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Neuroscience

Synapse में एफएम डाई सायक्लिंग: उच्च पोटेशियम ध्रुवीकरण, बिजली और Channelrhodopsin उत्तेजना की तुलना

Published: May 24, 2018 doi: 10.3791/57765
Automatic Translation
1, 2
1Department of Biological Sciences, Vanderbilt University, 2Departments of Biological Sciences, Pharmacology, Cell and Developmental Biology, Kennedy Center for Research on Human Development, Vanderbilt University and Medical Center

Summary

Synaptic पुटिका (एसवी) सायक्लिंग, न्यूरॉन synapses में सेलुलर संचार का मुख्य तंत्र है । एफएम डाई और रिलीज के लिए मात्रात्मक परख एसवी इंडो-और exocytosis के प्राथमिक साधन हैं । यहां, हम सभी उत्तेजना तरीकों की तुलना करने के लिए FM1-43 साइकिल चालन के लिए Drosophila neuromuscular जंक्शन (NMJ) मॉडल synapse ।

Abstract

एफएम रंजक synaptic पुटिका (एसवी) चक्र का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है । ये amphipathic जांच एक हाइड्रोफिलिक सिर और hydrophobic पूंछ है, उंहें पानी में घुलनशील बनाने के लिए reversibly प्रवेश और निकास झिल्ली लिपिड bilayers की क्षमता के साथ । इन styryl रंजक अपेक्षाकृत गैर जलीय मध्यम में फ्लोरोसेंट हैं, लेकिन प्लाज्मा झिल्ली के बाहरी पत्रक में प्रविष्टि का कारण बनता है एक > 40X प्रतिदीप्ति में वृद्धि हुई है । synapses में, एफएम रंजक एसवी endocytosis के दौरान आंतरिक, दोनों भीतर और एसवी पूल के बीच, और एसवी exocytosis के साथ जारी, neurotransmission के presynaptic चरणों कल्पना करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान कर रहे हैं । glutamatergic synapse विकास और समारोह के एक प्राथमिक आनुवंशिक मॉडल Drosophila neuromuscular जंक्शन (NMJ) है, जहां एफएम डाई इमेजिंग उत्परिवर्ती शर्तों की एक विस्तृत श्रृंखला में एसवी गतिशीलता यों तो बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है । NMJ synaptic टर्मिनल आसानी से सुलभ है, इमेजिंग अनुप्रयोगों के लिए बड़े synaptic बूटोंस आदर्श की एक सुंदर सरणी के साथ । यहां, हम तुलना और इसके विपरीत तीन तरीके को उत्तेजित करने के लिए Drosophila NMJ गतिविधि पर निर्भर FM1-43 डाई तेज/रिलीज: 1) स्नान आवेदन उच्च [K+] neuromuscular ऊतकों का ध्रुवीकरण करने के लिए, 2) सक्शन इलेक्ट्रोड मोटर तंत्रिका उत्तेजना presynaptic तंत्रिका टर्मिनल का ध्रुवीकरण करने के लिए, और 3) प्रकाश के लिए channelrhodopsin वेरिएंट के लक्षित ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति-उत्तेजित, ध्रुवीकरण के स्थानिक नियंत्रण । इन तरीकों में से प्रत्येक के Drosophila NMJ पर एसवी चक्र पर आनुवंशिक उत्परिवर्तन प्रभाव के अध्ययन के लिए लाभ और नुकसान है । हम इन फायदों और नुकसान पर चर्चा के लिए उत्तेजना दृष्टिकोण के चयन की सहायता, एक साथ एक रणनीति के लिए विशिष्ट तरीके के साथ होगा । फ्लोरोसेंट इमेजिंग के अलावा, एफएम रंजक एक ultrastructural स्तर पर एसवी चक्र तंत्र का अध्ययन करने के लिए ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (उनि) का उपयोग कर visualized इलेक्ट्रॉन घने संकेतों को photoconverted जा सकता है । हम Drosophila NMJ उत्तेजना के विभिंन तरीकों से फोकल और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी इमेजिंग की तुलना प्रदान करते हैं, के लिए भविष्य के प्रायोगिक मानदंड के चयन गाइड मदद करते हैं ।

Introduction

खूबसूरती के पात्र Drosophila लार्वा neuromuscular जंक्शन (NMJ) glutamatergic synapse मॉडल आनुवंशिक synapse1के एक विशाल स्पेक्ट्रम के साथ perturbations गठन और समारोह का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । मोटर न्यूरॉन टर्मिनल कई axon शाखाओं के होते हैं, प्रत्येक के साथ अनेक बढ़े हुए synaptic बूटोंस. इन विशाल varicosities (व्यास में 5 µm) glutamatergic रिजर्व में वर्दी synaptic SVs बुलबुले (cytosolic; ~ ४० एनएम व्यास में) सहित neurotransmission मशीनरी के सभी होते हैं, और आसानी से पट्टे पर देने वाली पूल2। presynaptic प्लाज्मा झिल्ली फ्यूजन साइट सक्रिय क्षेत्र (AZs), जहां exocytosis ट्रांस-synaptic संचार के लिए ग्लूटामेट न्यूरोट्रांसमीटर रिहाई मध्यस्थता में ये बुलबुले गोदी । बाद में, SVs चुंबन के माध्यम से प्लाज्मा झिल्ली से प्राप्त कर रहे है और रिसाइकिलिंग चलाने या clathrin-दोहराया exo के लिए मध्यस्थता endocytosis (सीएमई)/endocytosis चक्र । Drosophila NMJ आसानी से सुलभ और दोनों अलग और निस्र्पक एसवी चक्र म्यूटेंट के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है । आगे आनुवंशिक स्क्रीन का प्रयोग, उपंयास उत्परिवर्तनों नए एसवी चक्र के लिए महत्वपूर्ण जीन की पहचान के लिए नेतृत्व किया है3। इसके अलावा, रिवर्स आनुवंशिक पहले से ही ज्ञात जीन के साथ शुरू दृष्टिकोण उत्परिवर्ती सायक्लिंग phenotypes के सावधान विवरण के माध्यम से नई एसवी चक्र तंत्र के elucidation के लिए नेतृत्व किया है4। Drosophila NMJ लगभग exocytosis के दौरान पुटिका साइकिल चालन के लिए ऑप्टिकली ट्रैक करने के तरीकों के माध्यम से एसवी endocytosis और neurotransmission तंत्र के लिए एक प्रयोगात्मक synaptic तैयारी के रूप में आदर्श है ।

फ्लोरोसेंट मार्करों की एक सीमा साइकिल गतिशीलता के दौरान बुलबुले के दृश्य ट्रैकिंग की अनुमति है, लेकिन सबसे बहुमुखी एफएम डाई अनुरूप है जो पहले माओ, एफ., एट अलद्वारा संश्लेषित किया जाता है । 5. संरचनात्मक रूप से, एफएम रंजक एक हाइड्रोफिलिक सिर और एक lipophilic पूंछ एक खुशबूदार अंगूठी के माध्यम से जुड़े होते हैं, एक केंद्रीय वर्णक्रमीय गुण प्रदान क्षेत्र के साथ । झिल्ली में इन styryl रंजक विभाजन reversibly, झिल्ली पत्रक के बीच ' फ्लिप फ्लॉप ' नहीं है और इसलिए cytosol में मुक्त नहीं कर रहे हैं, और पानी की तुलना में झिल्ली में कहीं अधिक फ्लोरोसेंट हैं5. एक लिपिड bilayer में प्रतिवर्ती प्रविष्टि प्रतिदीप्ति6में ४० गुना वृद्धि का कारण बनता है । न्यूरॉन synapses पर, क्लासिक एफएम डाई लेबलिंग प्रयोगों से मिलकर स्नान synaptic तैयारी के दौरान डाई के साथ ध्रुवीकरण उत्तेजना करने के लिए लोड डाई के माध्यम से एसवी endocytosis. बाहरी डाई तो दूर धोया जाता है और एसवी चक्र7synapses भरी हुई छवि के लिए एक कैल्शियम से मुक्त घंटी समाधान में गिरफ्तार कर लिया है । एक डाई मुक्त स्नान में उत्तेजना के एक दूसरे दौर exocytosis, एक प्रक्रिया है कि प्रतिदीप्ति तीव्रता कमी को मापने के बाद किया जा सकता है के माध्यम से एफएम रिलीज चलाता है । एसवी एक एकल पुटिका से आबादी के लिए बुलबुले के सैकड़ों युक्त पूल मात्रात्मक6,7पर नजर रखी जा सकता है । एफएम रंजक कार्यात्मक अलग एसवी पूल के काटना गतिविधि पर निर्भर जमावड़े के लिए इस्तेमाल किया गया है, और चुंबन की तुलना करने के लिए और रन बनाम सीएमई सायक्लिंग8,9। विधि अलग परख, सहज और लघु synaptic चक्र गतिविधियों को संशोधित किया गया है (अति संवेदनशील उपकरणों के साथ बहुत छोटे प्रतिदीप्ति परिवर्तन का पता लगाने और photobleaching कम)10। परख एक इलेक्ट्रॉन में फ्लोरोसेंट एफएम संकेत photoconverting द्वारा ultrastructural स्तर तक बढ़ाया जा सकता है-संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए घने लेबल11,12,13,14 .

पोटेशियम की एक उच्च एकाग्रता में ऐतिहासिक, स्नान synaptic तैयारी (इसके बाद के रूप में "उच्च [कश्मीर) के लिए भेजा]") के लिए पसंद की विधि के लिए किया गया है को भंग उत्तेजना के लिए प्रेरित एसवी साइकिल चालन; को लेकर मेंढक कोलीनर्जिक NMJ5, को कल्चरल कुतर मस् हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स15, को Drosophila glutamatergic NMJ मॉडल16,17. यह उच्च [K+] दृष्टिकोण सरल है, कोई विशेष उपकरणों की आवश्यकता है, और इसलिए सबसे प्रयोगशालाओं के लिए सुलभ है, लेकिन दोनों आवेदन और डेटा की व्याख्या के लिए सीमाएं हैं । एक बहुत अधिक शारीरिक रूप से उचित तरीका है चूषण4,5,12की बिजली की उत्तेजना सक्शन इलेक्ट्रोड का उपयोग करने के लिए है । इस दृष्टिकोण presynaptic तंत्रिका टर्मिनल के प्रत्यक्ष उत्तेजना के लिए कार्रवाई संभावित प्रचार ड्राइव, और परिणाम सीधे neurotransmission समारोह के electrophysiological परख की तुलना में किया जा सकता है13,14, 15, लेकिन विशेष उपकरणों की आवश्यकता है और तकनीकी रूप से बहुत अधिक चुनौतीपूर्ण है । optogenetics के आगमन के साथ, channelrhodopsin न्यूरॉन उत्तेजना का उपयोग अतिरिक्त लाभ, चैनल अभिव्यक्ति के तंग spatiotemporal नियंत्रण बाइनरी Gal4/यूएएस प्रणाली20का उपयोग सहित है । इस दृष्टिकोण तकनीकी रूप से बहुत सक्शन इलेक्ट्रोड उत्तेजना से आसान है और एक बहुत सस्ते एलईडी प्रकाश स्रोत से अधिक कुछ नहीं की आवश्यकता है । यहां, हम FM1 की इमेजिंग-43 रोजगार (N-(3 triethylammoniumpropyl)-4-(4-(dibutylamino) styryl) pyridinium dibromide) दोनों की तुलना करने के लिए और इसके विपरीत इन तीन अलग उत्तेजना तरीकों पर Drosophila NMJ: सरल उच्च [K+ ], इलेक्ट्रिकल और नए channelrhodopsin दृष्टिकोणों को चुनौती ।

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Protocol

1. लार्वा गोंद विच्छेदन

  1. अच्छी तरह से elastomer किट (सामग्री की मेज) से सिलिकॉन elastomer इलाज एजेंट के 1 भाग के साथ सिलिकॉन elastomer आधार के 10 भागों मिश्रण ।
  2. कोट 22 x 22 मिमी elastomer और इलाज के साथ coverslips एक गर्म थाली पर कई घंटे के लिए ७५ ˚ सी पर (अब तक कोई स्पर्श करने के लिए चिपचिपा) ।
  3. कस्टम में एक elastomer-लेपित गिलास coverslip प्लेस plexi ग्लास विच्छेदन चैंबर (चित्रा 1, नीचे) लार्वा विच्छेदन के लिए तैयार करने में ।
  4. वांछित शंकु और टिप आकार प्राप्त करने के लिए एक मानक microelectrode खींचने का उपयोग कर borosilicate ग्लास केशिका से गोंद पिपेट तैयार करें ।
  5. धीरे से micropipette टिप तोड़, और दूसरे छोर करने के लिए, लचीले प्लास्टिक ट्यूब (1/32 "इंटीरियर व्यास, आईडी, 3/32" व्यास के बाहर, आयुध डिपो, 1/32 "दीवार के 2 फुट संलग्न; सामग्री की तालिका) मुंह फिटिंग के साथ (P2 पिपेट टिप) ।
  6. एक छोटा सा कंटेनर (०.६ मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब कैप) एक छोटी सी मात्रा (~ 20 µ एल) गोंद की (सामग्री तालिकाके साथ) भरें लार्वा विच्छेदन के लिए तैयारी में ।
  7. खारा के साथ चैंबर भरें (मिमी में): १२८ NaCl, 2 KCl, 4 MgCl2, 1 CaCl2, ७० सुक्रोज, और ५ २-[4-(2-hydroxyethyl) piperazin-1-yl] ethanesulfonic एसिड (HEPES) पीएच ७.२ ।
  8. विरोधी हार्स मूली peroxidase जोड़ें (एचआरपी) एंटीबॉडी संयुग्मित करने के लिए Alexa Fluor ६४७ (विरोधी एचआरपी: 647; पतला 1:10 एक 1 मिलीग्राम/एमएल स्टॉक से) NMJ presynaptic टर्मिनल के लेबलिंग के लिए विच्छेदन21,22के दौरान ।
  9. एक ठीक तूलिका का प्रयोग (आकार 2), भोजन की शीशी और elastomer-लेपित कवर ग्लास पर जगह से एक भटक तीसरे instar हटा दें ।
  10. गोंद की एक छोटी मात्रा के साथ ग्लास micropipette टिप भरें संलग्नक के साथ मुंह से उत्पंन नकारात्मक हवा के दबाव का उपयोग कर (१.५ कदम) ।
  11. स्थिति लार्वा संदंश और गोंद की एक छोटी बूंद के साथ सिर elastomer लेपित coverslip के साथ मुंह से सकारात्मक हवा के दबाव का उपयोग कर गोंद के साथ पृष्ठीय ओर ।
  12. इस प्रक्रिया को दोहराएं लार्वा के पीछे अंत के साथ, सुनिश्चित करें कि पशु दो गोंद संलग्नक के बीच तना हुआ फैला है बना ।
  13. कैंची का प्रयोग (ब्लेड 3 मिमी; सामग्री की तालिका), एक क्षैतिज कटौती (~ 1 मिमी) पीछे और एक ऊर्ध्वाधर सभी पृष्ठीय midline साथ काट कर ।
  14. ठीक संदंश (#5, सामग्री की मेज) का उपयोग करना, धीरे पृष्ठीय श्वासनली, आंत, वसा शरीर और अंय आंतरिक पेशियां को कवर अंगों को हटा दें ।
  15. चार शरीर की दीवार फ्लैप के लिए gluing प्रक्रिया को दोहराने, धीरे शरीर की दीवार दोनों क्षैतिज और खड़ी खिंचाव करने के लिए सुनिश्चित कर.
  16. लिफ्ट ventral तंत्रिका गर्भनाल (vnc) संदंश का उपयोग कर, ध्यान से कैंची के साथ मोटर नसों में कटौती, और फिर पूरी तरह से VNC को हटा दें ।
  17. सीए के साथ विच्छेदन खारा बदलें2 +-नि: शुल्क खारा (CaCl बिना ऊपर विच्छेदन खारा के रूप में एक ही2) एसवी सायक्लिंग बंद करने के लिए ।

2. विकल्प 1: उच्च [कश्मीर+] एफएम डाई लोडिंग

  1. एक FM1-43 स्टॉक समाधान (4 मिमी) से, 4 µ एम की एक अंतिम एकाग्रता के लिए ९० mm KCl समाधान (उच्च [K+] को विच्छेदन खारा में) 1 मिलीलीटर से 1 µ l जोड़ें ।
  2. एक पिपेट का उपयोग करना, Ca2 +उच्च के साथ इमेजिंग चैंबर में नि: शुल्क खारा [K+] एफएम डाई समाधान को उत्तेजित करने के लिए एसवी endocytosis डाई तेज बदलें ।
  3. तुरंत उच्च के पूर्व निर्धारित अवधि के लिए एक डिजिटल टाइमर शुरू [K+] ध्रुवीकरण उत्तेजना अवधि (उदा., 5 min; चित्र 2) ।
  4. एक स्वस्थ लार्वा तैयारी की पुष्टि करने के लिए, उच्च की अवधि के लिए पेशियां के मजबूत संकुचन नोट [K+] ध्रुवीकरण अवधि ।
  5. टाइमर अवधि समाप्त होने पर, जल्दी से उच्च [K+] एफएम डाई समाधान निकालें और Ca के साथ प्रतिस्थापित करें2 +-मुक्त खारा एसवी साइकिलिंग को रोकने के लिए ।
  6. 2 सीए के साथ त्वरित उत्तराधिकार में धो+-नि: शुल्क खारा (1 मिनट के लिए 5x) उच्च सुनिश्चित करने के लिए [K+] एफएम डाई समाधान पूरी तरह से हटा दिया है ।
  7. ताजा Ca में लार्वा तैयारी बनाए रखें2 +-फोकल माइक्रोस्कोप के साथ तत्काल इमेजिंग के लिए नि: शुल्क खारा ।

3. इमेजिंग: फोकल माइक्रोस्कोपी

  1. छवि NMJ डाई प्रतिदीप्ति (अन्य सूक्ष्मदर्शी इस्तेमाल किया जा सकता है) के लिए एक 40X पानी विसर्जन उद्देश्य के साथ एक ईमानदार फोकल माइक्रोस्कोप का प्रयोग करें ।
  2. छवि मांसपेशी 4 उदर खंडों के NMJ 2-4 (अन्य NMJs imaged किया जा सकता है) और उचित सॉफ्टवेयर (सामग्री की तालिका) का उपयोग कर छवियों को इकट्ठा.
  3. एचआरपी उत्तेजित करने के लिए एक HeNe ६३३ एनएम लेजर का प्रयोग करें: 647 (लंबे समय से पास फ़िल्टर > ६३५ एनएम) और एक आर्गन ४८८ एनएम लेजर FM1-43 (bandpass फ़िल्टर 530-600 एनएम के साथ) को उत्तेजित करने के लिए ।
  4. संचालन इष्टतम लाभ और दोनों चैनलों के लिए ऑफसेट निर्धारित करते हैं ।
    नोट: ये सेटिंग प्रयोग के शेष भाग में स्थिर रहेंगी.
  5. synaptic टर्मिनल के नीचे करने के लिए एचआरपी-चिह्नित शीर्ष से पूरे चयनित NMJ के माध्यम से एक फोकल जेड-स्टैक ले लो ।
  6. एफएम डाई अनलोडिंग के बाद सटीक एक ही NMJ के लिए अतिरिक्त सुनिश्चित करने के लिए NMJ imaged (खंड, पक्ष और मांसपेशी) के सावधान नोट ले लो ।

4. उच्च [K+] उत्तेजना: एफएम डाई एिं

  1. बदलें Ca2 +-उच्च के साथ मुक्त खारा [K+] खारा (बिना FM1-43 डाई) के लिए ध्रुवीकरण, एसवी exocytosis और डाई रिलीज ड्राइव ।
  2. तुरंत उच्च [K+] उत्तेजना अवधि के पूर्व निर्धारित अवधि के लिए एक डिजिटल टाइमर शुरू (उदा., 2 min; चित्र 2) ।
  3. टाइमर अवधि समाप्त होने पर, तुरंत उच्च [K+] खारा निकालें और Ca के साथ प्रतिस्थापित करें2 +-मुक्त खारा एसवी साइकिलिंग को रोकने के लिए ।
  4. Ca के साथ त्वरित उत्तराधिकार में धो2 +-नि: शुल्क खारा (1 मिनट के लिए 5x) उच्च सुनिश्चित करने के लिए [K+] खारा पूरी तरह से हटा दिया है ।
  5. ताजा Ca में लार्वा तैयारी बनाए रखें2 +-फोकल माइक्रोस्कोप के साथ तत्काल इमेजिंग के लिए नि: शुल्क खारा ।
  6. हो एक ही NMJ में FM1-43 डाई प्रतिदीप्ति छवि के लिए कुछ ही फोकल सेटिंग्स का उपयोग कर ऊपर उल्लेख किया ।

5. विकल्प 2: विद्युत उत्तेजना एफएम डाई लोडिंग

  1. आवश्यक शंकु और टिप आकार प्राप्त करने के लिए microelectrode खींचने (सामग्री की मेज) का उपयोग कर एक चूषण पिपेट तैयार करें ।
  2. आग-पोलिश एक माइक्रो के साथ microelectrode टिप एक भी मोटर तंत्रिका जब तक जाली एक तंग फिट के साथ चूसा जा सकता है ।
  3. स्लाइड चूषण एक micromanipulator पर इलेक्ट्रोड धारक पर पिपेट और लंबे समय तक लचीला प्लास्टिक ट्यूब और एक सिरिंज के लिए देते हैं ।
  4. सेट उत्तेजक पैरामीटर (उदा, 15 V, 20 हर्ट्ज आवृत्ति, 20 ms अवधि और 5 मिनट (चित्रा 2) के समय या 1 मिनट (चित्रा 3)).
  5. Ca2 +-ऊपर FM1 के साथ लार्वा तैयारी पर नि: शुल्क खारा-43 खारा (4 µ m; 1 मिमी CaCl2) इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी रिग पर बदलें ।
  6. तैयारी सूक्ष्मदर्शी मंच पर रखो और जब तक लार्वा और सक्शन पिपेट ध्यान में है मंच बढ़ा (40X जल-विसर्जन उद्देश्य) ।
  7. कट मोटर तंत्रिका के एक पाश ऊपर चूसना नकारात्मक हवा सक्शन इलेक्ट्रोड में सिरिंज द्वारा उत्पंन दबाव के साथ चयनित hemisegment innervating ।
  8. जबकि नेत्रहीन चयनित hemisegment में मांसपेशियों के संकुचन के लिए निगरानी उत्तेजना की एक छोटी फट के साथ चूषण इलेक्ट्रोड समारोह का परीक्षण ।
  9. (चरण ५.४) एसवी endocytosis और FM1-43 डाई तेज (चित्रा 2) ड्राइव करने के लिए चयनित मापदंडों का उपयोग कर मोटर तंत्रिका उत्तेजित ।
  10. Ca के साथ त्वरित उत्तराधिकार में धो2 +-मुक्त खारा (1 मिनट के लिए 5x) FM1-43 डाई समाधान को सुनिश्चित करने के लिए पूरी तरह से हटा दिया है ।
  11. ताजा Ca में लार्वा तैयारी बनाए रखें2 +-ऊपर से फोकल इमेजिंग प्रोटोकॉल का उपयोग तत्काल इमेजिंग के लिए मुक्त खारा ।
  12. एफएम डाई अनलोडिंग के बाद सटीक एक ही NMJ तक पहुंच सुनिश्चित करने के लिए NMJ imaged (खंड, पक्ष और मांसपेशी) के सावधान नोट ले लो ।

6. विद्युत उत्तेजना: एफएम डाई उतराई

  1. Ca2 +-नियमित खारा के साथ मुक्त खारा (बिना FM1-43 डाई) बदलें और तैयारी वापस इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी रिग मंच पर जगह है ।
  2. (उदा, 15 वी, 20 हर्ट्ज आवृत्ति, 20 एमएस अवधि और 2 मिनट के समय (चित्रा 2) या 20 एस (चित्रा 3)) अनलोडिंग के लिए उत्तेजितकर्ता मापदंडों सेट करें ।
  3. ऊपर के रूप में एक ही इलेक्ट्रोड में एक ही मोटर तंत्रिका चूसना, और फिर एसवी exocytosis और FM1-43 डाई रिलीज को सक्रिय करने के लिए उत्तेजित ।
  4. Ca के साथ त्वरित उत्तराधिकार में धो2 +-मुक्त खारा (1 मिनट के लिए 5x) बाहरी डाई सुनिश्चित करने के लिए पूरी तरह से हटा दिया है ।
  5. ताजा Ca में लार्वा तैयारी बनाए रखें2 +-फोकल माइक्रोस्कोप के साथ तत्काल इमेजिंग के लिए नि: शुल्क खारा ।
  6. एक ही NMJ में FM1-43 डाई प्रतिदीप्ति छवि को सुनिश्चित करने के लिए एक ही फोकल सेटिंग्स का उपयोग कर ऊपर उल्लेख किया ।

7. विकल्प 3: Channelrhodopsin उत्तेजना एफएम डाई लोडिंग

  1. ChR2 सह कारक युक्त भोजन पर ChR2-एक्सप्रेस लार्वा उठाएं-सभी ट्रांस रेटिना (इथेनॉल में भंग; १०० µ मीटर अंतिम एकाग्रता).
  2. कैमरा पोर्ट से लैस एक विच्छेदित माइक्रोस्कोपी स्टेज पर सामिल कक्ष में लार्वा तैयारी रखें ।
  3. एक नीली एलईडी संलग्न करें (४७० एनएम; सामग्री की तालिका) एक प्रोग्राम उत्तेजित करने के लिए एक समाक्षीय केबल का उपयोग कर और जगह कैमरा बंदरगाह में एलईडी ।
  4. ध्यान केंद्रित करने के लिए नीले रंग का नेतृत्व किया लार्वा समारोह पर प्रकाश बीम माइक्रोस्कोप का उपयोग कर ज़ूम समारोह ।
  5. Ca की जगह2 +-ऊपर FM1 के साथ लार्वा तैयारी पर नि: शुल्क खारा-43 खारा (4 µ m; 1 mM CaCl2) optogenetic मंच पर ।
  6. एलईडी मानकों का उपयोग कर सेट करें (उदा, 15 V, 20 हर्ट्ज आवृत्ति, 20 ms अवधि और 5 मिनट का समय (चित्रा 2)) ।
  7. प्रकाश उत्तेजना और optogenetic उत्तेजना अवधि के पूर्व निर्धारित अवधि के लिए एक टाइमर के साथ ट्रैक शुरू (उदा., 5 min; चित्र 2) ।
  8. जब टाइमर बंद हो जाता है, जल्दी से एफएम डाई समाधान को दूर करने और Ca के साथ प्रतिस्थापित2 +मुक्त खारा एसवी सायक्लिंग को रोकने के लिए ।
  9. Ca के साथ त्वरित उत्तराधिकार में धो2 +-मुक्त खारा (1 मिनट के लिए 5x) एफएम डाई समाधान सुनिश्चित करने के लिए पूरी तरह से हटा दिया है ।
  10. ताजा Ca में लार्वा तैयारी बनाए रखें2 +-ऊपर से इमेजिंग प्रोटोकॉल का उपयोग कर फोकल माइक्रोस्कोप के साथ तत्काल इमेजिंग के लिए नि: शुल्क खारा ।
  11. एफएम डाई अनलोडिंग के बाद सटीक एक ही NMJ तक पहुंच सुनिश्चित करने के लिए NMJ imaged (खंड, पक्ष और मांसपेशी) के सावधान नोट ले लो ।

8. Channelrhodopsin उत्तेजना: एफएम डाई एिं

  1. बदलें Ca2 +-नियमित खारा के साथ मुक्त खारा (बिना FM1-43 डाई) कैमरा बंदरगाह के साथ विच्छेदन खुर्दबीन स्टेज पर लार्वा पर ध्यान केंद्रित नेतृत्व किया ।
  2. (उदा, 15 वी, 20 हर्ट्ज आवृत्ति, 20 एमएस अवधि और 2 मिनट (चित्रा 2)) के समय उतराई के लिए उत्तेजित करने वाले मापदंडों सेट करें ।
  3. optogenetic उत्तेजना अवधि के पूर्व निर्धारित अवधि के लिए एक टाइमर के साथ प्रकाश उत्तेजना और ट्रैक शुरू (उदा., 2 मिनट; चित्र 2) ।
  4. जब टाइमर अवधि समाप्त होता है, जल्दी से एफएम डाई समाधान को दूर करने और Ca के साथ प्रतिस्थापित2 +मुक्त खारा एसवी सायक्लिंग को रोकने के लिए ।
  5. Ca के साथ त्वरित उत्तराधिकार में धो2 +-मुक्त खारा (1 मिनट के लिए 5x) बाहरी डाई सुनिश्चित करने के लिए पूरी तरह से हटा दिया है ।
  6. ताजा Ca में लार्वा तैयारी बनाए रखें2 +-फोकल माइक्रोस्कोप के साथ तत्काल इमेजिंग के लिए नि: शुल्क खारा ।
  7. एक ही NMJ में FM1-43 डाई प्रतिदीप्ति छवि को सुनिश्चित करने के लिए एक ही फोकल सेटिंग्स का उपयोग कर ऊपर उल्लेख किया ।

9. प्रतिदीप्ति ठहराव

  1. छवि जंमू में छवि लोड (NIH मुक्त स्रोत) और छवि पर क्लिक करके एक अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण बनाएं । पोट | जेड परियोजना ।
  2. विरोधी एचआरपी का प्रयोग: 647 चैनल, छवि के लिए जाओ । समायोजित करें । थ्रेशोल्ड और शीर्ष उपकरण पट्टी स्लाइड जब तक बस NMJ हाइलाइट किया गया है ।
  3. छड़ी उपकरण का उपयोग करना, NMJ पर क्लिक करें । यदि NMJ है, तो shift बटन दबाए रखें और सभी भागों का चयन करें ।
  4. FM1-43 डाई चैनल के लिए छवि को बदलने और विश्लेषण करने के लिए जाओ । प्रतिदीप्ति माप प्राप्त करने के लिए उपाय ।
  5. समान NMJ (पहचाने गए खंड, पक्ष और मांसपेशी) से "अनलोड" छवि के लिए चरण 9.1-9.4 दोहराएं ।
  6. को उतारा गया था कि डाई का प्रतिशत प्राप्त करने के लिए, उतारा/भरी हुई प्रतिदीप्ति तीव्रता के अनुपात ले ।
    नोट: यह कार्यविधि या तो "अंडाकार" या "मुक्तहस्त" चयन उपकरण का उपयोग कर एक bouton-प्रति-bouton आधार पर प्रतिदीप्ति का विश्लेषण करने के लिए संशोधित किया जा सकता है । पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति मांसपेशी प्रतिदीप्ति नमूना द्वारा घटाया जा सकता है । इस पृष्ठभूमि को कम करने के लिए एजेंट्स को भी जोड़ा जा सकता है ।

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Representative Results

चित्र 1 गतिविधि-निर्भर एफएम डाई इमेजिंग प्रोटोकॉल के लिए कार्य-प्रवाह दिखाता है । प्रयोग हमेशा एक ही लार्वा गोंद विच्छेदन के साथ शुरू होता है, उत्तेजना विधि की परवाह किए बिना बाद में इस्तेमाल किया । चित्र 1a एक विच्छेदित लार्वा का एक योजनाबद्ध है, ventral तंत्रिका कॉर्ड (VNC) दिखा रहा है, नसों radiating और दोहराया hemisegmental मांसपेशी पैटर्न । VNC हटा दिया जाता है और तैयारी FM1-43 के 4 µ m समाधान में नहाया (आंकड़ा 1b, गुलाबी) । तैयारी तो एफएम डाई की उपस्थिति में प्रेरित तीन संभव विकल्पों में से एक का उपयोग कर गतिविधि के माध्यम से डाई लोड निर्भर एसवी endocytosis (चित्रा 1cI-III) । अगला, एफएम डाई सायक्लिंग सीए का उपयोग कर गिरफ्तार किया है2 +-मुक्त खारा और एक विशिष्ट NMJ टर्मिनल एफएम डाई के साथ भरी हुई है कि एक फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग कर imaged है ("छवि भरी हुई"; चित्र 1 d) । इस मामले में, मांसपेशी 4 NMJ तंत्रिका, NMJ टर्मिनल शाखाओं में बंटी और एफएम synaptic बूटोंस भरी हुई के स्थान को योजनाबद्ध दिखाने के साथ चुना गया है । synaptic तैयारी एक ही ऊपर चयनित विधि का उपयोग कर एक दूसरी बार के लिए प्रेरित किया है, लेकिन एफएम डाई के अभाव में एसवी exocytosis और FM1-43 रिलीज (चित्रा 1e) ड्राइव । इसी की पहचान NMJ (मांसपेशी 4 NMJ इस उदाहरण में) तो फिर से एचआरपी का उपयोग कर imaged है: 647 synaptic लेबल और अवशिष्ट FM1-43 पुटिका संकेत ("अनलोड छवि"; चित्रा 1f). प्रयोगकर्ता शक्ति और लदान और उतराई चरणों की अवधि के लिए एक विशिष्ट परख या उत्परिवर्ती हालत के लिए माप का अनुकूलन निर्धारित करता है । प्रतिदीप्ति तीव्रता लोड हो रहा है और उतराई के बाद quantified है (चित्रा 1 डी, 1f), synaptic डाई endocytosis, exocytosis और लोड एफएम डाई का प्रतिशत जारी की माप प्राप्त करने के लिए । िरा पूरे NMJ या सिंगल बूटोंस के लिए किया जा सकता है ।

एफएम डाई साइकलिंग को तीन तरीकों से उत्तेजित किया जा सकता है: 1) उच्च [K+] पूरी तैयारी का खारा ध्रुवीकरण, 2) मोटर तंत्रिका की चूषण इलेक्ट्रोड उत्तेजना, या 3) प्रकाश चालित लक्षित channelrhodopsin की सक्रियण (ChR2; चित्र 2) । सभी तीन विधियों की एक सीधी साथ-साथ तुलना के लिए, हम FM1 की उपस्थिति में 5 मिनट के लिए प्रत्येक दृष्टिकोण के साथ उत्तेजित-43 (लोड हो रहा है) और फिर FM1 के अभाव में 2 मिनट के लिए-43 (उतराई), और imaged एचआरपी-लेबल NMJs समान फोकल सेटिंग्स का उपयोग ( चित्रा 2) । उच्च [K+] खारा ध्रुवीकरण विधि Drosophila लार्वा NMJ23के लिए व्यापक रूप से इस्तेमाल किया FM1-43 प्रोटोकॉल इस प्रकार है, सिवाय हम लार्वा विच्छेदन के लिए पिन के बजाय गोंद का उपयोग करें । गोंद खुर्दबीन उद्देश्यों के साथ हस्तक्षेप से बचा जाता है और शरीर की दीवार तनाव का अधिक सटीक निर्धारण में सक्षम बनाता है, लेकिन एक उदारवादी सीखने की अवस्था की आवश्यकता होती है । सभी तीन तरीकों NMJ synaptic bouton आर्बर भर में मजबूत और लगातार फ्लोरोसेंट संकेतों का उत्पादन और व्यक्तिगत synaptic बूटोंस (presets) के भीतर । उच्च [K+] खारा ध्रुवीकरण विधि सभी NMJs का कारण बनता है एफएम भर में भरा हुआ है के रूप में यह जानवर (चित्रा 2a, मध्य) में हर न्यूरॉन का ध्रुवीकरण । तंत्रिका चूषण इलेक्ट्रोड विद्युत उत्तेजना विधि केवल लार्वा है जिसके लिए इसी innervating मोटर तंत्रिका उत्तेजित किया गया है की एक एकल hemisegment में ड्राइव (चित्रा b, मध्य) । एक ही जानवर में उत्तेजित क्षेत्रों एचआरपी लेबल का उपयोग कर भेद कर रहे हैं, लेकिन कोई चौकस फ्लोरोसेंट डाई लोडिंग होते हैं, और उत्कृष्ट आंतरिक नियंत्रण के रूप में सेवा करते हैं । optogenetic ChR2 विधि ट्रांसजेनिक Gal4 चालक कार्यरत (चित्रा 2c) पर लक्षित ध्रुवीकरण निर्भर पैदा करता है । यहाँ, ड्राइवर एक vesicular ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टर (vglut) Gal4 था, इसलिए सभी glutamatergic न्यूरॉन्स glutamatergic मोटर न्यूरॉन्स के सभी सहित नीले प्रकाश उत्तेजना, के साथ, ध्रुवीकरण कर रहे हैं. नतीजतन, सभी NMJs इस उदाहरण में FM1-43 डाई के साथ भरी हुई हैं (चित्रा 2c, मध्य) । कक्ष-विशिष्ट ड्राइवर्स का उपयोग विशिष्ट NMJs को लेबल करने और दूसरों को आंतरिक नियंत्रण के लिए अनलेबल्ड छोड़ने के लिए किया जा सकता है ।

एफएम डाई अनलोडिंग को उसी विधि के जरिए हासिल किया गया था जिसे डाई लोड किया जाता था. पहली विधि में, लार्वा तैयारी बस उच्च में नहाया था [K+] FM1-43 के अभाव में खारा कोशिकाओं का ध्रुवीकरण करने के लिए, ड्राइव एसवी exocytosis, और synaptic टर्मिनलों अनलोड (चित्रा 2a, सही) । हम आम तौर पर एक छोटी उतराई अवधि (2 मिनट) का चयन करें, तो उतराई आंशिक है और टर्मिनलों एफएम चैनल में दिखाई देते रहते हैं । सक्शन इलेक्ट्रोड विद्युत उत्तेजना उतराई काफी अधिक चुनौतीपूर्ण है, क्योंकि यह एक ही hemisegment को लौट शामिल है, एक ही तंत्रिका की पहचान, और फिर से FM1-43 के अभाव में है कि तंत्रिका उत्तेजक ड्राइव डाई उतराई (चित्रा बी. ए. , दाएं) । ध्यान दें कि डाई अनलोड फिर से आंशिक था । ChR2 उतराई FM1 के अभाव में लार्वा तैयारी के नीले एलईडी रोशनी की एक दूसरी अवधि के लिए जोर देता है-43 चैनलों को सक्रिय करने के लिए, मोटर न्यूरॉन्स ध्रुवीकरण और एसवी exocytosis डाई रिलीज (चित्रा 2cसही) को उत्तेजित । अनलोडिंग (2 min) के इस टाइमस्केल के साथ, इन ध्रुवीकरण विधियों में से प्रत्येक ने भरी हुई FM1-43 डाई का केवल एक प्रतिशत उतारा, उच्च [K+] के साथ सबसे मजबूत और ChR2 ड्राइविंग डाई रिलीज (चित्रा 2) में सबसे कमजोर । हम (१४० µW/mm2), जो प्रकाशित रेंज (20-1000 µW/mm2)24,25,26में था एलईडी प्रकाश तीव्रता का इस्तेमाल मापा । ChR2 अधिक से अधिक ~ 1 मेगावाट रोशनी से 50-200 मेगावाट प्रकाश स्रोतों से सक्रिय है, ChR2 प्रभावशीलता के साथ भी एटीआर27,28लार्वा को खिलाया एकाग्रता पर निर्भर है । इस प्रकार, ChR2 उत्तेजना शक्ति हेरफेर किया जा सकता है । इसके अलावा, रिश्ते अंय उत्तेजना शक्तियों, timescales या पादी के साथ सच नहीं रह सकता है । प्रयोगकर्ता एक उत्परिवर्ती कि एसवी endocytosis या असामांय रूप से तेजी से exocytosis कम है के साथ काम कर रहा है, उत्तेजना मानकों उतराई के बाद एक चौकस संकेत बनाए रखने के लिए बदल सकता है की आवश्यकता हो सकती है । एंटी-एचआरपी लेबल एक एफएम संकेत के पूर्ण अभाव में भी NMJ की पहचान करने के लिए अनुमति देता है, लेकिन इस ठहराव के लिए आदर्श नहीं है । सिद्धांत रूप में, उतराई उत्तेजना भी लदान उत्तेजना से एक अलग प्रकार का हो सकता है ।

हमने हाल ही में विद्युत उत्तेजना4का उपयोग कर एसवी चक्र पर स्रावित synaptic deacylase Notum प्रभावों के नुकसान का अध्ययन किया । यहाँ, हम तुलना करने के लिए इस विश्लेषण का विस्तार 1) उच्च [K+] ध्रुवीकरण और 2) सक्शन इलेक्ट्रोड मोटर तंत्रिका उत्तेजना तरीकों (चित्रा 3). हम पाते है कि दोनों तरीकों एक समान परिणाम दे, कम FM1-43 एक Notum नल उत्परिवर्ती में डाई लोड हो रहा है; हालांकि, phenotype की डिग्री दो तरीकों के बीच अलग है । उच्च [K+] खारा के साथ ध्रुवीकरण के बाद पांच मिनट के लिए, वहां आनुवंशिक पृष्ठभूमि नियंत्रण के बीच भरी हुई प्रतिदीप्ति तीव्रता में एक बड़ी कमी है (डब्ल्यू१११८) उच्च स्तर और Notum नल म्यूटेंट (NotumKO ) निम्न स्तर (चित्र 3ए, शीर्ष) के साथ. quantified मापन में सामान्यीकृत एफएम प्रतिदीप्ति तीव्रता एचआरपी-रेखांकित NMJ टर्मिनलों के भीतर काफी कम है Notum के अभाव में (डब्ल्यू१११८ १.० ± ०.०५ बनाम NotumKO ०.५७ ± ०.०७; एन ≥ 13, पी < 0.0001; चित्र बी) । 1 मिनट के लिए 20 हर्ट्ज पर बिजली की उत्तेजना के बाद, हम नियंत्रण और Notum नल के बीच भरी हुई FM1-43 तीव्रता में एक तुच्छ कमी पाते हैं जब पूरे NMJ प्रतिदीप्ति (डब्ल्यू१११८ १.० ± ०.०५ बनाम NotumKO ०.८६ ± ०.०६; n = 8, p = ०.१०; चित्र 3ए, बी) । जब एक bouton-प्रति-bouton आधार पर डाई निगम को मापने, हम दोनों तरीकों के साथ भरी हुई डाई में एक महत्वपूर्ण कमी पाते हैं । उच्च के साथ उत्तेजना के बाद quantified माप में [K+] खारा, सामान्यीकृत एफएम प्रतिदीप्ति तीव्रता प्रति bouton काफी कमी आई है (डब्ल्यू१११८ १.० ± ०.०२ बनाम NotumKO ०.५२ ± ०.०२; एन ≥ 241, p< 0.0001; चित्र 3सी) । विद्युत उत्तेजना के बाद, bouton प्रति सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति तीव्रता भी काफी कम है, हालांकि एक कम डिग्री करने के लिए (डब्ल्यू१११८ १.० ± ०.०२ बनाम NotumKO ०.८३ ± ०.०२; एन ≥ 127, पी< 0.0001; चित्र 3सी) ।

दो उत्तेजना मानदंड के बीच परिणाम मतभेद कारकों की एक संख्या के कारण हो सकता है । सबसे पहले, उत्तेजना शक्ति माना है उच्च के साथ अधिक [K+] विद्युत मोटर तंत्रिका उत्तेजना की तुलना में । इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी रिकॉर्डिंग उच्च [K+] खारा की उपस्थिति में नहीं किया जा सकता है, लेकिन लार्वा neuromusculature स्पष्ट रूप से मजबूती से प्रेरित किया जा रहा है, मांसपेशियों के संकुचन के रूप में मजबूत और नित्य 5 मिनट स्नान अवधि में कर रहे हैं । हालांकि, हम शक्ति या उत्तेजना की आवृत्ति पता नहीं है । इसके विपरीत, बिजली की उत्तेजना सटीक वोल्टेज शक्ति और उत्तेजना की आवृत्ति को चुनने के उपयोगकर्ता के साथ ज्यादा नियंत्रित है । दूसरा, उत्तेजना अवधि उच्च [K+] विद्युत तंत्रिका उत्तेजना (चित्रा 3) की तुलना में लंबे समय के साथ था । हम दोहराया परीक्षणों के बाद 20 हर्ट्ज बिजली की उत्तेजना के 1 मिनट चुना. डाई लदान के 1 मिनट के बाद, वहां एक मजबूत और विश्वसनीय FM1-43 संकेत था, तो हम अपने अध्ययन के लिए है कि प्रतिमान4चुना है, हालांकि उत्तेजना के 5 मिनट के एक भी मजबूत फ्लोरोसेंट संकेत (चित्रा 2) दिया । इस प्रकार, उत्तेजना प्रतिमान की लंबाई FM1 में परिमाण परिवर्तनशीलता में योगदान की संभावना है-43 उच्च के बीच लोड हो रहा है [K+] और विद्युत उत्तेजना (चित्र बी, सी) । हालांकि उच्च [K+] विधि Notum म्यूटेंट के लिए एक और अधिक मजबूत phenotype दिखाया, हम अभी भी अधिक नियंत्रण4के कारण विद्युत विधि का उपयोग किया । ऐसे शक्ति, आवृत्ति और उत्तेजना की अवधि के रूप में नियंत्रित करने के लिए कई पैरामीटर हैं, और उन सेटिंग्स उत्परिवर्ती और सवाल के आधार पर फैसला किया जाना चाहिए । उदाहरण के लिए, उत्तेजना विधि विकल्प एसवी पूल पर निर्भर हो सकता है7 पूछताछ और गतिविधि पर निर्भर तंत्र10की जांच की ।

NMJ टर्मिनल में FM1-43 लोडिंग के बाद, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (फिगर 4) के लिए इलेक्ट्रॉन-घने सिग्नल का उत्पादन करने के लिए एक प्रतिदीप्ति डाई photoconversion को रोजगार दे सकते हैं । इस विधि में, डाई भरी तैयारी diaminobenzidine (ढाब) की उपस्थिति में तीव्र फ्लोरोसेंट रोशनी के संपर्क में है, एफएम डाई ऑक्सीकरण से प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के साथ एक अंधेरी हाला (चित्र 4a)11बनाने के लिए । कृपया पूर्ण विवरण12के लिए styryl रंजक के photoconversion पर जौव लेख देखें । इस विधि का लाभ यह है कि SVs स्पष्ट रूप से एक ultrastructural स्तर पर पता चला रहे हैं, हालांकि एसवी चक्र निश्चित रूप से स्थिर इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप इमेजिंग के साथ गिरफ्तार किया है । उत्तेजना के अभाव में, Drosophila NMJ में synaptic बूटोंस घनी बुलबुले के साथ भरी हुई हैं (~ ४० एनएम व्यास में; चित्रा 4B), बढ़े हुए organelles की दुर्लभ घटना (>व्यास में १०० एनएम) के साथ माना सायक्लिंग endosomes हो । उच्च [K+] खारा ध्रुवीकरण उत्तेजना दृढ़ता से इस प्रोफ़ाइल में परिवर्तन, एसवी जनसंख्या की आंशिक कमी और कई बढ़े हुए organelles के तेजी से संचय के साथ (>१०० व्यास में एनएम) को थोक से निकलने लगा प्लाज्मा झिल्ली की endocytosis (चित्र 4c, बाएँ). हालांकि इसी तरह के डिब्बों को उत्तेजित नियंत्रण में मौजूद है, उच्च के बाद इन organelles के उच्च घनत्व [K+] खारा ध्रुवीकरण चिंता है कि यह एक गैर शारीरिक प्रतिक्रिया हो सकती है उठाती है । सक्शन इलेक्ट्रोड मोटर तंत्रिका की विद्युत उत्तेजना एसवी जनसंख्या घट में अपेक्षाकृत अधिक कुशल है और बढ़े हुए endosomal बुलबुले के अधिक उत्पादन नहीं करता है (चित्रा 4d, बाएं) । यह पता चलता है कि थोक endocytosis उच्च [K+] ध्रुवीकरण से प्रेरित अधिक तीव्र मांग के दौरान एसवी जनसंख्या को बनाए रखने में मदद करता है ।

FM1-43 photoconversion या तो उच्च का उपयोग कर पूरा किया जा सकता है [K+] खारा ध्रुवीकरण या चूषण इलेक्ट्रोड मोटर तंत्रिका की विद्युत उत्तेजना, एक आराम bouton के सापेक्ष synaptic ultrastructure तुलना करने के लिए (चित्रा 4). उच्च के साथ [K+] ध्रुवीकरण उत्तेजना, दोनों व्यक्तिगत SVs और बढ़े हुए बुलबुले (>१०० एनएम व्यास में) इलेक्ट्रॉन के साथ लेबल किया जा सकता है घने ढाब प्रकाश चालित photoconversion (आंकड़ा 4c, सही) के बाद वेग । अज्ञात कारणों के लिए, बढ़े हुए पुटिका झिल्ली आम तौर पर कम घनी छोटे एसवी झिल्ली की तुलना में लेबल है । इसके अलावा, अक्सर SVs ढाब के साथ भर दिखाई देते हैं, बजाय सिर्फ झिल्ली, लेकिन यह उंहें बहुत unलेबल्ड बुलबुले से भेद आसान बना देता है । मोटर तंत्रिका की सक्शन इलेक्ट्रोड उत्तेजना के साथ, सायक्लिंग एसवी जनसंख्या भी unलेबल्ड SVs के सापेक्ष चिह्नित किया जा सकता है (चित्रा 4d, दाएं) । विद्युत उत्तेजना के साथ, बढ़े हुए बुलबुले (>१०० एनएम व्यास में) बूटोंस में स्थापित नहीं कर रहे है और, लगातार, माना endosomes की झिल्ली FM1 द्वारा लेबल नहीं कर रहे है-43 photoconversion । ऊपर के रूप में, सायक्लिंग SVs आम तौर पर ढाब के साथ भर रहे है एक कुछ हद तक सभी या कोई नहीं फैशन में हाला, और इसलिए अधिक आसानी से SVs है कि उत्तेजना (चित्रा 4d, सही) के दौरान गठन नहीं किया गया है से अलग । हम अभी तक ChR2 उत्तेजना निंनलिखित photoconversion प्रयास नहीं किया है । उत्तेजना के विभिंन समय पाठ्यक्रमों के साथ, FM1-43 डाई photoconversion एक निर्धारित करने के लिए जहां SVs का गठन कर रहे हैं, कैसे SVs की तस्करी कर रहे हैं, और synaptic bouton भीतर विभिंन स्थानिक पूल के बीच आंदोलन के समय की अनुमति देता है । उच्च [K+] और तंत्रिका उत्तेजना की तुलना थोक और एकल एसवी endocytosis तंत्र के विच्छेदन की अनुमति देता है ।

Figure 1
चित्रा 1: FM1 के फ़्लोचार्ट-43 डाई लोडिंग प्रोटोकॉल Drosophila NMJ पर । लार्वा गोंद विच्छेदन एक चपटा neuromusculature तैयारी का उत्पादन, ventral तंत्रिका कॉर्ड (VNC) के साथ ventral midline (वी. एम.) से hemisegmentally दोहराया शरीर की दीवार मांसपेशी arrays (एक कदम) के खंड नसों का अनुमान । VNC मुक्त काट दिया है, और पूरे लार्वा विच्छेदन तो गुलाबी FM1-43 समाधान (4 µ एम) उत्तेजना के लिए तैयारी में (कदम बी) में मशीन है । FM1-43 तो एक चयनित उत्तेजना प्रतिमान (चरण 3) के साथ भरी हुई है; उच्च के विकल्प के साथ [K+] पूरे लार्वा का ध्रुवीकरण (cI), चूषण इलेक्ट्रोड उत्तेजना एक एकल मोटर तंत्रिका (सीआईआई), या अत्यधिक लक्षित channelrhodopsin (cIII) के प्रकाश चालित सक्रियण । FM1-43 निगमन सीए का उपयोग कर गिरफ्तार कर लिया है2 +-मुक्त खारा और डाई-भरी NMJ छवि (कदम डी) । एक दूसरे उत्तेजना तो स्नान में FM1-43 के बिना किया जाता है डाई synaptic पुटिका exocytosis (कदम ई) ड्राइव । इसी NMJ फिर से री-इमेजेड synaptic टर्मिनल (स्टेप एफ) को उतार परख रहे हैं. फ्लोरोसेंट तीव्रता दोनों भरी हुई और उतारा NMJs से मापा जाता है एसवी endocytosis और एसवी exocytosis स्तर । नीचे पैनल निर्माण मानकों और इन अध्ययनों के लिए इस्तेमाल पारदर्शी एक्रिलिक चैंबर के लिए आयामों को दर्शाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: एफएम डाई लोड हो रहा है और सभी उत्तेजना तरीकों की तुलना उतराई । FM1 की तुलना-४३ डाई लोडिंग और उा में घूमते हुए तीसरे instar NMJ के साथ १) उच्च [K+] संपूर्ण लार्वा तैयारी का ध्रुवीकरण (ऊपर), 2) सक्शन इलेक्ट्रोड मोटर तंत्रिका की विद्युत उत्तेजना (मध्य) और 3) प्रकाश चालित केवल मोटर न्यूरॉन्स (नीचे) में लक्षित channelrhodopsin (ChR2) के सक्रियण. (क) एंटी-एचआरपी के साथ लेबल किए गए लार्वा NMJ: 647 presynaptic झिल्ली मार्कर (नीला, बाएं), FM1 के साथ भरी हुई-43 के माध्यम से उच्च [k+] ध्रुवीकरण के लिए 5 मिनट (मध्य) और फिर उच्च के माध्यम से उतारा [k+] ध्रुवीकरण के लिए 2 min. (B) दोनों FM1 के लिए एक ही उत्तेजनाओं अवधि के साथ चूषण इलेक्ट्रोड विद्युत तंत्रिका उत्तेजना के साथ तुलना-43 डाई लोडिंग और उतराई । (ग) लक्षित vglut-Gal4>यूएएस-ChR2-मोटर न्यूरॉन्स में H134R अभिव्यक्ति नीले (४७० एनएम) के साथ सक्रिय FM1-43 डाई लोडिंग और अनलोडिंग की ही उत्तेजनाओं की अवधि के लिए प्रकाश. तारांकन उच्च आवर्धन बूटोंस प्रदर्शित करने वाले प्रीसेट देखें । स्केल बार 10 µm, इनसेट synaptic बूटोंस मुख्य पैनलों से 3.5 x बढ़े के साथ है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: Notum null म्यूटेंट शो synaptic बूटोंस में एफएम डाई लोडिंग कम कर दिया है । FM1-43 भटक तीसरे instar के synaptic टर्मिनलों में भरी हुई आनुवंशिक नियंत्रण (डब्ल्यू१११८) की तुलना NMJ Notum अशक्त म्यूटेंट (NotumKO) । (क) NMJ बूटोंस के साथ लेबल उच्च [K+] पूरे लार्वा की तैयारी का ध्रुवीकरण (ऊपर) या सक्शन इलेक्ट्रोड उत्तेजना एक मोटर तंत्रिका (नीचे) में डब्ल्यू१११८ (बाएँ) और NotumKO (दाएँ). (ख) Quantified लोड FM1-43 प्रतिदीप्ति प्रति एक तितर बितर साजिश के रूप में उच्च [K+] ध्रुवीकरण और डब्ल्यू१११८ में चूषण इलेक्ट्रोड उत्तेजना बनाम NotumKO म्यूटेंट । (ग) एक bouton-प्रति-bouton आधार पर Quantified लोड प्रतिदीप्ति एक बॉक्स के रूप में और मूंछ साजिश उच्च की तुलना [K+] ध्रुवीकरण और डब्ल्यू में चूषण इलेक्ट्रोड उत्तेजना १११८ नियंत्रण बनाम NotumKO . छात्रों के दो पूंछ टी परीक्षण पी के साथ प्रत्येक तुलना के लिए प्रदर्शन किया गया-मूल्यों रेखांकन पर प्रदर्शित । सलाखों दिखाएं मतलब ± SEM चश्मे के साथ बनाया (Windows के लिए ७.० संस्करण) । विद्युत उत्तेजना डेटा Kopke एट अलसे अनुमति के साथ अनुकूलित किया गया है, विकास 144 (19): 3499-510, २०१७ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: एफएम डाई photoconversion के साथ Synaptic ultrastructure बुलबुले निशान । फ्लोरोसेंट FM1-43 संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (उनि) के माध्यम से दृश्य के लिए एक ऑक्सीकरण diaminobenzidine (ढाब) इलेक्ट्रॉन घने वेग को photoconverted जा सकता है । (क) photoconversion विधि का एक योजनाबद्ध आरेख Drosophila NMJ निम्नलिखित गतिविधि-निर्भर FM1-43 डाई लोडिंग लेबल करने के लिए. (ख) बाकी पर एक wildtype synaptic bouton के प्रतिनिधि उनि छवि (उत्तेजित) । नोट: वर्दी के घने जनसंख्या-आकार SVs. (ग) Synaptic बूटोंस कि उच्च के साथ उत्तेजित किया गया है [K+] 5 मिनट के लिए खारा ध्रुवीकरण, बिना photoconversion (बाएं) या FM1 के साथ-43 photoconversion (दाएं) । बल्क endosomal संरचनाओं की उपस्थिति को नोट करें, लेबल्ड और अनलेबल्स । (घ) Synaptic बूटोंस है कि बिजली के साथ एक तंत्रिका चूषण इलेक्ट्रोड पर 20 हर्ट्ज के साथ 5 मिनट के लिए नहीं photoconversion (बाएं) या FM1-43 photoconversion (दाएं) के साथ उत्तेजित किया गया है । ध्यान दें कि डाई भरी बुलबुले आसंन उतारा बुलबुले से ज्यादा गहरा दिखाई देते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

उच्च [K+] खारा ध्रुवीकरण उत्तेजना अब तक गतिविधि पर निर्भर एफएम डाई साइकिल चालन के लिए तीन विकल्पों में से सबसे आसान है, लेकिन संभावना कम शारीरिक29। इस सरल विधि पूरे जानवर में हर सुलभ सेल का ध्रुवीकरण, और इसलिए निर्देशित अध्ययन की अनुमति नहीं है । यह स्थानीय रूप से उच्च [K+] खारा एक micropipette के साथ लागू करने के लिए संभव हो सकता है, लेकिन यह अभी भी पूर्व/postsynaptic कोशिकाओं और संभावना synapse-संबद्ध glia1ध्रुवीकरण होगा । एक अंय प्रमुख चिंता यह है कि उच्च [K+] ध्रुवीकरण थोक endosomes कि केवल शायद ही कभी उत्तेजित बूटोंस में देखा जाता है की तेजी से गठन ड्राइव । हालांकि, थोक endosome गठन एक सक्रिय उत्परिवर्तनों द्वारा अवरुद्ध तंत्र है29, एक वास्तविक शारीरिक प्रक्रिया का संकेत है । इस प्रकार, उच्च के साथ FM1-43 इमेजिंग [K+] ध्रुवीकरण synapses पर चुनिंदा थोक endocytosis अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । चूषण इलेक्ट्रोड मोटर तंत्रिका की विद्युत उत्तेजना एक बहुत अधिक नियंत्रित विधि है । यह लाभ है कि केवल एक ही axon बंडल उत्तेजित है, और केवल presynaptic टर्मिनी सीधे (ज़ाहिर है, मांसपेशी फाइबर तो ट्रांसमीटर कार्रवाई द्वारा विध्रुवीकरण है) विध्रुवीकरण है । इसलिए यह एक ही जानवर है कि उत्तेजित नहीं कर रहे है में NMJs के एक महान आंतरिक नियंत्रण प्रदान करता है । इस विधि की अनुमति देता है एक कसकर उत्तेजना मानकों को नियंत्रित करने के लिए, उच्च के विपरीत [K+] उत्तेजना विधि, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी रिकॉर्डिंग के साथ प्रत्यक्ष तुलना को सक्षम करने4। हालांकि, इस तकनीक विशेष उपकरणों और तकनीकी कौशल का एक काफी उच्च स्तर की आवश्यकता है, और इसलिए कम सुलभ है । लक्षित channelrhodopsin (ChR2) के प्रकाश चालित सक्रियण को टारगेट करने का फायदा है न्यूरॉन्स का चयन30. इस विधि इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी तरीकों के साथ कोई परिचित की आवश्यकता है, और किसी भी प्रयोगशाला में बहुत सस्ते उपकरणों के साथ किया जा सकता है, लेकिन इस दृष्टिकोण Drosophila आनुवंशिकी के साथ बुनियादी अपनेपन की आवश्यकता है ।

उत्तेजना मापदंडों का चुनाव उच्च चर phenotypes1के साथ आनुवंशिक स्थितियों की एक सीमा के भीतर क्वेरी एसवी चक्र गतिशीलता परीक्षण के लिए महत्वपूर्ण है. सभी पद्धतियों के लिए, बाहरी [Ca2 +] का उपयोग एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है जो एसवी साइकलिंग की ड्राइविंग शक्ति को नियंत्रित करता है । उच्च के साथ [k+] उत्तेजना विधि, एक महत्वपूर्ण विकल्प है [k+] इस्तेमाल किया, जो ध्रुवीकरण शक्ति की डिग्री निर्धारित करता है । Drosophila haemolymph की माप 5 मिमी के एक [K+] संकेत मिलता है, और ९० mm आम तौर पर एकाग्रता सबसे अक्सर गतिविधि उत्तेजना के लिए चयनित है3,7,15,17 , 31. हालांकि, एक [K+] 30-90 mM से सीमा को उत्तेजना शक्ति5,16,३२भिंन करने के लिए कार्यरत किया गया है । एक और महत्वपूर्ण पैरामीटर निर्णय दोनों FM1 के लिए उच्च [K+] उत्तेजना की लंबाई है-43 लोड हो रहा है और उतराई । लोड करने के लिए अवधि निर्धारित करता है कि पूरे सायक्लिंग एसवी जनसंख्या प्रभावी ढंग से भरी हुई है, या केवल सक्रिय बुलबुले के एक सबसेट7। इसी तरह उतराई के लिए अवधि उत्तेजना अवधि है, जो या तो पता चलता है या अस्पष्ट उत्परिवर्ती phenotypes एसवी सायक्लिंग आवृत्ति2में दर परिवर्तन पर निर्भर कर सकते है में exocytosis के दौर से गुजर SVs का प्रतिशत तय करता है । सक्शन इलेक्ट्रोड विद्युत मोटर तंत्रिका उत्तेजना के साथ, पैरामीटर विकल्प भी उत्तेजना वोल्टेज, आवृत्ति, अवधि और पल्स अंतराल शामिल हैं. अस्थायी गतिविधि एसवी साइकिल गतिशीलता7के एक प्रमुख निर्धारक है, और अलग उत्तेजना पैटर्न चुनिंदा अलग एसवी पूल जुटाने कर सकते हैं । लक्षित प्रकाश चालित ChR2 सक्रियण के साथ, विकल्पों में ऊपर के सभी शामिल है (प्रकाश तीव्रता चर के साथ) और अतिरिक्त ट्रांसजेनिक अगले अनुभाग में चर्चा की विकल्प । इन पैरामीटर के साथ, विकल्प और अधिक प्रयोगात्मक नियंत्रण आता है, लेकिन यह भी तकनीकी जटिलता में वृद्धि हुई ।

Channelrhodopsin-2 (ChR2) एक हल्का-gated झिल्ली चैनल पारगंय मोनो-और divalent cations३३है । यदि ChR2 उत्तेजना चयनित है, वहां Gal4 चालक, यूएएस-ChR2 निर्माण और चैनल सक्रियण के लिए प्रकाश स्रोत चर सहित बनाया जा करने के लिए कई विकल्प हैं । Gal4 ड्राइवरों सर्वव्यापी से अत्यधिक विशिष्ट करने के लिए सीमा । उदाहरण के लिए, सर्वव्यापी UH1-Gal4 (बेटियां) हर कोशिका में ChR2 व्यक्त करते हैं, जबकि CcapR-Gal4 (Janelia) की मांसपेशी 6/7 ChR2 में NMJ ड्राइव, लेकिन नहीं मांसपेशी 4 NMJ31,३४। इस selectivity एक शक्तिशाली आंतरिक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । इस तरह के कई यूएएस-ChR2 वेरिएंट हैं, जिनमें ChR2-H134R (यहां इस्तेमाल किया जाता है; रूपांतरित अवशेषों photocurrents बढ़ जाती है कारण)३५, VChR1, मुख्य और कई और अधिक३६। इन चैनल वेरिएंट के प्रत्येक प्रकाश गेटिंग, कंडक्टर, आयन selectivity, कैनेटीक्स और संवेदीकरण के विशिष्ट गुण हैं । नोट कुछ निर्माणों एक फ्लोरोसेंट टैग कि एफएम इमेजिंग के साथ हस्तक्षेप कर सकता है होते हैं । उदाहरण के लिए, यहां प्रयुक्त यूएएस-ChR2-H134R को mCherry (उदा: ५८७ एनएम, em: ६१० एनएम) के साथ टैग किया गया है, लेकिन detectible-43 (उदा: ४७९ एनएम, em: ५९८ एनएम) इमेजिंग फ़िल्टर्स के साथ FM1 उत्सर्जन का उत्पादन नहीं करता है । तकनीकी पैरामीटर विकल्प चैनल सक्रियण के लिए प्रकाश स्रोत, तरंग दैर्ध्य और तीव्रता शामिल हैं । एक यहां इस्तेमाल किया विकल्प है एक सस्ता नीला उत्सर्जक एलईडी, नेत्रहीन मांसपेशियों के संकुचन परख द्वारा पुष्टि की उत्तेजना के साथ । हम भी epifluorescence का उपयोग कर ChR2 सक्रिय करने में सफल रहे थे, हालांकि एक स्कैनिंग फोकल लेजर पर्याप्त नहीं था । Epifluorescence लक्षित उत्तेजना में इस्तेमाल किया जा सकता है (पूरे जानवर के बजाय विशिष्ट क्षेत्रों), लेकिन उत्तेजना मानकों को नियंत्रित करने के लिए मुश्किल हैं, जबकि एलईडी एक सरल उत्तेजित करने के लिए कनेक्ट करने के लिए आसानी से दोनों की अवधि और प्रकाश की आवृत्ति को बदल दालों. विच्छेदन माइक्रोस्कोप कैमरा बंदरगाह के माध्यम से एलईडी प्रकाश ध्यान केंद्रित अधिक नियंत्रित, तीव्र प्रकाश उत्तेजना की अनुमति देता है ।

यह प्रयोगकर्ता को तय करने के लिए है या नहीं, उत्तेजना प्रतिमान के दौरान ventral तंत्रिका गर्भनाल/ हम यहां इस्तेमाल तीन तरीकों की तुलना के लिए पूरे केंद्रीय तंत्रिका तंत्र को दूर करने का फैसला किया है, लेकिन कभी भी ऊपर तारों को बरकरार छोड़ दिया है15. एक जटिलता है कि अंतर्जात तंत्रिका गतिविधि होती है जब भी तंत्रिका तंत्र पूरी छोड़ दिया है । इस गतिविधि की डिग्री जानवर से जानवर, प्रयोगकर्ता की विच्छेदन विशेषज्ञता पर बड़ी डिग्री में निर्भर से अत्यधिक चर रहा है । इस चर गतिविधि FM1 की राशि-43 डाई कि भरी हुई है और उतारा गया है, जो इसलिए नहीं exogenous उत्तेजना के कारण पूरी तरह से15कार्यरत है योगदान कर सकते हैं । एक संबंधित तकनीकी जटिलता है कि बरकरार कीट लार्वा कल्पित आंदोलन में पेशियां अनुबंध, और यह विस्थापन बहुत NMJ इमेजिंग के साथ हस्तक्षेप । केंद्रीय तंत्रिका तंत्र हटा दिया जाता है, और भी इमेजिंग4के दौरान सीए2 +मुक्त खारा के आवेदन के माध्यम से अगर इस आंदोलन को समाप्त है. इन दृष्टिकोण यहां इस्तेमाल किया NMJ तैयारी में उत्कृष्ट FM1-43 डाई इमेजिंग सक्षम करने के लिए पर्याप्त हैं । हालांकि, कुछ experimenters मांसपेशी संकुचन को बाधित करने के लिए दवाओं को जोड़ने के लिए चुनतेहैं (उदा., ryanodine, philanthotoxin-४३३), या कार्रवाई संभावित ब्लॉकर्स (उदा., tetrodotoxin)३७,३८का उपयोग करें । दवाओं की एक श्रृंखला के लिए चुनिंदा एसवी चक्र में हेरफेर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, ताकि कुछ कदम पर प्रकाश डाला, या neurotransmission तंत्र की जांच के लिए उत्परिवर्ती phenotypes दबाव का चिह्न । उदाहरण के लिए, कुछ experimenters कार्यरत है Veratridine (सक्रिय वोल्टेज-gated Na+ चैनल३९) के लिए आरक्षित पूल में एसवी लोडिंग बढ़ाने के लिए, Cyclosporin ए (रोकता Calcineurin गतिविधि४०) को बढ़ाने के लिए एसवी endocytosis, और Forskolin (सक्रिय करता है adenylyl cyclase४१, जो synaptic संचरण४२को बढ़ाता है) को बढ़ाने के लिए exo/इंडो सायक्लिंग पूल7,४३,४४। इस तरह के औषधीय जोड़तोड़ अतिरिक्त अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं । अंत में, FM1-43 पृष्ठभूमि के विच्छेदन की गुणवत्ता के आधार पर अलग डिग्री हो सकता है, धोने प्रभावशीलता और उत्तेजना प्रोटोकॉल । कुछ β-cyclodextrin Advasep-7४५, या जलीय fluorophore sulforhodamine४६के व्युत्पंन sulfobutylated, गैर-विशिष्ट प्रतिदीप्ति बुझाने के लिए और संकेत करने वाली पृष्ठभूमि अनुपात में सुधार करने के लिए जोड़ें ।

वहां कई तकनीकों है कि एफएम फ्लोरोसेंट इमेजिंग के साथ एसवी चक्र के आगे समझने के लिए कर सकते है (जैसे, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, synaptopHluorin, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी) । एक उदाहरण यहां दिखाया एफएम प्रतिदीप्ति photoconversion है कि ultrastructural विस्तार में एसवी चक्र की जांच करने के लिए प्रयोग किया जाता है । SVs कई पूल है कि स्थानिक और कार्यात्मक रूप से अलग है में आयोजित कर रहे है2। आसानी से पट्टे पर देने वाला पूल (RRP) तुरंत तीव्र उत्तेजना पर जारी बुलबुले शामिल हैं । एक बड़ा रीसाइक्लिंग पूल उदारवादी गतिविधि की शर्तों के तहत एसवी रिलीज जारी रखता है । एक आंतरिक आरक्षित पूल (आरपी) केवल मजबूत के साथ भर्ती है (प्रतीत होता है गैर के पास शारीरिक) उत्तेजना2। एसवी पूल कि सक्रिय कर रहे है उत्तेजना के प्रकार पर निर्भर करता है४७इस्तेमाल किया, और एफएम photoconversion का उपयोग कर Drosophila NMJ से रिपोर्ट इन विभिंन एसवी पूल के स्थानिक और कार्यात्मक गुणों में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि से पता चला है४८। एफएम photoconversion को एसवी पूल विभिंन उत्तेजना मानदंड के तहत सक्रिय अध्ययन किया जा सकता है, और इस तरह की लंबी endosomes और SVs४९के बीच बातचीत की तस्करी के रूप में प्रश्न प्रश्नों । प्रयोगकर्ता एफएम इमेजिंग में synapse पर अन्य गतिविधि-निर्भर परिवर्तन के साथ संयोजन में रुचि है, तो वहाँ FM1-43 डाई (FM1-43FX) के एक कथित तौर पर fixable अनुरूप है. यह जांच एक गतिविधि पर निर्भर डाई लदान के बाद Drosophila NMJ को ठीक करने के लिए अनुमति चाहिए, और फिर bouton गतिविधि स्तर (एफएम डाई प्रतिदीप्ति) और गतिविधि पर निर्भर अभिव्यक्ति के बीच सहसंबंध के लिए परीक्षण करने के लिए एंटीबॉडी लेबलिंग के साथ का पालन करें एक प् याज का प्रोटीन । भविष्य में, यह बेहद सुंदर Drosophila NMJ मॉडल synapse में अंय इमेजिंग दृष्टिकोण के साथ एफएम डाई इमेजिंग के संयोजन को सक्षम सकता है कि अतिरिक्त तरीकों का पता लगाने के लिए पुरस्कृत किया जाएगा ।

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी रुचि नहीं घोषित करते हैं ।

Acknowledgments

हम इस लेख के लिए योगदान के लिए Broadie प्रयोगशाला के सदस्यों को धंयवाद । इस काम को NIH R01s MH096832 और MH084989 को K.B., और NIH डॉक्टरेट फेलोशिप F31 MH111144 को D.L.K. से समर्थन मिला

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SylGard 184 Silicone Elastomer Kit Fisher Scientific NC9644388 To put on cover glass for dissections
Microscope Cover Glass 22x22-1 Fisherbrand 12-542-B To put SylGard on for dissections
Aluminum Top Hot Plate Type 2200 Thermolyne HPA2235M To cure the SylGard
Plexi glass dissection chamber N/A N/A Handmade
Borosilicate Glass Capillaries WPI 1B100F-4 To make suction and glue micropipettes
Laser-Based Micropipette Puller Sutter Instrument P-2000 To make suction and glue micropipettes
Tygon E-3603 Laboratory Tubing Component Supply Co. TET-031A For mouth and suction pipette
P2 pipette tip USA Scientific 1111-3700 For mouth pipette
0.6-mL Eppendorf tube cap Fisher Scientific 05-408-120 Used to put glue in for dissection
Vetbond 3M WPI vetbond Glue used for dissections
Potassium Chloride Fisher Scientific P-217 Forsaline
Sodium Chloride Millipore Sigma S5886 For saline
Magnesium Chloride Fisher Scientific M35-500 For saline
Calcium Chloride Dihydrate Millipore Sigma C7902 For saline
Sucrose Fisher Scientific S5-3 For saline
HEPES Millipore Sigma H3375 For saline
HRP:Alexa Fluor 647 Jackson ImmunoResearch 123-605-021 To label neuronal membranes
Paintbrush Winsor & Newton 94376864793 To manipulate the larvae
Dumont Dumostar Tweezers #5 WPI 500233 Used during dissection
7 cm McPherson-Vannas Microscissors (blades 3 mm) WPI 14177 Used during dissection 
FM1-43 Fisher Scientific T35356 Fluorescent styryl dye
Digital Timer VWR 62344-641 For timing FM dye load/unload 
LSM 510 META laser-scanning confocal microscope Zeiss For imaging the fluorescent markers
Zen 2009 SP2 version 6.0 Zeiss Software for imaging on confocal
HeNe 633nm laser Lasos To excite HRP:647 during imaging
Argon 488nm laser Lasos To excite the FM dye during imaging
Micro-Forge WPI MF200 To fire polish glass micropipettes
20mL Syringe Slip Tip BD 301625 To suck up the axon for electrical stimulation.
Micro Manipulator (magnetic base) Narishige MMN-9 To control the suction electrode for electrical stimulation
Stimulator Grass S48 To control the LED and electrical stimulation
Zeiss Axioskop Microscope Zeiss Used during electrical stimulation.
40X Achroplan Water Immersion Objective Zeiss Used during electrical stimulation and confocal imaging
All-trans Retinal Millipore Sigma R2500 Essential co-factor for ChR2
Zeiss Stemi Microscope with camera port Zeiss 2000-C Used during channelrhodopsin stimulation
LED 470nm ThorLabs M470L2 Used for ChR activation
T-Cube LED Driver ThorLabs LEDD1B To control the LED
LED Power Supply Cincon Electronics Co. TR15RA150 To power the LED
Optical Power and Energy Meter ThorLabs PM100D To measure LED intensity

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References

  1. Menon, K. P., Carrillo, R. A., Zinn, K. Development and plasticity of the Drosophila larval neuromuscular junction. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 647-670 (2013).
  2. Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Synaptic vesicle pools. Nat Rev Neurosci. 6 (1), 57-69 (2005).
  3. Long, A. A., et al. Presynaptic calcium channel localization and calcium-dependent synaptic vesicle exocytosis regulated by the Fuseless protein. J Neurosci. 28 (14), 3668-3682 (2008).
  4. Kopke, D. L., Lima, S. C., Alexandre, C., Broadie, K. Notum coordinates synapse development via extracellular regulation of Wingless trans-synaptic signaling. Development. 144 (19), 3499-3510 (2017).
  5. Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. J Neurosci. 12 (2), 363-375 (1992).
  6. Richards, D. A., Bai, J., Chapman, E. R. Two modes of exocytosis at hippocampal synapses revealed by rate of FM1-43 efflux from individual vesicles. J Cell Biol. 168 (6), 929-939 (2005).
  7. Verstreken, P., Ohyama, T., Bellen, H. J. FM 1-43 labeling of synaptic vesicle pools at the drosophila neuromuscular junction. Methods Mol Biol. 440, 349-369 (2008).
  8. Dickman, D. K., Horne, J. A., Meinertzhagen, I. A., Schwarz, T. L. A Slowed Classical Pathway Rather Than Kiss-and-Run Mediates Endocytosis at Synapses Lacking Synaptojanin and Endophilin. Cell. 123 (3), 521-533 (2005).
  9. Verstreken, P., et al. Endophilin Mutations Block Clathrin-Mediated Endocytosis but Not Neurotransmitter Release. Cell. 109 (1), 101-112 (2002).
  10. Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J. -Y., Goodman, K. M., Harata, N. C. Examination of synaptic vesicle recycling using FM dyes during evoked, spontaneous, and miniature synaptic activities. J Vis Exp. (85), (2014).
  11. Sandell, J. H., Masland, R. H. Photoconversion of some fluorescent markers to a diaminobenzidine product. J Histochem Cytochem. 36 (5), 555-559 (1988).
  12. Opazo, F., Rizzoli, S. O. Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes. J Vis Exp. (36), e1790 (2010).
  13. Sabeva, N. S., Bykhovskaia, M. FM1-43 Photoconversion and Electron Microscopy Analysis at the Drosophila Neuromuscular Junction. Bio-protocol. 7 (17), (2017).
  14. Sabeva, N., Cho, R. W., Vasin, A., Gonzalez, A., Littleton, J. T., Bykhovskaia, M. Complexin Mutants Reveal Partial Segregation between Recycling Pathways That Drive Evoked and Spontaneous Neurotransmission. J Neurosci. 37 (2), 383-396 (2017).
  15. Ryan, T. A., Reuter, H., Wendland, B., Schweizer, F. E., Tsien, R. W., Smith, S. J. The kinetics of synaptic vesicle recycling measured at single presynaptic boutons. Neuron. 11 (4), 713-724 (1993).
  16. Ramaswami, M., Krishnan, K. S., Kelly, R. B. Intermediates in synaptic vesicle recycling revealed by optical imaging of Drosophila neuromuscular junctions. Neuron. 13 (2), 363-375 (1994).
  17. Trotta, N., Rodesch, C. K., Fergestad, T., Broadie, K. Cellular bases of activity-dependent paralysis in Drosophila stress-sensitive mutants. J Neurobiol. 60 (3), 328-347 (2004).
  18. Long, A. A., et al. The nonsense-mediated decay pathway maintains synapse architecture and synaptic vesicle cycle efficacy. J Cell Sci. 123 (Pt 19), 3303-3315 (2010).
  19. Parkinson, W., Dear, M. L., Rushton, E., Broadie, K. N-glycosylation requirements in neuromuscular synaptogenesis. Development. 140 (24), 4970-4981 (2013).
  20. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), (1993).
  21. Jan, L. Y., Jan, Y. N. Antibodies to horseradish peroxidase as specific neuronal markers in Drosophila and in grasshopper embryos. Proc Natl Acad Sci. 79 (8), (1982).
  22. Paschinger, K., Rendić, D., Wilson, I. B. H. Revealing the anti-HRP epitope in Drosophila and Caenorhabditis. Glycoconj J. 26 (3), 385-395 (2009).
  23. Ramachandran, P., Budnik, V. Fm1-43 labeling of Drosophila larval neuromuscular junctions. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (8), (2010).
  24. Yawo, H., Kandori, H., Koizumi, A. Optogenetics: light-sensing proteins and their applications. , (2015).
  25. Pulver, S. R., Pashkovski, S. L., Hornstein, N. J., Garrity, P. A., Griffith, L. C. Temporal dynamics of neuronal activation by Channelrhodopsin-2 and TRPA1 determine behavioral output in Drosophila larvae. J Neurophysiol. 101 (6), 3075-3088 (2009).
  26. Hornstein, N. J., Pulver, S. R., Griffith, L. C. Channelrhodopsin2 Mediated Stimulation of Synaptic Potentials at Drosophila Neuromuscular Junctions. J Vis Exp. (25), e1133 (2009).
  27. Britt, J. P., McDevitt, R. A., Bonci, A. Use of channelrhodopsin for activation of CNS neurons. Curr Protoc Neurosci. , Chapter 2, Unit 2.16 (2012).
  28. Lin, J. Y. A user's guide to channelrhodopsin variants: features, limitations and future developments. Exp Physiol. 96 (1), 19-25 (2011).
  29. Vijayakrishnan, N., Woodruff, E. A., Broadie, K. Rolling blackout is required for bulk endocytosis in non-neuronal cells and neuronal synapses. J Cell Sci. 122, 114-125 (2009).
  30. Honjo, K., Hwang, R. Y., Tracey, W. D. Optogenetic manipulation of neural circuits and behavior in Drosophila larvae. Nat Protoc. 7 (8), 1470-1478 (2012).
  31. Dear, M. L., Shilts, J., Broadie, K. Neuronal activity drives FMRP- and HSPG-dependent matrix metalloproteinase function required for rapid synaptogenesis. Sci Signal. 10 (504), (2017).
  32. Baldwin, M. L., Rostas, J. A. P., Sim, A. T. R. Two modes of exocytosis from synaptosomes are differentially regulated by protein phosphatase types 2A and 2B. J Neurochem. 85 (5), 1190-1199 (2003).
  33. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 13940-13945 (2003).
  34. Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9715-9720 (2008).
  35. Nagel, G., Brauner, M., Liewald, J. F., Adeishvili, N., Bamberg, E., Gottschalk, A. Light Activation of Channelrhodopsin-2 in Excitable Cells of Caenorhabditis elegans Triggers Rapid Behavioral Responses. Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).
  36. Lin, J. Y. A user's guide to channelrhodopsin variants: features, limitations and future developments. Exp Physiol. 96 (1), 19-25 (2011).
  37. Sullivan, K. M., Scott, K., Zuker, C. S., Rubin, G. M. The ryanodine receptor is essential for larval development in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (11), 5942-5947 (2000).
  38. Narahashi, T., Moore, J. W., Scott, W. R. Tetrodotoxin Blockage of Sodium Conductance Increase in Lobster Giant Axons. J Gen Physiol. 47 (5), 965-974 (1964).
  39. Narahashi, T. Chemicals as tools in the study of excitable membranes. Physiol Rev. 54 (4), 813-889 (1974).
  40. Kuromi, H., Yoshihara, M., Kidokoro, Y. An inhibitory role of calcineurin in endocytosis of synaptic vesicles at nerve terminals of Drosophila larvae. Neurosci Res. 27 (2), 101-113 (1997).
  41. Seamon, K. B., Daly, J. W. Forskolin, cyclic AMP and cellular physiology. Trends Pharmacol Sci. 4, 120-123 (1983).
  42. Zhang, D., Kuromi, H., Kidokoro, Y. Synaptic Transmission at the Drosophila Neuromuscular Junction: Effects of Metabotropic Glutamate Receptor Activation. Slow Synaptic Responses Modul. , 260-265 (2000).
  43. Kuromi, H., Kidokoro, Y. The optically determined size of exo/endo cycling vesicle pool correlates with the quantal content at the neuromuscular junction of Drosophila larvae. J Neurosci. 19 (5), 1557-1565 (1999).
  44. Kuromi, H., Kidokoro, Y. Selective Replenishment of Two Vesicle Pools Depends on the Source of Ca2+ at the Drosophila Synapse. Neuron. 35 (2), 333-343 (2002).
  45. Kay, A. R., et al. Imaging Synaptic Activity in Intact Brain and Slices with FM1-43 in C. elegans, Lamprey, and Rat. Neuron. 24 (4), 809-817 (1999).
  46. Pyle, J. L., Kavalali, E. T., Choi, S., Tsien, R. W. Visualization of Synaptic Activity in Hippocampal Slices with FM1-43 Enabled by Fluorescence Quenching. Neuron. 24 (4), 803-808 (1999).
  47. Denker, A., Rizzoli, S. O. Synaptic vesicle pools: an update. Front Synaptic Neurosci. 2, 135 (2010).
  48. Denker, A., Kröhnert, K., Rizzoli, S. O. Revisiting synaptic vesicle pool localization in the Drosophila neuromuscular junction. J Physiol. 587 (12), 2919-2926 (2009).
  49. Wucherpfennig, T., Wilsch-Bräuninger, M., Gonz ález-Gait án, M. Role of Drosophila Rab5 during endosomal trafficking at the synapse and evoked neurotransmitter release. J Cell Biol. 161 (3), 609-624 (2003).

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तंत्रिका विज्ञान अंक १३५ Drosophila neuromuscular जंक्शन FM1-43 इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी photoconversion ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी
Synapse में एफएम डाई सायक्लिंग: उच्च पोटेशियम ध्रुवीकरण, बिजली और Channelrhodopsin उत्तेजना की तुलना
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Kopke, D. L., Broadie, K. FM Dye… More

Kopke, D. L., Broadie, K. FM Dye Cycling at the Synapse: Comparing High Potassium Depolarization, Electrical and Channelrhodopsin Stimulation. J. Vis. Exp. (135), e57765, doi:10.3791/57765 (2018).

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