Summary
Här presenterar vi två protokoll för att studera fagocytsystemet -Mycobacterium abscessus interaktioner: screening av transposon mutant bibliotek för bakteriell intracellulär brist och bestämning av bakteriell intracellulära transkriptom från RNA sekvensering. Båda tillvägagångssätten ger insikt om genomisk fördelar och transcriptomic anpassningar öka intracellulära bakterier fitness.
Abstract
Vad skiljer Mycobacterium abscessus från andra saprofytiska mykobakterier är förmågan att motstå fagocytos av mänskliga makrofager och förmågan att föröka sig inuti sådana celler. Dessa virulens drag återge M. abscessus patogena, särskilt i utsatta värdar med underliggande strukturella lungsjukdom, exempelvis cystisk fibros, bronkiektasi eller tuberkulos. Hur patienter smittas med M. abscessus oklar. Till skillnad från många mykobakterier, M. abscessus finns inte i miljön men kan finnas inuti endoparasiterna, miljömässiga fagocyter som representerar en potentiella reservoar för M. abscessus. Faktiskt, M. abscessus är resistent mot amoebal fagocytos och intra-amoeba livet verkar öka M. abscessus virulens i en experimentell modell av infektion. Men är lite känt om M. abscessus virulens i sig själv. För att dechiffrera de gener som ger en fördel till M. abscessus intracellulära liv, utvecklades en screening av M. abscessus transposon mutant bibliotek. Parallellt utvecklades en metod för RNA-extraktion från intracellulära mykobakterier efter samtidig kultur med endoparasiterna. Denna metod var validerad och tillät sekvensering av hela M. abscessus transcriptomes inne i cellerna; att ge, för första gången, en global syn på M. abscessus anpassning till intracellulära liv. Båda tillvägagångssätten ger oss en inblick i M. abscessus virulensfaktorer som möjliggör M. abscessus att kolonisera luftvägarna hos människa.
Introduction
Släktet Mycobacterium omfattar arter allt från ofarliga saprofytiska organismer till stora mänskliga patogener. Välkända sjukdomsframkallande arter som Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium marinum och Mycobacterium ulcerans tillhör undergruppen av långsamt växande mykobakterier (SGM). I kontrast, undergruppen av snabbt växande mykobakterier (RGM) kännetecknas av deras förmåga att bilda synliga kolonier i mindre än 7 dagar på agarsubstrat. RGM gruppen består av mer än 180 arter, främst icke-patogena saprofytiska mykobakterier. Studier på RGM interaktioner med sina värdar har främst fokuserat på Mycobacterium smegmatis och visar att dessa mykobakterier elimineras snabbt av den bakteriedödande effekten av makrofager.
Mycobacterium abscessus är en av de sällsynta RGM som är patogen för människor och ansvarar för ett brett spektrum av infektioner alltifrån hud och mjukdelsinfektioner till lung- och disseminerad infektioner. M. abscessus anses, tillsammans med Mycobacterium avium, huvudsakliga mykobakteriella patogenet i cystisk fibros patienter1.
Olika studier utförs på M. abscessus indikerar att denna mycobacterium beter sig som en intracellulära patogener, kan överleva den bakteriedödande Svaren av makrofager och fibroblaster i lungorna och huden, som inte vanligtvis observeras i RGM 2 , 3 , 4. M. abscessus genomanalys har identifierat metabolismvägarna som normalt återfinns i miljön mikroorganismer i kontakt med jorden, växter och vattenmiljöer, där gratis endoparasiterna är ofta närvarande5. De har också visat att M. abscessus är begåvad med flera virulensgener som inte finns i den saprofytiska och icke-patogena RGM, troligen förvärvats av den horisontell genöverföring i en nisch som är gynnsam till genetisk utbyte som kan samla olika amöba resistenta bakterier.
Experimentellt, var en av de första slående resultaten observationen av intracellulära tillväxten av M. abscessus i makrofager samt när det gäller M. tuberculosis6. M. abscessus motstår också försurning av phagosome, apoptos och autofagi, tre grundläggande mekanismer av cellulära motståndet till infektion2. Det har även visat att M. abscessus ska kunna upprätta en omedelbar kommunikation mellan phagosome och cytosolen, en mer näringsrik miljö som kan gynna bakteriell multiplikation2. Mycket lite är känt om genomisk fördelarna som M. abscessus äger eller har förvärvat för att möjliggöra överlevnad i en intracellulär miljö. Amöba coculture är en effektiv metod som tillåtna isoleringen av många nya amöba resistenta bakterier som Mycobacterium massiliense7,8. En förmåga att föröka sig inom endoparasiterna observerades, i en modell av aerosolization av M. abscessus i möss, som kan ge en ökad virulens M. abscessus4. En hypotes är att M. abscessus hade utvecklat genetiska egenskaper som uppstått inom denna miljö att överleva i Fagocytos celler, som skiljer sig från andra icke-patogena RGM. Dessa förvärv kan gynna möjligheten att sprida och dess virulens i den mänskliga värden.
Denna rapport beskriver verktyg och metoder att markera genomisk fördelar som är knutna till M. abscessus att överleva i endoparasiterna miljö. För detta ändamål beskrivs screening av M. abscessus transposon mutanter först på Acanthamoeba castellanii typ stam, som möjliggör identifiering av mutant's defekt intracellulära tillväxt. En andra sållning i makrofager rapporteras också, att bekräfta om detta fel kvarstår i den mänskliga värden. För det andra, utvecklat celler och öka dess virulens i djurens värd, en metod som speciellt anpassad för M. abscessus var för att förstå vilka mekanismer är utnyttjas i M. abscessus att anpassa sig till livet i fagocytos, efter samtidig kultur i närvaro av endoparasiterna som tillät utvinning av total-RNA från intra-amoebal bakterier. Som en följd utvecklades en helhetssyn av M. abscessus gener som krävs för en intracellulär liv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bibliotek Screening
- Byggandet av Tn mutant biblioteket
- Skaffa en transposon bibliotek.
Obs: För detta experiment erhölls en transposon mutant bibliotek från E.J. Rubin, Harvard School of Public Health, Boston, USA. Biblioteket byggdes från en smidig kliniska stam (43S) av den M. abscessus komplexa (M. abscessus subsp. massiliense) med en phagemid som förs in M. abscessus möjliggör slumpmässiga införandet av en enda Tn i en TA-dinukleotid (91,240 TA sekvenser i genomet M. abscessus ). För mer information se referens av Rubin o.a. 9 och Laencina o.a. 10.
- Skaffa en transposon bibliotek.
- Titrering av bibliotek och bevarande av M. abscessusTn mutanter i plattorna
Anmärkning: Detta tar en vecka.- Tina i biblioteket på isen. Bestämma bakteriell koncentration genom att utföra seriespädningar i 1 mL vatten (10-1 till 10-15). Plåt en droppe varje utspädning på en petriskål innehållande 7H 11 agarsubstrat med 250 mg/mL kanamycin. Inkubera plattorna vid 37 ° C i 3 – 4 dagar.
Obs: Här, en titrering av 1011 bakterier/mL återvanns. - Efter att bestämma koncentrationen av biblioteket, späd biblioteket till en slutlig koncentration på 3 000 bakterier/mL i 10 mL 25% glycerol-vatten. Alikvot biblioteket i 10 frysrör med 1 mL av biblioteket i varje rör. Lagra alikvoter vid-80 ° C.
- När du är redo att använda, Tina en alikvot av det utspädda biblioteket på is och tillsätt 100 µL av biblioteket till 10 kvadrat Mueller-Hinton (MH) agarplattor (storlek 12 cm) för att återställa 200 till 300 enskilda kolonier efter 3 – 4 dagars inkubation vid 37 ° C.
- Med sterila tandpetare, överföring enskilda kolonierna (omkring 6.000 kolonier i 60 x 96 brunnar) till 96 brunnar fyllda med 200 µL 7 h 9 medium kompletteras med 0.2% glycerol, 1% glukos, 250 mg/mL kanamycin. Inkubera vid 37 ° C i 5 dagar utan att skaka.
- Överför 100 µL av kulturen (steg 1.2.4) till en plattan med 96 brunnar innehållande 100 µL av 7H 9 medium med 40% glycerol. Lagra det beställda biblioteket vid-80 ° C.
- Upprepa steg 1.2.3. till 1.2.5. med resten av biblioteket tills 10 000 enskilda kloner återvinns (runt 100 x 96 brunnar plattan och 30 MH plattor).
- Tina i biblioteket på isen. Bestämma bakteriell koncentration genom att utföra seriespädningar i 1 mL vatten (10-1 till 10-15). Plåt en droppe varje utspädning på en petriskål innehållande 7H 11 agarsubstrat med 250 mg/mL kanamycin. Inkubera plattorna vid 37 ° C i 3 – 4 dagar.
- Beredning av endoparasiterna
- Kultur amöba Acanthamoeba castellanii (AC) i 75 cm2 vävnadsodling kolvar (RT) i rumstemperatur 30 mL PYG medium (tabell 1) för förstärkning av cellen linje11.
Obs: Mogna trophozoites från stora självhäftande celler med talrika mag vakuoler är klart synliga på Mikroskop. Cellen fördubbling tid uppskattas att 25 h. celler var förstärks varje 3 dagar genom att sprida en tredjedel av den ursprungliga kulturen i 75 cm2 vävnadsodling kolvar. - Ta bort det PYG mediet med 25 mL pipett. Tvätta cellerna med 10 mL AC buffert (tabell 2), som inte innehåller någon koldioxid eller kväve källor12. Upprepa tvätten dubbelt mer.
Obs: AC buffert som innehåller inga kol eller kväve källor undviker extracellulära tillväxten av mykobakterier. Detta minsta medium leder till encystment av endoparasiterna. För att begränsa detta, lades Värmeinaktiverade E. coli som substrat (steg 1.4) till endoparasiterna och mycket kort kultur gånger främjades (48 h för mutant screening) och 4 h eller 16 h kultur för RNAseq experiment. Alternativt använda detta medium men berikad med PYG medium (vanligen 10%). - Lossa amöban från botten av kolven med en enda kraftfull skaka av vävnadsodling kolven.
- Räkna celler med en hemocytometer att justera cellkoncentrationen till 5 x 105 endoparasiterna/mL utspädd i AC-buffert.
- Kultur amöba Acanthamoeba castellanii (AC) i 75 cm2 vävnadsodling kolvar (RT) i rumstemperatur 30 mL PYG medium (tabell 1) för förstärkning av cellen linje11.
- Beredning av Värmeinaktiverade Escherichia coli bakterier att mata amöba efter infektion
- Växa i E. coli kliniska isolera stam från en glycerol lager i 100 mL av Luria buljong (LB) över natten vid 37 ° C.
- Skörda bakterierna genom centrifugering vid 1 835 x g i 10 min i 50 mL rör. Kassera supernatanten. Återsuspendera pelleten med 10 mL 10% glycerol-vatten. Upprepa två gånger mer tvätt.
- Återsuspendera pelleten med 5 mL 10% glycerol-vatten. Alikvotens 0,5 mL i 1,5 mL rör. Bestämma mängden bakterier/mL genom att utföra seriespädningar och lägga till spädningar på LB agarplattor. Lagra alikvoter vid-80 ° C.
- Dagen innan amöba infektion, Tina en alikvot på is och vidare till värme-dödande genom ruvning röret vid 70 ° C i 60 min.
Obs: Kontrollera inaktivering av plätering 100 µL av inaktiverat bakterier på LB agarplattor över natten vid 37 ° C. Inga kolonier ska synas efter en natt av kultur. - Späd värmeavdödade bakterier till en koncentration av 107 bakterier i 50 µL av AC buffert och lagra de utspädda bakterierna vid 4 ° C i högst en vecka.
- Samtidig kultur av endoparasiterna -M. abscessus Tn mutant: första skärm
Anmärkning: Detta tar 3 – 4 månader för screening av 6.000 mutanter.- Sprida 5 x 104 endoparasiterna per brunn till en plattan med 96 brunnar i 100 µL av AC buffert. Inkubera i 1 h vid 32 ° C utan att skaka. Låt den flytande amöba trophozoïtes tid att hålla sig till brunnarna.
- Samtidigt ruvning, Tina bakterier på is för 1 h.
- Tillsätt 5 µL av de tinade bakterier kulturerna med en elektronisk flerkanalspipett. Infektera för 1,5 h. skärmen runt 6.000 individualiserad kloner från plattan med 96 brunnar Tn mutanter lager.
Obs: MOI är okänd på detta steg i protokollet. men odlades alla de 96 brunnar innehållande Tn mutanter på exakt samma sätt. Denna första skärmen syftar till att snabbt identifiera intracellulära bristfällig mutanter, utan hänsyn till variationerna i inokulum densitet. - Efter 1,5 h av infektion, Invertera plattan med 96 brunnar på sterila Flor placeras i en steriliserad metall bricka ta bort AC mediet under en spiskåpa. Fyll på med 200 µL av AC medium. Upprepa detta två gånger mer tvätt.
- Tillsätt 200 µL av färskt medium kompletteras med 100 µg/mL amikacin att undanröja återstående extracellulära mykobakterier.
- Inkubera i 2 h innan du fortsätter med 3 ytterligare tvättar (enligt beskrivningen i steg 1.5.3). Efter tvättning, upprätthålla kulturer med 50 µg/mL amikacin i 200 µL AC buffert.
- Lägg till 5 x 107 Värmeinaktiverade Escherichia coli -bakterier (från steg 1.4) i slutet av infektionen och varje 24 h att förhindra encystment av endoparasiterna.
- Efter 48 h av samtidig kultur, lyse celler genom att lägga till 10 µL 10% SDS (sodium dodecyl sulfate) till varje brunn och inkubera i 30 min vid 32 ° C. Fortsätt med den seriella utspädningen och lägga på Columbia agarplattor som innehåller 5% får blod (COS pläterar) för att utvärdera antalet intracellulära mykobakterier. Försegla plattan med parafilm och inkubera vid 37 ° C.
- När kolonierna visas på agarplattor efter 3-4 dagar, Fotografi plattan och identifiera mutanter nedsatt för intracellulära tillväxt genom att observera insättningarna med det lägsta antalet bakteriekolonier.
Obs: Inte misstycker om form, höjd eller densitet av kolonin (figur 1A). 136/6000 mutanter identifierades.
- Sprida 5 x 104 endoparasiterna per brunn till en plattan med 96 brunnar i 100 µL av AC buffert. Inkubera i 1 h vid 32 ° C utan att skaka. Låt den flytande amöba trophozoïtes tid att hålla sig till brunnarna.
- Samtidig kultur av endoparasiterna -M. abscessusTn mutant: andra skärm av mutanter identifierats under den första skärmen
Anmärkning: Detta tar 2 veckor. En andra skärm måste utföras med 136 försvagat mutanter erhålls efter den första skärmen att kvantifiera exakt antalet bakterier inokuleras och antalet intracellulär överlevnad bakterier 2 dagar efter infektion.- Vuxit 1 koloni av varje påverkade mutant i 50 mL fyllda rör med 20 mL 7 h 9 medium kompletteras med 0,2% glycerol, 1% glukos och 250 mg/mL kanamycin. Tillåter bakterierna att nå den exponentiella fasen (0,6 < OD < 0,8).
- Tvätta kulturen genom centrifugering (1 835 x g i 10 min) i AC medium. Kassera supernatanten. Upprepa detta tvätta två gånger med 20 mL 7 h 9 medium kompletteras med 0,2% glycerol, 1% glukos och 250 mg/mL kanamycin.
- Återsuspendera bakterierna i 5 mL AC buffert.
- Fastställa de kolonibildande enhet (CFU) koncentrationen av mutanter. I 24 brunnar, tillsätt 1 mL vatten till de två första raderna. Tillsätt 100 µL av bakteriesuspensionen till den första brunnen. Med en mikropipett, blanda tre gånger. Sedan, aspirera 100 µL och insättning till andra väl.
- Med ett nytt tips, upprepa steg 1.6.4 från andra väl till den tredje, osv tills tolfte väl.
- Aspirera 30 µL av den 10-12 utspädningen och lägga till en COS tallrik. Upprepa för de andra spädningarna.
- Wrap COS plattan med parafilm och Inkubera under 3 – 4 dagar vid 37 ° C. Bestämma koncentrationen genom räkning av kolonierna.
- Utför samtidig kultur analyser som beskrivs ovan i tre exemplar i en 24-well platta med 5 x 104 amöba per brunn i 1 mL AC Co odlingsmedium. Inokulera med en multiplicity av infektion (MOI) 10.
- Efter 48 h av samtidig kultur, fortsätta med cellys som beskrivs i steg 1.5.7. Utföra seriespädningar i vatten (10-1 till 10-6) och Lägg till 30 µL COS plattorna. Inkubera plattorna i 4 dagar vid 37 ° C innan du fortsätter med CFU räknar.
Obs: Efter denna andra skärm, 60 av 136 mutanter var bevarad. - Lagra mutanter påverkade för sin överlevnad inne i cellerna. Lägga till en koloni i en cryotube som innehåller LB medium med glycerol (20% slutlig) eller i en cryotube som innehåller kommersiell lösning och mikrokulor att gynna ett långsiktigt bevarande och underlätta framtida inympningen och sedan lagra vid-80 ° C.
- Bedöma i vitro mutant tillväxten genom att mäta den optiska densiteten (OD) på 600 nm varannan dag.
- Växa 1 koloni av varje påverkade mutant i 50 mL rör fyllda med 20 mL 7 h 9 medium kompletteras med 0,2% glycerol, 1% glukos och 250 mg/mL kanamycin. Tillåter bakterierna att nå den exponentiella fasen (0,6 < OD < 0,8) innan du justerar OD till 0,01 för att påbörja kinetik.
- Utesluta mutanter med en in vitro- tillväxt defekt jämfört med WT stam från uppsättningen av intracellulära bristfällig mutanter.
- Samtidig kultur av makrofager -M. abscessus Tn mutant defekt för ett intra-amoeba liv
Anmärkning: Detta tar 1 månad.- Sprida 5 x 104 J774.2 murina makrofager per brunn 24-well platta i 1 mL rikt medium, DMEM kompletteras med 10% av fostrets kalv Serum (FCS). Inkubera plattorna under 24 timmar vid 37 ° C och 5% CO2 att tillåta makrofag vidhäftning. Ge 3 replikat.
- Utföra infektionen. Inokulera Tn mutanter, med en MOI 10, utspädd i DMEM med 10% FCS i en volym av 100 µL.
- Efter 3 h av infektion, utföra tre tvättningar med 1 mL DMEM (en vakuumpump kan användas). Då behandla med 250 µg/mL amikacin (i DMEM med 10% FCS) för 1 h att undanröja återstående extracellulära mykobakterier.
- Efter 3 ytterligare tvättar med 1 mL DMEM, behålla kulturerna i 250 µg/mL amikacin (i DMEM med 10% FCS) till en slutlig volym av 1 mL att förhindra extracellulära mykobakteriella multiplikation.
- 72 h efter samtidig kultur, ta bort mediet och lysera makrofager genom att tillsätta 1 mL kallt vatten. Inkubera i 30 minuter vid 4 ° C.
- Utföra CFU analyser på COS pläterar för att utvärdera antalet intracellulära bakterier.
- I en 24-väl plattan, tillsätt 1 mL vatten till de två första raderna. Tillsätt 100 µL av den samtidig cellen lysate till den första brunnen. Med en mikropipett, blanda tre gånger. Aspirera 100 µL och sätta in dem i andra väl.
- Med ett nytt tips, upprepa utspädningen från andra väl till den tredje, osv tills tolfte väl. Sedan aspirera 30 µL av den 10-12 utspädningen och lägga till en COS tallrik.
- Upprepa för de andra spädningarna. Wrap COS plattan med parafilm och vänta 3-4 dagar för att observera och räkna kolonierna.
- Identifiering och sekvensering av platsen för insättning av Tn i M. abscessus mutanter
Anmärkning: Detta tar 1,5 månader för 60 mutanter.- Genomisk utvinning av de identifierade M. abscessus mutanter
- Växa mutanter i en 50 mL tub med 20 mL 7H 9 medium kompletteras med 0,2% glycerol, 1% glukos och kanamycin 250 mg/mL till exponentiell fas (OD600= 0,8).
- Skörda 10 mL av kulturerna (2 396 x g, 5 min). Kassera supernatanten. Avbryta bakterierna i 500 µL lösning (25% sackaros, 50 mM Tris pH 8, 10 mg/mL lysozym, 40 mM tiourea). Överför lösningen till 2 mL rör med skruvlock och inkubera i 2 timmar vid 37 ° C.
- Tillsätt 500 µL lösning II (25% sackaros, 50 mM Tris pH 8, 50 mM EDTA). Efter pipettering upp och ned 5 - 10 gånger, lägga zirkonium pärlor fram till en volym av 500 µL i röret.
- Fortsätt med cellys med en Homogenisatorer (3 x 6000 rpm, 45 s) med en 1 min inkubation på isen mellan varje omgång.
- Tillsätt 5 µL 20 mg/mL proteinas K (100 µg/mL slutlig) och inkubera proverna övernattning på 55 ° C.
- Tillsätt 1 mL av förkylning av fenol/kloroform/isopentanol (25:24:1) om du under ett dragskåp. Blanda proverna av omskakas innan du fortsätter med centrifugering vid RT och 16 500 x g i 30 min.
- Därefter centrifugering, vattenfasen och tillsätt en motsvarande volym av kall fenol/kloroform/isopentanol lösning under en huv. Centrifugera proverna vid 16.500 x g i 30 min att återställa vattenfasen igen.
- Lägga till 0.7 volym RT isopropanol återvunna vattenfasen under ett dragskåp. Invertera långsamt rören för att möjliggöra DNA nederbörd och inkubera i 5 min på RT. Sedan Centrifugera i 10 min vid 16.500 x g och RT.
- Avlägsna supernatanten och tvätta pelleten med 500 µL av 70% etanol under en huv. Centrifugera rören i 10 min vid 16.500 x g vid RT innan du tar bort etanol. Inkubera i 10 min så att resterande alkohol avdunstning.
- Slutligen, centrifugerade DNA i 100 µL av DNAS/RNase gratis vatten. Bestämma DNA avkastning och renhet DNA med en spektrofotometer.
- Ta bort 1 µg av genomisk DNA och sammanfattad med 10 U av ClaI för en natt för sub kloning Tn insticksstället. Använda tillverkarens protokollet.
Obs: Clajag enzym är en av de mest högt representerade restriktionsenzym i M. abscessus genomet (2.173 begränsning webbplatser). En Clajag begränsning webbplats finns även i Tn sekvensen uppströms av kanamycin motstånd kassetten Tn muterade. Således den Clajag-medierad subkloning gör det möjligt för att identifiera Tn insticksstället.
- Sub kloning i en plasmid genomisk DNA som innehåller Tn
Obs: Innan du fortsätter med Tn-subkloning i 2.686 bp pUC19 ampicillin-resistenta plasmiden, lägga till en Clajag begränsning plats i flera kloning platsen av Plasmiden. Sekvensen av pUC19 Plasmiden kan hittas på denna länk https://www.addgene.org/50005/sequences/.- Följ tillverkarens 's protokoll att smälta pUC19 plasmiden med EcoRjag och HindIII, som frigör ett fragment av 51 bp och ett fragment av 2635 bp. rena dubbel smält vektorn med en kommersiell PCR rening kit att eliminera 51 bp publicerat fragment.
- Blanda 1 µL (koncentration 25 pmol/µL) av två kompletterande oligonukleotider (5 'AGCT TATA AGATCT TATA ATCGAT TATA3' och 5 'AAT TAA TAA TCG ATT ATA AGA TCT TAT A3') 28 bp var och en innehåller Clajag begränsning webbplats och i ändarna av HindIII och EcoR Jag begränsning platser. Värma vid 100 ° C i 10 min och sedan kyla för att binda dem.
- Smälta Parade primers av EcoRjag och HindIII enligt tillverkarens protokollet.
- Ligera 150 ng av EcoRjag /HindIII-begränsad pUC19 plasmid med olika koncentration av Parade primers (50 pmol/µL, 25 pmol/µL, 2,5 pmol/µL) för 1 h på RT med 1 U av T4 DNA-ligase i en slutlig volym av 20 µL. Kontrollera kloning av en annan enzymatisk nedbrytning.
- Smälta den modifierade plasmiden med ClaI för 2 h vid 37 ° C.
- Ligera 50 ng av Clajag-begränsat pUC19plasmid och 50 ng av genomisk DNA smältas av Clajag för 1 h på RT med 1 U av T4 DNA-ligase i 10 µL.
- Gå vidare till E. coli electrocompetent bakterier omvandling med 5 – 10 µL av ligation (2500 V, 200 ohm, 25 µF). Välj klonerna på LB agarplattor kompletteras med 50 µg/mL kanamycin och 50 µg/mL ampicillin välja bakterierna bär plasmider med delar av Tn-sekvenser.
- Odla motståndskraftiga kloner över natten i LB flytande medium med lämpligt antibiotikum urval (50 µg/mL kanamycin och 50 µg/mL ampicillin).
- Extrahera plasmid DNA. Kontrollera förekomsten av skäret genom enzymatisk begränsning och sekvens 3' ände Tn att identifiera störd genen med en oligonukleotid (5' TTGACGAGTTCTTCTGA 3') som motsvarar de senast 17 baspar av den Tn kanamycin motstånd kassett.
- Rikta in sekvensen mot M. abscessus gå 06 stammen genom att utföra en nukleotid blast (BLAST-N).
- Genomisk utvinning av de identifierade M. abscessus mutanter
2. RNA-extraktion av intracellulära mykobakterier för Rnaseq analys
Anmärkning: Detta tar 4 månader för experiment och 4 månader för RNAseq analys.
-
Samtidig kultur av endoparasiterna-M. abscessus batchvis
Obs: I följande experimentet, samtidig kultur utförs i 50 mL rör med agitation att gynna bakterier till Cellkontakter.- Växa M. abscessus i 7 H 9 medium kompletteras med 0,2% glycerol, 1% glukos till mitten av-exponentiell fas vid 120 rpm.
- Tvätta bakterierna två gånger med 10 mL AC buffert.
- Uppskatta den bakterier koncentrationen genom att mäta den OD600nm (1 OD600= 4 x 108 mykobakterier). Lägga till 8,5 x 108 mykobakterier 8,5 x 106 endoparasiterna i 10 mL av AC medium.
- Inkubera i 1 h vid 30 ° C med mild agitation (ca 80 rpm).
- Skörda cellerna genom centrifugering vid 253 x g i 12 min. ta bort supernatanten och avbryta cellerna i 10 mL av AC buffert. Upprepa detta två gånger mer tvätt.
- Att resuspendera cellerna i 10 mL AC buffert innehållande 50 µg/mL amikacin för att eliminera extracellulära bakterier och inkubera i 4 timmar vid 30 ° C med mild agitation (80 rpm). Tvätta cellerna två gånger igen.
-
Utvinning av total-RNA från intracellulära M. abscessus
Obs: Utföra steg 2.2.1–2.2.3 under dragskåp på grund av användningen av giftiga reagenser.- Efter de slutliga tvättar, blandas de infekterade endoparasiterna i 4 mL kall lösning III (tabell 3) med tillfället 280 µL av β-merkaptoetanol att störa endoparasiterna. Detta är guanidinium kaliumtiocyanat (GTC) steget. Behålla punktskatteuppskovet på is för 10 min. Centrifugera cellen lysate för 30 min vid 2 396 x g och 4 ° C för att pellets utsläppt intracellulära bakterier.
- Avlägsna supernatanten och centrifugerade bakteriell i 1 mL kall lösning III. Skörda bakterierna vid 2396 x g under 30 minuter vid 4 ° C. Återsuspendera pelleten i 1 mL av utvinning buffert och överföring till en 2 mL skruven rör som innehåller zirkonium pärlor (till 500 µL graderingen av röret). Förvara rören under minst 24 h vid-80 ° C.
Obs: Lagring i Lys reagensen medger inaktivering av RNaser och cell upplösning. - När du är klar för användning, Tina prover på is och lysera dem med en Homogenisatorer genom att utföra två rundor på 6,000 rpm för 25 s, följt av en runda vid 6,000 rpm för 20 s med en 1 min inkubation på isen mellan varje omgång.
- För att svalna av provet, inkubera dem på is i 10 min. Sedan tillsätt 200 µL kloroform utspätt i isopentanol. Efter vortexa Centrifugera proverna för 1 min, 15 min vid 16.500 x g och 4 ° C.
- Tillsätt 0,8 mL kall isopropanol till vattenfasen och inkubera proverna för 2 – 3 h vid 20 ° C. Centrifugera proverna för 35 min på 16 500 x g och 4 ° C. Kassera supernatanten.
- Tvätta pelleten RNA genom att lägga till 500 µL kallt 70% etanol (blanda inte).
- Centrifugera proverna vid 16.500 x g i 10 min till avlägsna etanolen. Aspirera lösningen och torka i en centrifugal koncentrator.
- När torkat, Återsuspendera pellets i 100 µL av DNAS/RNase gratis vatten.
Obs: Prover måste behandlas två gånger med DNases att avlägsna DNA föroreningar enligt tillverkarens rekommendationer. - Bedöma RNA integriteten på en agarosgel och bekräfta genom att mäta antalet RNA integritet (RIN) och ribosomal förhållandet med en chip-baserade kapillärelektrofores metod.
Obs: RIN beaktar hela elektroforetiska spårningen. RIN mjukvaran algoritmen tillåter för klassificering av total-RNA, utifrån ett numreringssystem från 1 till 10, med 1 är den mest förnedrade profilen och 10 är mest intakt. För att fortsätta med cDNA bibliotek förberedelse, måste RINs vara över 8 och ribosomal förhållandet [28S/18S] så högt som möjligt, det idealiska värdet 2, beroende på organismen och dess särdrag. - Lagra RNA prover vid-80 ° C fram till utarbetandet av cDNA biblioteket för sekvensering.
-
Beredning av cDNA biblioteket
- För att fortsätta med bibliotek förberedelse, använda ett kommersiellt tillgängliga cDNA syntes kit (Tabell för material) med tillverkarens protokollet.
- Kolla på biblioteket för koncentration och kvalitet på ett DNA Chip.
Obs: Mer exakt och korrekt kvantifiering kan utföras med känsliga lysrör-baserade kvantitering analyser.
-
Bibliotek-sekvensering
- Normalisera proverna till 2 nM och gå vidare till multiplexing enligt flöde cell organisationen.
- Denaturera proverna vid en koncentration på 1 nM med 0,1 N NaOH för 5 min på RT.
- Späd ut proverna på 10 pM. Fyll varje prov på cellen flöde på 10 pM.
- Fortsätt med sekvensering med ett högt dataflöde sekvensering system som möjliggör storskalig genomik. Här kör var en SRM-kör (SR: enda Läs, PE: Parade-end läsningar, M: multiplexed prover) 51 cykler med 7 index baser Läs.
- Bedöma kvaliteten på sekvenseringen med externa FastQC program13.
- Efter Intrimningen av adapter sekvenser, fortsätta med Läs linjeföring mot en referens genomet. Justera mot eukaryot cell genomet att bedöma provet kontaminering och, om nödvändigt, Fortsätt med Intrimningen av den icke-bakteriell läser.
-
Statistisk analys
- Använda flera programvaror tillgängliga online definiera uppsättningar av Differentiellt uttryckta gener: R programvara, Bioconductor paket inklusive DESeq2 och PF2tools paketet (version 1.2.12) utvecklat vid plattformen ”transkriptom et Epigénome” (Pasteur Institutet, Paris).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
M. abscessus har förmågan att motstå och fly bakteriedödande svaren från makrofager och miljömässiga protozoer såsom endoparasiterna. M. abscessus uttrycker virulensfaktorer när den odlas i kontakt med endoparasiterna, vilket gör det mer virulent i möss4. Det första syftet med dessa metoder var att identifiera generna som är närvarande i M. abscessus så att dess överlevnad och förökning inom endoparasiterna.
För detta, en mutant bibliotek av M. abscessus subsp. massiliense, erhålls genom Tn leverans9, visades efter samtidig kultur i närvaro av endoparasiterna, att identifiera mutanter med försvagade tillväxten i detta intracellulära miljö (figur 1). Beteendet hos samma mutanter utvärderades också efter samtidig kultur med makrofager att analysera huruvida denna tillväxt dämpning bevarades i möss makrofager.
Detta blinda transposon bibliotek screening strategi, bekräftade en defekt replikering fenotyp för 47 av 6.000 mutanter som hade en överlevnad på 50% eller mindre i endoparasiterna eller makrofager, jämfört med kontroller10. För att utesluta har mutanter med försvagat intracellulär överlevnad som kan bero på en inneboende tillväxt defekt av mycobacterium, tillväxten kurvor av alla valda Tn mutanter utvärderats i en in vitro- flytande berikad odlingsmedium (1% glukos - 7 H 9). In vitro tillväxt av alla mutanter övervakades genom att följa OD600 av kulturer varannan dag. De olika mutanter som visas en in vitro- tillväxt defekt jämfört till motsvarande vildtyp stam uteslöts från studien.
Det var mycket viktigt för detta blindtest återges varje dag använder exakt samma protokoll. Begränsning av denna teknik var på första visuella screening, tagna av varje CFU att ge en korrekt bild för referens. I denna grupp av mutanter identifierades 12 M. abscessus mutanter (med duplikat) som transposon infogades i generna tillhör det ESX-4 locus av typen VII sekretionssystemet som understryker dess betydelse i den intracellulära tillväxten av M. abscessus10.
Hittills har analysen av M. abscessus virulens huvudsakligen baserats på den jämförande analysen av genomet hos M. abscessus med M. chelonae, en mycobacterium tillhör samma grupp, men orsakar endast infektioner i huden hos människa. Syftet var att få en katalog av de gener som uttrycks under olika samtidig odlingsbetingelser för att bättre förstå anpassning och potentiellt virulens mekanismer som är involverade under samtidig kultur i närvaro av miljömässiga professional fagocyter. Analysen av detta ökad virulens genom en heltäckande strategi för totala sekvensering messenger RNAs av M. abscessus, utfördes för att upptäcka RNASEN inducerad eller förträngt under amöba samtidig kulturer jämfört med RNASEN transkriberas under in vitro- villkor. Differentiell uttrycket av dessa RNAs kan medföra att M. abscessus en förbättrad ”virulens” förklarar koloniseringen av de övre luftvägarna hos människa.
Dessa samtidig kulturer genomfördes igen i en minsta medium (ingen källa av kol eller kväve) som beskrivits ovan, för att förhindra extracellulära tillväxten av M. abscessus och vara representativ för de miljöförhållanden som möter dessa mykobakterier och under trycket av urval av ett antibiotikum under samtidig kultur att välja intracellulära mykobakterier.
Därför utvecklades en teknik för att isolera RNA från intracellulära mykobakterier. Den största svårigheten med denna extraktion av mykobakteriella RNA var att undvika kontaminering med amoebal RNA (Eukaryoter typ). För att undvika detta, utfördes lys av amöba vid olika tidpunkter post samtidig kultur, använder guanidinium kaliumtiocyanat (GTC); eftersom intracellulära mykobakterier är resistenta. Efter detta steg genomfördes en mekanisk utvinning av mykobakteriella RNASEN med hjälp av en cell-Homogenisatorer i närvaro av zirkonium pärlor. Denna teknik tillät oss att erhålla mykobakteriella RNA av god kvalitet, med hög kvalitet, nödvändigt att förbättra förmågan att genomföra en fullständig analys av den M. abscessus transkriptom, RIN flera med hjälp av messenger RNA-sekvensering (mRNA) teknik (figur 2). Detta har aldrig gjorts tidigare och gav oss en grundläggande vision av genen familjerna induceras eller förträngt, genom att gruppera dem efter sin roll: M. abscessus svar på en miljö som begränsad i sin källa av näringsämnen och mineraler, att en hypoxisk eller sur miljö och motstånd av M. abscessus mot oxidativ och nitrosative stress och slutligen uttryck för M. abscessus virulens i miljömässiga amöba.
Figur 1 : A. första visuella skärmen i M. abscessus Tn mutanter i amöba. (A) storskaliga skärmen av Tn mutanter på endoparasiterna utförs i 96 brunnar med en slumpmässig multiplicity av infektion att snabbt identifiera försvagat mutanter. (B) identifiering av de försvagade Tn mutanterna störs gener. TN mutanter genomiskt DNA är fragmenterad med Clajag att klona Tn insticksstället. M. abscessus genomen hamnar 2500 Clajag begränsning webbplatser som gynnar erhållande av korta DNA fragment men sänkte sannolikheten att klona Tn insticksstället (1/2500). Kloner är valda med kanamycin, motstånd björnen av transposon. Störd genen identifieras av sekvensering med en primer inuti Tn kanamycin motstånd kassetten (svart pil). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Analys av mykobakteriella RNA-extraktion. (A), RNA utvinning av intracellulära M. abscessus under endoparasiterna -M. abscessus samtidig kultur. Endoparasiterna samtidig kulturer med M. abscessus utförs på en hög multiplicity av infektion (dvs 100) i stora volymer, med mild agitation, att gynna cell till bakterier kontakter. Efter samtidig kulturer, celler skördas och lyserat med en kombination av GTC och ß-merkaptoetanol. Cell lysate-innehållande bakterier behandlas med GTC igen för att försvaga cellväggen bakterier för att underlätta bakterier mekaniker lysis före RNA-extraktion. (B) RNA kvalitet och integritet bedömning med en bioanalyzer. En elektrofores gel ges som rRNA observeras (23S, 16S och 5S). RIN måste vara över 8 för att fortsätta med bibliotek förberedelse för sekvensering och rRNA nyckeltal (23S/16S) så högt som möjligt beroende på organismen, idealiska värdet 2. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Beteendet hos M. abscessus är mycket mer liknar beteendet hos patogena SGM såsom M. tuberkulos än alla andra mykobakterier som tillhör RGM2. Nyckelelement i patogenicitet av SGM är deras förmåga att överleva eller ens multiplicera inom antigen-presenterande celler, såsom makrofager och dendritiska celler.
M. abscessus har förvärvat vissa genomisk fördelar som visas av den totala sekvensen av dess arvsmassa14 för att överleva i en eukaryot fagocytos cell. Genomet hos M. abscessus har visat sig utvecklas snabbt och mycket plast, med många nyligen introducerade införande sekvenser såsom prophages och nya gener15. Även om det är mindre data på virulens faktorer i M. abscessus jämfört med M. tuberculosis, verkar M. abscessus kunna utvecklas snabbt och aktivt mot ökad virulens. Tills nu baserades analys av M. abscessus virulens i huvudsak på den jämförande analysen av genomet hos M. abscessus med M. chelonae, en mycobacterium tillhör samma grupp, men orsakar infektioner begränsat till huden hos människor. Vissa gener har inte presentera i M. chelonae men förekommer i M. abscessus, såsom fosfolipas C, delvis förklarat M. abscessus motstånd efter fagocytos av miljömässiga endoparasiterna4.
Utvecklingen av en amöba samtidig kultur teknik kompletteras med omgivningsprov visat otvetydigt amöba-mykobakteriella interaktioner16,17. Således, mykobakterier kan isoleras från lysates Co odlade i närvaro av endoparasiterna i ett vatten behandling växt18, och M. massiliense var isolerad från sputum av en patient efter samtidig kultur med endoparasiterna, medan kulturen som ensam inte gjorde tillåta isolering av detta mykobakterier8. Endoparasiterna betraktas alltmer som en inkubator för mykobakterier4 och Acanthamoebasp. som en naturlig miljö värd för många icke-tuberkulösa mykobakterier. Amoeba plus mykobakterier samtidig kultur system alltmer föreslås som enkla och snabba modeller att karakterisera faktorer inblandade i intracellulära tillväxten av mykobakterier19,20,21, 22,23,24.
I miljön, är samspelet mellan mykobakterier och endoparasiterna dåligt dokumenterad. Den första artikeln som beskriver bevis för ett samband mellan mykobakterier och endoparasiterna i fältet kom ut under 2014, och denna studie fokuserade på en analys av en dricksvatten nätverk25.
Till vår kunskap är detta den första visningen som beskrivs under en samtidig kultur med endoparasiterna. Denna studie tillät oss att demonstrera den roll som miljömässiga fagocyter i förvärvet av virulens hos en opportunistisk patogen som påverkar människor. För att belysa dessa gener som krävs för M. abscessusintracellulär överlevnad, genomfördes en skärm av en mutant bibliotek av införlivande i en underart av M. abscessus komplexa och i en klinisk stam. Detta muterade bibliotek visades med endoparasiterna, detta senast har visats som en ”övningsfält” för att öka M. abscessus virulens i möss4, liknande den som observerats med M. avium26. Det stora resultatet var upptäckten för första gången i mykobakterier av den viktiga rollen som det ESX-4 locus kodning en typ VII sekretionssystemet och förfader till den ESX-1 locus anses viktiga för virulens och intracellulär överlevnad av M. tuberculosis Mycobacterium microti och M. marinum27,28,29,30,31.
Det andra målet var att få en katalog av de gener som uttrycks under olika samtidig odlingsbetingelser för att bättre förstå anpassning och potentiella virulens mekanismer som är involverade under samtidig kultur i närvaro av miljömässiga professionella fagocyter. Analysen av detta ökad virulens genom en heltäckande strategi för totala sekvensering av messenger RNAs av M. abscessus, utfördes för att upptäcka RNASEN inducerad eller förträngt under amöba samtidig kulturer jämfört med RNASEN transkriberas under in vitro- villkor. Differentiell uttrycket av dessa RNAs kan medföra att M. abscessus en förbättrad ”virulens” förklarar koloniseringen av de övre luftvägarna hos människa. Bland RGM arter är M. abscessus ett undantag till den icke-patogena fenotypen tillsammans med M. chelonae. M. abscessus förmåga att orsaka liknande patologier att tuberkulösa mykobakterier gör den ännu mer unik. Många studier har rapporterat de intracellulära anpassningarna av M. tuberkulos till liv inuti makrofager32,33 men ingen har fokuserat på M. abscessus anpassningar i vivo. Transkriptionell svar av M. abscessus hypoxi har varit beskrivs34 dock lyfta fram rollen som mycobactins och den dosR regulon som beskrivs i M. tuberkulos. Analys av den M. abscessus transkriptom inuti endoparasiterna och makrofager ger en inblick i de bakteriella anpassningar till intracellulära liv i sig.. En jämförelse av dessa transcriptomes tillåter bedömning av rollen av endoparasiterna utlösa M. abscessus virulens hos människor och att dechiffrera av specifika anpassningar till fagocytos däggdjursceller. Ett antagande har gjorts att amoebal miljön kan utgöra en 'utbildning marken' för M. abscessus innan överföring till mänskliga celler, för att beskriva M. abscessus virulens i form av evolutionära anpassningar, återger denna strategi ursprungliga .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi erkänner kraftigt Pr. E.J. Rubin (Harvard Medical School, Boston, USA) för dyrbara gåva muterade bibliotek och Dr. Ben Marshall (medicinska fakulteten, University of Southampton, UK) för korrigeringar av manuskriptet. Vi erkänner kraftigt franska patienten föreningen för cystisk fibros ”Vaincre la Mucoviscidose” och ”L'Association Gregory Lemarchal” för deras finansiella stöd (RF20150501377). Vi tackar också den nationella byrån för forskning (ANR program DIMIVYR (ANR-13-BSV3-0007-01)) och de Région Ile-de-France (Domaine d'Intérêt majeure Maladies Infectieuses et Emergentes) för finansiering av postdoktorsstipendium till Smootie_-M. L. L. är en doctoral fellow från den ”Ministère de L'Enseignement Supérieur et de la Recherche”.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of Material/ Equipment | |||
| 24-well plates | Thermofisher | 11874235 | |
| 96-well plates | Thermofisher | 10687551 | |
| Beadbeater | Bertin | Precellys 24 | |
| Bioanalyzer | Agilent | ||
| Genepulser Xcell | Biorad | ||
| Nanodrop spectrophotometer 2000 | Thermofisher | ||
| QuBit fluorometer | Thermofisher | Q33226 | |
| zirconium beads/silica beads | Biospec products | 11079101Z | Beads |
| Name of reagent/cells | |||
| Acanthamoeba castellanii | ATCC | 30010 | strain |
| Amikacin | Mylan | 150927-A | powder |
| B-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | solution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | >93% granular anhydrous |
| Chloroform | Fluka | 25666 | solution |
| ClaI enzyme | New England Biolabs | R0197S | enzyme |
| Columbia agar | Biomerieux | 43041 | 90 mm |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | powder |
| DMEM | Thermofisher | 11500596 | medium |
| DNase and RNase free water | Invitrogen | 10977-035 | solution |
| E. coli electrocompetent | Thermofisher | 18265017 | bacteria |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E4884 | powder |
| Escherichia coli | Clinical isolate | personal stock | bacteria |
| Fe(NH4)2(SO4)-6H20 | EMS | 15505-40 | sulfate solution 4% aqueous |
| Fetal Calf Serum | Gibco | 10270 | serum |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | solution |
| Guanidium thiocyanate | Euromedex | EU0046-D | powder |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | I9516 | solution |
| J774.2 macrophages | Sigma-Aldrich | J774.2 | Strain |
| kanamycin | Sigma-Aldrich | 60615 | powder |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | Monobasic, anhydrous |
| LB liquid medium | Invitrogen | 12795-027 | powder |
| Lysozyme | Roche | 10837059001 | powder |
| MgSO4 | Labosi | M275 | pur |
| Microbank TM (cryotubes with beads) | Pro-Lab Diagnostic | PL.170/M | |
| Middlebrook 7H11 medium | Sigma-Aldrich | M0428 | powder |
| Middlebrook 7H9 medium | Thermofisher | 11753473 | powder |
| Müller-Hinton agar | Biorad | 3563901 | powder |
| N-Lauryl-sarcosine | Merck | S37700 416 | powder |
| Na2HPO4-7H2O | Sigma-Aldrich | S9390 | 98-102% |
| Phenol/chloroforme | Sigma-Aldrich | 77617 | solution |
| Proteinase K | Thermofisher | EO0491 | powder |
| proteose peptone | BD | 211684 | enzymatic digest of animal tissue |
| pUC19 plasmid | New England Biolabs | 54357 | plasmid |
| SDS 20% | Biorad | 1610418 | solution |
| Sodium citrate | Calbiochem | 567446 | powder |
| Thiourea | Sigma-Aldrich | 88810 | powder |
| Tris | Sigma-Aldrich | 154563 | powder |
| Trizol | Thermofisher | 12044977 | solution |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 | solution |
| Yeast extract | BD | 212750 | |
| Kit | |||
| AMBION DNase kit | Thermofisher | 10792877 | kit |
| DNA Agilent Chip | Agilent | 5067-1504 | kit |
| GeneJET Plasmid Miniprep kit | Thermofisher | K0503 | kit |
| PureLink PCR Purification kit | Invitrogen | K310001 | kit |
| Quant-It" assays kit | Thermofisher | Q33140/Q32884 | kit |
| T4 DNA ligase | Invitrogen | Y90001 | kit |
| TruSeq Stranded RNA LT prep kit | Illumina | 15032611 | kit |
References
- Qvist, T., et al. Comparing the harmful effects of nontuberculous mycobacteria and Gram negative bacteria on lung function in patients with cystic fibrosis. Journal of Cystic Fibrosis. 15 (3), 380-385 (2016).
- Roux, A. -L., et al. The distinct fate of smooth and rough Mycobacterium abscessus variants inside macrophages. Open Biology. 6 (11), 160185 (2016).
- Castañeda-Sánchez, J., et al. Defensin Production by Human Limbo-Corneal Fibroblasts Infected with Mycobacteria. Pathogens. 2 (4), 13-32 (2013).
- Bakala N'Goma, J. C., et al. Mycobacterium abscessus phospholipase C expression is induced during coculture within amoebae and enhances M. abscessus virulence in mice. Infection and Immunity. 83 (2), 780-791 (2015).
- Ripoll, F., et al. Non mycobacterial virulence genes in the genome of the emerging pathogen Mycobacterium abscessus. Public Library of Science One. 4 (6), 5660 (2009).
- Tailleux, L., et al. Constrained intracellular survival of Mycobacterium tuberculosis in human dendritic cells. Journal of Immunology. 170 (4), 1939-1948 (2003).
- Jacquier, N., Aeby, S., Lienard, J., Greub, G. Discovery of new intracellular pathogens by amoebal coculture and amoebal enrichment approaches. Journal of Visualized Experiments. (80), e51055 (2013).
- Adékambi, T., et al. Amoebal coculture of "Mycobacterium massiliense" sp. nov. from the sputum of a patient with hemoptoic pneumonia. Journal of Clinical Microbiology. 42 (12), (2004).
- Rubin, E. J., et al. In vivo transposition of mariner-based elements in enteric bacteria and mycobacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (4), 1645-1650 (1999).
- Laencina, L., et al. Identification of genes required for Mycobacterium abscessus growth in vivo with a prominent role of the ESX-4 locus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (5), 1002-1011 (2018).
- Rowbotham, T. J. Isolation of Legionella pneumophila from clinical specimens via amoebae, and the interaction of those and other isolates with amoebae. Journal of Clinical Pathology. 36 (9), 978-986 (1983).
- Moffat, J. F., Tompkins, L. S. A quantitative model of intracellular growth of Legionella pneumophila in Acanthamoeba castellanii. Infection and Immunity. 60 (1), 296-301 (1992).
- FastQC program. , Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2018).
- Ripoll, F., et al. Non mycobacterial virulence genes in the genome of the emerging pathogen Mycobacterium abscessus. Public Library of Science One. 4 (6), 5660 (2009).
- Choo, S. W., et al. Genomic reconnaissance of clinical isolates of emerging human pathogen Mycobacterium abscessus reveals high evolutionary potential. Science Reports. 4, (2015).
- Greub, G., Raoult, D. Microorganisms Resistant to Free-Living Amoebae. Clinical Microbiology Reviews. 17 (2), 413-433 (2004).
- Kicka, S., et al. Establishment and Validation of Whole-Cell Based Fluorescence Assays to Identify Anti-Mycobacterial Compounds Using the Acanthamoeba castellanii - Mycobacterium marinum Host-Pathogen System. Public Library of Science One. 9 (1), 87834 (2014).
- Thomas, V., Loret, J. -F., Jousset, M., Greub, G. Biodiversity of amoebae and amoebae-resisting bacteria in a drinking water treatment plant. Environmental Microbiology. 10 (10), 2728-2745 (2008).
- Lamrabet, O., Medie, F. M., Drancourt, M. Acanthamoeba polyphaga-enhanced growth of mycobacterium smegmatis. Public Library of Science One. 7 (1), (2012).
- Cosson, P., Soldati, T. Eat, kill or die: when amoeba meets bacteria. Current Opinion in Microbiology. 11 (3), 271-276 (2008).
- Lelong, E., et al. Role of magnesium and a phagosomal P-type ATPase in intracellular bacterial killing. Cellular microbiology. 13, November 2010 246-258 (2011).
- Ouertatani-Sakouhi, H., et al. Inhibitors of Mycobacterium marinum virulence identified in a Dictyostelium discoideum host model. Public Library of Science One. 12 (7), 0181121 (2017).
- Trofimov, V., et al. Antimycobacterial drug discovery using Mycobacteria-infected amoebae identifies anti-infectives and new molecular targets. Science Reports. 8 (1), 3939 (2018).
- Cardenal-Muñoz, E., Barisch, C., Lefrançois, L. H., López-Jiménez, A. T., Soldati, T. When Dicty Met Myco, a (Not So) Romantic Story about One Amoeba and Its Intracellular Pathogen. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 529 (2017).
- Delafont, V., et al. First evidence of amoebae-mycobacteria association in drinking water network. Environmental Science & Technology. 48 (20), (2014).
- Cirillo, J. D., Falkow, S., Tompkins, L. S., Bermudez, L. E. Interaction of Mycobacterium avium with environmental amoebae enhances virulence. Infection and Immunity. 65 (9), (1997).
- Stamm, L. M., et al. Mycobacterium marinum escapes from phagosomes and is propelled by actin-based motility. Journal of Experimental Medicine. 198 (9), 1361-1368 (2003).
- Groschel, M. I., Sayes, F., Simeone, R., Majlessi, L., Brosch, R. ESX secretion systems: mycobacterial evolution to counter host immunity. Nature Reviews Microbiology. 14 (11), 677-691 (2016).
- Pym, A. S., et al. Recombinant BCG exporting ESAT-6 confers enhanced protection against tuberculosis. Nature Medicine. 9 (5), 533-539 (2003).
- Hsu, T., et al. The primary mechanism of attenuation of bacillus Calmette-Guerin is a loss of secreted lytic function required for invasion of lung interstitial tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (21), 12420-12425 (2003).
- Smith, J., et al. Evidence for pore formation in host cell membranes by ESX-1-secreted ESAT-6 and its role in Mycobacterium marinum escape from the vacuole. Infection and Immunity. 76 (12), 5478-5487 (2008).
- Schnappinger, D., et al. Transcriptional Adaptation of Mycobacterium tuberculosis. within Macrophages. Journal of Experimental Medicine. 198 (5), 693-704 (2003).
- Fontan, P., Aris, V., Ghanny, S., Soteropoulos, P., Smith, I. Global Transcriptional Profile of Mycobacterium tuberculosis during THP-1 Human Macrophage Infection. Infection and Immunity. 76 (2), 717-725 (2008).
- Miranda-CasoLuengo, A. A., Staunton, P. M., Dinan, A. M., Lohan, A. J., Loftus, B. J. Functional characterization of the Mycobacterium abscessus genome coupled with condition specific transcriptomics reveals conserved molecular strategies for host adaptation and persistence. BMC Genomics. 17 (1), 553 (2016).
