Summary
Poisson zèbre est un naturel Vibrio cholerae hôte et peut être utilisé pour récapituler et d’étudier l’ensemble du cycle infectieux de la colonisation à la transmission. Ici, nous démontrons comment évaluer les niveaux de colonisation V. cholerae et quantifier la diarrhée chez le poisson zèbre.
Abstract
Vibrio cholerae est surtout connu comme l’agent infectieux qui provoque le choléra de maladie humaine. À l’extérieur de l’hôte humain, V. cholerae existe principalement dans le milieu aquatique, où elle interagit avec une variété d’espèces aquatiques supérieures. Vertébrés poissons sont connus pour être un environnement hôte et sont un réservoir potentiel V. cholerae dans la nature. V. cholerae et l’espèce de poisson téléostéen Danio rerio, communément appelé poisson-zèbre, originaires du sous-continent indien, ce qui suggère une interaction de longue date dans les milieux aquatiques. Poisson zèbre est un organisme modèle idéal pour l’étude de nombreux aspects de la biologie, y compris les maladies infectieuses. Poisson zèbre peut être facilement et rapidement colonisé par V. cholerae après exposition dans l’eau. Colonisation de l’intestin par V. cholerae entraîne la production de la diarrhée et l’excrétion de répliqué V. cholerae. Ces excrété la bactérie peut alors continuer à coloniser de nouveaux poissons hôtes. Ici, nous démontrons comment évaluer V. cholerae-colonisation de l’intestin dans le poisson-zèbre et comment quantifier V. cholerae-induite par le poisson-zèbre diarrhée. Le modèle de colonisation doit être utile pour les chercheurs qui étudient si les gènes d’intérêt peuvent être importants pour la colonisation de l’hôte et/ou pour la survie dans l’environnement. La quantification du poisson-zèbre diarrhée devrait être utile aux chercheurs qui étudient tout pathogène intestinale et qui sont intéressés à explorer le poisson-zèbre comme système modèle.
Introduction
Vibrio cholerae est une bactérie Gram-négatif aquatique qui provoque le choléra maladie humaine, mais aussi les diarrhées sporadiques1,2. V. cholerae se trouve dans l’environnement dans de nombreuses régions du globe, souvent associé à d’autres organismes aquatiques. Ces organismes associant incluent plancton, masses de œufs insectes, mollusques et poissons vertébrés espèces3,4,5,6,7. Plusieurs études ont isolé V. cholerae des voies intestinales des poissons dans les différentes zones géographiques7,8,9,10. La présence de V. cholerae chez les poissons indique que les poissons peut agir comme un réservoir environnemental. Poissons pourraient également être impliqués dans la transmission de la maladie à l’homme et de la propagation géographique de V. cholerae souches6.
Pour mieux comprendre comment V. cholerae interagit avec poissons, Danio rerio, mieux connu sous le nom de poisson-zèbre, a été développé comme un système modèle pour l’étude de V. choleraee11. Poisson zèbre sont originaires d’Asie du Sud, y compris la région de la baie du Bengale, qui est considérée comme le plus ancien réservoir de V. cholerae. Avant le premier début pandémie de choléra en 1817, choléra n’avait pas été porté à l’extérieur de ce qui est maintenant l’Inde et le Bangladesh. Par conséquent, poisson-zèbre et V. cholerae presque certainement sont associées entre elles sur des échelles de temps évolutif, suggérant que poisson zèbre sont une foule de V. cholerae dans le milieu naturel12.
Le modèle de poisson zèbre pour V. cholerae est simple à exécuter et peut être utilisé pour étudier l’ensemble du pathogène V. cholerae le cycle de vie. Poissons sont exposés à V. cholerae de baignade dans l’eau qui a été vaccinée avec un nombre connu de V. cholerae. En quelques heures, colonisation de l’intestin a lieu, suivi par la production de la diarrhée. Diarrhée est constitué de mucine, protéines, bactéries excrétées et autres contenus intestinaux. Le degré de la diarrhée peut être quantifié à l’aide de quelques simples mesures13. V. cholerae qui a été excrétés par les poissons infectés peut ensuite passer à infecter les poissons naïfs, complétant le cycle infectieux. Par conséquent, le modèle de poisson-zèbre récapitule les V. cholerae maladies humaines processus12,14.
Le plus fréquemment utilisé V. cholerae modèles animaux ont toujours été des souris et des lapins14,15,16,17,18. Ces modèles ont contribué à ajouter à notre connaissance de la pathogénèse de V. cholerae . Cependant, parce que les souris et les lapins ne sont pas naturelles V. cholerae hôtes, il y a des limites à quels aspects du cycle de vie V. cholerae peuvent être étudiés. La colonisation de V. cholerae des souris et des lapins nécessite généralement l’absence du microbiote intestinal ou un prétraitement avec des antibiotiques pour endommager le microbiote intestinal. Les deux modèles nécessitent soit de gavage d’introduire les bactéries du tube digestif ou de manipulation chirurgicale d’injecter directement les bactéries dans les intestins. Poisson zèbre ont un avantage car les poissons adultes avec un microbiote intestinal intact sont facilement colonisés et le processus infectieux se passe naturellement, sans aucune manipulation nécessaire.
Le présent travail montre l’utilisation du poisson-zèbre comme modèle à V. cholerae infection. L’infection, dissection, dénombrement des colonisateurs V. choleraeet la quantification de la diarrhée causée par V. cholerae sera décrit12,13. Ce modèle est susceptible d’être utile aux scientifiques intéressés dans le processus de la maladie de V. cholerae , tant dans la vie de V. cholerae environnementale.
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Protocol
Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de Wayne State University. Cette méthode a été décrite en Runft et al. 12
1. détermination des niveaux de colonisation de l’intestin
NOTE : Colonisation de l’intestin est la métrique plus utile dans le modèle de poisson-zèbre car il peut être utilisé pour comparer la fitness relative de différentes souches de V. cholerae ou les effets des mutations ou des débouchures de gène.
- Inoculation du poisson-zèbre par immersion
Remarque : Cela signifie d’exposition ressemble à l’évolution naturelle de l’infection.- Préparation de V. cholerae
- Inoculer 5 mL de bouillon de lysogénie (LB) avec un isolé V. cholerae colonie d’une LB sur plaque et incuber à 37 ° C sous agitation (180 tr/min) 6 – 8 h (culture de nuit).
- Inoculer 25 mL de milieu frais stérilisés à l’autoclave de LB dans une fiole conique de 250 mL avec 50 µL de la culture pendant la nuit qui précède. Il incuber pendant 16 à 18 h à 37 ° C sous agitation (150 tr/min).
- Lire la densité optique à 600 nm (OD600) d’une dilution de 1/10 de la culture au jour le jour pour estimer le nombre de bactéries par mL (le OD600 = 1 est de ~ 109 UFC/mL.)
- Récolter les cellules par centrifugation à 6 000 g pendant 10 min. Retirez les médias avec une pipette ou décanter dans une solution désinfectante. Remettre en suspension les cellules dans du PBS stérile de la concentration désirée, généralement entre 1 x 107 à 1 x 1010 par ml de PBS.
NOTE : Ici, nous nous référons à autoclavé par osmose inverse l’eau contenant des sels de mer de 60 mg/L d’eau stérile de l’infection.
-
Ensemencement et incubation
- Placez quatre ou cinq poissons zèbres dans un bécher de 400 mL contenant 200 mL d’eau stérile de l’infection.
- Ajouter 1 mL de V. cholerae (de l’étape 1.1.1.4.) pour obtenir la concentration désirée infection (généralement de 5 x 104 à 5 x 107 UFC/mL) dans 200 mL d’eau de l’infection.
- Couvrir le bécher avec un couvercle perforé pour empêcher les poissons de sauter par-dessus ; la partie supérieure d’une boîte de pointe 200 µL fonctionne bien pour cela.
- Étiquetez chaque bécher et rangez-les dans un incubateur à façade en verre fixée à 28 ° C pour la durée de l’expérience.
-
Procédure pour l’exposition temporaire
NOTE : Une exposition transitoire à V. cholerae (généralement 6 h), suivie par la suppression des bactéries inoculer est utile pour étudier la transmission et la quantification plus précise des bactéries excrétées.- Après 6 h d’exposition, versez l’eau du bécher dans une résille pour recueillir le poisson. Jeter l’eau infectée dans un récipient d’eau de Javel pour tuer les V. cholerae.
- Placer le poisson retiré dans un bécher de 200 mL d’eau stérile de l’infection. Laissez le poisson à la nage dans cette eau claire pendant 5 min éliminer les bactéries en surface du poisson.
- Répétez la procédure nette (étape 1.2.2) et placer le poisson dans un nouveau bécher de 200 mL d’eau stérile de l’infection. Garder le poisson dans ce bécher pour la durée de l’expérience.
- Préparation de V. cholerae
- Euthanasie
- Lorsque l’expérience a atteint son point de terminaison souhaité, prendre un échantillon de l’infection de l’eau (15 mL suffit en général) pour permettre la numération bactérienne excrétée et la mesure de la diarrhée (tels que le dosage de la mucine, teneur en protéines ou OD), si vous le souhaitez (section 2).
- Videz le reste de l’eau à travers une résille (pour recueillir le poisson) dans l’eau de Javel pour tuer les V. cholerae dans l’eau.
- Placer le poisson dans un bécher contenant de l’eau de l’infection et 336 µg/mL de méthanesulfonate de 3-aminobenzoate d’éthyle (tricaïne) et incuber le poisson dans cette solution de tricaïne pendant 20 min à température ambiante.
Remarque : Les filets de pêche ont été stérilisés avec une solution javellisée de 10 %.
- Dissection
- Préparation de poisson
- Évider un poisson hors de la solution de tricaïne avec une cuillère en plastique jetable et placez-le sur la surface de la dissection.
- Position du poisson avec sa face ventrale vers le haut et la broche à travers la mâchoire inférieure, avec l’extrémité arrondie de l’axe incliné loin du centre du corps. Placez un autre NIP juste postérieur à l’anus, aussi incliné loin du corps.
- Exposition du tractus intestinal
- Tamponner la surface ventrale du poisson avec un chiffon non pelucheux imbibé d’éthanol à 70 %.
- Stériliser un scalpel et ciseaux de Vannas en les plongeant dans l’éthanol à 70 % et les flammes.
- Faire une petite incision sur la longueur dans le ventre juste sous la peau en pénétrant les échelles et en utilisant le scalpel. Veillez à ne pas couper trop profondément, car le tractus intestinal est situé juste sous la peau.
- En utilisant les ciseaux, prolonger l’incision avec précaution le long du corps, coupe n’est pas supérieure à niveau de la peau et éviter l’anus.
- Faire deux incisions latérales avec les ciseaux vers la tête du poisson afin de permettre une ouverture de l’incision.
- Épinglez la peau de chaque côté des incisions latérales à la surface de dissection, pêche à la ligne les broches, loin du corps.
Remarque : Les conseils des broches ont été précédemment stérilisées par les flammes avec de l’alcool.
-
Enlèvement du tractus intestinal
Remarque : Le tractus intestinal doit être visible sous la forme pâle d’un tube très mince sur le dessus des autres organes.- Flamme-stériliser le forceps et puis utilisez-les pour enlever l’intestin entier (généralement 12 à 15 mm de longueur). Déposer l’intestin dans un tube d’homogénéisation contenant des perles de verre (voir étapes 1.4.1–1.4.2) et 1 mL de 1 x PBS ou LB, sur la glace.
- Préparation de poisson
- Homogénéisation
- Préparer les tubes d’homogénéisation à l’avance en versant ~1.5 g de perles de verre de 1 mm dans 2 mL tubes bouchon à vis (remplissez-les approximativement à mi-distance) et ensuite de les stériliser à l’autoclave.
- Ajouter 1 mL de stérile LB ou 1 x PBS.
- Une fois que les intestins du poisson-zèbre ont été ajouté (étape 1.3.3.1) aux tubes, vis les bouchons sur très serré et puis fixer les tubes dans l’homogénéiseur vortex.
- Homogénéiser les échantillons pendant 1 min sur position maximum, puis cool eux sur la glace pour 1 à 2 min. répètent ce cycle d’homogénéisation une fois de plus pour une homogénéisation complète.
Remarque : Plusieurs méthodes alternatives pour l’homogénéisation fonctionnera également.
- Quantifier les niveaux de la colonisation de l’intestin
- Préparer les tubes (tubes à essai petit verre ou tubes de microcentrifuge de 1,5 mL) pour la dilution en série de l’homogénat en ajoutant 900 µL de LB ou 1 x PBS dans chaque tube. Pour chaque poisson, préparer les tubes de 5 – 6 et faire 10 fois des dilutions de l’homogénat intestinale en ajoutant 100 µL de l’homogénat dans le premier tube, Vortex il mix, et puis en ajoutant 100 µL du tube du premier au second tube.
- Répétez cette procédure jusqu'à ce que toutes les dilutions ont été préparées.
- Plaque de 100 à 200 µL de chaque dilution sur plaques de gélose LB contenant 100 µg/mL de streptomycine (si vous utilisez des souches résistantes à la streptomycine) et 40 µg/mL de X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside). Incuber les plaques à 30 ° C pendant 16 à 18 h.
- Après l’incubation durant la nuit, compter V. cholerae colonies sur les plaques, soit à l’aide d’un compteur de colonies automatisée ou manuelle de comptage des colonies ; Il est utile de marquer les colonies comptées avec une pointe de marqueur.
- Déterminer l’UFC / intestin de poissons en multipliant la teneur en germes par le facteur de dilution de la suspension, en prenant en compte le volume qui a été plaqué.
2. mesure de la diarrhée de poisson
Remarque : Quatre différents indicateurs ont servi à évaluer les diarrhées de poisson : les niveaux de mucine dans l’eau, les niveaux de protéines excrétées ensemble dans l’eau, l' OD600 de l’eau et le V. cholerae UFC dans l' eau13. Diarrhée, normalement devient visuellement évidente environ 6 h après l’exposition du poisson-zèbre à V. cholerae comme décrit ci-dessus.
-
Déterminer les niveaux de mucine
Remarque : La sécrétion de mucine est induite lors de la colonisation de V. cholerae et constitue une bonne mesure des niveaux d’excrétion, surtout au début de l’infection,13. L’essai de mucine est une variation sur la microplaque à l’acide périodique Schiff dosage19.- Préparer les matériaux suivants : 50 % (p/v) d’acide périodique solution mère et 0,1 % solution de travail à l’acide périodique (10 µL du stock 50 % acide périodique on ajout 5 mL d’acide acétique 7 % — utiliser immédiatement après la prise), normes de mucine, plaques de Microplaque 96 puits, Schiff réactif.
- Élaborer des normes de la mucine en suspendant les quantités suivantes de mucine (d’un type de porcin estomac III) dans un tampon d’acétate de sodium (100 mM acétate de sodium, 5mM EDTA, pH à 5,5 à l’acide acétique glacial) : 400 µg/mL, 300 µg/mL, 200 µg/mL, 150 µg/mL , 100 µg/mL, 75 µg/mL, 50 µg/mL, 25 µg/mL et 10 µg/mL.
Préparer la plaque en ajoutant 100 µL de l’infection par l’eau dans chaque puits qui sera utilisé dans l’essai comme suit : blanc 1 x PBS ; normes de mucine tel que décrit ci-dessus, ou un échantillon d’eau de l’infection des poissons. Faire de chaque échantillon en triple exemplaire.
- Élaborer des normes de la mucine en suspendant les quantités suivantes de mucine (d’un type de porcin estomac III) dans un tampon d’acétate de sodium (100 mM acétate de sodium, 5mM EDTA, pH à 5,5 à l’acide acétique glacial) : 400 µg/mL, 300 µg/mL, 200 µg/mL, 150 µg/mL , 100 µg/mL, 75 µg/mL, 50 µg/mL, 25 µg/mL et 10 µg/mL.
- Ajouter 50 µL de solution d’acide périodique 0,1 % fraîche à chacun avec une pipette multicanaux et mélangez-le en pipettant également monter et descendre plusieurs fois.
- Enveloppez la plaque bien dans une pellicule plastique et il incuber à 37 ° C pendant 1 à 1,5 h.
- Laisser refroidir la plaque à température ambiante pendant 5 à 10 min. Ajouter 100 µL de solution de fuchsine (du réactif de Schiff) à chaque puits et pipette de haut en bas pour mélanger.
- Enrouler la plaque dans une pellicule plastique et il incuber à température ambiante sur une plate-forme bascule jusqu'à ce que la couleur a mis au point ; la couleur est généralement développée au sein de 20 min. lire l’absorbance à 560 nm en utilisant un lecteur de plaque.
- Tracer une courbe standard de mucine (OD560vs µg/mL mucin standard). Déterminer les niveaux de la mucine des inconnus en identifiant où l' OD560 de chaque inconnu se situe sur la courbe d’étalonnage et de la concentration de mucine correspondant pour cette valeur de lecture.
- Préparer les matériaux suivants : 50 % (p/v) d’acide périodique solution mère et 0,1 % solution de travail à l’acide périodique (10 µL du stock 50 % acide périodique on ajout 5 mL d’acide acétique 7 % — utiliser immédiatement après la prise), normes de mucine, plaques de Microplaque 96 puits, Schiff réactif.
-
Déterminer les niveaux de la protéine
NOTE : En dehors de la mucine, niveaux globaux de protéine dans l’eau sont un autre proxy pour les niveaux de la diarrhée (selles nuageux, liquide) produites par les poissons. Cette procédure utilise une analyse standard de Bradford pour estimer les taux de protéines. Taux de protéines sont estimés d’après la courbe d’étalonnage de l’albumine sérique bovine (BSA).- Mélanger 100 µL d’une des normes de la BSA (voir note ci-dessous) ou 100 µL d’infection (eau du bécher contenant les poissons infectés) avec 900 µL de Bradford réactif d’analyse (le réactif d’analyse de protéines Pierce fonctionne bien pour cela) dans une cuvette jetable. Incuber les échantillons à la température ambiante pendant 2 min.
Remarque : Les normes de BSA suivantes ont été utilisées : 1 800 µg/mL, 1 000 µg/mL, 750 µg/mL, 500 µg/mL, 250 µg/mL, 125 µg/mL, 50 µg/mL et 25 µg/mL. Les normes de la BSA ont été dilués dans l’eau distillée autoclavé. - Lire l' OD660 de chaque norme ou l’échantillon à l’aide d’un spectrophotomètre.
- Tracer la courbe standard de BSA (OD660vs µg/mL). Déterminer les taux de protéines des inconnus en identifiant où l' OD660 de chaque inconnu tombe sur la courbe d’étalonnage BSA et lire la concentration de mucine correspondant pour cette valeur.
- Mélanger 100 µL d’une des normes de la BSA (voir note ci-dessous) ou 100 µL d’infection (eau du bécher contenant les poissons infectés) avec 900 µL de Bradford réactif d’analyse (le réactif d’analyse de protéines Pierce fonctionne bien pour cela) dans une cuvette jetable. Incuber les échantillons à la température ambiante pendant 2 min.
-
Mesure OD600
Remarque : La présence de diarrhée (selles nuageux, liquide) est visiblement évidente après que plusieurs h et une détermination de600 OD simple peuvent être utilisées pour quantifier cela.- Il faut inverser le tube contenant l’eau infection plusieurs fois pour répartir le contenu. Ajouter 1 mL d’échantillon dans une cuvette jetable. Utiliser 1 mL d’eau stérile infection comme contrôle négatif.
- Effectuer une mesure « en blanc » à l’aide du spectrophotomètre à 600 nm en utilisant l’échantillon témoin négatif. Lire chaque échantillon d’eau à 600 nm et enregistrer les résultats.
-
Détermination d’excrété V. cholerae UFC/mL après l’infection
Remarque : Une composante majeure de la diarrhée, produite par le poisson-zèbre est excrétée V. cholerae. La détermination de la CFU/mL peut être utilisée à des fins comme l’estimation de la réplication bactérienne dans le tractus intestinal de poisson et en guise d’une dose infectieuse dans les expériences de transmission. Cette mesure est préférable lorsqu’une infection transitoire a eu lieu. Si une infection 24h est utilisée, alors ce test mesurera l’inoculum combiné plus les excrétés V. cholerae.- Prendre un échantillon d’eau au point temps désiré et le diluer en série comme décrit plus haut.
- Les dilutions en série sur des milieux sélectifs (LB agar contenant la streptomycine ou un autre antibiotique approprié ou DSAP) sur plaque et les incuber à 30 ° C pendant 24 h.
- Compter les colonies. Calculer la CFU / mL d’eau, comme indiqué au point 1.5.
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Representative Results
V. cholerae la colonisation du tractus intestinal zebrafish
Pour fournir un exemple des niveaux typiques de la colonisation que nous observons, nous avons inoculé 5 x 106 UFC de la EL Tor V. cholerae souche pandémique N16961 dans 200 mL d’eau dans un becher contenant plusieurs poisson-zèbre. Après 6 h de l’infection, les poissons étaient lavés à l’eau fraîche et transférés dans un bécher de 200 mL d’eau de l’infection autoclavées comme décrit dans le protocole. 18 h après le transfert (ou 24h après la primo-infection), les poissons ont été euthanasiés et leurs intestins ont été prises afin de déterminer les niveaux de la colonisation. Environ 105 à 106 V. cholerae cellules / intestin de poissons ont été généralement observées dans la tractus intestinal 24 h après l’infection (hpi) (Figure 1) avec la taille d’inoculum de6 5 x 10.
Quantification de la diarrhée de poisson
Diarrhée a été quantifiée en utilisant les quatre essais simples décrites ci-dessus. Le premier test, l’UFC d’excrétées V. cholerae, est illustré à la Figure 1. Des dilutions de l’IEH 24 de l’eau ont été cultivées pour compter les V. cholerae UFC. On observe généralement des concentrations relativement élevées d’excrétées V. cholerae ; dans cet exemple, environ 105 V. cholerae millilitres d’eau ont été détectés. Les poissons non infectés ne produisent pas décelable V. cholerae (données non présentées).
Le deuxième test utilisé pour quantifier la diarrhée est excrétée mucine. La figure 2 illustre les effets de trois différentes V. cholerae infectieuses doses sur les niveaux de mucine dans l’eau 24 hpi. Une plus forte dose infectieuse est corrélée à une excrétion plus élevée de mucine dans l’eau. Comme témoin, quatre poissons ont été placés dans un bécher identique d’eau, mais les PBS a été ajouté au lieu de la suspension de V. cholerae . Les poissons témoins excrété très peu de mucine.
L’essai de quantification diarrhéiques troisième est l' OD600 de l’IEH 24 de l’eau. Comme illustré à la Figure 3, l' OD600 de cette eau était significativement plus élevée dans le bécher contenant du poisson-zèbre infecté par V. cholerae que dans le bécher contenant du poisson-zèbre non infecté.
Enfin, les niveaux de protéines totales ont été mesurés dans l’eau. L’eau contenant des poissons infectés contenue des niveaux de protéine totale près de deux fois celle observée dans l’eau contenant les poissons non infectés (Figure 4). Collectivement, ces quatre essais illustrent les effets de V. cholerae infection sur l’excrétion du poisson-zèbre.
Figure 1 : Colonisation de l’intestin du poisson-zèbre de V. cholerae. Les poissons ont été infectés pendant 6 h, puis lavés et incubés pendant un total de 24 h. Le côté gauche de la figure illustre la totale UFC / intestin de quatre poissons (points noirs). Le côté droit de la figure indique la V. cholerae UFC / mL mesurés dans l’eau 24 hpi (carrés noirs). Les moyens des deux séries de données sont affichés avec une grande ligne horizontale et l’écart-type sont indiquées par des barres d’erreur. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : test de mucine. Trois différentes V. cholerae doses infectieuses ont été utilisés, ainsi qu’un contrôle non infecté, comme indiqué au titre de la x-axe. Les valeurs moyennes de la mucine détectés dans l’eau par l’acide périodique mis à jour le dosage de Schiff (PAS) sont indiqués par les barres noires au-dessus de chaque dose infectieuse. Les barres d’erreur indiquent l’écart-type. Les astérisques indiquent p < 0,05 tel que déterminé par l’élève de non appariés test t. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Dosage de600 OD comme un proxy pour diarrhée. L' OD600 de 1 mL d’eau depuis les béchers contenant soit V. cholerae infectés ou poissons sains a été mesurée. Les barres noires indiquent la valeur moyenne et les barres d’erreur indiquent l’écart-type. Les astérisques indiquent p < 0,05 tel que déterminé par l’élève de non appariés test t. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Total des taux de protéines dans l’eau. La fraction protéique totale a été estimée par une analyse de Bradford comme décrit. Les barres noires indiquent les valeurs moyennes et les barres d’erreur indiquent l’écart-type. Les astérisques indiquent p < 0,05 tel que déterminé par l’élève de non appariés test t. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Le poisson-zèbre est un relativement nouveau modèle pour l’étude de V. cholerae mais est très prometteur pour la future découverte des aspects inconnus de V. cholerae biologie et pathogenèse11,12,13 . Le modèle de poisson-zèbre adulte a l’avantage d’être une fois naturelles V. cholerae hôte qui contient le microbiote intestinal intact, mature et un modèle environnemental. Inconvénients du modèle sont que les deux facteurs de virulence humaine majeure, la toxine cholérique et la toxine-coregulated Pili, ne sont pas nécessaires pour le poisson-zèbre colonisation ou pathogénie12. Toutefois, cela pourrait par ailleurs considéré comme un autre avantage qui pourrait permettre l’identification du roman V. cholerae colonisation des facteurs et de faciliter l’étude des autres toxines de V. cholerae . Ceci est particulièrement important pour la grande majorité des non-O1/O139 « environnementale » souches de V. cholerae , dont la plupart ne pas produire la toxine cholérique ou toxine-coregulated pili et encore peuvent encore provoquer des maladie20,21.
Les problèmes plus susceptibles d’apparaître à l’aide de ce modèle sont liés à la microflore intestinale abondante. Culture sur milieux non-sélectifs fera ce modèle essentiellement inutilisable car il sera impossible d’identifier les colonies de V. cholerae . Même en utilisant des médias sélectifs ou partiellement sélectifs tel que LB plus streptomycine ou DSAP, un fond de colonies du microbiote intestinal sera présent. Il est essentiel de vérifier que les colonies qui se comptent sont justifiées V. cholerae de patcher les colonies produites par l’ensemencement sur géloses moins sélective sur un milieu très sélectif comme TCB. Par ailleurs, l’insertion d’un marqueur sélectif de mieux dans le génome d’une souche d’intérêt simplifierait grandement l’identification de V. cholerae d’homogénats intestinales.
L’avantage des essais utilisés pour quantifier la diarrhée de poisson-zèbre, c’est qu’ils sont simples et peu coûteux d’exécuter13. L’inconvénient est que ces tests sont en grande partie non spécifiques, en dehors de comptage excrétées V. cholerae UFC directement, et il peut devenir difficile de déterminer si la diarrhée est directement attribuable à la pathogenèse de V. cholerae , ou à quelque autre facteur de stress . Le développement des variations de ces derniers ou d’autres tests afin d’améliorer leur spécificité sera probablement de l’aide à l’avenir Mensurations de V. cholerae pathogénie chez le poisson zèbre.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Merci à Melody Neely, Jon Allen, Abuaita de Bâle et Donna Runft pour leurs efforts pour contribuer à développer le modèle de poisson-zèbre. La recherche rapportée ici a été financée par le National Institute of Allergy et des maladies infectieuses de la National Institutes of Health, sous les numéros de prix R21AI095520 et R01AI127390 (pour Jeffrey H. Withey). Le contenu est la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement l’opinion officielle de la National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrument | |||
| Shaker incubator | New Brunswick Scientific, Edison, NJ | Excella E25 | |
| Incubator | NUAIRE, Plymouth, MN | Auto Flow | |
| Spectrophotometer | Thermo, Waltham, MA | Geaesys 6 | |
| Vortex homogenizer | Minibeadbeater24 | 112011 | |
| Weighing Machine | Ohaus, Columbia, MD | Adventurer Pro | |
| Heat Stirer | Corning, Corning, NY | PC-420D | |
| Burner | |||
| automated colony counter | REVSCI | 120417B | |
| Materials | |||
| 400 ml glass beakers | Pyrex | ||
| perforated lids | Microtip holder with holes from tip box | ||
| disposable plastic spoons | Office Depot, Boca Raton, FL | D15-25-7008 | |
| Fish Tank System | Aquaneering, San Diego, CA | ||
| RO Water Purifier | Aqua FX | TK001 | |
| Fish net | Marina | ||
| fish food | Tetra fin | ||
| Brine Shrimp | Red jungle brand | O.S.I. pro 80 | |
| Styrofoam board | |||
| Pins | |||
| Scalpels | Fine Scientific tools, Foster City, CA | 10000-10 | |
| Forceps | Fine Scientific tools, Foster City, CA | 11223-20 | |
| Vannas scissors | Fine Scientific tools, Foster City, CA | 15000-11 | |
| 2 ml screw cap tubes | Fisher Scientific, Hampton, NH | 02-681-375 | |
| 1 mm glass beads | Bio Spec | 11079110 | |
| Glass beads for spreading | Sigma, St. Louis, MO | 18406-500G | |
| Petri plate | Fisher Brand, Hampton, NH | FB0875713 | |
| 1.5 ml centrifuge tube | Midsci, Valley Park, MO | AVSS1700 | |
| 50 ml centrifuge tube | Corning Falcon, Corning, NY | 352098 | |
| Test tubes | Pyrex | 9820 | |
| Glass Pipette | Fisher Brand, Hampton, NH | 13675K | |
| Micro pipettes | Sartorius Biohit, Göttingen, Germany | m1000/m200/m20 | |
| Tips | Genesee Scientific, San Diego, CA | 24-150RS/24-412 | |
| Chemicals | |||
| Instant Ocean salts | |||
| phosphate buffered saline | VWR Life Science, Radnor, PA | K813-500ml | |
| Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma, St. Louis, MO | A5040 | |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside | Sigma, St. Louis, MO | 10651745001 | |
| Schiff’s reagent | Sigma, St. Louis, MO | 84655-250 mL | |
| periodic acid | Fisher Scientific, Hampton, NH | 10450-60-9 | |
| Mucin from porcine stomach | Sigma, St. Louis, MO | M2378-100G | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific, Hampton, NH | 9046-46-8 | |
| Pierce 660nm Protein Assay Reagent | Thermo, Waltham, MA | 22660 | |
| LB medium | |||
| Trypton | BD Biosciences, San Jose, CA | 211705 | |
| Teast Extract | BD Biosciences, San Jose, CA | 212750 | |
| NACL | Fisher Scientific, Hampton, NH | BP358-212 | |
| Agar | BD Biosciences, San Jose, CA | 214010 | |
| TCBS Agar | BD Biosciences, San Jose, CA | 265020 | |
| DCLS Agar | Sigma, St. Louis, MO | 70135-500gm | |
| Software | |||
| Microsoft office | |||
| Prism 5 |
References
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