Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

זיהוי סמנים התקפה אלימה של Mycobacterium abscessus עבור שכפול תאיים ב Phagocytes

Published: September 27, 2018 doi: 10.3791/57766
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 2, 1, 1
12I, UVSQ, INSERM UMR1173, Université Paris-Saclay, 2Institut Pasteur, Unité de Pathogénomique Mycobactérienne
* These authors contributed equally

Summary

להלן מוצגים שני פרוטוקולים ללמוד אינטראקציות פגוציט -Mycobacterium abscessus : הקרנת transposon מוטציה ספריה עבור לקוי תאיים חיידקי וגם הקביעה של חיידקי תאיים transcriptome מ- RNA . רצף. שתי הגישות לספק תובנות יתרונות גנומית ועיבודים transcriptomic שיפור כושר חיידקים תאיים.

Abstract

מה מבדיל בין Mycobacterium abscessus מן mycobacteria saprophytic אחרות הוא היכולת להתנגד phagocytosis על ידי מקרופאגים האדם את היכולת להתרבות בתוך תאים כאלה. התכונות הללו התקפה אלימה לבלתי abscessus מ פתוגניים, במיוחד אצל המארחים פגיע עם מחלת ריאות המבנית הבסיסית, כגון סיסטיק פיברוזיס, ברונכיאקטזיס או שחפת. כמה חולים להידבק מ abscessus עדיין לא ברור. בניגוד mycobacteria רבים, מ abscessus לא נמצא בסביבה, אבל שעשויים לשכון בתוך amoebae, phagocytes סביבתיים המייצגים מאגר פוטנציאלי עבור abscessus מ'. אכן, abscessus מ עמיד amoebal phagocytosis ונראה החיים אינטרה-אמבה להגדיל התקפה אלימה abscessus מ במודל ניסיוני של זיהום. עם זאת, מעט מאוד ידוע על התקפה אלימה מ abscessus בפני עצמו. כדי לפענח את הגנים הענקת יתרון לחיים תאיים מ' abscessus , פותחה הקרנה של ספריית מוטנטים של transposon מ abscessus . במקביל, פותחה שיטה של RNA מן Mycobacteria תאיים החילוץ לאחר תרבות משותפת עם amoebae. שיטה זו היה מאומת והתירו את הרצף של כל מ abscessus transcriptomes בתוך התאים; מתן, בפעם הראשונה, תצוגה גלובלית על abscessus מ הסתגלות לחיים תאיים. שתי הגישות לתת לנו תובנה הגורמים התקפה אלימה מ abscessus המאפשרים abscessus מ ליישב את דרכי הנשימה אצל בני אדם.

Introduction

הסוג Mycobacterium כוללת מינים ועד אורגניזמים מזיקים saprophytic פתוגנים אנושי הגדולות. זנים פתוגניים ידועים כגון שחפת Mycobacterium, התחממות עולמית Mycobacterium ulcerans שייך קבוצת המשנה של הגדלים לאט mycobacteria (SGM). לעומת זאת, קבוצת המשנה של בצמיחה מהירה mycobacteria (RGM) מאופיין על ידי יכולתם להקים מושבות גלוי פחות מ 7 ימים באמצעי אגר. הקבוצה RGM כוללת יותר מ-180 מינים, בעיקר פתוגניים שאינם mycobacteria saprophytic. מחקרים על אינטראקציות RGM עם מארחיהם התמקדו בעיקר Mycobacterium smegmatis ומדגימים כי mycobacteria האלה מסולקות במהירות על-ידי הפעולה אחרים של מקרופאגים.

Mycobacterium abscessus הוא אחד RGM נדיר כי הם פתוגניים לבני והוא אחראי על מגוון רחב של זיהומים בעור, זיהומים רקמות רכות ועד דלקות ריאות, המופץ. מ abscessus הוא נחשב, יחד עם Mycobacterium avium, המחלה mycobacterial הראשי חולי סיסטיק פיברוזיס1.

מחקרים שונים שבוצעו במ abscessus מציינים כי mycobacterium הזה מתנהג כמו הפתוגן תאיים, מסוגלת לשרוד את התגובה אחרים של מקרופאגים ו fibroblasts הריאות, העור, אשר לא נצפית בדרך כלל ב- RGM 2 , 3 , 4. ניתוח הגנום מ abscessus זיהה משעולים חילוף החומרים הנמצאים בדרך כלל מיקרואורגניזמים סביבתיים במגע עם הקרקע, הצמחים וסביבות הימית, איפה amoebae חינם לעתים קרובות להציג5. הם הוכיחו abscessus מ' ניחן מספר גנים התקפה אלימה לא למצוא את RGM saprophytic ואת פתוגניים שאינם, כנראה נרכשה על ידי העברה גנטית אופקית שנישה חיובית ל- exchange גנטי עשויה לאסוף חיידקים עמידים אמבה שונים.

השפעול, אחת התוצאות הבולט הראשון היה התבוננות צמיחה תאיים של מ abscessus ב מקרופאגים כמו גם באשר מ. שחפת6. מ abscessus מתנגד גם לחומצי phagosome, אפופטוזיס, autophagy, שלושה מנגנונים חיוניים של המחתרת הסלולר זיהום2. אפילו הוכח כי מ abscessus הוא מסוגל ליצור תקשורת מיידית בין phagosome את ציטוזול, סביבה יותר עשירות אולי טובה כפל חיידקים2. מעט מאוד ידוע על היתרונות גנומית מ abscessus הנו או רכשה כדי לאפשר הישרדות בסביבה תאיים. אמבה coculture היא שיטה יעילה אשר איפשר את ניתוקה של חיידקים עמידים אמבה חדשים רבים כמו Mycobacterium massiliense7,8. יכולת להתרבות בתוך amoebae נצפתה, במודל של חשוד מ abscessus בעכברים, אשר ניתן להתייעץ על התקפה אלימה גדל מ abscessus4. אחת ההשערות היא כי abscessus מ פותחו תכונות גנטיות נתקל בתוך סביבה זו כדי לשרוד בתאים phagocytic, אשר שונים אחרים RGM פתוגניים שאינם. רכישות אלה אולי טובה היכולת, התקפה שלה אלימה במארח אנושי.

הדו ח מתאר כלים ושיטות כדי להדגיש את היתרונות גנומית הוענקו ל מ abscessus כדי לשרוד בסביבת amoebae. למטרה זו, ההקרנה של מוטציות transposon מ abscessus הוא תיאר לראשונה, על המתח מסוג Acanthamoeba castellanii , אשר מאפשר הזיהוי תקינה של מוטציות לצמיחה תאיים. הקרנה שנייה מקרופאגים הוא גם דיווח, כדי לוודא אם הפגם הזה נמשכת ב לארח אדם. שנית, כדי להבין אילו מנגנונים הם רתמו ב abscessus מ להסתגל לחיים phagocytic תאים ולהגדיל התקפה שלה אלימה במארח בבעלי חיים, שיטת מותאם מ abscessus היה פיתחה, לאחר תרבות משותפת בנוכחות amoebae שמותר החילוץ של RNA הכולל מחיידקים אינטרה-amoebal. כתוצאה מכך, פותחה תצוגה מקיפה של גנים abscessus מ הנדרשים עבור חיים תאיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ספריית ההקרנה

  1. הקמת ספריית מוטנטים Tn
    1. להשיג את ספריית transposon.
      הערה: עבור ניסוי זה, ספריית מוטנטים transposon ממנו הושג אי. ג'יי רובין, הרווארד בית הספר לבריאות הציבור, בוסטון, ארה ב. הספרייה נבנה זן קליניים חלקה (43S) של מ' abscessus מורכבים (מ abscessus subsp. massiliense) עם phagemid מוחדרים מ abscessus ומאפשר החדרת יחיד Tn אקראי אל dinucleotide TA (91,240 TA רצפי הגנום מ abscessus ). לפרטים נוספים ראה הפניה של רובין. et al. 9 ו. Laencina et al. 10.
  2. טיטור של הספרייה, שימור המוטציות abscessusTn מ בצלחות
    הערה: זה לוקח שבוע אחד.
    1. להפשיר את הספריה על הקרח. לקבוע ריכוז חיידקים על ידי ביצוע דילולים סדרתי ב- 1 מ ל מים (10-1 כדי 10-15). צלחת טיפה של כל דילול על צלחת פטרי המכילות בינוני אגר 11 7 שעות עם kanamycin 250 מ"ג/מ"ל. דגירה הלוחות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3-4 ימים.
      הערה: כאן, טיטור של חיידקים11 10/mL נמצאו.
    2. לאחר קביעת הריכוז של הספרייה, לדלל את הספריה שיש ריכוז סופי של חיידקים/מ 3,000 ל 10 מ"ל מים-25% גליצרול. Aliquot בספריה. cryotubes 10 מ ל 1 של הספרייה כל שפופרת. לאחסן את aliquots ב-80 מעלות צלזיוס.
    3. כאשר מוכן לשימוש, להפשיר aliquot אחד של הספרייה מדולל על קרח ולהוסיף µL 100 של הספרייה 10 מרובע מולר-הינטון (MH) אגר צלחות (גודל 12 ס מ) להתאושש בין 200 ל 300 מושבות בודדות לאחר 3-4 ימי דגירה ב 37 º C.
    4. עם קיסמים סטרילי, העברת המושבות בודדים (כ-6,000 מושבות ב 60 x 96-ובכן צלחות) 96-ובכן לוחות מלא 200 µL של 7 שעות 9 בינוני בתוספת 0.2% גליצרול, 1% גלוקוז, 250 מ"ג/מ"ל של kanamycin. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 5 ימים מבלי לרעוד.
    5. להעביר 100 µL של התרבות (שלב 1.2.4) צלחת 96-ובכן המכיל 100 µL של 7 שעות 9 בינוני עם 40% גליצרול. חנות הספרייה מסודרת-80 מעלות צלזיוס.
    6. חזור על שלבים 1.2.3. כדי 1.2.5. עם שאר הספרייה עד 10,000 שיבוטים בודדים התאוששו (סביב 100 x 96-ובכן צלחת 30 צלחות MH).
  3. הכנת amoebae
    1. תרבות אמבה Acanthamoeba castellanii (AC) ב- 75 ס מ2 תרביות רקמה מבחנות בטמפרטורת החדר (RT) ב30 מ"ל PYG בינוני (טבלה 1) עבור הגברה של התא קו11.
      הערה: בוגרת trophozoites מתאי דבק גדול עם וקואלות עיכול רבות הם נראים בבירור על מיקרוסקופ. התא הכפלת זמן מוערך להיות ה 25 התאים היו מוגבר כל 3 ימים על ידי הפצת שליש אחד של התרבות הראשונית ב- 75 ס מ2 תרביות רקמה מבחנות.
    2. הסר את המדיום PYG עם פיפטה 25 מ. לשטוף את התאים עם 10 מ ל AC מאגר (טבלה 2), אשר אינו מכיל כל פחמן או חנקן ממקורות12. חזור עוד פעמיים בכביסה.
      הערה: AC מאגר המכיל אין מקורות פחמן או חנקן מונע צמיחת mycobacteria חוץ-תאית. בינונית מזערי זה מוביל encystment של amoebae. כדי להגביל את זה, לא פעיל חום e. coli נוספו כמו מצע (שלב 1.4) amoebae, תרבות קצר מאוד פעמים היו בדרגה (48 h עבור מוטציה הקרנה) ותרבות 4 h או 16 h לניסויים RNAseq. לחלופין, השתמש בינוני אבל מועשר PYG בינונית (בדרך כלל 10%).
    3. ניתוק של אמבה מתחתית הבקבוק עם שייק נמרצת יחיד + בקבוקי שתייה צידניות תרביות רקמה.
    4. ספירת תאים עם hemocytometer כדי להתאים את הריכוז תא ל 5 x 105 amoebae/mL מדולל במאגר AC.
  4. הכנה של חום-לא פעיל Escherichia coli חיידקים להאכיל אמבה לאחר ההדבקה
    1. לגדול המתח קליניים e. coli ולבודד מן מניה גליצרול ב- 100 מ של מרק לוריא (LB) בן לילה ב 37 º C.
    2. לקצור את החיידקים על ידי צנטריפוגה ב x 1,835 g 10 דקות צינורות 50 מ. למחוק את תגובת שיקוע. Resuspend בגדר עם 10 מיליליטר 10% גליצרול-מים. חזור עוד פעמיים את הכביסה.
    3. Resuspend בגדר עם 5 מיליליטר 10% גליצרול-מים. Aliquot 0.5 mL לתוך צינורות 1.5 mL. לקבוע את כמות החיידקים/mL על-ידי ביצוע דילולים טורי והוספת דילולים על פלטות אגר ליברות. לאחסן את aliquots ב-80 מעלות צלזיוס.
    4. יום לפני הזיהום אמבה, להפשיר aliquot אחת על הקרח והמשך חום-הרג מאת המקננת הצינור ב- 70 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות.
      הערה: לבדוק אם איון של ציפוי µL 100 של חיידקים לא מופעל על LB פלטות אגר בן לילה ב 37 º C. אין מושבות צריך להיות גלוי אחרי לילה אחד של תרבות.
    5. לדלל חום-נהרג לחיידקים ריכוז חיידקים 107 ב- 50 µL AC מאגר ולאחסן את החיידקים מדולל ב 4 ° C לשבוע אחד לא יותר.
  5. תרבות משותפת של amoebae -abscessus מ Tn מוטציה: תחילה מסך
    הערה: זה לוקח 3-4 חודשים להקרנה של מוטציות 6,000.
    1. מורחים 5 x 104 amoebae/טוב כדי צלחת 96-ובכן ב- 100 µL AC המאגר. תקופת דגירה של h 1-32 מעלות צלזיוס מבלי לרעוד. אפשר בפעם trophozoïtes אמבה צף לדבוק הבארות.
      1. בזמן המקננת, להפשיר חיידקים על קרח לשעה.
    2. להוסיף 5 µL של התרבויות המופשרים חיידקים עם פיפטה רב-ערוצי אלקטרונית. להדביק על ה 1.5 מסך בסביבות 6,000 שיבוטים בפעוט מהצלחת 96-ובכן Tn מוטציות מניות.
      הערה: למשרד הפנים לא ידוע בשלב זה של הפרוטוקול; עם זאת, כל הלוחות 96-ובכן המכיל Tn מוטציות היו מעובדות בדיוק באותו אופן. זה המסך הראשון שמטרתו לזהות במהירות תאיים מוטציות לקוי, בלי לקחת בחשבון את הווריאציות בצפיפות inoculum.
    3. לאחר ה 1.5 של זיהום, היפוך על הלוחית 96-ובכן פדים סטריליים להציב מגש מתכת סטיריליים להסיר את המדיום AC ברדס fume. מילוי מחדש עם µL 200 AC בינוני. חזור על זה לשטוף עוד פעמיים.
    4. להוסיף 200 µL בינוני טרי בתוספת 100 µg/mL amikacin לחסל הנותרים mycobacteria חוץ-תאית.
    5. תקופת דגירה של שעתיים לפני שתמשיך עם 3 כביסות נוספים (כפי שמתואר בשלב 1.5.3). לאחר הרחצה, לשמור על התרבויות עם 50 amikacin µg/mL, ב- µL 200 AC המאגר.
    6. להוסיף 5 x 107 חום-לא פעיל חיידקים Escherichia coli (מתוך שלב 1.4) בקצה של הזיהום ואת כל 24 שעות כדי למנוע encystment של amoebae.
    7. לאחר 48 שעות של תרבות משותפת, lyse בתאים על-ידי הוספת 10 µL 10% למען חברה דמוקרטית (dodecyl נתרן גופרתי) כל טוב ועל תקופת דגירה של 30 דקות ב- 32 מעלות צלזיוס. להמשיך עם דילול טורי ולהוסיף על פלטות אגר קולומביה המכילים דם כבשים 5% (כי צלחות) כדי להעריך את מספר mycobacteria תאיים. לאטום את הצלחת עם מצלמות-מיקרוסקופים, דגירה ב 37 º C.
    8. כאשר המושבות מופיעים על לוחות אגר אחרי 3-4 ימים, לצלם הצלחת ולזהות המוטציות לקוי לצמיחה תאיים על ידי התבוננות ההפקדות עם המספר הנמוך ביותר של מושבות חיידקים.
      הערה: לא אכפת על צורה, גובה או צפיפות של המושבה (איור 1א'). 136/6000 מוטציות זוהו.
  6. תרבות משותפת של amoebae -מ abscessusTn מוטציה: המסך השני של המוטציות. שזוהו במהלך המסך הראשון
    הערה: זה לוקח 2 שבועות. מסך השני חייב להתבצע עם 136 הקלוש המוטנטים שהושג לאחר המסך הראשון לכמת במדויק את מספר החיידקים מחוסן ואת המספר של הישרדות תאיים חיידקים 2 ימים לאחר הפגיעה.
    1. גדל 1 מושבה של כל מוטציה מושפעים ב 50 מ ל צינורות מלאים 20 מ של 7 שעות 9 בינוני בתוספת 0.2% גליצרול, גלוקוז 1% ו- 250 מ"ג/מ"ל של kanamycin. לאפשר לחיידקים להגיע לשלב מעריכית (0.6 < OD < 0.8).
    2. לשטוף את התרבות על ידי צנטריפוגה (1,835 x g 10 דקות) AC בינוני. למחוק את תגובת שיקוע. חוזר זה לשטוף פעמיים יותר עם 20 מ של 7 שעות 9 בינוני בתוספת 0.2% גליצרול, גלוקוז 1% ו- 250 מ"ג/מ"ל של kanamycin.
    3. Resuspend החיידק ב 5 מ ל AC המאגר.
    4. לקבוע את המושבה ויוצרים יחידה (CFU) ריכוז של המוטציות. ב. ובכן 24 צלחות, להוסיף 1 מ"ל של מים שתי השורות הראשונות. להוסיף 100 µL של חיידקי ההשעיה הבאר הראשונה. עם micropipette, מערבבים שלוש פעמים. לאחר מכן, תשאף 100 µL ו ההפקדה השנייה טוב.
    5. עם טיפ חדש, חזור על שלב 1.6.4 מן הבאר השנייה כדי השלישי, וכו ' עד השתיים היטב.
    6. האחות µL 30 של דילול 10-12 ולהוסיף אותו צלחת COS. חזור על דילולים אחרים.
    7. תקופת דגירה של 3-4 ימים ב- 37 מעלות צלזיוס. לפף את הצלחת כי עם מצלמות-מיקרוסקופים לקבוע הריכוז על ידי ספירת המושבות.
    8. ביצוע מבחני תרבות משותפת כמתואר לעיל שהפקידים לתוך צלחת 24-ובכן עם 5 x 104 אמבה לכל באר 1 מ"ל של AC תרבות משותפת בינוני. לחסן עם ריבוי של זיהום (MOI) של 10.
    9. לאחר 48 שעות של תרבות משותפת, להמשיך פירוק התא כפי שמתואר בשלב 1.5.7. ביצוע דילולים סדרתי במים (10-1 כדי 10-6) ולהוסיף 30 µL הלוחות COS. תקופת דגירה לוחיות הרישוי של 4 ימים ב 37 מעלות צלזיוס לפני שתמשיך עם CFU לספור.
      הערה: לאחר המסך השני הזה, 60 של מוטציות 136 היו והתפאורה.
    10. חנות המוטציות השפיעו על ההישרדות שלהם בתוך התאים. להוסיף מושבה cryotube המכילה בינוני ליברות עם גליצרול (20% הסופי) או של cryotube המכילה פתרון מסחרי, גרגרי טובה של שימור לטווח ארוך, להקל על חיסון לעתיד ולאחסן ואז ב-80 מעלות צלזיוס.
    11. להעריך את הגידול במבחנה מוטציה על ידי מדידת צפיפות אופטית (OD)-600 nm כל יומיים.
      1. לגדול 1 מושבה של כל מוטציה מושפעים 50 מ ל צינורות מלאים 20 מ של 7 שעות 9 בינוני בתוספת 0.2% גליצרול, גלוקוז 1% ו- 250 מ"ג/מ"ל של kanamycin. לאפשר לחיידקים להגיע לשלב מעריכית (0.6 < OD < 0.8) לפני התאמת OD כדי 0.01 כדי להתחיל את קינטיקה.
      2. הכללת מוטציות עם במבחנה צמיחה פגם בהשוואה המתח WT של הסט של מוטציות לקוי תאיים.
  7. תרבות משותפת של מקרופאגים -abscessus מ Tn מוטציה פגומים עבור חיים אינטרה-אמבה
    הערה: זה לוקח חודש.
    1. מורחים 5 x 104 J774.2 מאתר מקרופאגים לכל טוב של צלחת 24-ובכן ב 1 מ"ל של מדיום עשיר, DMEM בתוספת 10% של סרום עגל עוברית (FCS). דגירה הצלחות במשך 24 שעות ביממה-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 כדי לאפשר מקרופאג אדהזיה. לספק משכפל 3.
    2. לבצע את הזיהום. לחסן מוטציות Tn , עם MOI של 10, מעורבבת עם DMEM עם 10% FCS באמצעי אחסון של 100 µL.
    3. לאחר 3 שעות של זיהום, לבצע שלוש כביסות עם 1 מ"ל של DMEM (יכול לשמש משאבת ואקום). אז פנקו עם 250 amikacin µg/mL (ב DMEM עם 10% FCS) עבור h 1 כדי לחסל את mycobacteria חוץ-תאית הנותרים.
      1. לאחר 3 נוספים שוטפים עם 1 מ"ל של DMEM, לשמור על תרבויות amikacin µg/mL 250 (ב DMEM עם 10% FCS) באמצעי אחסון הסופי של 1 מ"ל כדי למנוע כפל mycobacterial חוץ-תאית.
    4. 72 h לאחר תרבות משותפת, להסיר את המדיום ואת lyse מקרופאגים על-ידי הוספת 1 מ"ל של מים קרים. תקופת דגירה של 30 דקות ב 4 º C.
    5. ביצוע מבחני CFU על צלחות COS כדי להעריך את מספר החיידקים תאיים.
      1. בצלחת 24-ובכן, להוסיף 1 מ"ל של מים שתי השורות הראשונות. להוסיף 100 µL של התא שותף lysate הבאר הראשונה. עם micropipette, מערבבים שלוש פעמים. האחות 100 µL, להפקיד אותם השני טוב.
      2. עם טיפ חדש, חזור על דילול מן הבאר השנייה כדי השלישי, וכו ' עד השתיים היטב. לאחר מכן תשאף 30 µL של דילול 10-12 , להוסיף את צלחת COS.
      3. חזור על דילולים אחרים. לעטוף את הצלחת כי עם מצלמות-מיקרוסקופים ולחכות 3-4 ימים להתבונן ולספור את המושבות.
  8. זיהוי ורצף של האתר של החדרת Tn של מוטציות abscessus מ
    הערה: זה לוקח חודשים 1.5 למוטאנטים 60.
    1. הפקת גנומית מזוהה מוטציות abscessus מ
      1. לגדול המוטציות בשפופרת 50 מ עם 20 מ של 7 שעות 9 בינוני שיושלם עם גליצרול 0.2%, 1% גלוקוז kanamycin 250 מ"ג/מ"ל לשלב מעריכית (OD600= 0.8).
      2. הקציר 10 מ"ל של התרבויות (2,396 x g, 5 דקות). למחוק את תגובת שיקוע. להשעות את חיידק µL 500 של פתרון אני (25% סוכרוז, 50 מ מ טריס pH 8, 10 מ"ג/מ"ל ליזוזים, thiourea 40 מ מ). להעביר את הפתרון לתוך צינורות 2 מ"ל עם בורג מכסה ואת תקופת דגירה של 2 h ב- 37 מעלות צלזיוס.
      3. להוסיף 500 µL של פתרון II (25% סוכרוז, 50 מ מ טריס pH 8, 50 מ מ EDTA). לאחר pipetting למעלה, למטה 5 - 10 פעמים, להוסיף חרוזים זירקוניום עד נפח של 500 µL בצינור.
      4. . המשך עם פירוק התא עם מהמגן (3 x 6,000 סל ד, 45 s) עם הדגירה 1 דקות בקרח בין כל סיבוב.
      5. להוסיף 5 µL של 20 מ"ג/מ"ל Proteinase K (final µg 100/mL), דגירה הדגימות בן לילה-55 מעלות צלזיוס.
      6. להוסיף 1 מ"ל של קור של אלכוהול פנול/כלורופורם/isoamyl (25:24:1) תחת ברדס fume. לערבב את הדוגמאות על ידי vortexing לפני שתמשיך עם צנטריפוגה-RT ו- x 16,500 g למשך 30 דקות.
      7. לאחר צנטריפוגה, לשחזר את פאזה מימית ולהוסיף אמצעי שווה של תמיסת כוהל פנול/כלורופורם/isoamyl קר ברדס. Centrifuge את הדגימות ב x 16,500 g למשך 30 דקות לשחזר את פאזה מימית שוב.
      8. להוסיף נפח 0.7 של אלכוהול איזופרופיל RT השלב מימית התאושש ברדס fume. היפוך לאט הצינורות כדי לאפשר DNA משקעים דגירה 5 דקות ב- RT. צנטריפוגה ואז 10 דקות ב 16,500 x g ו- RT.
      9. הסר את תגובת שיקוע, לשטוף את גלולה עם 500 µL של 70% אתנול ברדס. Centrifuge צינורות 10 דקות ב x 16,500 g ב- RT לפני הסרת האתנול. תקופת דגירה של 10 דקות לאפשר אידוי אלכוהול הנותרים.
      10. לבסוף, להשעות בגדר דנ א ב µL 100 DNase/RNase מים חינם. לקבוע את הדנ א, התשואה וטוהר, DNA עם ספקטרופוטומטרים.
      11. הסר µg 1 של ה-DNA גנומי והתקציר עם 10 U הוא ללילה אחד עבור תת שיבוט האתר ההכנסה Tn . להשתמש בפרוטוקול של היצרן.
        הערה: סיאני האנזים הוא אחד של אנזימי הגבלה ביותר מייצגים הגנום abscessus מ' (2,173 הגבלת אתרים). סיאני הגבלת האתר נמצא גם רצף Tn במעלה הזרם בקלטת ההתנגדות kanamycin למוטציה Tn. לפיכך, סיאני בתיווך subcloning מאפשר לזהות את האתר ההכנסה Tn.
    2. תת שיבוט בתוך פלסמיד ה-DNA גנומי המכיל את Tn
      הערה: לפני הדיון, עם Tn-subcloning ב 2,686 bp pUC19 עמידים אמפיצילין פלסמיד, להוסיף סיאני הגבלת האתר באתר שיבוט מרובים של פלסמיד. רצף פלסמיד pUC19 ניתן למצוא ב https://www.addgene.org/50005/sequences/ בקישור הזה.
      1. בצע יצרן של פרוטוקול לעיכול פלסמיד pUC19 עם EcoR הינדהשלישי, אשר משחרר שבר של 51 ואני bp ושבר של 2635 bp. לטהר את הווקטור מתעכל כפול עם ערכת טיהור PCR מסחרי לחסל את 51 bp שוחרר פרגמנט.
      2. לערבב 1 µL (ריכוז 25 pmol/µL) של שני oligonucleotides משלימים (5 'AGCT טטה AGATCT טטה ATCGAT TATA3' ו- 5 'AAT TAA TAA TCG ATT אתא אגא TCT TAT A3') של 28 bp המכילים כל אחד סיאני הגבלת האתר ואת בקצוות הינדהשלישי, EcoR אני באתרים מגבלת. מחממים ב 100 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ואז צנני על מנת לאגד אותם.
      3. לעכל את צבעי בסיס לזווג מאת EcoRואני הינדהשלישי על פי הפרוטוקול של היצרן.
      4. מאתרים ומפסיקים 150 ng של EcoRאניהינדpUC19 מוגבלת השלישי פלסמיד עם ריכוז שונה של תחל לזווג (50 pmol/µL, 25 pmol/µL, 2.5 pmol/µL) עבור h 1 ב RT עם ליגאז 1 ה-DNA של U T4 באמצעי אחסון הסופי של µL 20. בדיקה השיבוט על ידי שונה עיכול אנזימטי.
      5. לעכל את פלסמיד שהשתנתה עם הסי. אי. אני כבר שעתיים ב 37 º C.
      6. מאתרים ומפסיקים 50 ng של הסי. אי. אני מוגבלת pUC19פלסמיד ו- 50 ng של דנ א גנומי מתעכל על ידי סיאני עבור h 1 ב RT עם ליגאז 1 ה-DNA של U T4 ב 10 µL.
      7. המשך e. coli electrocompetent טרנספורמציה חיידקים עם 5-10 µL של מצדו (2500 V, 200 אוהם, 25 µF). בחר השיבוטים על פלטות אגר LB בתוספת 50 kanamycin µg/mL ו- 50 אמפיצילין µg/mL כדי לבחור את החיידקים הנושא פלסמידים עם מנות של רצפי Tn.
      8. לגדול שיבוטים עמיד למשך הלילה במדיום נוזלי ליברות עם הבחירה אנטיביוטי המתאים (kanamycin µg/mL 50 ו- 50 אמפיצילין µg/mL).
      9. תמצית ה-DNA פלסמיד. לבדוק הנוכחות של הקדמי על-ידי הגבלת אנזימטיות, רצף 3' סוף Tn לזהות את הגן שיבשו עם המקביל oligonucleotide (5' TTGACGAGTTCTTCTGA 3') זוגות בסיס אחרונה 17 של kanamycin Tn ההתנגדות קלטת.
      10. יישר את הרצף נגד המתח ללכת 06 מ abscessus על-ידי ביצוע הפיצוץ נוקלאוטיד (הפיצוץ-N).

2. RNA החילוץ של Mycobacteria תאיים לניתוח Rnaseq

הערה: זה לוקח 4 חודשים לניסויים ו-4 חודשים לניתוח RNAseq.

  1. תרבות משותפת של amoebae-מ abscessus בקבוצות
    הערה: בניסוי הבא, תרבות משותפת מתבצע ב- 50 מ ל צינורות עם עצבנות לטובת חיידקים לאנשי תא.
    1. גדל מ abscessus ב 7 שעות 9 בתוספת 0.2% גליצרול, 1% גלוקוז כדי השלב אמצע-מעריכית 120 סל ד בינוני.
    2. לשטוף את החיידקים פעמיים עם 10 מ ל AC המאגר.
    3. מעריכים את ריכוז חיידקים על ידי מדידת את יתר600nm (1 OD600= 4 x 108 mycobacteria). להוסיף 8.5 x 108 mycobacteria 8.5 x 106 amoebae ב- 10 מ ל AC בינוני.
    4. תקופת דגירה של 1 h ב- 30 ° C עם עצבנות עדין (בערך 80 סל ד).
    5. לקצור את התאים על ידי צריך שתוציאו ב 253 x גרם במשך 12 דקות להסיר תגובת שיקוע, להשעות את התאים 10 מ ל AC המאגר. חזור על זה לשטוף עוד פעמיים.
    6. Resuspend התאים 10 מ ל AC מאגר המכיל 50 µg/mL amikacin לחסל את החיידקים חוץ-תאית, תקופת דגירה של 4 h ב- 30 ° C עם עצבנות עדין (80 סל ד). לשטוף את התאים פעמיים שוב.
  2. מיצוי של RNA הכולל מתאיים abscessus מ
    הערה: לבצע צעדים 2.2.1–2.2.3 מתחת למכסה המנוע fume עקב השימוש של ריאגנטים רעילים.
    1. לאחר כביסות סופית, resuspend את amoebae נגועים ב- 4 מיליליטר קר הפתרון השלישי (טבלה 3) עם µL extemporaneously 280 של β-mercaptoethanol להפריע amoebae. זהו השלב thiocyanate (GTC) guanidinium. לשמור על התליה על קרח דק 10 צנטריפוגה התא lysate עבור 30 min ב 2,396 x g ו- 4 ° C כדי הצניפה החיידק תאיים שפורסמו.
    2. הסר את תגובת שיקוע, להשעות את צניפה חיידקי ב 1 מ"ל של פתרון קר השלישי. הקציר החיידק ב x 2396 g למשך 30 דקות ב 4 º C. Resuspend בגדר ב 1 מ"ל של מאגר החילוץ, העברת לתוך צינור הברגים 2 מ"ל המכילה חרוזים זירקוניום (עד 500 µL הדרגתית של הצינור). לאחסן את הצינורות עבור פחות 24 שעות ב- 80 ° c
      הערה: אחסון הכימית פירוק היתרי איון של התפרקות RNases ותא.
    3. כאשר מוכן לשימוש, להפשיר דוגמאות על הקרח ואת lyse אותם עם מהמגן על ידי ביצוע שני סיבובים ב- 6,000 סל ד ב-25 s, ולאחריו סיבוב אחד ב- 6,000 סל ד 20 s עם הדגירה 1 דקות בקרח בין כל סיבוב.
    4. להתקרר המדגם, דגירה אותם על קרח למשך 10 דקות. לאחר מכן להוסיף 200 µL של כלורופורם מדולל באלכוהול isoamyl. לאחר vortexing הדגימות עבור 1 דקות, צנטריפוגה למשך 15 דקות ב- 16,500 x g ו- 4 מעלות צלזיוס.
    5. להוסיף 0.8 מ ל אלכוהול איזופרופיל קר שלב מימית, דגירה בדגימות במשך 2-3 h ב- 20 ° c Centrifuge את הדגימות במשך 35 דקות ב- 16,500 x g ו- 4 מעלות צלזיוס. למחוק את תגובת שיקוע.
    6. לשטוף בגדר RNA על-ידי הוספת µL 500 של אתנול 70% קר (לא לערבב).
    7. Centrifuge את הדגימות ב x 16,500 g 10 דקות להסיר את האתנול. האחות הפתרון ויבש ברכז צנטריפוגלי.
    8. ברגע מיובש, resuspend כדורי ב- µL 100 DNase/RNase מים חינם.
      הערה: חייבים להיות מטופלים דגימות פעמיים עם DNases כדי להסיר את ה-DNA מזהמים בהתאם להמלצות היצרן.
    9. להעריך את תקינות ה-RNA על ג'ל agarose ואשר על ידי מדידת מספר שלמות RNA (RIN) ואת היחס ribosomal שיטה מבוססת שבב אלקטרופורזה נימי.
      הערה: רין לוקח את האיתור electrophoretic כולו בחשבון. רין אלגוריתם התוכנה מאפשרת הסיווג של RNA הכולל, מבוסס על מערכת המספור מ- 1 עד 10, עם 1 לפרופיל ביותר מפורק ולא 10 הוא תקין ביותר. כדי להמשיך עם הכנה ספריית cDNA, RINs להיות מעל 8 ו ribosomal היחס [28S/18S] גבוה ככל האפשר, הערך האידיאלי להיות 2, בהתאם של האורגניזם ושל specificities שלה.
    10. לאחסן RNA דגימות ב-80 מעלות צלזיוס עד הכנה של ספריית cDNA רצף.
  3. הכנה של ספריית cDNA
    1. כדי להמשיך עם ספריית הכנה, להשתמש ערכת סינתזה cDNA זמינים מסחרית (טבלה של חומרים) באמצעות הפרוטוקול של היצרן.
    2. אבדוק בספריה על ריכוז ואיכות על שבב דנ א
      הערה: כימות מדויקת יותר ניתן לבצע עם מבחני כימות מבוססי פלורסנט רגיש.
  4. ספריית רצף
    1. לנרמל את הדגימות 2 ננומטר והמשך ריבוב לפי הארגון תא זרימה.
    2. Denature את הדגימות-ריכוז של 1 ננומטר באמצעות 0.1 N NaOH עבור 5 דקות ב- RT.
    3. לדלל את הדגימות בשעה 22:00. לטעון כל דגימה על התא זרימה בשעה 22:00.
    4. להמשיך עם רצף עם מערכת רצף תפוקה גבוהה המאפשרת גנומיקה בקנה מידה גדול. כאן ההפעלה היה ריצה רלוקטנציה ממותג (SR: קריאה יחיד, PE: קריאות לזווג-end, מ ': מרובב דגימות) 51 מחזורים עם 7 בסיסים אינדקס לקרוא.
    5. להעריך את האיכות של הרצף עם תוכנית FastQC חיצוני13.
    6. לאחר שנשר מתאם רצפים, להמשיך עם יישורים קריאה נגד גנום הפניה. ישר נגד הגנום התאים האיקריוטים כדי להעריך מדגם זיהום, במידת הצורך, להמשיך עם הגזם הקריאות הלא-בקטריאלי.
  5. ניתוח סטטיסטי
    1. משתמש מספר תוכנות זמין באינטרנט כדי להגדיר קבוצות של גנים ביטוי באופן שונה: R תוכנה, חבילות Bioconductor כולל DESeq2 ואת החבילה PF2tools (גירסה 1.2.12) שפותחה פלטפורמת "Transcriptome et Epigénome" (פסטר המכון, פריס).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מ abscessus יש את היכולת להתנגד ולברוח התגובות אחרים של מקרופאגים, חד-תאיים סביבתיים כגון amoebae. מ abscessus מבטא הגורמים התקפה אלימה כאשר גדל עם amoebae, מה שהופך אותו יותר מידבק עכברים4. המטרה הראשונה של שיטות אלה היה כדי לזהות את הגנים נוכח מ abscessus המאפשר את הישרדות וכפל בתוך amoebae.

בשביל זה, ספריית מוטנטים מ abscessus subsp. massiliense, מתקבל על ידי Tn משלוח9, הוקרן בעקבות תרבות משותפת בנוכחות amoebae, לזהות מוטציות עם צמיחה הקלוש הזה תאיים סביבה (איור 1). ההתנהגות של המוטציות באותו הוערך גם בעקבות תרבות משותפת עם מקרופאגים לנתח אם זו הנחתה לצמיחה שנשתמרה בזכרון עכברים מקרופאגים.

הספרייה transposon עיוור הקרנת הגישה, אישר הפנוטיפ שכפול פגומים עבור 47 של מוטציות 6,000 שהיה של הישרדות של 50% או פחות amoebae ו/או מקרופאגים, בהשוואה שולטת10. כדי לשלול מוטציות עם הישרדות תאיים הקלוש זה עשוי לנבוע פגם מהותי צמיחה mycobacterium, הגידול עקומות של כל הנבחרות Tn מוטציות הוערכו במדיום in vitro לקשרי תרבות נוזלי מועשר (1 %) גלוקוז - 7 ה 9). במבחנה הצמיחה של כל המוטציות היה פיקוח על-ידי ביצוע OD600 של תרבויות כל יומיים. המוטציות שונים מוצגים במבחנה צמיחה פגם בהשוואה לאמץ פראי-סוג המתאימה לא נכללו במחקר.

זה היה חשוב מאין כמותו עבור בדיקה עיוורת זו להיות מועתק כל יום שימוש בדיוק באותו הפרוטוקול. המגבלה של טכניקה זו היה בהקרנה החזותי הראשון, התמונות צולמו של כל CFU לספק תמונה מדויקת עבור ההפניה. בקבוצה זו של מוטציות, abscessus מ 12 מוטציות (כולל כפילות) אותרו בה transposon הוכנס לתוך הגנים השייכים מיקומה ESX-4 סוג מערכת הפרשת השביעי אשר מדגיש את חשיבותו תוך תאיים הצמיחה של abscessus מ10.

עד עכשיו, הניתוח של התקפה אלימה abscessus מ ביסודו מבוסס על ניתוח השוואתי של הגנום של מ abscessus עם זו של chelonae מ', mycobacterium השייכים לאותה הקבוצה אבל גורם רק זיהומים עורו של בני אדם. המטרה היתה להשיג קטלוג של הגנים לידי ביטוי במהלך תנאים שונים תרבות משותפת כדי להבין טוב יותר את ההסתגלות ואת פוטנציאל מנגנוני ארסיות מעורב במהלך תרבות משותפת בנוכחות מקצועי איכות הסביבה phagocytes. ניתוח של זו התקפה אלימה מוגבר באמצעות גישה מקיפה של RNAs שליח הכולל רצף של abscessus מ', בוצעה על מנת לזהות RNAs המושרה או מודחקים במהלך אמבה תרבויות המשנה בהשוואה של RNAs עיבד תחת במבחנה תנאים. הביטוי דיפרנציאלית של אלה RNAs יכול להתייעץ כדי abscessus מ של משופרת "התקפה אלימה" המסביר הקולוניזציה של דרכי הנשימה העליונות אצל בני אדם.

תרבויות אלה שיתוף שוב בוצעו במדיום מינימלי (אין מקור פחמן או חנקן) כמתואר לעיל, על מנת למנוע את צמיחת מ abscessus חוץ-תאית, להיות נציג של תנאים סביבתיים בפני אלה mycobacteria, תחת הלחץ של מבחר של אנטיביוטיקה לאורך משך תרבות שותף לבחירת mycobacteria תאיים.

לכן, הטכניקה פותחה כדי לבודד את הרנ א מ mycobacteria תאיים. הקושי המרכזי עם החילוץ הזה של mycobacterial RNA היה הימנעות זיהום עם amoebal RNA (סוג איקריוטים). כדי למנוע זאת, פירוק של אמבה בוצע לעבר בזמנים שונים פוסט משותף תרבות, באמצעות guanidinium thiocyanate (GTC); מאז mycobacteria תאיים הם עמידים. לאחר שלב זה, מיצוי מכני של RNAs mycobacterial התבצע באמצעות תא-מהמגן בנוכחות זירקוניום חרוזים. טכניקה זו אפשרה לנו להשיג RNA mycobacterial באיכות טובה, עם מספר רין באיכות גבוהה, חיוני על מנת לשפר את היכולת לבצע ניתוח מלא של transcriptome abscessus מ' , באמצעות רצף RNA שליח (mRNA) טכניקה (איור 2). זה לא נעשה מעולם ונתן לנו חזון מהותי של המשפחות ג'ין המושרה או מודחקים, על-ידי קיבוץ אותם על פי תפקידם: התגובה של abscessus מ' לסביבה מוגבל למקורו של חומרים מזינים ומינרלים, כדי שתקבעו או החומצית והתנגדות של abscessus מ' חמצוני, מתח nitrosative, וכל סוף סוף ביטוי של התקפה אלימה של abscessus מ באמבה סביבתיים.

Figure 1
איור 1 : א מסך החזותי הראשון מ abscessus Tn מוטציות באמבה. (א) מסך רחב היקף של Tn מוטציות ב- amoebae מתבצע ב 96-ובכן צלחות עם ריבוי אקראי של זיהום לזהות במהירות מוטציות הקלוש. (B) זיהוי של המוטציות Tn הקלוש משובשות גנים. דנ א גנומי Tn למוטציות פיצול קבצים עם הסי. אי. אני לשבט את האתר ההכנסה Tn . מ abscessus הגנום בנמלים 2500 סיאני הגבלת אתרים אילו טובות השגת DNA קצרים קטעים אבל הוריד את ההסתברות לשבט את האתר ההכנסה Tn (1/2500). השיבוטים שנבחרו עם kanamycin, דוב ההתנגדות על ידי transposon. הגן שיבשו מזוהה על ידי רצף עם פריימר בתוך בקלטת ההתנגדות kanamycin Tn (חץ שחור). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : ניתוח של החילוץ-RNA mycobacterial. (א) RNA החילוץ של תאיים abscessus מ במהלך amoebae -מ abscessus תרבות משותפת. Amoebae תרבויות שיתוף עם מ' abscessus מבוצעות על ריבוי גבוה של זיהום (קרי, 100), בכמויות גדולות, עם עצבנות עדין, לטובת תא לאנשי חיידקים. לאחר שיתוף תרבויות, התאים הם שנקטפו, lysed עם שילוב של GTC ו המדפיסים-mercaptoethanol. תא lysate המכילים חיידקים מטופלת עם GTC שוב כדי להחליש את דופן התא של חיידקים כדי להקל על פירוק מכונאי חיידקים לפני החילוץ-RNA. (B) RNA הערכת איכות ושלמות עם bioanalyzer. ג'ל אלקטרופורזה ניתנת שלפיו rRNA נצפית (23S, 16 ו- 5S). רין חייב להיות מעל 8 כדי להמשיך עם ספריית לקראת רצף של rRNA יחסי (23S/16) גבוה ככל האפשר בהתאם האורגניזם, הערך האידיאלי להיות 2. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ההתנהגות של מ' abscessus דומה הרבה יותר אופן הפעולה של SGM פתוגניים כגון מ. שחפת מאשר כל mycobacteria אחרים השייכים RGM2. רכיב המפתח ב- פתוגניות של SGM הוא היכולת שלהם לשרוד או אפילו להכפיל בתוך תאים אנטיגן, כגון מקרופאגים, תאים דנדריטים.

מ abscessus רכשה את יתרונות גנומית מסוימים כפי שהראה את רצף הגנום שלו14 סה על מנת לשרוד בתוך תא phagocytic האיקריוטים. הגנום של מ abscessus הוכח מתפתחות במהירות והציג פלסטיק מאוד, עם רבים לאחרונה ההכנסה רצפים כגון prophages וגנים חדשים15. למרות שיש פחות נתונים על התקפה אלימה גורמים abscessus מ' לעומת מ. שחפת, מ abscessus לא תוכל להתפתח במהירות, באופן פעיל לקראת התקפה אלימה מוגברת. עד עכשיו, הניתוח של התקפה אלימה abscessus מ היה מבוסס בעיקרו על ניתוח השוואתי של הגנום של מ abscessus עם זו של chelonae מ', mycobacterium השייכים לאותה הקבוצה אבל גרימת זיהומים מוגבל העור אצל בני אדם. כמה גנים לא מציגים מ chelonae , אבל נוכח מ' abscessus, כגון phospholipase C, יש להסביר ההתנגדות של abscessus מ' לאחר phagocytosis amoebae סביבתיים4.

הפיתוח של שיטת תרבות משותפת אמבה בתוספת דוגמאות סביבתיים הוכיחה חד משמעית אמבה mycobacterial אינטראקציות16,17. לפיכך, mycobacteria יכול להיות מבודד lysates תרבותי משותף בנוכחות amoebae הצמח טיפול מים18, ולא מ massiliense היה מבודד ברוק של חולה לאחר תרבות משותפת עם amoebae, ואילו התרבות לבד לא לאפשר את הבידוד הזה mycobacteria8. Amoebae נחשבים יותר ויותר כמו בריחה mycobacteria4 ו- Acanthamoebasp. כמחשב מארח הסביבה הטבעית עבור רבים mycobacteria tuberculous. תרבות משותפת אמבה פלוס mycobacteria מערכות יותר ויותר להיות מוצעים כמודלים פשוטה ומהירה כדי לאפיין גורמים מעורבים בהתפתחות תאיים mycobacteria19,20,21, 22,23,24.

בסביבת, האינטראקציה בין mycobacteria לבין amoebae מתועדת היטב. המאמר הראשון מתאר עדות של שיוך בין mycobacteria לבין amoebae בשדה יצא בשנת 2014, מחקר זה התמקד ניתוח של רשת שתיית מים25.

לידע שלנו, זוהי ההקרנה הראשונה המתוארת במהלך תרבות משותפת עם amoebae. מחקר זה אפשר לנו להפגין את התפקיד שממלאת הסביבה phagocytes ברכש של התקפה אלימה של פתוגן הזדמנותית המשפיעים על בני אדם. על מנת להדגיש את הגנים האלה נדרש להישרדות תאיים abscessus מ', מסך של ספרייה מוטציה על ידי טרנספוזיציה בוצע תת-מין מ abscessus מורכבים, זן קליניים. ספריית מוטציה זו הוקרן עם amoebae, זה האחרון שיש כבר הוכיחה כמו "אימונים" להגדלת התקפה אלימה של מ abscessus עכברים4, דומה לזה שנצפה עם avium מ26. התוצאה העיקרי היה הגילוי בפעם הראשונה ב- mycobacteria של תפקיד חיוני של מיקומה ESX-4 בקידוד של סוג השביעי הפרשת ומערכת הקדמון של מיקומה ESX-1 נחשב חיוני התקפה אלימה והישרדות תאיים של מ. שחפת Mycobacterium microti , התחממות עולמית מ27,28,29,30,31.

המטרה השנייה הייתה לקבל קטלוג של הגנים לידי ביטוי במהלך תנאים שונים תרבות משותפת כדי להבין טוב יותר את ההסתגלות ואת מנגנוני ארסיות פוטנציאליים מעורב במהלך תרבות משותפת בנוכחות סביבתיים phagocytes מקצועי. ניתוח של זו התקפה אלימה מוגבר באמצעות גישה מקיפה של הכולל רצף של RNAs שליח של abscessus מ', בוצעה על מנת לזהות RNAs המושרה או מודחקים במהלך אמבה תרבויות המשנה בהשוואה של RNAs עיבד תחת במבחנה תנאים. הביטוי דיפרנציאלית של אלה RNAs יכול להתייעץ כדי abscessus מ של משופרת "התקפה אלימה" המסביר הקולוניזציה של דרכי הנשימה העליונות אצל בני אדם. בין מינים RGM, מ abscessus הוא הכלל פנוטיפ פתוגניים שאינם יחד עם chelonae מ'. היכולת של מ abscessus כדי לגרום פתולוגיות דומה כדי tuberculous mycobacteria עושה את זה אפילו יותר ייחודי. מחקרים רבים דיווחו על עיבודים תאיים של מ. שחפת לחיים בתוך המקרופאגים32,33 , אבל אף אחד לא מתמקדת על abscessus מ עיבודים ויוו. תגובת תעתיק abscessus מ היפוקסיה כבר מתואר34 , הדגשת תפקידו של mycobactins, את regulon dosR כפי שמתואר מ. שחפת. ניתוח transcriptome מ' abscessus בתוך amoebae ו מקרופאגים נותן תובנה adaptions חיידקי אל תאיים חיים כשלעצמה. השוואה של האלה transcriptomes מתיר את ההערכה של התפקיד של amoebae מפעילה abscessu מs התקפה אלימה בבני אדם וכדי את פיענוח עיבודים ספציפי בתרבית של תאים phagocytic. הנחה נעשתה כי הסביבה amoebal שאולי מהווה "אימונים" מ abscessus לפני העברת תאי אדם, כדי לתאר מ abscessus התקפה אלימה מבחינת עיבודים אבולוציונית, רינדור גישה זו המקורית .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

אנו מאוד להכיר pr. אי. ג'יי רובין (הספר לרפואה של הרווארד, בוסטון, ארה ב) על המתנה היקרה של המוטציה ספריה, ד ר בן מרשל (הפקולטה לרפואה, אוניברסיטת סאות'המפטון, אנגליה) עבור התיקונים של כתב היד. אנו מאוד להכיר התאחדות החולה צרפתית סיסטיק פיברוזיס "Vaincre la Mucoviscidose", "L'Association גרגורי Lemarchal" על תמיכתם פיננסיים (RF20150501377). אנו מודים גם הסוכנות הלאומית למחקר (ANR תוכנית DIMIVYR (ANR-13-BSV3-0007-01)), את Région ile-de-(Domaine d'Intérêt Majeur מחלות Infectieuses et Emergentes) למימון הבתר את הנר-מ'. ל' ל' הוא בחור דוקטורט מ "ומוסרת Ministère de L'Enseignement et de la Recherche".

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Name of Material/ Equipment
24-well plates Thermofisher 11874235
96-well plates Thermofisher 10687551
Beadbeater  Bertin Precellys 24
Bioanalyzer Agilent
Genepulser Xcell Biorad
Nanodrop spectrophotometer 2000 Thermofisher
QuBit fluorometer Thermofisher Q33226
zirconium beads/silica beads Biospec products 11079101Z Beads
Name of reagent/cells
Acanthamoeba castellanii  ATCC 30010 strain
Amikacin  Mylan 150927-A powder
B-mercaptoethanol  Sigma-Aldrich M6250 solution
CaCl2 Sigma-Aldrich C1016 >93% granular anhydrous
Chloroform  Fluka 25666 solution
ClaI enzyme New England Biolabs R0197S enzyme
Columbia agar  Biomerieux 43041 90 mm
D-Glucose Sigma-Aldrich G8270  powder
DMEM  Thermofisher 11500596 medium
DNase and RNase free water  Invitrogen 10977-035 solution
E. coli electrocompetent  Thermofisher 18265017 bacteria
EDTA Sigma-Aldrich E4884 powder
Escherichia coli  Clinical isolate personal stock bacteria
Fe(NH4)2(SO4)-6H20  EMS 15505-40 sulfate solution 4% aqueous
Fetal Calf Serum Gibco 10270 serum
Glycerol Sigma-Aldrich G5516 solution
Guanidium thiocyanate  Euromedex EU0046-D powder
Isopropanol  Sigma-Aldrich I9516 solution
J774.2 macrophages Sigma-Aldrich J774.2 Strain
kanamycin  Sigma-Aldrich 60615 powder
KH2PO4 Sigma-Aldrich P0662 Monobasic, anhydrous
LB liquid medium  Invitrogen 12795-027 powder
Lysozyme Roche 10837059001 powder
MgSO4 Labosi M275 pur
Microbank TM (cryotubes with beads) Pro-Lab Diagnostic PL.170/M
Middlebrook 7H11 medium Sigma-Aldrich M0428 powder
Middlebrook 7H9 medium Thermofisher 11753473 powder
Müller-Hinton agar Biorad 3563901 powder
N-Lauryl-sarcosine Merck S37700 416 powder
Na2HPO4-7H2O Sigma-Aldrich S9390 98-102%
Phenol/chloroforme  Sigma-Aldrich 77617 solution
Proteinase K Thermofisher EO0491 powder
proteose peptone BD 211684 enzymatic digest of animal tissue
pUC19 plasmid New England Biolabs 54357 plasmid
SDS  20% Biorad 1610418 solution
Sodium citrate Calbiochem 567446 powder
Thiourea Sigma-Aldrich 88810 powder
Tris Sigma-Aldrich 154563 powder
Trizol  Thermofisher 12044977 solution
Tween 80 Sigma-Aldrich P1754  solution
Yeast extract  BD 212750
Kit
AMBION DNase kit  Thermofisher 10792877 kit
DNA Agilent Chip Agilent 5067-1504 kit
GeneJET Plasmid Miniprep kit  Thermofisher K0503 kit
PureLink PCR Purification kit Invitrogen K310001 kit
Quant-It" assays kit Thermofisher Q33140/Q32884 kit
T4 DNA ligase  Invitrogen Y90001 kit
TruSeq Stranded RNA LT prep kit Illumina 15032611 kit

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Qvist, T., et al. Comparing the harmful effects of nontuberculous mycobacteria and Gram negative bacteria on lung function in patients with cystic fibrosis. Journal of Cystic Fibrosis. 15 (3), 380-385 (2016).
  2. Roux, A. -L., et al. The distinct fate of smooth and rough Mycobacterium abscessus variants inside macrophages. Open Biology. 6 (11), 160185 (2016).
  3. Castañeda-Sánchez, J., et al. Defensin Production by Human Limbo-Corneal Fibroblasts Infected with Mycobacteria. Pathogens. 2 (4), 13-32 (2013).
  4. Bakala N'Goma, J. C., et al. Mycobacterium abscessus phospholipase C expression is induced during coculture within amoebae and enhances M. abscessus virulence in mice. Infection and Immunity. 83 (2), 780-791 (2015).
  5. Ripoll, F., et al. Non mycobacterial virulence genes in the genome of the emerging pathogen Mycobacterium abscessus. Public Library of Science One. 4 (6), 5660 (2009).
  6. Tailleux, L., et al. Constrained intracellular survival of Mycobacterium tuberculosis in human dendritic cells. Journal of Immunology. 170 (4), 1939-1948 (2003).
  7. Jacquier, N., Aeby, S., Lienard, J., Greub, G. Discovery of new intracellular pathogens by amoebal coculture and amoebal enrichment approaches. Journal of Visualized Experiments. (80), e51055 (2013).
  8. Adékambi, T., et al. Amoebal coculture of "Mycobacterium massiliense" sp. nov. from the sputum of a patient with hemoptoic pneumonia. Journal of Clinical Microbiology. 42 (12), (2004).
  9. Rubin, E. J., et al. In vivo transposition of mariner-based elements in enteric bacteria and mycobacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (4), 1645-1650 (1999).
  10. Laencina, L., et al. Identification of genes required for Mycobacterium abscessus growth in vivo with a prominent role of the ESX-4 locus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (5), 1002-1011 (2018).
  11. Rowbotham, T. J. Isolation of Legionella pneumophila from clinical specimens via amoebae, and the interaction of those and other isolates with amoebae. Journal of Clinical Pathology. 36 (9), 978-986 (1983).
  12. Moffat, J. F., Tompkins, L. S. A quantitative model of intracellular growth of Legionella pneumophila in Acanthamoeba castellanii. Infection and Immunity. 60 (1), 296-301 (1992).
  13. FastQC program. , Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2018).
  14. Ripoll, F., et al. Non mycobacterial virulence genes in the genome of the emerging pathogen Mycobacterium abscessus. Public Library of Science One. 4 (6), 5660 (2009).
  15. Choo, S. W., et al. Genomic reconnaissance of clinical isolates of emerging human pathogen Mycobacterium abscessus reveals high evolutionary potential. Science Reports. 4, (2015).
  16. Greub, G., Raoult, D. Microorganisms Resistant to Free-Living Amoebae. Clinical Microbiology Reviews. 17 (2), 413-433 (2004).
  17. Kicka, S., et al. Establishment and Validation of Whole-Cell Based Fluorescence Assays to Identify Anti-Mycobacterial Compounds Using the Acanthamoeba castellanii - Mycobacterium marinum Host-Pathogen System. Public Library of Science One. 9 (1), 87834 (2014).
  18. Thomas, V., Loret, J. -F., Jousset, M., Greub, G. Biodiversity of amoebae and amoebae-resisting bacteria in a drinking water treatment plant. Environmental Microbiology. 10 (10), 2728-2745 (2008).
  19. Lamrabet, O., Medie, F. M., Drancourt, M. Acanthamoeba polyphaga-enhanced growth of mycobacterium smegmatis. Public Library of Science One. 7 (1), (2012).
  20. Cosson, P., Soldati, T. Eat, kill or die: when amoeba meets bacteria. Current Opinion in Microbiology. 11 (3), 271-276 (2008).
  21. Lelong, E., et al. Role of magnesium and a phagosomal P-type ATPase in intracellular bacterial killing. Cellular microbiology. 13, November 2010 246-258 (2011).
  22. Ouertatani-Sakouhi, H., et al. Inhibitors of Mycobacterium marinum virulence identified in a Dictyostelium discoideum host model. Public Library of Science One. 12 (7), 0181121 (2017).
  23. Trofimov, V., et al. Antimycobacterial drug discovery using Mycobacteria-infected amoebae identifies anti-infectives and new molecular targets. Science Reports. 8 (1), 3939 (2018).
  24. Cardenal-Muñoz, E., Barisch, C., Lefrançois, L. H., López-Jiménez, A. T., Soldati, T. When Dicty Met Myco, a (Not So) Romantic Story about One Amoeba and Its Intracellular Pathogen. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 529 (2017).
  25. Delafont, V., et al. First evidence of amoebae-mycobacteria association in drinking water network. Environmental Science & Technology. 48 (20), (2014).
  26. Cirillo, J. D., Falkow, S., Tompkins, L. S., Bermudez, L. E. Interaction of Mycobacterium avium with environmental amoebae enhances virulence. Infection and Immunity. 65 (9), (1997).
  27. Stamm, L. M., et al. Mycobacterium marinum escapes from phagosomes and is propelled by actin-based motility. Journal of Experimental Medicine. 198 (9), 1361-1368 (2003).
  28. Groschel, M. I., Sayes, F., Simeone, R., Majlessi, L., Brosch, R. ESX secretion systems: mycobacterial evolution to counter host immunity. Nature Reviews Microbiology. 14 (11), 677-691 (2016).
  29. Pym, A. S., et al. Recombinant BCG exporting ESAT-6 confers enhanced protection against tuberculosis. Nature Medicine. 9 (5), 533-539 (2003).
  30. Hsu, T., et al. The primary mechanism of attenuation of bacillus Calmette-Guerin is a loss of secreted lytic function required for invasion of lung interstitial tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (21), 12420-12425 (2003).
  31. Smith, J., et al. Evidence for pore formation in host cell membranes by ESX-1-secreted ESAT-6 and its role in Mycobacterium marinum escape from the vacuole. Infection and Immunity. 76 (12), 5478-5487 (2008).
  32. Schnappinger, D., et al. Transcriptional Adaptation of Mycobacterium tuberculosis. within Macrophages. Journal of Experimental Medicine. 198 (5), 693-704 (2003).
  33. Fontan, P., Aris, V., Ghanny, S., Soteropoulos, P., Smith, I. Global Transcriptional Profile of Mycobacterium tuberculosis during THP-1 Human Macrophage Infection. Infection and Immunity. 76 (2), 717-725 (2008).
  34. Miranda-CasoLuengo, A. A., Staunton, P. M., Dinan, A. M., Lohan, A. J., Loftus, B. J. Functional characterization of the Mycobacterium abscessus genome coupled with condition specific transcriptomics reveals conserved molecular strategies for host adaptation and persistence. BMC Genomics. 17 (1), 553 (2016).

Tags

אימונולוגיה זיהום גיליון 139 מיקרוביולוגיה אמבה Acanthamoeba castellanii Mycobacterium abscessus ספריה transposon תרבות משותפת אמבה-mycobacteria ה-RNA הפקת תאיים mycobacteria RNAseq.
זיהוי סמנים התקפה אלימה של <em>Mycobacterium abscessus</em> עבור שכפול תאיים ב Phagocytes
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dubois, V., Laencina, L., Bories,… More

Dubois, V., Laencina, L., Bories, A., Le Moigne, V., Pawlik, A., Herrmann, J. L., Girard-Misguich, F. Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes. J. Vis. Exp. (139), e57766, doi:10.3791/57766 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter