיולוגיים. גירוי חשמלי אלקטרודה היניקה של עצב מוטורי יחסית יעיל יותר ב depleting האוכלוסייה SV, אינו מייצר יותר של השלפוחיות המוגלתיות endosomal מוגדלת (איור 4D, משמאל). הדבר מצביע על כי אנדוציטוזה בצובר מונע על ידי דפולריזציה [K+] גבוהה מסייעת לשמור על האוכלוסייה SV במהלך דרישה יותר אינטנסיבי.
Photoconversion FM1-43 יכול להתבצע באמצעות גבוהה [K+] מלוחים דפולריזציה או גירוי חשמלי אלקטרודה היניקה של עצב מוטורי, להשוות ultrastructure סינפטית יחסית בוטון המנוחה (איור 4). עם גבוה [K+] depolarizing גירוי, SVs בודדים והן שלפוחית מוגדלת (^100 ננומטר בקוטר) יכול להיקרא עם צפיפות אלקטרונים DAB precipitate הבאים מונחה-אור photoconversion (איור 4C, נכון). מסיבות לא ידועות, קרום שלפוחית מוגדלת הוא בדרך כלל פחות בצפיפות שכותרתו יותר קרום SV קטנים יותר. יתר על כן, SVs מופיעים לעתים מלא התמיסה DAB, ולא רק את הקרום, אבל זה לגרום להם הרבה יותר קל להבחין בין השלפוחיות המוגלתיות ללא תווית. עם אלקטרודה היניקה גירוי של עצב מוטורי, האוכלוסייה SV אופניים גם ניתן לסמן באופן יחסי ללא תווית SVs (איור 4D, נכון). עם גירוי חשמלי, שלפוחית מוגדלת (^100 ננומטר בקוטר) לא נוצרות detectably עם העיתון ons, באופן עקבי, הממברנות של מדברות endosomes לא מסומנים על-ידי photoconversion FM1-43. כמו לעיל, SVs אופניים בדרך כלל מלאים של DAB precipitate אופנה במקצת all-or-none, ולכן יותר שקל להבחין SVs זה לא נוצר במהלך הגירוי (איור 4D, נכון). לא עוד ניסינו photoconversion בעקבות גירוי ChR2. עם הזמן השונים קורסים של גירוי, FM1-43 צבע photoconversion מאפשרת לקבוע היכן נוצרות SVs איך SVs הם הנסחר, העיתוי של התנועה בין בריכות מרחביות שונות בתוך בוטון סינפטית. ההשוואה של גבוהה [K+], גירוי עצבי מאפשר ניתוח בצובר ומנגנונים אנדוציטוזה יחיד SV.
איור 1: תרשים זרימה של טעינת פרוטוקול- דרוזופילה NMJ צבע FM1-43. הקרע דבק זחל מייצרת תכשיר neuromusculature שעברו שיטוח, עם חוט עצבי הגחון (VNC) מקרין סגמנטלי העצבים מן האמצע הגחון (Vm) כדי hemisegmentally חוזרת לגוף החומה שריר מערכים (שלב). VNC הוא לשחרר, הקרע זחל כולו מודגרת ואז בפתרון ורוד FM1-43 (4 מיקרומטר) כהכנה גירוי (שלב ב'). FM1-43 ואז נטען עם פרדיגמה גירוי שנבחר (שלב 3); עם האפשרויות של דפולריזציה [K+] גבוהה של הזחל כולו (cI), שאיבה אלקטרודה גירוי של עצבים מוטוריים יחיד (cII), או הפעלת מונחה אור ממוקדות channelrhodopsin (cIII). התאגדות FM1-43 נעצר באמצעות Ca2 +-חינם תמיסת מלח ו- NMJ שנטענו לצבוע עם תמונה (שלב ד). גירוי השני ואז נעשה ללא FM1-43 באמבטיה לנהוג לצבוע שלפוחית סינפטית אקסוציטוזה (שלב ה). NMJ אותו ואז צילמו מחדש כדי assay הטרמינל סינפטית לפרוק (שלב f). פלורסנט בעוצמה נמדד NMJs טעון והן לפרוק לכמת אקסוציטוזה אנדוציטוזה SV ורמות SV. החלונית התחתונה מציגה את הבנייה פרמטרים הממדים עבור תא אקרילי שקוף המשמש עבור מחקרים אלה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: FM לצבוע טעינה ופריקה של השוואה בין שיטות גירוי כל. השוואה של FM1-43 לצבוע טעינה, פריקה ב לחלל השלישי נודד NMJ עם 1) גבוהה [K+] דפולריזציה של הכנת זחל כולו (למעלה), 2) יניקה אלקטרודה גירוי חשמלי של עצב מוטורי (באמצע) ו- 3) אור מונחה הפעלה של יישוב channelrhodopsin (ChR2) רק במוטורי לגלוקוז (למטה). (א) הזחל NMJ המסומנת על האנטי-מרקר ממברנה presynaptic HRP:647 (כחול, שמאלה), עמוסה FM1-43 ויה דפולריזציה גבוהה [K+] עבור 5 דקות (באמצע) ולביטול ואז דרך דפולריזציה גבוהה [K+] עבור 2 דק (B) השוואה עם אלקטרודה היניקה גירוי עצבי חשמלי עם התקופות גירויים זהה עבור שניהם לצבוע FM1-43 לפריקה וטעינה. (ג) ממוקד vglut-Gal4^UAS-ChR2-H134R ביטוי מוטורי לגלוקוז מופעל עם כחול (470 ננומטר) אור על תקופות גירויים באותו צבע FM1-43 לפריקה וטעינה. כוכביות מתייחסים כניסות הצגת עם העיתון ons הגדלה גבוהה יותר. סרגל קנה מידה הוא 10 מיקרומטר, עם שיבוץ סינפטית עם העיתון ons מוגדל 3.5 X מ פאנלים הראשי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: מוטציות null Notum מראים מופחתת לצבוע FM שם עם העיתון ons סינפטית. FM1-43 נטען לתוך מסופי סינפטית כ"רוח השלישי instar NMJ השוואת הבקרה הגנטית (w1118) Notum המוטנטים null (קוNotum). עם העיתון ons (A) NMJ המסומנת גבוהה [K+] דפולריזציה של הכנה זחל כולו (למעלה) או אלקטרודה היניקה גירוי של עצבים מוטוריים אחד (למטה) w1118 (משמאל) ו NotumKO (מימין). Quantified (B) טעון פלורסצנטיות FM1-43 לכל NMJ כמו מגרש פיזור השוואת גבוהה [K+] דפולריזציה וגירוי אלקטרודה היניקה בפקדים w1118 לעומת NotumKO מוטציות. Quantified (ג) נטען זריחה על בסיס בוטון-לכל-בוטון כמו מגרש תיבת-שפם השוואת דפולריזציה [K+] גבוהה ו יניקה אלקטרודה לגירוי בפקדים w1118 לעומת Notumקו . T-זנבית-הבדיקות של סטודנט בוצעו עבור כל השוואה עם p-הערכים המוצגים על הגרפים. ברים להציג זאת אומרת ± SEM עם פריזמה (גירסה 7.0 עבור Windows). הנתונים גירוי חשמלי היה מותאם באישור Kopke et al., פיתוח 144 (19): 3499-510, 2017. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: ultrastructure סינפטיים עם FM photoconversion צבע לסימון שלפוחית. פלורסנט FM1-43 יכול להיות photoconverted את התמיסה צפיפות אלקטרונים מחומצן diaminobenzidine (DAB) לתצוגה חזותית באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM). (א) A תרשים סכמטי של השיטה photoconversion לתייג את NMJ דרוזופילה בעקבות פעילות תלוית FM1-43 צבע טעינת. (B) TEM נציג תמונה של בוטון סינפטית wildtype במצב מנוחה (unstimulated). הערה אוכלוסייה צפופים של בגודל אחיד SVs. (ג) סינפטית עם העיתון ons זה כבר עוררו עם גבוהה [K+] דפולריזציה saline למשך 5 דקות, בלי photoconversion (משמאל) או עם FM1-43 photoconversion (מימין). הערה הנוכחות של מבנים endosomal בתפזורת, שכותרתו ואת ללא תווית. (ד) סינפטית עם העיתון ons זה יש כבר מגורה חשמלית עם חוצפה יניקה אלקטרודה ב 20 הרץ למשך 5 דקות עם לא photoconversion (משמאל) או עם FM1-43 photoconversion (מימין). שימו לב כי השלפוחיות המוגלתיות שנטענו לצבוע להופיע הרבה יותר סמוכים שלפוחית לפרוק כהה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
גירוי גבוה [K+] מלוחים depolarizing הוא והכי מתוך שלושת האפשרויות עבור צבע FM תלויי-פעילות רכיבה על אופניים, אבל סביר להניח פיזיולוגיים לפחות29. שיטה פשוטה זו depolarizes כל תא נגיש החיה כולו, אז אינו מאפשר לימודים מכוונת. ייתכן ניתן להחיל באופן מקומי גבוה תמיסת מלח [K+] עם micropipette, אבל זה עדיין depolarize תאים טרום/postsynaptic וסביר סינפסה-הקשורים עכשיו, דונלד1. חשש מרכזי נוסף הוא זה גבוה [K+] דפולריזציה כוננים מהירה היווצרות endosomes בכמות גדולה כי הם רק לעתים רחוקות ראיתי ב- unstimulated עם העיתון ons. עם זאת, בצובר אנדוזום צורה היא מנגנון פעיל תיחסם על-ידי מוטציות29, המציינת את תהליך פיזיולוגי אמיתי. לפיכך, הדמיה FM1-43 עם דפולריזציה [K+] גבוהה ניתן ללמוד באופן סלקטיבי בצובר אנדוציטוזה-הסינפסות. גירוי חשמלי אלקטרודה היניקה של עצב מוטורי היא שיטה הרבה יותר מבוקר. זה היתרון של רק צרור אקסון בודד מגורה, ולא רק presynaptic טרמיני הוא ישירות depolarized (כמובן, סיבי השריר הוא ואז depolarized על-ידי פעולת משדר). לכן מספק פקד פנימי גדול של NMJs החיה אותו הם לא גירוי. שיטה זו מאפשרת לשלוט שליטה הפרמטרים גירוי, בניגוד שיטת גירוי [K+] גבוהה, המאפשרים השוואה ישירה עם הקלטות אלקטרופיזיולוגיה4. עם זאת, טכניקה זו דורש ציוד מיוחד וברמת מיומנות טכנית גבוהה למדי, ולכן הוא פחות נגיש. ההפעלה מבוססת אור של יישוב channelrhodopsin (ChR2) יש את היתרון של פילוח נוירונים בחר30. שיטה זו דורשת אין כל היכרות עם שיטות אלקטרופיזיולוגיה, והוא יכול להיעשות עם ציוד זול מאוד במעבדה כלשהי, אך גישה זו מצריכה היכרות בסיסית עם גנטיקה דרוזופילה .
הבחירה של גירוי פרמטרים היא חשובה ביותר עבור בדיקות SV מחזור dynamics שאילתה בטווח של תנאים גנטי עם פנוטיפים משתנה מאוד1. עבור כל השיטות, החיצוני [Ca2 +] בשימוש הוא פרמטר מפתח שליטה הכוח המניע של SV רכיבה על אופניים. עם שיטת גירוי גבוה [K+], בחירה חשובה היא [K+] בשימוש, הקובע את מידת הכוח דפולריזציה. מדידות של דרוזופילה haemolymph לציין [K+] של 5 מ מ, 90 מ מ הוא בדרך כלל ריכוז לרוב שבחרת עבור פעילות גירוי3,7,15,17 , 31. אולם, מ 30-90 מ מ טווח [K+] כבר מועסקים משתנים16,325,כוח גירוי. עוד פרמטר קריטי החלטה הוא האורך של הגירוי גבוהה [K+] עבור שניהם FM1-43 לפריקה וטעינה. תקופת להעלאה קובעת אם האוכלוסיה SV אופניים ביעילות טעון, או רק תת-ערכה של שלפוחית פעיל7. התקופה לפריקת באופן דומה מכתיבה אחוז SVs בתהליך אקסוציטוזה בתקופה גירוי, אשר יכול לחשוף או לטשטש התלויים על קצב המוטציות פנוטיפים משתנה ב ה-SV רכיבה על אופניים בתדירות2. עם אלקטרודה היניקה גירוי חשמלי עצבים מוטוריים, אפשרויות פרמטר כוללות גם גירוי מתח, תדירות, משך ומרווחי דופק. חנותם בדוגמת פעילות דטרמיננטה מפתח של SV רכיבה על אופניים dynamics7, גירוי אחר דפוסים באופן סלקטיבי יכולה לגייס בריכות SV ברורים. עם ממוקד מונחה-אור ChR2 ההפעלה, האפשרויות הן: כל האמור לעיל (עם עוצמת אור משתנים), אפשרויות נוספות הטרנסגניים שעלון בסעיף הבא. עם אלה פרמטר, בחירות מגיע ניסיוני יותר שליטה, אלא גם המורכבות הטכנית מוגברת.
Channelrhodopsin-2 (ChR2) הוא ערוץ ממותגת אור קרום חדיר מונו - ו קטיונים דו ערכיים33. אם ChR2 גירוי נבחרה, יש אפשרויות רבות להתבצע כולל מנהל ההתקן Gal4, UAS-ChR2 לבנות ומשתנים מקור האור להפעלת ערוץ. Gal4 מנהלי התקנים נע בין בכל מקום ספציפי מאוד. לדוגמה, UH1-Gal4 בכל מקום (daughterless) אקספרס ChR2 בכל תא, בעוד CcapR-Gal4 (Janelia) כונני ChR2 בשריר NMJ 6/7 אבל לא את השריר 4 NMJ31,34. הסלקטיביות הזאת יכולה לשמש פקד פנימי רב עוצמה. ישנן גם גרסאות UAS-ChR2 רבים, כולל ChR2-H134R (כאן בשימוש; photocurrents מוגבר גורם את שאריות מוטציה)35, VChR1, המפקדת, עוד רבים36. בכל גרסאות אלה ערוץ יש מאפיינים ברורים של אור דרך השער, מוליכות, יון סלקטיביות, קינטיקה, הקהיה. הערה שבונה מסוימים מכילים תגית פלורסנט שעלולה להפריע FM הדמיה. לדוגמה, UAS-ChR2-H134R המשמש כאן מתויג עם mCherry (לשעבר: 587 ננומטר, em: 610 nm), אבל אינו מייצר פליטה detectible עם FM1-43 (לשעבר: 479 ננומטר, em: 598 ננומטר) הדמיה מסננים. פרמטר טכני אפשרויות כוללות את מקור האור, אורך הגל והעוצמה להפעלת הערוץ. אפשרות להשתמש כאן הוא זול פולט-blue LED, עם גירוי חזותי אושרה על-ידי assaying התכווצות שרירים. גם אנחנו היינו מצליחים בהפעלת ChR2 שימוש epifluorescence, למרות לייזר קונפוקלי סריקה לא הספיק. Epifluorescence יכול לשמש יישוב גירוי (מגזרים ספציפיים במקום כל החיות), אבל גירוי הפרמטרים הם קשה לשלוט, ואילו ה-LED מחובר עד ממריץ פשוט בקלות הפיצולים הן את המשך והתדירות של אור פולסים. התמקדות נורית ה-LED דרך היציאה מצלמה ניתוח המיקרוסקופ מאפשר גירוי קל יותר מבוקרת, אינטנסיבי.
זה תלוי הנסיין להחליט אם ישאיר אותו עצב הגחון הכבל/שלם במהלך הפרדיגמה גירוי או לא. בחרנו להסיר את מערכת העצבים המרכזית כולו עבור ההשוואה שלוש שיטות כאן, אבל לפעמים החיווט במעלה הזרם נשאר שלם15. סיבוך נמצא כי פעילות עצבית אנדוגני מתרחש כאשר מערכת העצבים נשאר שלם. מידת הפעילות הזאת זה משתנה מאוד מחיה לחיה, תלויה בבמידה רבה המומחיות דיסקציה של הנסיין. פעילות זו משתנה יכול לתרום כמות FM1-43 צבע זה הוא לטעינה ולביטול, וזו ולכן לא אך ורק בשל ה לגירוי אקסוגני מועסקים15. סיבוך טכני הקשור היא הזחלים ביתור שלם חוזה את מערכת השרירים בתנועה פיקטיבי, הזחה הזה מאוד מפריע NMJ הדמיה. תנועה זו הביאו להקלה אם מוסר על מערכת העצבים המרכזית, וגם באמצעות היישום של Ca2 +-תמיסת מלח חינם במהלך הדימות4. גישות אלה המשמש כאן מספיקים לאפשר מצויינת לצבוע FM1-43 הדמיה בהכנת NMJ. עם זאת, כמה ניסויים לבחור להוסיף תרופות כדי לעכב את התכווצות שרירים (למשל, ryanodine, philanthotoxin-433), או להשתמש פוטנציאל הפעולה חוסמי (למשל, טטרודוטוקסין)37,38. מגוון של תרופות ניתן לטפל באופן סלקטיבי את מחזור SV, כדי להדגיש שלבים מסוימים, או להדגיש פנוטיפים מוטציה לבחון את מנגנוני עצבית. לדוגמה, כמה ניסויים המועסקים Veratridine (מפעיל ממותגת מתח Na+ ערוצי39) כדי להגדיל SV טעינת בבריכה מילואים, וציקלוספורין A (מעכב פעילות Calcineurin40) כדי לשפר את SV אנדוציטוזה, ו Forskolin (מפעיל adenylyl cyclase41, אשר משפר הסינאפסית42) כדי להגדיל את מסכות/אנדו אופניים בריכה7,43,44. מניפולציות תרופתי כזה יכול לספק תובנות נוספות. לבסוף, רקע FM1-43 יכול להתרחש בדרגות בהתבסס על איכות לנתיחה, שטיפת פרוטוקול האפקטיביות וגירוי. יש להוסיף נגזרת sulfobutylated של β-cyclodextrin Advasep-745או את fluorophore מימית sulforhodamine46, להרוות ספציפי קרינה פלואורסצנטית ולשפר את יחס אות-כדי-ברקע.
ישנן טכניקות רבות והסיכון FM פלורסנט הדמיה כדי הבנה נוספת של מחזור SV (למשל, אלקטרופיזיולוגיה, synaptopHluorin, מיקרוסקופ אלקטרונים). דוגמה המוצג כאן הוא photoconversion קרינה פלואורסצנטית FM המשמש כדי לחקור את ה-SV מחזור בפירוט ultrastructural. SVs מאורגנות מספר בריכות הנמצאים במרחב והן מבחינה תפקודית ברורה2. הבריכה בקלות releasable (בידם) מכיל שלפוחית שוחרר מיד על גירוי אקוטי. בריכה מיחזור גדול שומר על SV שחרור בתנאים של פעילות מתונה. בריכה פנימית מילואים (RP) הוא גויס רק עם גירוי חזק (לכאורה ליד הלא-פיזיולוגיים)2. הבריכות SV אשר מופעלים תלויות בסוג של גירוי המשמש47, הדוחות NMJ דרוזופילה באמצעות FM photoconversion חשפו מפתח תובנות המרחבי פונקציונלי מאפיינים אלה בריכות שונות SV48. FM photoconversion ניתן ללמוד בריכות SV מופעל תחת שונות גירויים פרדיגמות ושאלות שאילתה כגון לדיון ארוך האינטראקציה סחר בין endosomes ל- SVs49. אם הנסיין שמעוניין FM הדמיה, בשילוב עם שינויים תלויי-פעילות אחרים על הסינפסה, יש אנלוגים הדיווחים ניתן לתיקון לצבוע FM1-43 (FM1-43FX). המכשיר הזה צריך לאפשר אחד לתקן את דרוזופילה NMJ לאחר צבע תלויי-פעילות טעינת ולאחר מכן בצע נוגדן תיוג לבדיקת מתאמים בין רמת הפעילות בוטון (FM לצבוע זריחה) תלויי-פעילות לביטוי חלבון בעל עניין. בעתיד, זה. להיות מאוד מתגמל לחקור שיטות נוספות העלולה לאפשר השילוב של צבע FM הדמיה עם גישות אחרות הדמיה על הסינפסה מודל יפה NMJ דרוזופילה .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים אין אינטרסים מתחרים.
Acknowledgments
אנו מודים Broadie מעבדה חברים לתרומות למאמר זה. עבודה זו נתמכה על ידי NIH R01s MH096832 ו- MH084989 כדי. תן לי לראות, ואחווה NIH predoctoral F31 MH111144 כדי D.L.K.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SylGard 184 Silicone Elastomer Kit | Fisher Scientific | NC9644388 | To put on cover glass for dissections |
| Microscope Cover Glass 22x22-1 | Fisherbrand | 12-542-B | To put SylGard on for dissections |
| Aluminum Top Hot Plate Type 2200 | Thermolyne | HPA2235M | To cure the SylGard |
| Plexi glass dissection chamber | N/A | N/A | Handmade |
| Borosilicate Glass Capillaries | WPI | 1B100F-4 | To make suction and glue micropipettes |
| Laser-Based Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-2000 | To make suction and glue micropipettes |
| Tygon E-3603 Laboratory Tubing | Component Supply Co. | TET-031A | For mouth and suction pipette |
| P2 pipette tip | USA Scientific | 1111-3700 | For mouth pipette |
| 0.6-mL Eppendorf tube cap | Fisher Scientific | 05-408-120 | Used to put glue in for dissection |
| Vetbond 3M | WPI | vetbond | Glue used for dissections |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P-217 | Forsaline |
| Sodium Chloride | Millipore Sigma | S5886 | For saline |
| Magnesium Chloride | Fisher Scientific | M35-500 | For saline |
| Calcium Chloride Dihydrate | Millipore Sigma | C7902 | For saline |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | For saline |
| HEPES | Millipore Sigma | H3375 | For saline |
| HRP:Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 123-605-021 | To label neuronal membranes |
| Paintbrush | Winsor & Newton | 94376864793 | To manipulate the larvae |
| Dumont Dumostar Tweezers #5 | WPI | 500233 | Used during dissection |
| 7 cm McPherson-Vannas Microscissors (blades 3 mm) | WPI | 14177 | Used during dissection |
| FM1-43 | Fisher Scientific | T35356 | Fluorescent styryl dye |
| Digital Timer | VWR | 62344-641 | For timing FM dye load/unload |
| LSM 510 META laser-scanning confocal microscope | Zeiss | For imaging the fluorescent markers | |
| Zen 2009 SP2 version 6.0 | Zeiss | Software for imaging on confocal | |
| HeNe 633nm laser | Lasos | To excite HRP:647 during imaging | |
| Argon 488nm laser | Lasos | To excite the FM dye during imaging | |
| Micro-Forge | WPI | MF200 | To fire polish glass micropipettes |
| 20mL Syringe Slip Tip | BD | 301625 | To suck up the axon for electrical stimulation. |
| Micro Manipulator (magnetic base) | Narishige | MMN-9 | To control the suction electrode for electrical stimulation |
| Stimulator | Grass | S48 | To control the LED and electrical stimulation |
| Zeiss Axioskop Microscope | Zeiss | Used during electrical stimulation. | |
| 40X Achroplan Water Immersion Objective | Zeiss | Used during electrical stimulation and confocal imaging | |
| All-trans Retinal | Millipore Sigma | R2500 | Essential co-factor for ChR2 |
| Zeiss Stemi Microscope with camera port | Zeiss | 2000-C | Used during channelrhodopsin stimulation |
| LED 470nm | ThorLabs | M470L2 | Used for ChR activation |
| T-Cube LED Driver | ThorLabs | LEDD1B | To control the LED |
| LED Power Supply | Cincon Electronics Co. | TR15RA150 | To power the LED |
| Optical Power and Energy Meter | ThorLabs | PM100D | To measure LED intensity |
References
- Menon, K. P., Carrillo, R. A., Zinn, K. Development and plasticity of the Drosophila larval neuromuscular junction. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 647-670 (2013).
- Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Synaptic vesicle pools. Nat Rev Neurosci. 6 (1), 57-69 (2005).
- Long, A. A., et al. Presynaptic calcium channel localization and calcium-dependent synaptic vesicle exocytosis regulated by the Fuseless protein. J Neurosci. 28 (14), 3668-3682 (2008).
- Kopke, D. L., Lima, S. C., Alexandre, C., Broadie, K. Notum coordinates synapse development via extracellular regulation of Wingless trans-synaptic signaling. Development. 144 (19), 3499-3510 (2017).
- Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. J Neurosci. 12 (2), 363-375 (1992).
- Richards, D. A., Bai, J., Chapman, E. R. Two modes of exocytosis at hippocampal synapses revealed by rate of FM1-43 efflux from individual vesicles. J Cell Biol. 168 (6), 929-939 (2005).
- Verstreken, P., Ohyama, T., Bellen, H. J. FM 1-43 labeling of synaptic vesicle pools at the drosophila neuromuscular junction. Methods Mol Biol. 440, 349-369 (2008).
- Dickman, D. K., Horne, J. A., Meinertzhagen, I. A., Schwarz, T. L. A Slowed Classical Pathway Rather Than Kiss-and-Run Mediates Endocytosis at Synapses Lacking Synaptojanin and Endophilin. Cell. 123 (3), 521-533 (2005).
- Verstreken, P., et al. Endophilin Mutations Block Clathrin-Mediated Endocytosis but Not Neurotransmitter Release. Cell. 109 (1), 101-112 (2002).
- Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J. -Y., Goodman, K. M., Harata, N. C. Examination of synaptic vesicle recycling using FM dyes during evoked, spontaneous, and miniature synaptic activities. J Vis Exp. (85), (2014).
- Sandell, J. H., Masland, R. H. Photoconversion of some fluorescent markers to a diaminobenzidine product. J Histochem Cytochem. 36 (5), 555-559 (1988).
- Opazo, F., Rizzoli, S. O. Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes. J Vis Exp. (36), e1790 (2010).
- Sabeva, N. S., Bykhovskaia, M. FM1-43 Photoconversion and Electron Microscopy Analysis at the Drosophila Neuromuscular Junction. Bio-protocol. 7 (17), (2017).
- Sabeva, N., Cho, R. W., Vasin, A., Gonzalez, A., Littleton, J. T., Bykhovskaia, M. Complexin Mutants Reveal Partial Segregation between Recycling Pathways That Drive Evoked and Spontaneous Neurotransmission. J Neurosci. 37 (2), 383-396 (2017).
- Ryan, T. A., Reuter, H., Wendland, B., Schweizer, F. E., Tsien, R. W., Smith, S. J. The kinetics of synaptic vesicle recycling measured at single presynaptic boutons. Neuron. 11 (4), 713-724 (1993).
- Ramaswami, M., Krishnan, K. S., Kelly, R. B. Intermediates in synaptic vesicle recycling revealed by optical imaging of Drosophila neuromuscular junctions. Neuron. 13 (2), 363-375 (1994).
- Trotta, N., Rodesch, C. K., Fergestad, T., Broadie, K. Cellular bases of activity-dependent paralysis in Drosophila stress-sensitive mutants. J Neurobiol. 60 (3), 328-347 (2004).
- Long, A. A., et al. The nonsense-mediated decay pathway maintains synapse architecture and synaptic vesicle cycle efficacy. J Cell Sci. 123 (Pt 19), 3303-3315 (2010).
- Parkinson, W., Dear, M. L., Rushton, E., Broadie, K. N-glycosylation requirements in neuromuscular synaptogenesis. Development. 140 (24), 4970-4981 (2013).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), (1993).
- Jan, L. Y., Jan, Y. N. Antibodies to horseradish peroxidase as specific neuronal markers in Drosophila and in grasshopper embryos. Proc Natl Acad Sci. 79 (8), (1982).
- Paschinger, K., Rendić, D., Wilson, I. B. H. Revealing the anti-HRP epitope in Drosophila and Caenorhabditis. Glycoconj J. 26 (3), 385-395 (2009).
- Ramachandran, P., Budnik, V. Fm1-43 labeling of Drosophila larval neuromuscular junctions. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (8), (2010).
- Yawo, H., Kandori, H., Koizumi, A. Optogenetics: light-sensing proteins and their applications. , (2015).
- Pulver, S. R., Pashkovski, S. L., Hornstein, N. J., Garrity, P. A., Griffith, L. C. Temporal dynamics of neuronal activation by Channelrhodopsin-2 and TRPA1 determine behavioral output in Drosophila larvae. J Neurophysiol. 101 (6), 3075-3088 (2009).
- Hornstein, N. J., Pulver, S. R., Griffith, L. C. Channelrhodopsin2 Mediated Stimulation of Synaptic Potentials at Drosophila Neuromuscular Junctions. J Vis Exp. (25), e1133 (2009).
- Britt, J. P., McDevitt, R. A., Bonci, A. Use of channelrhodopsin for activation of CNS neurons. Curr Protoc Neurosci. , Chapter 2, Unit 2.16 (2012).
- Lin, J. Y. A user's guide to channelrhodopsin variants: features, limitations and future developments. Exp Physiol. 96 (1), 19-25 (2011).
- Vijayakrishnan, N., Woodruff, E. A., Broadie, K. Rolling blackout is required for bulk endocytosis in non-neuronal cells and neuronal synapses. J Cell Sci. 122, 114-125 (2009).
- Honjo, K., Hwang, R. Y., Tracey, W. D. Optogenetic manipulation of neural circuits and behavior in Drosophila larvae. Nat Protoc. 7 (8), 1470-1478 (2012).
- Dear, M. L., Shilts, J., Broadie, K. Neuronal activity drives FMRP- and HSPG-dependent matrix metalloproteinase function required for rapid synaptogenesis. Sci Signal. 10 (504), (2017).
- Baldwin, M. L., Rostas, J. A. P., Sim, A. T. R. Two modes of exocytosis from synaptosomes are differentially regulated by protein phosphatase types 2A and 2B. J Neurochem. 85 (5), 1190-1199 (2003).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 13940-13945 (2003).
- Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9715-9720 (2008).
- Nagel, G., Brauner, M., Liewald, J. F., Adeishvili, N., Bamberg, E., Gottschalk, A. Light Activation of Channelrhodopsin-2 in Excitable Cells of Caenorhabditis elegans Triggers Rapid Behavioral Responses. Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).
- Lin, J. Y. A user's guide to channelrhodopsin variants: features, limitations and future developments. Exp Physiol. 96 (1), 19-25 (2011).
- Sullivan, K. M., Scott, K., Zuker, C. S., Rubin, G. M. The ryanodine receptor is essential for larval development in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (11), 5942-5947 (2000).
- Narahashi, T., Moore, J. W., Scott, W. R. Tetrodotoxin Blockage of Sodium Conductance Increase in Lobster Giant Axons. J Gen Physiol. 47 (5), 965-974 (1964).
- Narahashi, T. Chemicals as tools in the study of excitable membranes. Physiol Rev. 54 (4), 813-889 (1974).
- Kuromi, H., Yoshihara, M., Kidokoro, Y. An inhibitory role of calcineurin in endocytosis of synaptic vesicles at nerve terminals of Drosophila larvae. Neurosci Res. 27 (2), 101-113 (1997).
- Seamon, K. B., Daly, J. W. Forskolin, cyclic AMP and cellular physiology. Trends Pharmacol Sci. 4, 120-123 (1983).
- Zhang, D., Kuromi, H., Kidokoro, Y. Synaptic Transmission at the Drosophila Neuromuscular Junction: Effects of Metabotropic Glutamate Receptor Activation. Slow Synaptic Responses Modul. , 260-265 (2000).
- Kuromi, H., Kidokoro, Y. The optically determined size of exo/endo cycling vesicle pool correlates with the quantal content at the neuromuscular junction of Drosophila larvae. J Neurosci. 19 (5), 1557-1565 (1999).
- Kuromi, H., Kidokoro, Y. Selective Replenishment of Two Vesicle Pools Depends on the Source of Ca2+ at the Drosophila Synapse. Neuron. 35 (2), 333-343 (2002).
- Kay, A. R., et al. Imaging Synaptic Activity in Intact Brain and Slices with FM1-43 in C. elegans, Lamprey, and Rat. Neuron. 24 (4), 809-817 (1999).
- Pyle, J. L., Kavalali, E. T., Choi, S., Tsien, R. W. Visualization of Synaptic Activity in Hippocampal Slices with FM1-43 Enabled by Fluorescence Quenching. Neuron. 24 (4), 803-808 (1999).
- Denker, A., Rizzoli, S. O. Synaptic vesicle pools: an update. Front Synaptic Neurosci. 2, 135 (2010).
- Denker, A., Kröhnert, K., Rizzoli, S. O. Revisiting synaptic vesicle pool localization in the Drosophila neuromuscular junction. J Physiol. 587 (12), 2919-2926 (2009).
- Wucherpfennig, T., Wilsch-Bräuninger, M., Gonz ález-Gait án, M. Role of Drosophila Rab5 during endosomal trafficking at the synapse and evoked neurotransmitter release. J Cell Biol. 161 (3), 609-624 (2003).
