Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

시 냅 스에서 사이클링 하는 FM 염료: 높은 칼륨 도발은, 전기 및 Channelrhodopsin 자극을 비교

Published: May 24, 2018 doi: 10.3791/57765
Automatic Translation
1, 2
1Department of Biological Sciences, Vanderbilt University, 2Departments of Biological Sciences, Pharmacology, Cell and Developmental Biology, Kennedy Center for Research on Human Development, Vanderbilt University and Medical Center

Summary

시 냅 스 소포 (SV) 자전거는 신경 시 냅 스에서 세포 커뮤니케이션의 핵심 메커니즘. FM 염료 통풍 관 및 릴리스 양적 SV 엔도-및 exocytosis 시 금의 기본 수단입니다. 여기, 우리는 모든 자극 방법 FM1 43 초파리 신경 근육 학 교차로 (NMJ) 모델 시 냅 스에서 자전거를 비교 합니다.

Abstract

FM 염료는 시 냅 스 소포 (SV) 주기를 공부 하는 데 사용 됩니다. 이러한 amphipathic 프로브는 친수성 머리와 소수 성 꼬리, 수용 성 역 입력 하 고 종료 막 지질 bilayers 능력 들을 만들고 있다. 이러한 styryl 염료는 상대적으로 비-형광 수성 매체에 있지만 원형질 막의 외부 전단에 삽입 한 > 형광 40 X 증가. 신경 시 냅 스에서 FM 염료는 SV endocytosis, 매매 모두 시간과 SV 풀 사이 함께 출시 된 SV exocytosis neurotransmission의 연 접 단계를 시각화 하는 강력한 도구를 제공 하는 동안 내 면. Glutamatergic 냅 개발 및 기능의 기본 유전자 모델은 Drosophila 신경 근육 학 교차로 (NMJ), FM 영상을 염색 SV 역학 돌연변이 조건의 넓은 범위에서 계량을 광범위 하 게 사용 되었습니다. NMJ 시 냅 스 터미널은, 아름 다운 배열의 큰 시 냅 스 boutons 이미징 응용 프로그램에 적합 합니다. 여기, 우리가 비교와 초파리 NMJ 활동 종속 FM1 43 염료 글귀/릴리스를 자극 하는 세 가지 방법으로 대조: 높은 [+K] 신경 근육 학 조직 depolarize, 2) 흡입 전극 모터 신경의 응용 프로그램 1) 목욕 연 접 신경 맨끝, 및 3 depolarize를 자극) 대상의 도발은 빛 자극, 공간 제어를 위한 channelrhodopsin 이체의 유전자 변형 식. 이러한 메서드의 마다 장점과 단점 SV 주기 유전자 변이 효과의 연구에 대 한 초파리 NMJ에. 우리는 이러한 장점과 단점 각 전략을 구체적인 방법론을 함께 자극 방식의 선택에 도움을 논의할 예정 이다. 형광 이미징, 뿐만 아니라 FM 염료 ultrastructural 수준에서 SV 사이클 메커니즘 연구를 전송 전자 현미경 (TEM)을 사용 하 여 시각화 하는 전자 밀도 신호를 photoconverted 수 있습니다. 우리 confocal의 비교를 제공 하 고 전자 현미경 이미징 도움말 가이드에 초파리 NMJ 자극의 다른 방법에서 미래 실험 패러다임의 선택.

Introduction

초파리 애벌레 신경 근육 학 교차로 (NMJ) glutamatergic 냅 모델 아름 답게 특징은 시 냅 스 형성 유전자 섭1의 광대 한 스펙트럼과 기능을 공부 하 고 사용 되었습니다. 여러 축 삭 분 지, 각각 많은 확대 시 냅 스 boutons 모터 신경 맨끝에 의하여 이루어져 있다. 이 널찍한 varicosities (최대 5 µ m 직경에서) neurotransmission 기계, 균일 한 glutamatergic 시 냅 스 소포를 포함 하 여 모든 포함 (SVs; ~ 40 nm 직경에서) cytosolic 예비에 쉽게 releasable 풀2. 이 소포는 연 접 원형질 막 퓨전 사이트 활성 영역 (AZs), 어디 exocytosis 트랜스에 대 한 조미료 신경 전달 물질 방출을 중재에 도킹-시 냅 스 통신. 그 후, SVs는 반복된 엑 소/endocytosis 사이클 키스 실행 재활용 또는 clathrin 중재 된 endocytosis (CME)를 통해 원형질 막에서 검색 됩니다. Drosophila NMJ은 쉽게 접근 가능 하 고 모두 분리 및 SV 주기 돌연변이 적합. 앞으로 유전 스크린을 사용 하 여, 새로운 돌연변이 SV 사이클3에 대 한 중요 한 새로운 유전자의 식별을 끌고있다. 또한, 이미 알려진된 유전자로 시작 하는 역 유전 접근은 돌연변이 고기4사이클의 주의 설명을 통해 새로운 SV 사이클 메커니즘의 해명에 이르렀다. Drosophila NMJ 광학 트랙 소포 neurotransmission 동안 순환 하는 방법을 통해 SV endocytosis 및 exocytosis 메커니즘을 해 부에 대 한 실험 시 냅 스 준비로 거의 이상적 이다.

다양 한 형광 마커 중 역학, 소포의 시각적 추적 허용 하지만 가장 다재 다능 한 마오, F., 동부 표준시 알에 의해 처음 합성 FM 염료 아날로그. 5. FM 염료는 친수성 머리와 스펙트럼 속성 부여 중앙 지역으로 향기로운 반지를 통해 연결 된 질 성 꼬리를 포함 하는 구조적으로. 이러한 styryl 염료 역 막에 분할 할 하지 '플립플롭' 막 전단지 사이 고 그래서 결코, cytosol에서 무료 고 물5보다 훨씬 더 막에 형광. 지질 bilayer에 가역 삽입 형광6에 40-fold 증가 발생합니다. 신경 시 냅 스에서 클래식 FM 염료 라벨 실험 SV endocytosis 통해 염료를 로드 depolarizing 자극 하는 동안 염료와 시 냅 스 준비 목욕 이루어져 있다. 외부 염료 다음 씻 고 SV 주기 이미지 로드 시 냅 스7를 칼슘 무료 벨소리 솔루션에 체포 됩니다. 염료 무료 목욕에 자극의 두 번째 라운드 exocytosis, 형광 강도 감소를 측정 하 여 따라 할 수 있는 과정을 통해 FM 석방을 트리거합니다. 풀 vesicles의 수백을 포함 하는 단일 소포에서 SV 인구 양적 모니터링된6,7일 수 있다. 기능적으로 뚜렷한 SV 풀의 활동-종속 동원 해 부 키스-및-실행 CME 사이클링8,9대를 비교 하 고 FM 염료 사용 되었습니다. 방법은 별도로 분석 결과 갖는, 자연과 소형 시 냅 스 사이클 활동 (아주 작은 형광 변화를 감지 하 여 photobleaching를 줄이기 위해 매우 중요 한 장비)와10에 수정 되었습니다. 분석 실험으로 확장할 수 있습니다 ultrastructural 단계로 photoconverting 형광 FM 신호 전송 전자 현미경 검사 법11,12,13,14 전자 밀도 라벨으로 .

역사적으로, 칼륨 ("높은 [K+]" 라 함)의 높은 농도에 입욕 시 냅 스 준비 되었습니다 depolarizing SV 사이클링;을 유도 하는 자극에 대 한 선택의 방법 개구리 해 NMJ5년까지 경작 설치류 두뇌 hippocampal 신경15, 초파리 glutamatergic NMJ 모델16,17. 높은 [K+] 이렇게 간단, 특수 장비, 필요 고 따라서 대부분의 실험실에 액세스할 수 하지만 응용 프로그램 및 데이터 해석에 대 한 제한이 있습니다. 훨씬 더 순수 적절 한 방법을 사용 하는 신경4,5,12의 흡입 전극 전기 자극. 이 방법은 활동 전위 전파 연 접 신경의 직접적인 자극에 대 한 터미널, 고 결과 electrophysiological 분석 neurotransmission 함수13,14의 직접 비교 될 수 있다 15, 하지만 특수 장비를 필요로 하 고 기술적으로 훨씬 더 도전적인는. Optogenetics의 출현으로 channelrhodopsin 신경 자극의 사용 이진 Gal4/UAS 시스템20을 사용 하 여 채널 식의 꽉 spatiotemporal 제어를 포함 하 여 추가적인 이점이 있다. 이 방법은 흡입 전극 자극 보다 기술적으로 훨씬 쉽게 하며 매우 저렴 한 LED 광원 보다 아무것도 더. 우리 모두 비교 하 고 대조 초파리 NMJ에서 이러한 세 가지 다른 자극 방법 FM1-43 (N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(4-(dibutylamino)styryl) pyridinium dibromide)의 이미지를 사용 하는 여기,: 간단한 높은 [K+ ], 전기 및 새로운 channelrhodopsin 접근을 도전.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. 애벌레 접착제 해 부

  1. 철저 하 게 혼합 실리콘 탄성 엘라 스토 머 키트 (자료 테이블)에서 에이전트를 경화 실리콘 탄성 중합체의 1 부분으로 기본의 10 개 부분.
  2. 몇 시간 (때까지 더 이상 터치 스티커)에 대 한 탄성 중합체와 75 ˚C에서 뜨거운 접시에 치료 22 x 22 m m 유리 coverslips 코트.
  3. 단일 탄성 중합체 코팅 유리 coverslip을 애벌레 해 부에 대 한 준비에 맞춤 plexi 유리 절 개 챔버 (그림 1, 하단)에 넣으십시오.
  4. 표준 microelectrode 끌어당기는 사람을 사용 하 여 원하는 테이퍼 팁 크기를 붕 규 산 유리 모 세관에서 접착제 펫을 준비 합니다.
  5. 부드럽게 micropipette 팁 오프 하 고 다른 쪽 끝을, 유연한 플라스틱 튜브 (1/32"내부 직경, ID 3/32" 외부 직경, OD, 1/32"벽;의 2 피트 자료의 테이블) 와 입 (P2 피 펫 팁) 피팅.
  6. 애벌레 해 부에 대 한 준비에 접착제 (자료 테이블)의 작은 양 (~ 20 µ L)으로 작은 컨테이너 (0.6 mL Eppendorf 관 모자)를 채우십시오.
  7. 챔버 (mM)에 염 분 채우기: 128 NaCl, 2 KCl, 4 MgCl2, 1 CaCl2, 70 자당 및 5 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic 산 (HEPES) pH 7.2.
  8. 알 렉 사 Fluor 647에 활용 된 안티-말 무 과산화 효소 (HRP) 항 체를 추가 (안티-HRP:647; 1 mg/mL 재고에서 희석 1시 10분)은 NMJ를 라벨에 대 한 해 부21,22동안 연 접 맨끝.
  9. 좋은 붓 (크기 2)를 사용 하, 식품 유리병에서 방황 하 고 세 번째 탈피를 제거 하 고 탄성 중합체 코팅 커버 유리에 놓습니다.
  10. 유리 제 micropipette 팁을 첨부 (1.5 단계)와 입에 의해 생성 된 부정적인 공기 압력을 사용 하 여 접착제의 작은 볼륨을 채우십시오.
  11. 위치 유 충 등 사이드를 집게와 접착제 탄성 중합체 코팅 coverslip 작은 머리 입으로 긍정적인 공기 압력을 사용 하 여 접착제의 드롭.
  12. 확인 하 고 동물 상당량이 두 접착제 첨부 파일 사이의 긴장 된 유 충의 후부 끝이 절차를 반복 합니다.
  13. 가 위를 사용 하 여 (블레이드 3 m m; 테이블의 자료), 후부 및 수직 컷 등 쪽 midline 따라 수평 컷 (~ 1 m m)를 확인.
  14. 부드럽게 잘 집게 (#5, 테이블의 자료)를 사용 하 여 등 기관, 창 자, 뚱뚱한 몸 및 다른 내부 장기를 덮고 있는 근육 제거.
  15. 4 몸 벽 날개, 수평 및 수직으로 체 벽을 부드럽게 스트레칭 하를 접착제로 붙이는 절차를 반복 합니다.
  16. 집게를 사용 하 여 복 부 신경 코드 (VNC), 신중 하 게 모터 신경은가 위로 잘라 들어올린 다음 VNC를 완전히 제거.
  17. 해 부 생리를 바꿉니다 캘리포니아2 +-SV를 막으려고 (CaCl2없이 위의 해 부 식 염 수와 동일)는 염 분을 무료 자전거.

2. 옵션 1: 높은 [K+] FM 염료 로드

  1. FM1 43 재고 솔루션 (4 m m)에서 90 m KCl 해결책 (높은 [K+] 해 부 염 분에서) 4 µ M의 최종 농도 대 한 m의 1 mL에 1 µ L를 추가 합니다.
  2. 교체를 피 펫을 사용 하 여 Ca2 +-SV endocytosis 염료의 통풍 관을 자극 하 고 [K+] FM 염료 솔루션과 영상 실에서 무료 염 분.
  3. 즉시 시작 자극 기간 depolarizing [K+]의 미리 결정 된 기간에 대 한 디지털 타이머 (예., 5 분; 그림 2)입니다.
  4. 건강 한 애벌레 준비를 확인 하려면 높은 [K+] 도발은 기간 동안은 근육의 강한 수축 note.
  5. 타이머 기간 끝나면 신속 하 게 높은 [K+] FM 염료 솔루션을 제거 하 고 대체 캘리포니아2 +-SV를 막으려고 무료 염 분 사이클링.
  6. 캘리포니아2 +빠른 승계에서 세척-높은 [K+] FM 염료 솔루션 완전히 제거 되도록 하기 위해 식 염 수 (5 x 1 분)을 무료.
  7. 신선한 캘리포니아2 +에서 애벌레 준비를 유지-confocal 현미경으로 즉시 이미징에 대 한 무료 염 분.

3. 영상: Confocal 현미경 검사 법

  1. 똑바로 confocal 현미경을 사용 하 여 이미지 NMJ 염료 형광 (다른 현미경 사용 될 수 있다)에 물 집중 목표 X 40.
  2. 이미지 근육 복 부 세그먼트 2-4 (다른 NMJs 몇 군데 수)의 4 NMJ 적절 한 소프트웨어 (테이블의 재료)를 사용 하 여 이미지를 수집 하 고.
  3. HeNe 633 nm 레이저를 사용 하 여 HRP:647 (와 긴 패스 필터 > 635 nm)와 아르곤 488 nm 레이저 FM1-43 (대역 통과 필터 530-600 nm)와 자극을 자극.
  4. 운영 체제는 최적의 이득 및 두 채널에 대 한 오프셋을 결정 합니다.
    참고:이 설정은 실험의 나머지 부분에 걸쳐 일정 한 유지 됩니다.
  5. 시 냅 스 터미널의 바닥에 HRP 표시 위에서 전체 선택한 NMJ 통해 confocal Z 스택 가져가 라.
  6. 주의 주의 NMJ 몇 군데 (세그먼트, 측면 및 근육)의 FM 역 염색 후 정확한 동일한 NMJ에 초과 되도록 합니다.

4. 높은 [K+] 자극: FM 염료 내리기

  1. 대체 캘리포니아2 +-무료 염 분 높은 [K+] 염 (FM1 43 염료) 없이 드라이브 도발은를 가진 SV exocytosis 염료 릴리스.
  2. 높은 [K+] 자극 기간 미리 결정 된 기간에 대 한 디지털 타이머를 즉시 시작 (예., 2 분; 그림 2)입니다.
  3. 타이머 기간 끝나면 즉시 높은 [K+] 염 분을 제거 하 고 대체 캘리포니아2 +-SV를 막으려고 무료 염 분 사이클링.
  4. 캘리포니아2 +빠른 승계에서 세척-높은 [K+] 염 분 완전히 제거 되도록 하기 위해 식 염 수 (5 x 1 분)을 무료.
  5. 신선한 캘리포니아2 +에서 애벌레 준비를 유지-confocal 현미경으로 즉시 이미징에 대 한 무료 염 분.
  6. 동일한 confocal 설정을 사용 하 여 위에서 설명한 동일한 NMJ에 FM1 43 염료 형광 이미지를 특정 수 있습니다.

5. 옵션 2: 전기 자극 FM 염료 로드

  1. 필요한 테이퍼 팁 크기를 microelectrode 끌어당기는 사람 (테이블의 재료)를 사용 하 여 흡입 피 펫을 준비 합니다.
  2. 화재-폴란드어 마이크로 포지 microelectrode 끝까지 단일 모터 신경 꽉 맞는와 빨려 수 있습니다.
  3. micromanipulator에 흡입 피 펫 전극 홀더에 고 긴 유연한 플라스틱 튜브와 주사기를 연결 하십시오.
  4. 자극 매개 변수 설정 (예., 15 V, 20 Hz 주파수, 20 ms 기간 및 시간 5 분 (그림 2) 또는 1 분 (그림 3)).
  5. 대체 Ca2 +-FM1 43 염 분 (4 µ M, 1 mM CaCl2) 전기 생리학 장비에 위의 애벌레 준비에 무료 염 분.
  6. 현미경 단계에 준비 넣고 유 충과 흡입 피펫은 초점 (40 X 물 침수 목표)에 때까지 무대를 마련 합니다.
  7. 부정적인 공기 압력 흡입 전극으로 주사기에 의해 생성 된 선택 된 hemisegment를 innervating 컷된 모터 신경의 루프를 빨 아.
  8. 선택 된 hemisegment에 있는 근육 수축에 대 한 시각적으로 모니터링 하는 동안 자극의 짧은 버스트와 함께 흡입 전극 기능을 테스트 합니다.
  9. SV endocytosis를 선택한 매개 변수 (단계 5.4) 및 FM1 43 염료의 통풍 관 (그림 2)를 사용 하 여 모터 신경 자극.
  10. 캘리포니아2 +빠른 승계에서 세척-FM1 43 염료 솔루션 완전히 제거 되도록 하기 위해 식 염 수 (5 x 1 분)을 무료.
  11. 신선한 캘리포니아2 +에서 애벌레 준비를 유지-위에서 confocal 영상 프로토콜을 사용 하 여 즉시 이미징에 대 한 무료 염 분.
  12. (세그먼트, 측면 및 근육) FM 염료 내리기 후 정확한 동일한 NMJ에 대 한 액세스를 보장 하기 위해 몇 군데 NMJ의 주의 기록해 둡니다.

6. 전기 자극: FM 염료 내리기

  1. 대체 Ca2 +-(FM1 43 염료) 없이 일반 식 염 수와 염 분 및 전기 생리학 장비 무대에 다시 준비를 놓습니다.
  2. 역에 대 한 자극 매개 변수 설정 (예를 들어, 15 V, 20 Hz 주파수, 20 ms 기간 및 2 분 (그림 2) 또는 20 시간 (그림 3)).
  3. 동일한 모터 신경, 위와 같이 동일한 전극에 빨 아 그리고 SV exocytosis FM1 43 염료 릴리스를 활성화 하 자극.
  4. 캘리포니아2 +빠른 승계에서 세척-외부 염료 완전히 제거 되도록 하기 위해 식 염 수 (5 x 1 분)을 무료.
  5. 신선한 캘리포니아2 +에서 애벌레 준비를 유지-confocal 현미경으로 즉시 이미징에 대 한 무료 염 분.
  6. 동일한 confocal 설정을 사용 하 여 위에서 설명한 동일한 NMJ에 FM1 43 염료 형광 이미지를 확인 합니다.

7. 옵션 3: Channelrhodopsin 자극 FM 염료 로드

  1. ChR2 공동 인자 모든 trans 망막 (에탄올에 용 해, 100 µ M 최종 농도)를 포함 하는 음식에 ChR2 표현 애벌레를 올립니다.
  2. 카메라 포트를 장착 해 부 현미경 스테이지에 플 렉 시 유리 챔버에 애벌레 준비를 놓습니다.
  3. 파란색 LED를 연결 (470 nm; 자료의 테이블) 프로그래밍 가능한 자극 하는 동축 케이블을 사용 하 고 카메라 포트에 LED를 배치.
  4. 블루 LED 빛 빔 현미경 확대/축소 기능을 사용 하 여 해 부 애벌레 함수에 초점.
  5. 대체 Ca2 +-optogenetic 스테이지의 FM1 43 염 분 (4 µ M, 1 mM CaCl2) 위의 애벌레 준비에 무료 염 분.
  6. (예를 들어, 15 V, 20 Hz 주파수, 20 ms 기간 및 시간 5 분 (그림 2)의) 자극 기를 사용 하 여 LED 매개 변수를 설정 합니다.
  7. 빛 자극을 시작 하 고 (예를 들어, 5 분; optogenetic 자극 기간 미리 결정 된 기간에 대 한 타이머 추적 그림 2)입니다.
  8. 타이머 중지, 신속 하 게 FM 염료 솔루션을 제거 하 고 대체 캘리포니아2 +-SV를 막으려고 무료 염 분 사이클링.
  9. 캘리포니아2 +빠른 승계에서 세척-FM 염료 솔루션 완전히 제거 되도록 하기 위해 식 염 수 (5 x 1 분)을 무료.
  10. 신선한 캘리포니아2 +에서 애벌레 준비를 유지-confocal 현미경 위에서 이미징 프로토콜을 사용 하 여 즉시 이미징에 대 한 무료 염 분.
  11. (세그먼트, 측면 및 근육) FM 염료 내리기 후 정확한 동일한 NMJ에 대 한 액세스를 보장 하기 위해 몇 군데 NMJ의 주의 기록해 둡니다.

8. Channelrhodopsin 자극: FM 염료 내리기

  1. 대체 캘리포니아2 +-카메라 포트 LED와 해 부 현미경 스테이지 (FM1 43 염료) 없이 일반 염 분으로 무료 염 분 유 충에 초점을 맞춘.
  2. 언로드 (예를 들어, 15 V, 20 Hz 주파수, 20 ms 기간 및 2 분 (그림 2)의 시간)에 대 한 자극 매개 변수를 설정 합니다.
  3. 빛 자극을 시작 하 고 optogenetic 자극 기간 미리 결정 된 기간에 대 한 타이머 추적 (예: 2 분; 그림 2)입니다.
  4. 타이머 기간 끝나면 빨리 FM 염료 솔루션을 제거 하 고 바꿉니다 캘리포니아2 +-SV를 막으려고 무료 염 분 사이클링.
  5. 캘리포니아2 +빠른 승계에서 세척-외부 염료 완전히 제거 되도록 하기 위해 식 염 수 (5 x 1 분)을 무료.
  6. 신선한 캘리포니아2 +에서 애벌레 준비를 유지-confocal 현미경으로 즉시 이미징에 대 한 무료 염 분.
  7. 동일한 confocal 설정을 사용 하 여 위에서 설명한 동일한 NMJ에 FM1 43 염료 형광 이미지를 확인 합니다.

9. 형광 정량화

  1. 이미지 J (NIH 오픈 소스)에서 이미지를 로드 하 고 이미지를 클릭 하 여 최대 강도 투영을 만듭니다 | 스택 | Z 프로젝트입니다.
  2. 안티를 사용 하 여-HRP:647 채널, 이미지 이동 | 조정 | 임계값와 슬라이드 그냥 NMJ 선택 될 때까지 상단 도구 모음.
  3. 자동 선택 도구 사용 하는 NMJ에 클릭 합니다. 불연속은 NMJ 이면 Shift 버튼을 누른 상태 고 모든 부품을 선택 합니다.
  4. FM1 43 염료로 이미지를 변경 하 고 이동 분석 | 형광 측정을 측정 합니다.
  5. (식별 된 세그먼트, 측면 및 근육) 같은 NMJ에서 "내려진된" 이미지에 대 한 단계 9.1-9.4 반복 합니다.
  6. 로드 된 염료의 백분율을 얻으려면, 언로드/로드 형광 강렬의 비율을 가져가 라.
    참고:이 절차는 "타원형" 또는 "자유형" 선택 도구를 사용 하 여 bouton 당 bouton 기준 형광 분석을 수정할 수 있습니다. 배경 형광 근육 형광을 샘플링 하 여 공제 될 수 있습니다. 에이전트를 줄이기 위해이 배경을 추가할 수 있습니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

그림 1 프로토콜 이미징 활동 종속 FM 염료에 대 한 작업 흐름을 보여 줍니다. 실험은 항상 이후에 사용 되는 자극 방법에 관계 없이 같은 애벌레 접착제 해 부로 시작 합니다. 그림 1a 보여주는 복 부 신경 코드 (VNC), 신경 및 반복된 hemisegmental 근육 패턴을 발산 해 부 유 충의 회로도 이다. VNC 제거 되 고 준비 FM1-43 (그림 1b, 핑크)의 4 µ M 솔루션에 목욕. 준비는 다음 활동 종속 SV endocytosis (그림 1cI-III) 통해 염료를 로드 하는 세 가지 가능한 옵션 중 하나를 사용 하 여 FM 염료의 자극. 다음, FM 염료 사용 하 여 Ca2 +체포 사이클링-무료 식 염 수와 FM 염료와 함께 로드 된 특정 NMJ 터미널 confocal 현미경 ("로드 이미지";를 사용 하 여 몇 군데는 그림 1 d)입니다. 이 경우에, 근육 신경, NMJ 터미널 분기 및 FM의 도식 표시 위치와 4 NMJ 선택 시 냅 스 boutons 로드. 시 냅 스 준비 SV exocytosis와 FM1 43 릴리스 (그림 1e)를 위에, 그러나 FM 염료의 부재에서를 선택 하는 동일한 방법을 사용 하 여 두 번째 시간에 대 한 자극은. 같은 NMJ를 식별 (이 예에서 4 NMJ 근육)은 다음 다시 몇 군데 HRP:647 시 냅 스 레이블 및 잔여 FM1 43 기 신호 ("내려진된 이미지";를 사용 하 여 그림 1f)입니다. 실험 강도 및 로드 및 언로드 특정 분석 결과 또는 돌연변이 상태에 대 한 측정을 최적화 하는 단계의 기간을 결정 합니다. 형광 강도 로드 및 언로드 (그림 1 d, 1 층) 후 계량, 시 냅 스 염료 endocytosis, exocytosis의 비율의 측정을 얻을 로드 출시 FM 염료. 전체 NMJ 또는 단일 boutons에 대 한 분석을 수행할 수 있습니다.

FM 염료 사이클링 세 가지 방법으로 자극 될 수 있다: 1) 고 [K+] 염 분 도발은 전체 준비, 모터 신경의 2) 흡입 전극 자극 또는 타겟된 channelrhodopsin (ChR2; 3) 가벼운 구동된 인증의 그림 2)입니다. 모든 세 가지 방법의 직접적인 측면-의해-측면 비교에 대 한 우리는 FM1-43 (로드)의 5 분 그리고 FM1-43 (역)의 부재에서 2 분 각 방법으로 자극 하 고 HRP 표시 NMJs 동일한 confocal 설정 ( 를 사용 하 여 몇 군데 그림 2). 높은 [K+] 염 분 도발은 방법 우리가 애벌레 절 개 핀 대신 접착제를 사용 제외 하 고 초파리 애벌레 NMJ23에 대 한 널리 사용 FM1 43 프로토콜을 다음과 같습니다. 접착제는 현미경 목표와 방해를 방지 하 고 체 벽 긴장의 더 정확한 결정 하지만 적당 한 학습 곡선을 필요로 합니까. 모든 세 가지 방법 강력 하 고 일관 된 형광 신호 NMJ 시 냅 시스 bouton 아 버 전체와 개별 시 냅 스 boutons (인세트)를 생성합니다. 높은 [K+] 염 분 도발은 메서드 (그림 2A, 중간) 동물의 모든 신경 depolarizes로 유 충을 통해 FM 로드 되도록 모든 NMJs 발생 합니다. 신경 흡입 전극 전기 자극 방법입니다 (그림 2B, 중간) 자극 모터 신경 되었습니다 해당 innervating 애벌레의 단일 hemisegment에만 드라이브. 같은 동물에 unstimulated 세그먼트 HRP 라벨을 사용 하 여 구별할 수 있습니다 하지만 로드, 아무 관찰 형광 염료를 포함 하 고 우수한 내부 통제 역할. Optogenetic ChR2 메서드 생성 대상된 도발은 유전자 변형 Gal4 드라이버 고용 (그림 2C)에 의존 합니다. 여기, 드라이버 기공을 글루타민 산 염 운송업 자 (vglut) Gal4, 그래서 모든 glutamatergic 신경 glutamatergic 모터 신경의 모든 포함 한 블루 빛 자극, depolarized는 이었다. 그 결과, 모든 NMJs FM1 43 염료가 예 (그림 2C, 중간)와 함께 로드 됩니다. 특정 NMJs 레이블 및 내부 통제에 대 한 레이블 없음 다른 사람을 두고 하 셀 전용 드라이버를 사용할 수 있습니다.

FM 역 염료 염료를 로드 하는 데 사용 된 동일한 방법을 통해 달성 되었다. 첫 번째 방법에서 애벌레 준비는 단순히 셀, 드라이브 SV exocytosis, depolarize 시 냅 스 터미널 (그림 2A, 오른쪽)를 언로 드을 FM1-43의 부재에 높은 [K+] 염 분에 목욕을 합니다. 우리는 일반적으로 짧은 역 기간 (2 분)을 선택, 그래서 역 부분 이며 단말기 그대로 FM 채널에 표시 됩니다. 동일한 hemisegment를 반환 같은 신경을 식별 하 고 다시 염료 언로드 (그림 2B를 FM1-43의 부재에서 그 신경 자극을 포함 하기 때문에 상당히 더 많은 도전은 흡입 전극 전기 자극 역 , 오른쪽). 참고 언로드 염료가 다시 부분입니다. ChR2 내리기 FM1-43 활성화 하는 채널, 모터 신경 depolarize 고 SV exocytosis 염료 릴리스 (그림 2C, 오른쪽)을 자극의 부재에서 애벌레 준비의 블루 LED 조명의 두 번째 기간을 수반 한다. 이 표시줄 내리기 (2 분)와 함께 이러한 각각의 depolarization 메서드 언로드 높은 [K+] 로드 FM1 43 염료의 극히 강한 및 ChR2 약한 염료 릴리스 (그림 2)에서. 우리는 LED 빛의 강도 사용 (140 µW/m m2), 게시 된 범위 (20-1000 µW/m m2)24,,2526에 측정. ChR2는 ChR2 효과 또한 애벌레27,28에 ATR 농도에 따라 50-200 mW 광원에서 ~ 1 mW 조명 극대로 활성화 됩니다. 따라서, ChR2 자극 강도 조작할 수 있습니다. 또한, 관계는 다른 자극 강점, 날짜 표시줄 또는 genotypes 진정한 남아 있지 않을 수 있습니다. 또는 경우에 실험 SV endocytosis 감소 했습니다 돌연변이 협력 exocytosis를 일반적으로 빨리, 자극 매개 변수 내리기 후 관찰 신호를 유지 하기 위해 변경 해야 합니다. 안티-HRP 레이블 FM 신호의 완전 한 부재에도 NMJ를 식별할 수 있지만 이것은 정량화에 대 하 이상적 이다. 원칙적으로, 역 자극 또한 수 로드 자극에서 다른 종류의 있습니다.

우리는 최근 SV 주기 전기 자극4를 사용 하 여에 시 냅 스 deacylase 분 비 Notum 효과의 감소를 공부 했습니다. 여기, 우리는이 분석 비교 1) 높은 [K+] 도발은 2) 흡입 전극 모터 신경 자극 방법 (그림 3)을 확장. 우리 모두 비슷한 결과 제공 하는 방법을, 보여주는 감소 FM1 43 염료 Notum null 돌연변이;에서 로드를 찾아합니다 그러나, 표현 형의 학위는 두 가지 방법 사이 구분 됩니다. 5 분에 대 한 높은 [K+] 염 분과 도발은 후 있다 유전 배경 제어 (w1118) 로드 형광 강도에 큰 감소 높은 레벨과 Notum null 돌연변이 (Notum코 ) 낮은 수준 (그림 3A, 상단). 계량된 측정에서 HRP 설명 NMJ 터미널 내에서 정규화 된 FM 형광 강도 크게 감소 Notum ( Notum코 0.57 ± 0.07 대w1118 1.0 ± 0.05, n≥13, p 의 부재에 < 0.0001; 그림 3B)입니다. 1 분 20 Hz에서 전기 자극 후 우리가 찾을 로드 FM1 43 강도 컨트롤 및 Notum null 사이 사소한 감소 전체 NMJ 형광 (w1118 1.0 ± 0.05 Notum코 대를 측정 하는 경우 0.86 ± 0.06; n = 8, p = 0.10; 그림 3A, B)입니다. Bouton 당 bouton 기준 염료 설립을 측정할 때 보면 염색 방법 중 둘 다 로드에 상당한 감소. 높은 [K+] 염 분으로 자극 후 정량 측정, bouton 당 정규화 된 FM 형광 강도 크게 감소 ( Notum코 0.52 ± 0.02 대w1118 1.0 ± 0.02, n≥241, p< 0.0001; 그림 3C)입니다. 전기 자극 후 bouton 당 정규화 된 형광 강렬은 또한 크게 줄 고, 이기는 하지만 낮은 정도로 ( Notum코 0.83 ± 0.02 대w1118 1.0 ± 0.02, n≥127, p< 0.0001; 그림 3C)입니다.

두 자극 패러다임 간의 결과 차이 요인의 숫자로 인해 수 있습니다. 첫째, 자극 강도가 큰 것으로 추정 된다 높은 [K+] 전기 모터 신경 자극에 비해. 전기 생리학 기록 높은 [K+] 염 분, 존재 할 수 없습니다 하지만 애벌레 neuromusculature는 명확 하 게 되 고 튼튼하게 자극, 강력 하 고 5 분 입욕 기간 동안 지속적인 근육 수축으로. 그러나, 강도 또는 자극의 주파수를 알고 하지 않습니다. 반면, 전기 자극은 훨씬 더 정확한 전압 힘과 자극의 주파수를 선택 하는 사용자와 제어 됩니다. 둘째, 자극 기간은 더 높은 [K+] 전기 신경 자극 (그림 3)에 비해. 우리는 반복된 시험 후 20 Hz 전기 자극의 1 분을 선택 했다. 염료 로드의 1 분 후 5 분 자극의 준도 강한 형광 신호 (그림 2) 비록 우리 우리의 연구4, 그 패러다임을 선택 그래서 강력 하 고 신뢰할 수 있는 FM1 43 신호를 했다. 따라서, 자극 패러다임의 길이 가능성이 높은 [K+] 전기 자극 (그림 3B, C) 사이 FM1 43 로딩에 크기 변화에 기여 하 고. 높은 [K+] 메서드 Notum 돌연변이 대 한 더 강력한 표현 형을 보였다, 하지만 우리는 여전히 큰 제어4때문에 전기 메서드를 사용. 많은 매개 변수 강도, 주파수 등 자극의 기간을 제어 하 고 설정만 돌연변이 및 질문에 따라 결정 해야 합니다. 예를 들어 자극 방법 선택 SV 심문 수영장7 에 따라 달라질 수 있습니다 고 활동-종속 메커니즘 조사10.

FM1-43 NMJ 터미널에 로드, 후 한 형광 염료 photoconversion 전자 현미경 검사 법 (그림 4)에 대 한 전자 밀도 신호를 생산 하기 위해 고용 수 있습니다. 이 방법에서는, 염료 로드 준비 어두운 침전 (그림 4A)11만들려고 DAB 산화 FM 염료에서 반응성 산소 종 (한 덩어리), diaminobenzidine의 강렬한 형광 빛에 노출 됩니다. 자세한 내용은12styryl 염료의 photoconversion 정돈 문서를 참조 하십시오. 이 방법의 장점은 비록 SV 사이클은 물론 정적 전자 현미경 이미징 체포 SVs ultrastructural 수준에서 명확 하 게 공개 됩니다입니다. 자극의 부재에서 초파리 NMJ에 시 냅 스 boutons 밀도가 소포와 함께 로드 됩니다 (~ 40 nm 직경; 그림 4B) 확대 세포의 드문와 (>100 nm 직경에서) 자전거 endosomes를 것으로 추정. 높은 [K+] 염 분 자극을 강하게 depolarizing SV 인구의 부분 소모와 수많은 확대 세포의 급속 한 축적이이 프로필 변경 (>100 nm 직경에서) 대량에서 파생 생각 원형질 막 (그림 4C, 왼쪽)의 endocytosis. 유사한 구획 unstimulated 컨트롤에 존재, 높은 [K+] 염 분 도발은 후 이들이 세포의 밀도가 높은이 아닌 생리 적인 응답을 수 있다는 우려를 발생 시킵니다. 모터 신경의 전기 자극을 흡입 전극 SV 인구를 없애고에 상대적으로 더 효율적 이며 더 확대 endosomal 소포 (그림 4D, 왼쪽)을 생성 하지 않습니다. 이 높은 [K+] 도발은 힘입어 대량 endocytosis 더 강렬한 수요 동안 SV 인구를 유지 됩니다 나왔다.

FM1-43 photoconversion 휴식 bouton (그림 4)를 기준으로 열 대권 외의 시 냅 스를 비교 하 고 [K+] 염 분 도발은 또는 흡입 전극 모터 신경의 전기 자극을 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 높은 [K+] 자극, 개별 SVs와 확대 소포를 depolarizing (>100 nm 직경에서)는 전자 밀도 DAB 촉진 다음 빛 기반 photoconversion (그림 4C, 오른쪽)와 함께 표시 될 수 있습니다. 알 수 없는 이유로 확대 소포 막 작은 SV 막 보다 덜 조밀 하 게 레이블이 지정 된 일반적으로 이다. 또한, SVs는 종종 소량 침전으로 가득 표시 보다는 그냥 막, 하지만이 그들 훨씬 쉽게 레이블 없는 소포에서 구별 하는 것. 모터 신경의 흡입 전극 자극, 자전거 SV 인구 또한 레이블이 SVs (그림 4D, 오른쪽)을 기준으로 표시할 수 있습니다. 전기 자극으로 소포를 확대 (>100 nm 직경에서) 탐지에 boutons, 일관 되 게,는 추정의 막을 형성 하지 endosomes FM1-43 photoconversion에 의해 레이블이 있습니다. 로 위의 자전거 SVs 일반적으로 채워집니다 다소 all-or-none 패션, 촉진 하 고 그러므로 더 쉽게 구별 하지 자극 (그림 4D, 오른쪽) 동안 형성 된 SVs 덩어리. 우리 아직 photoconversion ChR2 자극에 따라 시도 하지 했습니다. 자극의 다른 시간 코스, FM1 43 염료 photoconversion SVs 형성 된다, SVs는 인신 매매 방법 및 시 냅 시스 bouton 다른 공간 풀 사이의 움직임의 타이밍을 결정 한 수 있습니다. [K+] 높고 신경 자극의 비교 대량 및 단일 SV endocytosis 메커니즘의 해 부를 수 있습니다.

Figure 1
그림 1: 순서도 FM1 43 염료 초파리 NMJ에 프로토콜을 로드. 애벌레 접착제 해 부 평평된 neuromusculature 준비, 복 부 신경 코드 (VNC)는 hemisegmentally 복 부 정중 선 (Vm)에서 단편 신경이 투영 체 벽 반복 배열 근육 (단계 a). VNC는 무료, 고 전체 애벌레 해 부 다음 자극 (b 단계)에 대 한 준비에 분홍색 FM1 43 솔루션 (4 µ M)에서 알을 품. FM1 43 선택한 자극 패러다임 (3 단계); 로드 전체 유 충 (cI)의 높은 [K+] 도발은 옵션 (cII), 단일 모터 신경의 전극 자극 또는 빛 기반 활성화 타겟이 channelrhodopsin (cIII)의 흡입. FM1 43 법인 캘리포니아2 +를 사용 하 여 체포-무료 식 염 수와 염료 로드 NMJ 군데 (d 단계). 두 번째 자극 염색 시 냅 스 소포 exocytosis (e 단계)를 욕조에 FM1 43 없이 다음 이루어집니다. 동일한 NMJ는 무부하 시 냅 스 터미널 (단계 f) 분석 결과를 다시 몇 군데 다음. 형광 강도 SV endocytosis 및 exocytosis 수준 SV 척도를 로드 및 언로드된 NMJs에서 측정 됩니다. 하단 패널 건설 매개 변수 및 이러한 연구에 사용 되는 투명 한 아크릴 챔버에 대 한 치수를 보여 줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: FM 염색 모든 자극 방법의 로드 및 언로드 비교. FM1-43의 비교 로딩 염색 및 모터 신경 (중간)의 전극 전기 자극의 전체 애벌레 준비 (위), 1)이 [K+] 도발은와 방황 3 탈피 NMJ에에서 내리기 2) 흡입 3) 빛 주도 모터 신경 (아래)에 대상으로 channelrhodopsin (ChR2)의 활성화. 안티와 함께 표시 (A)는 애벌레 NMJ-HRP:647 연 접 막 마커 (파란색, 왼쪽), 5 분 (중간)에 대 한 높은 [K+] 도발은 통해 FM1 43 함께 로드 하 고 다음 2 분 (B)에 대 한 높은 [K+] 도발은 통해 언로드 로드 및 언로드 두 FM1 43 염료에 대 한 동일한 자극 기간으로 흡입 전극 전기 신경 자극과 비교. (C) vglut대상-Gal4>파란색으로 활성화 하는 모터 신경에 있는 UAS-ChR2-H134R 식 (470 nm) 로드 및 언로드 FM1 43 염료의 동일한 자극 동안 빛. 별표는 인세트 높은 배율 boutons 표시를 참조 하십시오. 눈금 막대는 10 µ m 삽입 시 냅 스 boutons와 주요 패널에서 3.5 X 확대. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: Notum null 돌연변이 시 냅 스 boutons에 로드 하는 감소 된 FM 염료를 보여줍니다. FM1-43 방황의 시 냅 스 터미널에 로드 Notum null 돌연변이 (Notum코)를 3 탈피 하 NMJ 유전자 제어 (w1118) 비교. (A) NMJ boutons 전체 애벌레 준비 (맨 위)의 높은 [K+] 도발은 또는 w1118 (왼쪽)와 Notum코 (오른쪽)에 1 개의 모터 신경 (아래)의 흡입 전극 자극. (B) Quantified 로드 높은 [K+] 도발은 Notum코 돌연변이 대 w1118 컨트롤에 흡입 전극 자극을 비교 하는 점도로 NMJ 당 FM1 43 형광. (C) Quantified 로드 형광 bouton 당 bouton 기준으로 높은 [K+] 도발은 흡입 전극 자극 Notum코 대 w1118 컨트롤에서 비교 상자와 수염 음모 . 학생의 두 꼬리 t-테스트는 p-값이 그래프에 표시 된 각 비교 수행 했다. 막대는 프리즘 (윈도우용 버전 7.0)로 만든 평균 ± SEM 표시 됩니다. 전기 자극 데이터 Kopke 외허가 적응 되었습니다., 개발 144 (19): 3499-510, 2017. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4: 시 냅 스 열 대권 외의 소포를 FM 염료 photoconversion와. 형광 FM1-43 전송 전자 현미경 (TEM)을 통해 시각화를 위한 산화 diaminobenzidine (DAB) 전자 조밀한 침전을 photoconverted 수 있습니다. (A) A. 을 로드 하는 활동-종속 FM1 43 염료 다음 초파리 NMJ를 photoconversion 방법의 회로도 나머지 (unstimulated)에서 wildtype 시 냅 시스 bouton의 (B) 대표 TEM 이미지. 유니폼 사이즈 SVs. (C) 시 냅 스 boutons photoconversion (왼쪽) 없이 5 분에 대 한 높은 [K+] 염 분 도발은 또는 FM1-43 photoconversion (오른쪽) 자극 된의 인구 밀도 note 참고 대량 endosomal 구조의 존재 표시 및 레이블 없음. (D) 시 냅 스 boutons 전기에 신경으로 자극 없는 photoconversion (왼쪽) 또는 FM1-43 photoconversion (오른쪽) 5 분 동안 20 Hz에서 전극 흡입. 참고 염료 로드 소포 인접 언로드된 소포 보다 훨씬 어두운 나타납니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

높은 [K+] 염 분 depolarizing 자극은 훨씬 활동 종속 FM 염료 사이클링, 하지만 가능성이 적어도 생리29에 대 한 세 가지 옵션의 쉬운. 이 간단한 방법은 모든 액세스할 수 셀 전체 동물에 depolarizes 하 고 그래서 감독된 연구를 허용 하지 않습니다. 로컬로 micropipette와 높은 [K+] 염 분을 적용 하는 것만이 여전히 사전/postsynaptic 세포와 시 냅 스 연결 가능성이 명과1depolarize 것입니다. 또 다른 주요 관심사는 그 높은 [K+] 도발은 드라이브 빠른 형성의 대량 endosomes 거의 unstimulated boutons에서 볼 수 있습니다. 그러나, 대량 endosome 형성 변이29, 진짜 생리 적인 과정을 나타내는 의해 차단 하는 활성 메커니즘입니다. 따라서, 높은 [K+] 도발은와 FM1 43 이미징 선택적으로 시 냅 스에서 대량 endocytosis 공부를 사용할 수 있습니다. 흡입 전극 모터 신경의 전기 자극은 훨씬 더 많은 제어 방법입니다. 그것은 하나의 축 삭 번들만 자극 하 고 연 접 테르미니 직접 depolarized 장점이 (물론, 근육 섬유는 다음 depolarized 송신기 행동에 의해). 그것은 그러므로 자극 하지 같은 동물에 NMJs의 훌륭한 내부 통제를 제공 한다. 이 메서드는 엄격 하 게 제어 전기 생리학 기록4와 직접 비교를 사용 하는 높은 [K+] 자극 메서드와 달리 자극 매개 변수 하나를 수 있습니다. 그러나,이 기술은 특수 장비와 기술, 상당히 높은 수준의 요구 이며 따라서 액세스. 타겟된 channelrhodopsin (ChR2)의 빛 기반 활성화 선택 뉴런30를 표적으로 하기의 이점이 있다. 이 방법은 전기 생리학 방법 가진 아무 친밀도 요구 하 고 어떤 실험실에서 매우 저렴 한 장비와 함께 할 수 있습니다 하지만이 방법은 기본적인 익숙하다고 초파리 유전학 않아도.

자극 매개 변수 선택은 SV 사이클 역학 높은 변수 고기1유전 조건의 범위 내에서 쿼리 테스트를 위해 매우 중요 하다. 모든 방법에 대 한 외부 [캘리포니아2 +] 사용 SV의 원동력을 제어 키 매개 변수는 사이클링. 높은 [K+] 자극 방법으로 중요 한 선택은 [K+] 사용는 도발은 힘의 정도 결정 합니다. Drosophila haemolymph의 측정 [K+] 5mm, 나타내고 90mm는 일반적으로 가장 자주 활동 자극3,7,,1517 선택 농도 , 그러나 31., 30-90 m m에서 [K+] 범위는 자극 강도5,,1632를 고용 되었습니다. 또 다른 중요 한 매개 변수 결정 두 FM1 43 로드 및 언로드에 대 한 높은 [K+] 자극의 길이입니다. 로드에 대 한 기간 전체 자전거 SV 인구는 효과적으로 로드 여부, 또는 활성 소포7의 하위 집합을 결정 합니다. 마찬가지로 공개 하거나 애매 한 돌연변이 고기 비율에 의존 수 있는 SVs exocytosis 자극 기간에 진행의 백분율 변화 사이클링 주파수2SV 지시 내리기 위한 기간. 흡입 전극 전기 모터 신경 자극, 매개 변수 선택 포함 또한 자극 전압, 주파수, 기간 및 펄스 간격. 일시적으로 꽃무늬 활동 SV 역학7, 자전거의 핵심 결정 이며 다른 자극 패턴 선택적으로 고유한 SV 풀을 동원 수 있습니다. 타겟 라이트 기반 ChR2 정품 인증 선택 (빛의 강도 변수)와 위의 모든 등 추가 유전자 변형 옵션에서 설명한 다음 섹션. 이러한 매개 변수를 선택 더 많은 실험 제어 뿐만 아니라 증가 기술 복잡성 온다.

Channelrhodopsin-2 (ChR2)는 빛 문이 막 채널 모노-및 divalent 양이온33침투성. ChR2 자극을 선택 하는 경우 Gal4 드라이버, UAS-ChR2 구성 및 채널 활성화를 위한 광원 변수를 포함 하 여 만들어질 많은 선택이 있다. 매우 특정 하에서 유비 쿼터 스 Gal4 드라이버 다양 합니다. 예를 들어, 유비 쿼터 스 UH1 Gal4 (daughterless) CcapR-Gal4 (Janelia) 근육에 ChR2를 드라이브 하는 반면 모든 셀에 ChR2를 표현 것 6/7 NMJ 그러나 하지 근육 4 NMJ31,34. 이 선택도 강력한 내부 통제로 사용할 수 있습니다. 마찬가지로 많은 UAS-ChR2 변종, ChR2-H134R (여기에 사용된, 돌연변이 잔류물 원인 증가 photocurrents)35, VChR1, 최고와 많은 더 많은36를 포함 하 여 있다. 이 채널 이체의 각각 게이팅, 전도도, 이온 선택도, 속도 론 및 둔감 빛의 고유 속성이 있습니다. 일부 구문을 포함 FM 이미징 방해할 수 있는 형광 태그 note. MCherry는 UAS-ChR2-H134R 여기 사용 예를 들어 태그입니다 (예: 587 nm, em: 610 nm), FM1-43 detectible 방출 생성 하지 않습니다 하지만 (예: 479 nm, em: 598 nm) 필터 이미징. 기술적인 매개 변수 선택에는 광원, 파장 및 강도 채널 활성화에 대 한 포함 됩니다. 여기에 사용 되는 옵션은 자극 시 금 근육 수축에 의해 시각적으로 확인 하는 저렴 한 블루 발광 LED. 우리는 또한 ChR2를 활성화에 성공 confocal 레이저 스캐닝은 충분 한 epifluorescence를 사용 하 여. Epifluorescence 대상된 자극 (전체 동물 대신 특정 세그먼트)에 사용 될 수 있지만 자극 매개 변수, 제어 하기 어려운 반면 기간 및 빛의 주파수를 변경 하는 간단한 자극까지 쉽게 연결 하는 LED 펄스입니다. 해 부 현미경 카메라 포트를 통해 LED 빛을 초점 더 많은 제어, 강렬한 빛 자극 수 있습니다.

그것은 복 부 신경 코드/뇌 자극 패러다임 동안 그대로 여부를 결정 하는 실험입니다. 우리는 여기, 사용 하는 세 가지 방법의 비교에 대 한 전체 중앙 신 경계를 제거 하기로 하지만 때로는 업스트림 배선 그대로15왼쪽. 합병증은 신 경계 전체 왼쪽 때마다 발생 하는 내 인 성 신경 활동. 이 활동의 정도 동물, 해 부 전문은 실험의 큰 정도에 의존 하는 동물에서 높은 변수. 이 변수 활동이 아니다 그러므로 전적으로 인해 고용 exogenous 자극15FM1 43 염료 로드 되 고, 그 금액에 기여할 수 있다. 관련된 기술적인 합병증은 그대로 해 부 애벌레 계약 움직이다 운동, 근육이이 변위 NMJ 이미징 크게 방해. 이 운동은 중앙 신 경계를 제거 하 고 또한 캘리포니아2 +의 응용 프로그램을 통해 완화는-4이미징 동안 무료 염 분. 여기에 사용 된 이러한 접근은 NMJ 준비에서 이미징 우수한 FM1 43 염료를 설정 하기에 충분. 그러나, 일부 경험 (예: ryanodine, philanthotoxin-433), 근육 수축 억제 또는 활동 전위 차단제 (예, 테트로도톡신)37,38을 사용 하는 약물을 추가 하기로 결정 했다. 약물의 범위는 SV 사이클의 특정 단계를 강조 하거나 돌연변이 고기 neurotransmission 메커니즘을 검사 하기 위해 선택적으로 조작에 사용할 수 있습니다. 예를 들어 일부 경험 고용 (활성화 전압-문이 나+ 채널39) Veratridine SV SV endocytosis를 향상 시키기 위해 보유 수영장 Cyclosporin A (Calcineurin 활동40억제)에서 로드를 증가 하 고 산림 (adenylyl 있고41, 시 냅 스 전송42향상 활성화)는 엑 소/엔도 자전거 풀7,43,44증가. 이러한 약리 조작 추가 통찰력을 제공할 수 있습니다. 마지막으로, FM1 43 배경 정도의 절 개, 세척 효과 자극 프로토콜의 품질에 따라 발생할 수 있습니다. 일부 추가 β-cyclodextrin Advasep-745또는 수성 fluorophore sulforhodamine46일반적인 형광 담금질 하 여 신호 대 배경 비율 개선의 sulfobutylated 파생 합니다.

SV 주기 (예, 전기 생리학, synaptopHluorin, 전자 현미경 검사 법)의 더 이해 FM 형광 이미징 동행 수 있는 수많은 기술이 있다. 여기에 FM 형광 photoconversion SV를 조사 하는 데 사용 되는 표시 예 ultrastructural 세부 주기. SVs는 공간적, 기능적으로 명료한2의 여러 가지 풀으로 구성 됩니다. 쉽게 releasable 수영장 (RRP) 급성 자극에 즉시 공개 하는 소포를 포함 합니다. 더 큰 재활용 수영장 SV 릴리스 적당 한 활동의 조건 하에서 유지합니다. 내부 보유 수영장 (RP)는 (겉보기 근처 생리) 강한 자극2만 채용 된다. SV 풀을 활성화 자극 사용47의 유형에 따라 그리고 FM photoconversion를 사용 하 여 초파리 NMJ에서 보고서는 이러한 다른 SV 풀48의 공간 속성과 기능에 중요 한 통찰력. FM photoconversion SV 풀 다른 자극 패러다임, 그리고 긴 논의 밀매 상호 작용 endosomes SVs49쿼리 질문에서 활성화 연구를 사용할 수 있습니다. 실험 시 냅 스에서 다른 활동-종속 변경 함께에서 FM 영상에 관심이 있다면, 거기는 FM1 43 염료 (FM1-43FX)의 보도의 하면 고칠 수 아날로그 이다. 이 조사 해야 하나 활동-종속 염료 로드, 후 초파리 NMJ를 해결 하기 위해 허용 하 고 다음 항 체 라벨 bouton 활동 수준 (FM 염료 형광) 및 활동-종속 표현 사이의 상관 관계에 대 한 테스트와 함께 후속를 관심의 단백질입니다. 미래에, 그것은 매우 보람이 있을 FM 염료의 조합 수 있도록 추가 방법을 아름 다운 초파리 NMJ 모델 시 냅 스에서 다른 이미징 접근 이미징.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

저자 아무 경쟁 관심사를 선언합니다.

Acknowledgments

우리는이 문서에 기여에 대 한 Broadie 연구소 회원을 감사합니다. 이 작품 NIH R01s MH096832 및 MH084989 K.B.에 의해 지원 되었다 고 NIH predoctoral 친목 F31 MH111144 D.L.K.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SylGard 184 Silicone Elastomer Kit Fisher Scientific NC9644388 To put on cover glass for dissections
Microscope Cover Glass 22x22-1 Fisherbrand 12-542-B To put SylGard on for dissections
Aluminum Top Hot Plate Type 2200 Thermolyne HPA2235M To cure the SylGard
Plexi glass dissection chamber N/A N/A Handmade
Borosilicate Glass Capillaries WPI 1B100F-4 To make suction and glue micropipettes
Laser-Based Micropipette Puller Sutter Instrument P-2000 To make suction and glue micropipettes
Tygon E-3603 Laboratory Tubing Component Supply Co. TET-031A For mouth and suction pipette
P2 pipette tip USA Scientific 1111-3700 For mouth pipette
0.6-mL Eppendorf tube cap Fisher Scientific 05-408-120 Used to put glue in for dissection
Vetbond 3M WPI vetbond Glue used for dissections
Potassium Chloride Fisher Scientific P-217 Forsaline
Sodium Chloride Millipore Sigma S5886 For saline
Magnesium Chloride Fisher Scientific M35-500 For saline
Calcium Chloride Dihydrate Millipore Sigma C7902 For saline
Sucrose Fisher Scientific S5-3 For saline
HEPES Millipore Sigma H3375 For saline
HRP:Alexa Fluor 647 Jackson ImmunoResearch 123-605-021 To label neuronal membranes
Paintbrush Winsor & Newton 94376864793 To manipulate the larvae
Dumont Dumostar Tweezers #5 WPI 500233 Used during dissection
7 cm McPherson-Vannas Microscissors (blades 3 mm) WPI 14177 Used during dissection 
FM1-43 Fisher Scientific T35356 Fluorescent styryl dye
Digital Timer VWR 62344-641 For timing FM dye load/unload 
LSM 510 META laser-scanning confocal microscope Zeiss For imaging the fluorescent markers
Zen 2009 SP2 version 6.0 Zeiss Software for imaging on confocal
HeNe 633nm laser Lasos To excite HRP:647 during imaging
Argon 488nm laser Lasos To excite the FM dye during imaging
Micro-Forge WPI MF200 To fire polish glass micropipettes
20mL Syringe Slip Tip BD 301625 To suck up the axon for electrical stimulation.
Micro Manipulator (magnetic base) Narishige MMN-9 To control the suction electrode for electrical stimulation
Stimulator Grass S48 To control the LED and electrical stimulation
Zeiss Axioskop Microscope Zeiss Used during electrical stimulation.
40X Achroplan Water Immersion Objective Zeiss Used during electrical stimulation and confocal imaging
All-trans Retinal Millipore Sigma R2500 Essential co-factor for ChR2
Zeiss Stemi Microscope with camera port Zeiss 2000-C Used during channelrhodopsin stimulation
LED 470nm ThorLabs M470L2 Used for ChR activation
T-Cube LED Driver ThorLabs LEDD1B To control the LED
LED Power Supply Cincon Electronics Co. TR15RA150 To power the LED
Optical Power and Energy Meter ThorLabs PM100D To measure LED intensity

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Menon, K. P., Carrillo, R. A., Zinn, K. Development and plasticity of the Drosophila larval neuromuscular junction. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 647-670 (2013).
  2. Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Synaptic vesicle pools. Nat Rev Neurosci. 6 (1), 57-69 (2005).
  3. Long, A. A., et al. Presynaptic calcium channel localization and calcium-dependent synaptic vesicle exocytosis regulated by the Fuseless protein. J Neurosci. 28 (14), 3668-3682 (2008).
  4. Kopke, D. L., Lima, S. C., Alexandre, C., Broadie, K. Notum coordinates synapse development via extracellular regulation of Wingless trans-synaptic signaling. Development. 144 (19), 3499-3510 (2017).
  5. Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. J Neurosci. 12 (2), 363-375 (1992).
  6. Richards, D. A., Bai, J., Chapman, E. R. Two modes of exocytosis at hippocampal synapses revealed by rate of FM1-43 efflux from individual vesicles. J Cell Biol. 168 (6), 929-939 (2005).
  7. Verstreken, P., Ohyama, T., Bellen, H. J. FM 1-43 labeling of synaptic vesicle pools at the drosophila neuromuscular junction. Methods Mol Biol. 440, 349-369 (2008).
  8. Dickman, D. K., Horne, J. A., Meinertzhagen, I. A., Schwarz, T. L. A Slowed Classical Pathway Rather Than Kiss-and-Run Mediates Endocytosis at Synapses Lacking Synaptojanin and Endophilin. Cell. 123 (3), 521-533 (2005).
  9. Verstreken, P., et al. Endophilin Mutations Block Clathrin-Mediated Endocytosis but Not Neurotransmitter Release. Cell. 109 (1), 101-112 (2002).
  10. Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J. -Y., Goodman, K. M., Harata, N. C. Examination of synaptic vesicle recycling using FM dyes during evoked, spontaneous, and miniature synaptic activities. J Vis Exp. (85), (2014).
  11. Sandell, J. H., Masland, R. H. Photoconversion of some fluorescent markers to a diaminobenzidine product. J Histochem Cytochem. 36 (5), 555-559 (1988).
  12. Opazo, F., Rizzoli, S. O. Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes. J Vis Exp. (36), e1790 (2010).
  13. Sabeva, N. S., Bykhovskaia, M. FM1-43 Photoconversion and Electron Microscopy Analysis at the Drosophila Neuromuscular Junction. Bio-protocol. 7 (17), (2017).
  14. Sabeva, N., Cho, R. W., Vasin, A., Gonzalez, A., Littleton, J. T., Bykhovskaia, M. Complexin Mutants Reveal Partial Segregation between Recycling Pathways That Drive Evoked and Spontaneous Neurotransmission. J Neurosci. 37 (2), 383-396 (2017).
  15. Ryan, T. A., Reuter, H., Wendland, B., Schweizer, F. E., Tsien, R. W., Smith, S. J. The kinetics of synaptic vesicle recycling measured at single presynaptic boutons. Neuron. 11 (4), 713-724 (1993).
  16. Ramaswami, M., Krishnan, K. S., Kelly, R. B. Intermediates in synaptic vesicle recycling revealed by optical imaging of Drosophila neuromuscular junctions. Neuron. 13 (2), 363-375 (1994).
  17. Trotta, N., Rodesch, C. K., Fergestad, T., Broadie, K. Cellular bases of activity-dependent paralysis in Drosophila stress-sensitive mutants. J Neurobiol. 60 (3), 328-347 (2004).
  18. Long, A. A., et al. The nonsense-mediated decay pathway maintains synapse architecture and synaptic vesicle cycle efficacy. J Cell Sci. 123 (Pt 19), 3303-3315 (2010).
  19. Parkinson, W., Dear, M. L., Rushton, E., Broadie, K. N-glycosylation requirements in neuromuscular synaptogenesis. Development. 140 (24), 4970-4981 (2013).
  20. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), (1993).
  21. Jan, L. Y., Jan, Y. N. Antibodies to horseradish peroxidase as specific neuronal markers in Drosophila and in grasshopper embryos. Proc Natl Acad Sci. 79 (8), (1982).
  22. Paschinger, K., Rendić, D., Wilson, I. B. H. Revealing the anti-HRP epitope in Drosophila and Caenorhabditis. Glycoconj J. 26 (3), 385-395 (2009).
  23. Ramachandran, P., Budnik, V. Fm1-43 labeling of Drosophila larval neuromuscular junctions. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (8), (2010).
  24. Yawo, H., Kandori, H., Koizumi, A. Optogenetics: light-sensing proteins and their applications. , (2015).
  25. Pulver, S. R., Pashkovski, S. L., Hornstein, N. J., Garrity, P. A., Griffith, L. C. Temporal dynamics of neuronal activation by Channelrhodopsin-2 and TRPA1 determine behavioral output in Drosophila larvae. J Neurophysiol. 101 (6), 3075-3088 (2009).
  26. Hornstein, N. J., Pulver, S. R., Griffith, L. C. Channelrhodopsin2 Mediated Stimulation of Synaptic Potentials at Drosophila Neuromuscular Junctions. J Vis Exp. (25), e1133 (2009).
  27. Britt, J. P., McDevitt, R. A., Bonci, A. Use of channelrhodopsin for activation of CNS neurons. Curr Protoc Neurosci. , Chapter 2, Unit 2.16 (2012).
  28. Lin, J. Y. A user's guide to channelrhodopsin variants: features, limitations and future developments. Exp Physiol. 96 (1), 19-25 (2011).
  29. Vijayakrishnan, N., Woodruff, E. A., Broadie, K. Rolling blackout is required for bulk endocytosis in non-neuronal cells and neuronal synapses. J Cell Sci. 122, 114-125 (2009).
  30. Honjo, K., Hwang, R. Y., Tracey, W. D. Optogenetic manipulation of neural circuits and behavior in Drosophila larvae. Nat Protoc. 7 (8), 1470-1478 (2012).
  31. Dear, M. L., Shilts, J., Broadie, K. Neuronal activity drives FMRP- and HSPG-dependent matrix metalloproteinase function required for rapid synaptogenesis. Sci Signal. 10 (504), (2017).
  32. Baldwin, M. L., Rostas, J. A. P., Sim, A. T. R. Two modes of exocytosis from synaptosomes are differentially regulated by protein phosphatase types 2A and 2B. J Neurochem. 85 (5), 1190-1199 (2003).
  33. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 13940-13945 (2003).
  34. Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9715-9720 (2008).
  35. Nagel, G., Brauner, M., Liewald, J. F., Adeishvili, N., Bamberg, E., Gottschalk, A. Light Activation of Channelrhodopsin-2 in Excitable Cells of Caenorhabditis elegans Triggers Rapid Behavioral Responses. Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).
  36. Lin, J. Y. A user's guide to channelrhodopsin variants: features, limitations and future developments. Exp Physiol. 96 (1), 19-25 (2011).
  37. Sullivan, K. M., Scott, K., Zuker, C. S., Rubin, G. M. The ryanodine receptor is essential for larval development in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (11), 5942-5947 (2000).
  38. Narahashi, T., Moore, J. W., Scott, W. R. Tetrodotoxin Blockage of Sodium Conductance Increase in Lobster Giant Axons. J Gen Physiol. 47 (5), 965-974 (1964).
  39. Narahashi, T. Chemicals as tools in the study of excitable membranes. Physiol Rev. 54 (4), 813-889 (1974).
  40. Kuromi, H., Yoshihara, M., Kidokoro, Y. An inhibitory role of calcineurin in endocytosis of synaptic vesicles at nerve terminals of Drosophila larvae. Neurosci Res. 27 (2), 101-113 (1997).
  41. Seamon, K. B., Daly, J. W. Forskolin, cyclic AMP and cellular physiology. Trends Pharmacol Sci. 4, 120-123 (1983).
  42. Zhang, D., Kuromi, H., Kidokoro, Y. Synaptic Transmission at the Drosophila Neuromuscular Junction: Effects of Metabotropic Glutamate Receptor Activation. Slow Synaptic Responses Modul. , 260-265 (2000).
  43. Kuromi, H., Kidokoro, Y. The optically determined size of exo/endo cycling vesicle pool correlates with the quantal content at the neuromuscular junction of Drosophila larvae. J Neurosci. 19 (5), 1557-1565 (1999).
  44. Kuromi, H., Kidokoro, Y. Selective Replenishment of Two Vesicle Pools Depends on the Source of Ca2+ at the Drosophila Synapse. Neuron. 35 (2), 333-343 (2002).
  45. Kay, A. R., et al. Imaging Synaptic Activity in Intact Brain and Slices with FM1-43 in C. elegans, Lamprey, and Rat. Neuron. 24 (4), 809-817 (1999).
  46. Pyle, J. L., Kavalali, E. T., Choi, S., Tsien, R. W. Visualization of Synaptic Activity in Hippocampal Slices with FM1-43 Enabled by Fluorescence Quenching. Neuron. 24 (4), 803-808 (1999).
  47. Denker, A., Rizzoli, S. O. Synaptic vesicle pools: an update. Front Synaptic Neurosci. 2, 135 (2010).
  48. Denker, A., Kröhnert, K., Rizzoli, S. O. Revisiting synaptic vesicle pool localization in the Drosophila neuromuscular junction. J Physiol. 587 (12), 2919-2926 (2009).
  49. Wucherpfennig, T., Wilsch-Bräuninger, M., Gonz ález-Gait án, M. Role of Drosophila Rab5 during endosomal trafficking at the synapse and evoked neurotransmitter release. J Cell Biol. 161 (3), 609-624 (2003).

Tags

신경 과학 문제 135 초파리 신경 근육 학 교차로 FM1-43 전기 생리학 photoconversion 전송 전자 현미경 검사 법
시 냅 스에서 사이클링 하는 FM 염료: 높은 칼륨 도발은, 전기 및 Channelrhodopsin 자극을 비교
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kopke, D. L., Broadie, K. FM Dye… More

Kopke, D. L., Broadie, K. FM Dye Cycling at the Synapse: Comparing High Potassium Depolarization, Electrical and Channelrhodopsin Stimulation. J. Vis. Exp. (135), e57765, doi:10.3791/57765 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter