Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

التحديد الكمي لاستعمار الكوليرا والإسهال في النموذج الزرد الكبار

Published: July 12, 2018 doi: 10.3791/57767

Summary

هي الزرد طبيعية الكوليرا استضافة ويمكن استخدامها للخص ودراسة دورة المعدية بأكملها من الاستعمار إلى انتقال العدوى. هنا، نحن لشرح كيفية تقييم مستويات الاستعمار ضد الكوليرا والإسهال في الزرد كمياً.

Abstract

الضمة الكوليرية أفضل المعروف كعامل المعدية التي تسبب الكوليرا الأمراض البشرية. خارج المضيف البشرية، ضد الكوليرا أساسا موجود في البيئة المائية، حيث يتفاعل مع مجموعة متنوعة من الأنواع المائية أعلى. الأسماك فقاريات معروفة ليكون مضيف بيئية ومحتملة ضد الكوليرا خزان في الطبيعة. ضد الكوليرا وأنواع الأسماك تيليوست دانيو rerio، المعروف الزرد، تنبع من شبه القارة الهندية، مما يوحي بوجود تفاعل منذ أمد بعيد في البيئات المائية. الزرد كائن نموذج مثالي لدراسة جوانب كثيرة من الأحياء، بما في ذلك الأمراض المعدية. الزرد يمكن أن تكون بسهولة وسرعة من استعمر ضد الكوليرا بعد التعرض في المياه. استعمار الأمعاء ضد الكوليرا يؤدي إلى إنتاج الإسهال وإفراز منسوخة ضد الكوليرا. هذه تفرز البكتيريا يمكن ثم انتقل إلى استعمار جديد الأسماك المضيفين. هنا، نحن لشرح كيفية تقييم ضد الكوليرا-استعمار الأمعاء في الزرد، وكيفية قياس ضد الكوليرا-التي يسببها الإسهال الزرد. نموذج الاستعمار ينبغي أن تكون مفيدة للباحثين الذين يدرسون ما إذا كانت الجينات للفائدة قد تكون هامة لاستعمار المضيف و/أو للبقاء على قيد الحياة البيئية. التحديد الكمي للإسهال الزرد ينبغي أن يكون مفيداً للباحثين الذين يدرسون أي مسببات الأمراض المعوية المهتمين باستكشاف الزرد كنظام نموذجي.

Introduction

الضمة الكوليرية هو بكتيريا سلبية الغرام المائية، والذي يسبب مرض الكوليرا فضلا عن الإسهال متفرقة1،2. خامسا-الكوليرا وجدت في البيئة في مناطق كثيرة من العالم، وغالباً ما ترتبط مع غيرها من الكائنات المائية. وتشمل هذه الكائنات تربط العوالق والجماهير بيض الحشرات والرخويات والأسماك الفقارية الأنواع3،4،5،،من67. وقد عزل العديد من الدراسات ضد الكوليرا من أصقاع المعوية من الأسماك في مناطق جغرافية مختلفة7،،من89،10. الوجود ضد الكوليرا في الأسماك يشير إلى أن الأسماك قد تعمل كخزان بيئية. يمكن أن يكون تورط الأسماك أيضا في نقل المرض إلى البشر وفي انتشار جغرافي ضد الكوليرا سلالات6.

لفهم كيفية تفاعل ضد الكوليرا مع الأسماك، وضعت دانيو rerio، المعروف الزرد، كنظام نموذجي لدراسة ضد الكوليراه11. الزرد أصلية في جنوب آسيا، بما في ذلك منطقة خليج البنغال، الذي يعتقد أنه أقرب خزان ضد الكوليرا. قبل بداية وباء الكوليرا الأولى في 1817، لم يبلغ الكوليرا خارج ما هو الآن في الهند وبنغلاديش. ولذلك، الزرد و ضد الكوليرا يكاد يكون من المؤكد المرتبطة مع بعضها البعض عبر مقاييس زمنية تطورية، مما يوحي بأن الزرد مجموعة ضد الكوليرا في البيئة الطبيعية12.

بسيط لتنفيذ نموذج الزرد ضد الكوليرا ويمكن استخدامها لدراسة كامل الممرضة ضد الكوليرا دورة الحياة. تتعرض الأسماك ضد الكوليرا بالاستحمام في المياه التي قد تم تلقيح مع عدد معروف من ضد الكوليرا. في غضون ساعات قليلة، تجري استعمار الأمعاء، يليه إنتاج الإسهال. يتكون الإسهال الميوسين والبروتينات، أغلبه البكتيريا وغيرها من محتويات الأمعاء. يمكن قياس درجة الإسهال باستخدام القياسات البسيطة قليلة13. ضد الكوليرا التي قد تم تفرز بالأسماك المصابة يمكن ثم انتقل إلى تصيب الأسماك السذاجة، واستكمال دورة المعدية. ولذلك، يلخص النموذج الزرد ضد الكوليرا مرض بشري العملية12،14.

الأكثر استخداماً ضد الكوليرا نماذج حيوانية تاريخيا الفئران والأرانب14،،من1516،،من1718. هذه النماذج قد ساعدت في إضافة إلى معرفتنا بالمرضية ضد الكوليرا . ومع ذلك، نظراً للفئران والأرانب ليست طبيعية ضد الكوليرا المضيفين، هناك قيود يمكن أن يدرس ما هي جوانب دورة حياة ضد الكوليرا . الاستعمار ضد الكوليرا من الفئران والأرانب يتطلب عادة غياب المعوية الحجمية أو المعالجة بالمضادات الحيوية للتلف الحجمية المعوية. تتطلب كلا النموذجين تزقيمية لإدخال البكتيريا الجهاز الهضمي أو التلاعب الجراحية مباشرة حقن البكتيريا في الأمعاء. الزرد يتمتعون بميزة هي سهولة استعمرت الأسماك الكبار مع الحجمية الأمعاء سليمة وعملية المعدية يحدث بطبيعة الحال، دون أي تلاعب المطلوبة.

يوضح هذا العمل الاستفادة الزرد كنموذج للإصابة ضد الكوليرا . سوف تكون العدوى وتشريح وتعداد المستعمر ضد الكوليرا، والتحديد الكمي للإسهال الناجم عن ضد الكوليرا وصف12،13. هذا النموذج من المحتمل أن تكون مفيدة للعلماء المهتمين في عملية المرض ضد الكوليرا وفي نمط الحياة البيئية ضد الكوليرا .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

عليها جميع الأساليب الموصوفة هنا "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة ولاية وين. وكان أول من وصف هذا الأسلوب في رونفت et al. 12

1-تحديد مستويات استعمار الأمعاء

ملاحظة: استعمار الأمعاء هو المقياس الأكثر فائدة في النموذج الزرد كما يمكن استخدامه لمقارنة اللياقة البدنية النسبية من سلالات مختلفة ضد الكوليرا أو آثار الطفرات أو الجينات بالضربة القاضية.

  1. تطعيم الزرد بالغمر
    ملاحظة: هذا يعني التعرض لتمثل المسار الطبيعي للعدوى.
    1. إعداد ضد الكوليرا
      1. تلقيح 5 مل مرق ليسوجيني (رطل) مع معزولة ضد الكوليرا مستعمرة من رطل لوحة واحتضان في 37 درجة مئوية مع الهز (180 لفة في الدقيقة) عن 6 – 8 ح (الثقافة بين عشية وضحاها).
      2. تلقيح 25 مل من الطازجة المتوسطة رطل يعقم في قارورة مخروطية 250 مل مع 50 ميليلتر للثقافة بين عشية وضحاها أعلاه. احتضانها من أجل ح 16 – 18 في 37 درجة مئوية مع الهز (150 لفة في الدقيقة).
      3. قراءة الكثافة البصرية 600 نانومتر (OD600) من 1/10 إضعاف الثقافة بين عشية وضحاها تقدير العدد من البكتيريا كل مل (OD600 = 1 هو ~ 109 زيمبابوي/mL.)
      4. حصاد الخلايا باستخدام الطرد المركزي في 6,000 ز لأدنى 10 إزالة وسائل الإعلام مع ماصة أو من أجل إيقاف في حل مطهر. ريسوسبيند الخلايا في برنامج تلفزيوني العقيمة إلى التركيز المطلوب، عادة ما بين 1 × 107 إلى 1 × 1010 لكل مل من برنامج تلفزيوني.
        ملاحظة: هنا، نشير إلى يعقم ماء التناضح العكسي التي تحتوي على أملاح البحر 60 مغ/لتر كالماء العدوى العقيمة.
    2. التلقيح والحضانة
      1. ضع الزرد أربعة أو خمسة إلى 400 مل كوب يحتوي على 200 مل من الماء العدوى العقيمة.
      2. أضف 1 مل من ضد الكوليرا (من الخطوة 1.1.1.4.) للحصول على تركيز العدوى المطلوب (عادة 5 × 104 إلى 5 × 107 زيمبابوي/mL) في 200 مل من الماء العدوى.
      3. تغطية الكأس بغطاء مثقب لمنع السمك من القفز؛ الجزء العلوي من مربع تلميح 200 ميليلتر يعمل جيدا لهذا.
      4. قم بتسمية كل الكأس ووضعها في حاضنة الزجاج الأمامي تعيين عند 28 درجة مئوية خلال مدة التجربة.
    3. الداخلي للتعرض عابرة
      ملاحظة: تعرض عابرة إلى ضد الكوليرا (عادة 6 ح) متبوعاً بإزالة البكتيريا إينوكولاتينج مفيد لدراسة الانتقال وتقدير أكثر دقة للبكتيريا أغلبه.
      1. بعد 6 ح تعرض، صب الماء كوب من خلال شبكة صيد السمك لجمع الأسماك. تجاهل المياه المصابة في وعاء للتبييض بالقتل ضد الكوليرا.
      2. ضع الأسماك تمت إزالتها في كوب 200 مل من الماء العدوى العقيمة. السماح للأسماك على السباحة في هذه المياه النظيفة لمدة 5 دقائق لإزالة البكتيريا السطحية من الأسماك.
      3. كرر الإجراء الصافي (الخطوة 1.2.2) والأسماك في كوب جديد 200 مل مياه العدوى العقيمة. الحفاظ على الأسماك في هذا الكأس طوال فترة التجربة.
  2. القتل الرحيم
    1. عندما وصلت هذه التجربة في النهاية المرجوة، أخذ عينة من الإصابة المياه (15 مل عادة كافية) للسماح للتهم البكتيرية أغلبه، وقياس الإسهال (مثل المقايسة الميوسين محتوى البروتين و/أو OD)، إذا كان المطلوب (القسم 2).
    2. صب التبييض بالقتل ضد الكوليرا في المياه قبالة ما تبقى المياه من خلال شبكة صيد السمك (لجمع الأسماك).
    3. ضع السمك في كوب يحتوي على الإصابة بالمياه بالإضافة إلى 336 ميكروغرام/مل من إيثيل 3-أمينوبينزواتي ميثانيسولفوناتي (تريكيني) واحتضان السمك في هذا الحل تريكيني لمدة 20 دقيقة في الرايت
      ملاحظة: تم تعقيمهن fishnets مع حل التبييض 10%.
  3. تشريح
    1. إعداد الأسماك
      1. حلج القطن سمكة خارج الحل تريكايني مع ملعقة بلاستيك القابل للتصرف ووضعه على سطح تشريح.
      2. موقف الأسماك تواجه الجانب البطني إلى الأعلى ورقم التعريف الشخصي أنه عن طريق الفك السفلي، مع نهاية حادة من الدبوس الزاوية بعيداً عن مركز الجسم. مكان طرف آخر الخلفي فقط لفتحه الشرج، الزاوية أيضا بعيداً عن الجسم.
    2. التعرض للامعاء
      1. وانخفض مسحه السطح البطني من الأسماك مع مسح خالية من الوبر في الإيثانول 70%.
      2. تعقيم دون مشرط ومقص فانس غمس لهم في الإيثانول 70% ويلهب لهم.
      3. جعل شق صغير طوليا في بطن فقط تحت الجلد باختراق الجداول واستخدام دون مشرط. أن يكون حريصا على عدم قطع عميقا جداً، كما الأمعاء يقع فقط تحت الجلد.
      4. باستخدام المقص، توسيع الشق بعناية على طول الجسم، وقطع لا أعمق من مستوى الجلد وتجنب فتحه الشرج.
      5. جعل التخفيضات الجانبية اثنين مع المقص تجاه رئيس الأسماك للسماح فتح الشق.
      6. دبوس الجلد على كل جانب من الشقوق الجانبية إلى السطح تشريح، الصيد دبابيس، بعيداً عن الجسم.
        ملاحظة: تم سابقا تعقيمهن نصائح المسامير التي يلهب بها مع الكحول.
    3. إزالة الأمعاء
      ملاحظة: يجب أن تكون مرئية كأنبوب شاحب، رقيقة جداً على رأس الأجهزة الأخرى في الأمعاء.
      1. لهب-تعقيم الملقط وثم استخدامها لإزالة كامل الأمعاء (عادة 12 – 15 ملم في الطول). ضع الأمعاء في أنبوب تجانس التي تحتوي على حبات الزجاج (انظر الخطوات 1.4.1–1.4.2) و 1 مل 1 x برنامج تلفزيوني أو رطل, على الجليد.
  4. تجانس
    1. إعداد أنابيب التجانس مقدما بصب غ ~1.5 من حبات الزجاج 1 ملم إلى 2 مل أنابيب ملولبة (ملء لهم في منتصف الطريق تقريبا) وتعقيم ثم لهم بالتعقيم.
    2. أضف 1 مل من رطل العقيمة أو برنامج تلفزيوني x 1.
    3. وبمجرد الأمعاء الزرد المسمار المضافة (الخطوة 1.3.3.1) للأنابيب، القبعات على شكل محكم جداً، وثم تأمين الأنابيب في الخالطون دوامة.
    4. مجانسة العينات لمدة 1 دقيقة على إعداد الحد الأقصى، ثم بارد لهم على الجليد للحد الأدنى 1 – 2 كرر دورة التجانس هذا مرة أخرى تجانس كامل.
      ملاحظة: سوف تعمل عدة أساليب بديلة لتحقيق التجانس أيضا.
  5. قياس مستويات استعمار الأمعاء
    1. إعداد الأنابيب (أنابيب اختبار زجاجية صغيرة أو 1.5 مل ميكروسينتريفوجي الأنابيب) لتمييع المسلسل هوموجيناتي عن طريق إضافة ميليلتر 900 رطل أو برنامج تلفزيوني x 1 لكل أنبوبة. لكل الأسماك، إعداد أنابيب 5 – 6 وجعل الوقت تخفيف المسلسل من هوموجيناتي المعوية بإضافة 100 ميليلتر من هوموجيناتي إلى الأنبوب الأول، فورتيكسينج إلى المزيج، ومن ثم إضافة 100 ميليلتر من الأنبوب الأول إلى الأنبوب الثاني.
    2. كرر هذا الإجراء إلى تخفيف جميع قد أعدت.
    3. 100-200 ميليلتر لتمييع كل رطل أجار لوحات تحتوي على 100 ميكروغرام/مل من ستربتوميسين (في حالة استخدام سلالات مقاومة ستربتوميسين) و 40 ميكروغرام/مل من X-غال (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) على لوحة. احتضان لوحات عند 30 درجة مئوية ح 16 – 18.
    4. بعد الاحتضان بين عشية وضحاها، عد المستعمرات ضد الكوليرا في اللوحات، وأما باستخدام عداد مستعمرة الآلي أو يدوياً عد المستعمرات؛ أنه من المفيد بمناسبة المستعمرات التي تم جردها مع تلميح ماركر.
    5. تحديد زيمبابوي في الأمعاء السمك بضرب العدد لوحة عامل التخفيف من التعليق، آخذا في الاعتبار وحدة التخزين التي تم مطلي.

2-قياس إسهال السمك

ملاحظة: استخدمت أربعة مقاييس مختلفة لتقييم الإسهال الأسماك: مستويات الميوسين في الماء، ومستويات البروتين أغلبه عموما في الماء، والتطوير التنظيمي600 من الماء، و ضد الكوليرا زيمبابوي في المياه13. الإسهال عادة ما تتضح بصريا حوالي 6 ح بعد تعرض الزرد إلى ضد الكوليرا كما هو موضح أعلاه.

  1. تحديد مستويات الميوسين
    ملاحظة: إفراز الميوسين فعل أثناء الاستعمار ضد الكوليرا ، وهو مقياس جيد لمستويات إفراز، خصوصا في المراحل الأولى في إصابة13. والرزن الميوسين اختلاف في حمض الدوري microtiter شيف المقايسة19.
    1. إعداد المواد التالية: 50% (w/v) حمض الدوري حل الأسهم وحل العامل حمض الدوري 0.1% (10 ميليلتر الأسهم حمض الدوري 50% إضافة إلى 5 مل حمض الخليك 7% — استخدم فورا بعد إجراء)، المعايير الميوسين، ولوحات microtiter 96، حسنا، شيف كاشف.
      1. إعداد معايير الميوسين بتعليق المبالغ التالية من الميوسين (من نوع المعدة الخنزير الثالث) في المخزن مؤقت خلات صوديوم (pH خلات، يدتا 5 مم، الصوديوم 100 مم إلى 5.5 مع حمض الخليك الجليدية): 400 ميكروغرام/ملليلتر، 300 ميكروغرام/مل، 200 ميكروغرام/مل، 150 ميكروغرام/مل ، 100 ميكروغرام/مل 75 ميكروغرام/مل، 50 ميكروغرام/مل، 25 ميكروغرام/مل و 10 ميكروغرام/مل.
        إعداد اللوحة عن طريق إضافة 100 ميليلتر من الإصابة بالماء لكل بئر التي سيتم استخدامها في مقايسة النحو التالي: فارغة 1 x PBS؛ الميوسين المعايير كما هو موضح أعلاه، أو عينة مياه من العدوى الأسماك. كل عينة في ثلاث نسخ.
    2. إضافة 50 ميليلتر من 0.1% حمض الدوري حل جديدة لكل جيدا مع ماصة متعددة القنوات وأنها مزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً عدة مرات.
    3. التفاف اللوحة محكم في غلاف بلاستيكي واحتضان أنه عند 37 درجة مئوية ح 1 – 1.5.
    4. بارد لوحة وصولاً إلى درجة حرارة الغرفة عن 5 – 10 دقيقة إضافة 100 ميليلتر حل فوكسين (كاشف شيف الشعبية) لكل بئر، وبيبيت صعودا وهبوطاً لمزجها.
    5. التفاف اللوحة في غلاف بلاستيكي واحتضان في درجة حرارة الغرفة على منصة هزاز حتى وضعت اللون؛ عموما هو وضع اللون ضمن 20 دقيقة قراءة امتصاص في 560 نانومتر باستخدام قارئ لوحة.
    6. رسم منحنى قياسي الميوسين (OD560مقابل ميكروغرام/مل الميوسين القياسية). تحديد مستويات الميوسين المجهولة بتحديد حيث يسقط OD560 من كل معروف على المنحنى القياسي وقراءة تركيز الميوسين المقابلة لتلك القيمة.
  2. تحديد مستويات البروتين
    ملاحظة: وبصرف النظر عن الميوسين، مستويات البروتين عموما في الماء وكيل آخر لمستويات الإسهال (البراز غائم، السائلة) التي تنتجها الأسماك. يستخدم هذا الإجراء فحص برادفورد قياسية لتقدير مستويات البروتين. وتقدر مستويات البروتين على منحنى قياسي ألبومين المصل بقرى (BSA).
    1. مزيج 100 ميليلتر من أحد المعايير جيش صرب البوسنة (راجع الملاحظة أدناه) أو 100 ميليلتر من الإصابة بالمياه (من الكأس التي تحتوي على الأسماك المصابة) مع ميليلتر 900 من برادفورد كاشف الإنزيم (الكاشف مقايسة البروتين بيرس يعمل جيدا لهذا) في ومبومو المتاح. احتضان جميع العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة.
      ملاحظة: استخدمت المعايير جيش صرب البوسنة التالية: 1,800 ميكروغرام/مل 1,000 ميكروغرام/ملليلتر، 750 ميكروغرام/مل، 500 ميكروغرام/مل، 250 ميكروغرام/ملليلتر، 125 ميكروغرام/مل، 50 ميكروغرام/مل و 25 ميكروغرام/مل. كانت تضعف المعايير جيش صرب البوسنة في الماء المقطر يعقم.
    2. قراءة OD660 كل معيار أو عينة عليها باستخدام جهاز المطياف الضوئي.
    3. ارسم المنحنى القياسي جيش صرب البوسنة (OD660مقابل ميكروغرام/مل). تحديد مستويات البروتين المجهولة بتحديد حيث تقع على المنحنى القياسي جيش صرب البوسنة OD660 من كل معروف وقراءة تركيز الميوسين المقابلة لتلك القيمة.
  3. قياس القطر الخارجي600
    ملاحظة: وجود الإسهال (البراز غائم، سائلة) واضح وضوحاً بعد عدة ح وعزم600 OD بسيطة يمكن استخدامها لقياس هذا.
    1. عكس الأنبوب الذي يحتوي على الماء الإصابة عدة مرات توزيعها بالتساوي المحتويات. إضافة 1 مل عينة الماء إلى ومبومو المتاح. استخدم 1 مل من الماء العدوى العقيمة كعنصر سلبي.
    2. القيام بقياس "فارغة" باستخدام جهاز المطياف الضوئي مبلغ 600 نانومتر باستخدام نموذج المراقبة السلبية. قراءة كل عينة المياه في 600 نانومتر وسجل النتائج.
  4. تصميم تفرز ضد الكوليرا زيمبابوي/مل بعد الإصابة
    ملاحظة: يفرز عنصرا رئيسيا من الإسهال التي تنتجها في الزرد ضد الكوليرا. البت في زيمبابوي/مل يمكن استخدامها لأغراض مثل تقدير النسخ المتماثل البكتيرية في الأمعاء الأسماك، وكتدبير الجرعة المعدية في تجارب الإرسال. ويتم هذا التدبير أفضل عندما حدث مرض انتقالي. إذا كان يستخدم عدوى ح 24، سيتم قياس هذا التحليل العدوى المشتركة بالإضافة إلى أغلبه ضد الكوليرا.
    1. أخذ عينة مياه عند نقطة الوقت المطلوب وتمييع تسلسلياً كما هو موضح سابقا.
    2. لوحة تخفيف المسلسل على وسائط انتقائية (التي تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة آخر أو ستربتوميسين أو DCLS أجار رطل) واحتضانها لهم عند 30 درجة مئوية ح 24.
    3. عد المستعمرات. حساب زيمبابوي الواحد مل من الماء كما هو موضح في الخطوة 1، 5.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

خامسا-الكوليرا الاستعمار المسالك المعوية الزرد

تقديم مثال لمستويات الاستعمار نموذجية نلاحظ، نحن تلقيح 5 × 106 زيمبابوي من تور ش ضد الكوليرا السلالة الجائحة N16961 في 200 مل الماء في كوب يحتوي على عدة الزرد. بعد 6 ح للإصابة، تم غسلها في المياه العذبة الأسماك وتحويلها إلى كوب 200 مل من العدوى يعقم المياه كما هو موضح في البروتوكول. ح 18 بعد نقل (أو 24 ساعة بعد الإصابة الأولية)، وقد euthanized الأسماك، وأخذت الأمعاء لتحديد مستويات الاستعمار. 10 حوالي5 إلى6 10 ضد الكوليرا الخلايا في الأمعاء الأسماك لوحظت عادة في الأمعاء العدوى بعد 24 ساعة (hpi) (الشكل 1) مع حجم 5 × 106 العدوى.

التحديد الكمي لإسهال السمك

وكان كمياً الإسهال باستخدام فحوصات بسيطة الأربعة المذكورة أعلاه. الفحص الأولى، زيمبابوي في أغلبه ضد الكوليرا، يرد في الشكل 1. كانت مطلية بتخفيف المسلسل من hpi 24 الماء العد ضد الكوليرا زيمبابوي. عادة يتم التقيد بمستويات عالية نسبيا من أغلبه ضد الكوليرا ؛ في هذا المثال، حوالي 10 تم الكشف عن5 ضد الكوليرا لكل مل من الماء. لا تنتج الأسماك مصابة المزودة ضد الكوليرا (البيانات لا تظهر).

المقايسة الثانية تستخدم للتحديد الكمي للإسهال هو أغلبه الميوسين. يظهر الشكل 2 آثار ثلاثة مختلفة ضد الكوليرا المعدية جرعات على مستويات الميوسين في المياه 24 hpi. أعلى جرعة معدية يرتبط بأعلى إفراز الميوسين في الماء. كعنصر تحكم، ووضعت الأسماك الأربعة في الكأس متطابقة من المياه، ولكن تمت إضافة برنامج تلفزيوني بدلاً من الوقف ضد الكوليرا . مراقبة الأسماك تفرز الميوسين القليل جداً.

التحليل الكمي الإسهال الثالث هو OD600 من hpi 24 المياه. كما هو موضح في الشكل 3، OD600 من هذه المياه كان أعلى بكثير في كوب يحتوي على الزرد المصابين ضد الكوليرا مما في كوب يحتوي على الزرد مصابة.

وأخيراً، تم قياس مستويات البروتين الكلي في المياه. المياه التي تحتوي على الأسماك المصابة الواردة ما يقرب من ضعف مستويات البروتين الإجمالية التي لوحظت في المياه التي تحتوي على الأسماك غير مصاب (الشكل 4). جماعياً، توضح هذه فحوصات أربعة الآثار ضد الكوليرا عدوى لديه على إفراز الزرد.

Figure 1
الشكل 1: استعمار الأمعاء الزرد التي ضد الكوليرا. الأسماك المصابة ح 6، ثم غسلها والمحتضنة لمدة 24 ساعة. ويوضح الجانب الأيمن من الشكل زيمبابوي مجموع كل الأمعاء الأسماك الأربعة (النقاط السوداء). الجانب الأيمن من الشكل يشير إلى ضد الكوليرا زيمبابوي كل مل تقاس بالمياه 24 hpi (المربعات السوداء). تظهر وسيلة لمجموعتي البيانات مع خط أفقي كبير والانحراف المعياري المشار إليها بواسطة أشرطة الخطأ. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: تحليل الميوسين. ثلاثة مختلفة ضد الكوليرا الجرعات المعدية استخدمت، جنبا إلى جنب مع عنصر تحكم غير مصاب، كما هو مبين تحت x-المحور. يتم الإشارة إلى قيم الميوسين الكشف عن في الماء بواسطة حمض الدوري معدلة الاعتداء Schiff (PAS) يعني بأشرطة سوداء فوق كل جرعة المعدية. أشرطة الخطأ تشير إلى الانحراف المعياري. وتشير العلامات النجمية إلى ف < 0.05 كما يحددها الطالب في مزاوج اختبار t. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: OD600 المقايسة كوكيل للإسهال. إصابة OD600 1 مل من الماء من قنينة تحتوي على أما ضد الكوليرا أو تم قياس الأسماك غير مصاب. أشرطة سوداء تشير إلى القيمة الوسطية وأشرطة الخطأ تشير إلى الانحراف المعياري. وتشير العلامات النجمية إلى ف < 0.05 كما يحددها الطالب في مزاوج اختبار t. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: مجموع مستويات البروتين في الماء- وقدرت مجموع البروتين مقايسة برادفورد كما هو موضح. أشرطة سوداء تشير إلى قيم المتوسط الحسابي وأشرطة الخطأ تشير إلى الانحراف المعياري. وتشير العلامات النجمية إلى ف < 0.05 كما يحددها الطالب في مزاوج اختبار t. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الزرد هو نموذج جديد نسبيا لدراسة ضد الكوليرا ولكن يحمل الكثير من الوعود للمستقبل اكتشاف جوانب غير معروفة من قبل ضد الكوليرا البيولوجيا والمرضية11،،من1213 . النموذج الزرد الكبار لديه مزايا كلا طبيعية ضد الكوليرا المضيف يحتوي الحجمية الأمعاء سليمة، وناضجة، ونموذج للبيئة. عيوب النموذج أن اثنين من عوامل الفوعة البشرية الرئيسية والسمية الكوليرا والهياكل كوريجولاتيد السمية، غير مطلوبة لالزرد الاستعمار أو المرضية12. ومع ذلك، وهذا يمكن النظر بدلاً من ذلك كميزة أخرى يمكن أن تمكن من تحديد هوية الرواية ضد الكوليرا الاستعمار العوامل وتسهيل دراسة السموم الأخرى ضد الكوليرا . وهذا ذات الصلة لا سيما أن الغالبية العظمى من غير-O1/O139 "البيئية" ضد الكوليرا سلالات، معظمها لا تنتج الكوليرا السمية أو السمية كوريجولاتيد الهياكل وحتى الآن لا يزال يمكن أن يسبب المرض20،21.

مشاكل الأكثر احتمالاً أن تنشأ باستخدام هذا النموذج ترتبط الحجمية المعوية وفيرة. الطلاء على وسائل الإعلام نونسيليكتيفي سيجعل هذا النموذج أساسا غير صالحة للاستعمال، فإنه سيكون من المستحيل تحديد المستعمرات ضد الكوليرا . خلفية مستعمرات من الحجمية المعوية حتى استخدام وسائط انتقائية أو انتقائية جزئيا مثل رطل زائد ستربتوميسين أو DCLS، سيكون حاضرا. من الضروري للتحقق من أن المستعمرات التي يجري عد النية ضد الكوليرا بالترقيع المستعمرات التي تنتجها الطلاء على وسائط أقل انتقائية إلى وسيلة انتقائية للغاية مثل ثلاثي. بدلاً من ذلك، إدراج علامة انتقائية أفضل في الجينوم من سلالة فائدة إلى حد كبير يبسط تحديد ضد الكوليرا من هوموجيناتيس المعوية.

استفادة الاختبارات المستخدمة لقياس الزرد الإسهال أنها بسيطة وغير مكلفة لتنفيذ13. العيب هو أن هذه الاختبارات إلى حد كبير غير محدد، وبصرف النظر عن عد أغلبه ضد الكوليرا زيمبابوي مباشرة، ويمكن أن يصبح من الصعب على تحديد ما إذا كان الإسهال نتيجة مباشرة ضد الكوليرا المرضية، أو إلى بعض الضغوطات الأخرى . المساعدات وضع الاختلافات هذه أو فحوصات أخرى لتحسين إرادتهم خصوصية المحتمل في المستقبل قياسات ضد الكوليرا المرضية في الزرد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

وبفضل ميلودي نيلي، جون الين، أبوعيطة بازل، ودونا رونفت لجهودها في المساعدة على تطوير النموذج الزرد. البحث الذي ذكرته هنا أيده بالمعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية من "معاهد الصحة الوطنية في" إطار جائزة الأرقام R21AI095520 و R01AI127390 (لجيفري فتحي حاء). المحتوى هي المسؤولة الوحيدة عن المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية "المعاهد الوطنية للصحة".

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Instrument
Shaker incubator New Brunswick Scientific, Edison, NJ Excella E25
Incubator NUAIRE, Plymouth, MN Auto Flow
Spectrophotometer Thermo, Waltham, MA Geaesys 6
Vortex homogenizer Minibeadbeater24 112011
Weighing Machine Ohaus, Columbia, MD Adventurer Pro
Heat Stirer Corning, Corning, NY PC-420D
Burner
automated colony counter REVSCI 120417B
Materials
400 ml glass beakers Pyrex
perforated lids Microtip holder with holes from tip box
disposable plastic spoons Office Depot, Boca Raton, FL D15-25-7008
Fish Tank System Aquaneering, San Diego, CA
RO Water Purifier Aqua FX TK001
Fish net Marina
fish food Tetra fin
Brine Shrimp Red jungle brand O.S.I. pro 80
Styrofoam board
Pins
Scalpels Fine Scientific tools, Foster City, CA 10000-10
Forceps Fine Scientific tools, Foster City, CA 11223-20
Vannas scissors Fine Scientific tools, Foster City, CA 15000-11
2 ml screw cap tubes Fisher Scientific, Hampton, NH 02-681-375
1 mm glass beads Bio Spec 11079110
Glass beads for spreading Sigma, St. Louis, MO 18406-500G
Petri plate Fisher Brand, Hampton, NH FB0875713
1.5 ml centrifuge tube Midsci, Valley Park, MO AVSS1700
50 ml centrifuge tube Corning Falcon, Corning, NY 352098
Test tubes Pyrex 9820
Glass Pipette Fisher Brand, Hampton, NH 13675K
Micro pipettes Sartorius Biohit, Göttingen, Germany m1000/m200/m20
Tips Genesee Scientific, San Diego, CA 24-150RS/24-412
Chemicals
Instant Ocean salts
phosphate buffered saline VWR Life Science, Radnor, PA K813-500ml
Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt Sigma, St. Louis, MO A5040
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside Sigma, St. Louis, MO 10651745001
Schiff’s reagent Sigma, St. Louis, MO 84655-250 mL
periodic acid Fisher Scientific, Hampton, NH 10450-60-9
Mucin from porcine stomach Sigma, St. Louis, MO M2378-100G
Bovine serum albumin Fisher Scientific, Hampton, NH 9046-46-8
Pierce 660nm Protein Assay Reagent Thermo, Waltham, MA 22660
LB medium
Trypton BD Biosciences, San Jose, CA 211705
Teast Extract BD Biosciences, San Jose, CA 212750
NACL Fisher Scientific, Hampton, NH BP358-212
Agar BD Biosciences, San Jose, CA 214010
TCBS Agar BD Biosciences, San Jose, CA 265020
DCLS Agar Sigma, St. Louis, MO 70135-500gm
Software
Microsoft office
Prism 5

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Harris, J. B., LaRocque, R. C., Qadri, F., Ryan, E. T., Calderwood, S. B. Cholera. The Lancet. 379 (9835), 2466-2476 (2012).
  2. Dutta, D., et al. Vibrio cholerae non-O1, non-O139 serogroups and cholera-like diarrhea, Kolkata, India. Emerging Infectious Diseases. 19 (3), 464-467 (2013).
  3. Huq, A., et al. Ecological relationships between Vibrio cholerae and planktonic crustacean copepods. Applied and Environmental Microbiology. 45 (1), 275-283 (1983).
  4. Halpern, M., Landsberg, O., Raats, D., Rosenberg, E. Culturable and VBNC Vibrio cholerae: interactions with chironomid egg masses and their bacterial population. Microbial Ecology. 53 (2), 285-293 (2007).
  5. Broza, M., Halpern, M. Pathogen reservoirs. Chironomid egg masses and Vibrio cholerae. Nature. 412 (6842), 40 (2001).
  6. Halpern, M., Izhaki, I. Fish as hosts of Vibrio cholerae. Frontiers in Microbiology. 8 (282), (2017).
  7. Senderovich, Y., Izhaki, I., Halpern, M. Fish as reservoirs and vectors of Vibrio cholerae. PLoS ONE. 5 (1), e8607 (2010).
  8. Traore, O., et al. Occurrence of Vibrio cholerae in fish and water from a reservoir and a neighboring channel in Ouagadougou, Burkina Faso. The Journal of Infection in Developing Countries. 8 (10), 1334-1338 (2014).
  9. Booth, L. V., Lang, D. A., Athersuch, R. Isolation of Vibrio cholerae non-01 from a Somerset farmworker and his tropical fish tank. Journal of Infection. 20 (1), 55-57 (1990).
  10. Torres-Vitela, M. A., et al. Incidence of Vibrio cholerae in fresh fish and ceviche in Guadalajara, Mexico. Journal of Food Protection. 60 (3), 237-241 (1997).
  11. Rowe, H. M., Withey, J. H., Neely, M. N. Zebrafish as a model for zoonotic aquatic pathogens. Developmental & Comparative Immunology. 46 (1), 96-107 (2014).
  12. Runft, D. L., et al. Zebrafish as a natural host model for Vibrio cholerae colonization and transmission. Applied and Environmental Microbiology. 80 (5), 1710-1717 (2014).
  13. Mitchell, K. C., Breen, P., Britton, S., Neely, M. N., Withey, J. H. Quantifying Vibrio cholerae enterotoxicity in a zebrafish infection model. Applied and Environmental Microbiology. , (2017).
  14. Klose, K. E. The suckling mouse model of cholera. Trends in Microbiology. 8 (4), 189-191 (2000).
  15. Formal, S. B., Kundel, D., Schneider, H., Kunevn,, Sprinz, H. Studies with Vibrio cholerae in the ligated loop of the rabbit intestine. British Journal of Experimental Pathology. 42, 504-510 (1961).
  16. Williams, E. M., Dohadwalla, A. N., Dutta, N. K. Diarrhea and accumulation of intestinal fluid in infant rabbits infected with Vibrio cholerae in an isolated jejunal segment. The Journal of Infectious Diseases. 120 (6), 645-651 (1969).
  17. Spira, W. M., Sack, R. B., Froehlich, J. L. Simple adult rabbit model for Vibrio cholerae and enterotoxigenic Escherichia coli diarrhea. Infection and Immunity. 32 (2), 739-747 (1981).
  18. Ritchie, J. M., Rui, H., Bronson, R. T., Waldor, M. K. Back to the future: studying cholera pathogenesis using infant rabbits. mBio. 1 (1), (2010).
  19. Kilcoyne, M., Gerlach, J. Q., Farrell, M. P., Bhavanandan, V. P., Joshi, L. Periodic acid-Schiff's reagent assay for carbohydrates in a microtiter plate format. Analytical Biochemistry. 416 (1), 18-26 (2011).
  20. Balaji, V., Sridharan, G., Jesudason, M. V. Cytotoxicity of non O1, non O139 Vibrios isolated from fresh water bodies in Vellore, south India. Indian Journal of Medical Research. 110, 155-159 (1999).
  21. Hasan, N. A., et al. Nontoxigenic Vibrio cholerae non-O1/O139 isolate from a case of human gastroenteritis in the U.S. Gulf Coast. Journal of Clinical Microbiology. 53 (1), 9-14 (2015).

Tags

علم المناعة والعدوى، العدد 137، الزرد، الكوليرا، الكوليرا، التفاعلات المضيف الممرض، استعمار، وأمراض الإسهال، ومسببات الأمراض المعوية
التحديد الكمي لاستعمار <em>الكوليرا</em> والإسهال في النموذج الزرد الكبار
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nag, D., Mitchell, K., Breen, P.,More

Nag, D., Mitchell, K., Breen, P., Withey, J. H. Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model. J. Vis. Exp. (137), e57767, doi:10.3791/57767 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter