Summary
Zebrafish são um natural Vibrio cholerae hospedar e pode ser usado para recapitular e estudar o ciclo infeccioso de colonização para transmissão. Aqui, demonstramos como V. cholerae níveis de colonização de avaliar e quantificar a diarreia no zebrafish.
Abstract
Vibrio cholerae é conhecido como o agente infeccioso que causa a cólera de doenças humanas. Fora do hospedeiro humano, V. cholerae principalmente existe no ambiente aquático, onde interage com uma variedade de espécies aquáticas superiores. Vertebrados peixes são conhecidos por serem um host ambiental e são um reservatório potencial de V. cholerae na natureza. Tanto V. cholerae e as espécies de peixes teleósteos Danio rerio, comumente conhecidas como peixe-zebra, originam o subcontinente indiano, sugerindo uma interação de longa data em ambientes aquáticos. Zebrafish são um organismo modelo ideal para estudar muitos aspectos da biologia, incluindo doenças infecciosas. Zebrafish pode ser facilmente e rapidamente colonizado por V. cholerae após exposição na água. Colonização intestinal por V. cholerae leva à produção de diarreia e a excreção de replicada V. cholerae. Estas excretada bactérias pode, em seguida, vão para colonizar novos hospedeiros de peixe. Aqui, demonstramos como avaliar V. cholerae-colonização intestinal no zebrafish e como quantificar V. cholerae-induzida do zebrafish diarreia. O modelo de colonização deve ser útil para pesquisadores que estão estudando se os genes de interesse podem ser importantes para a colonização do hospedeiro e/ou de sobrevivência ambiental. A quantificação do zebrafish diarreia deve ser útil para pesquisadores estudando qualquer patógeno intestinal que estão interessados em explorar o zebrafish como um sistema modelo.
Introduction
Vibrio cholerae é uma bactéria Gram-negativa aquática que provoca a cólera de doenças humanas, bem como diarreia esporádica1,2. V. cholerae é encontrado no ambiente em muitas áreas do globo, muitas vezes associado com outros organismos aquáticos. Estes organismos associados incluem plâncton, massas de ovos de insetos, moluscos e vertebrados peixes espécie3,4,5,6,7. Vários estudos têm isolado V. cholerae do trato intestinal de peixes em diferentes zonas geográficas7,8,9,10. A presença de V. cholerae em peixes indica que o peixe pode atuar como um reservatório ambiental. Peixes também poderiam ser implicados na transmissão da doença aos seres humanos e na disseminação geográfica de V. cholerae estirpes6.
Para entender melhor como o V. cholerae interage com peixe, Danio rerio, mais conhecido como peixe-zebra, foi desenvolvido como um sistema modelo para estudar V. cólerae11. Zebrafish são nativas do Sul da Ásia, incluindo a região da Baía de Bengala, que é pensado para ser o mais antigo reservatório de V. cholerae. Antes do início primeiro cólera pandemia, em 1817, a cólera não tinha sido relatada fora do que é hoje a Índia e Bangladesh. Portanto, zebrafish e V. cholerae quase certamente associado com o outro em escalas de tempo evolutivo, sugerindo que zebrafish são uma série de V. cholerae no ambiente natural12.
O modelo de zebrafish para o V. cholerae é simples de executar e pode ser usado para estudar a patogenicidade de todo o ciclo de vida V. cholerae . Peixes são expostos para o V. cholerae por tomar banho na água que tenha sido inoculado com um número conhecido de V. cholerae. Dentro de algumas horas, colonização intestinal ocorre, seguido pela produção de diarreia. Diarreia consiste de mucina, proteínas, bactérias excretadas e outro conteúdo intestinal. O grau de diarreia pode ser quantificado usando algumas medições simples13. V. cholerae que tem sido excretado pelos peixes infectados pode então ir para infectar os peixes ingênuo, completando o ciclo infeccioso. Portanto, o modelo de zebrafish recapitula o V. cholerae doença humana processo12,14.
O mais frequentemente usado V. cholerae modelos animais têm sido, historicamente, ratos e coelhos14,15,16,17,18. Esses modelos têm sido fundamentais para adicionar ao nosso conhecimento de V. cholerae patogênese. No entanto, porque os ratos e coelhos não são naturais V. cholerae anfitriões, existem limitações a que aspectos do ciclo de vida V. cholerae podem ser estudados. A V. cholerae colonização de ratos e coelhos, normalmente, requer a ausência da microbiota intestinal ou um tratamento prévio com antibióticos para danificar a microbiota intestinal. Ambos os modelos requerem ou gavagem para introduzir as bactérias para o sistema digestivo ou manipulação cirúrgica para injetar diretamente as bactérias no intestino. Zebrafish têm uma vantagem em que peixes adultos com uma microbiota intestinal intacta prontamente são colonizados e o processo infeccioso acontece naturalmente, sem qualquer manipulação necessária.
O presente trabalho demonstra a utilização do zebrafish como modelo em V. cholerae infecção. A infecção, dissecação, enumeração de colonizar V. choleraee a quantificação de diarreia causada pelo V. cholerae será descrito12,13. Este modelo é provável que seja útil para os cientistas interessados no processo de doença V. cholerae e o V. cholerae ambiental estilo de vida.
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Protocol
Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) da Wayne State University. Esse método foi descrito pela primeira vez em Runft et al . 12
1. determinação dos níveis de colonização Intestinal
Nota: Colonização Intestinal é a métrica mais útil no modelo de zebrafish como ele pode ser usado para comparar a adequação relativa de diversas variedades de V. cholerae ou os efeitos de mutações ou nocautes de gene.
- Inoculação de zebrafish por imersão
Nota: Este meio de exposição assemelha-se o curso natural da infecção.- Preparação do V. cholerae
- Inocular 5ml de caldo lisogenia (LB) com um isolado V. cholerae colônia de um LB da placa e incubar a 37 ° C, com agitação (180 rpm) para 6-8 h (cultura durante a noite).
- Inocule 25 mL de meio fresco de LB esterilizado em um Erlenmeyer de 250 mL com 50 µ l de cultura acima durante a noite. Incube-16 – 18 h a 37 ° C, com agitação (150 rpm).
- Ler a densidade óptica em 600 nm (OD600) de uma diluição de 1/10 da cultura durante a noite para estimar o número de bactérias por mL (o OD600 = 1 é 10 ~9 UFC/mL.)
- Colher as células por centrifugação a 6.000 g durante 10 min. remover a mídia com uma pipeta ou derramá-lo fora em uma solução desinfetante. Ressuspender as células em PBS estéril para a concentração desejada, tipicamente entre 1 x 107 a 1 x 1010 por ml de PBS.
Nota: Aqui, nos referimos a autoclavado osmose reversa água contendo sais de 60 mg/L do mar como água estéril de infecção.
-
Inoculação e incubação
- Colocar um copo de 400 mL, contendo 200 mL de água estéril infecção zebrafish quatro ou cinco.
- Adicione 1 mL de V. cholerae (da etapa 1.1.1.4.) para obter a concentração desejada de infecção (tipicamente 5 x 104 a 5 x 107 UFC/mL) em 200 mL de água de infecção.
- Cobrir o recipiente com uma tampa perfurada para evitar que os peixes saltem para fora; parte superior de uma caixa de dica de 200 µ l funciona bem para isso.
- Etiquete cada copo e colocá-los em uma incubadora de vidro da frente regulado a 28 ° C, para a duração do experimento.
-
Procedimento para a exposição transitória
Nota: Uma exposição transitória para o V. cholerae (tipicamente de 6 h) seguida da remoção das bactérias inoculando é útil para estudar a transmissão e para a quantificação mais precisa de bactérias excretadas.- Após 6 h de exposição, deite fora a água do copo através de uma rede para recolher os peixes. Descarte a água infectada dentro de um recipiente de água sanitária para matar o V. cholerae.
- Coloque o peixe removido em um copo de 200 mL de água estéril de infecção. Permitir que os peixes a nadar nessa água limpa por 5 min remover as bactérias de superfície do peixe.
- Repita o procedimento líquido (etapa 1.2.2) e coloque o peixe em um novo copo de 200 mL de água estéril de infecção. Mantenha o peixe este copo para a duração do experimento.
- Preparação do V. cholerae
- Eutanásia
- Quando o experimento alcançou seu ponto final desejado, tirar uma amostra da infecção água (15 mL é geralmente suficiente) permitir excretadas contagens bacterianas e a medição de diarreia (tais como o ensaio de mucina, teor de proteínas e/ou OD), se desejado (secção 2).
- Despeje o restante da água através de um arrastão (para recolher os peixes) em água sanitária para matar o V. cholerae na água.
- Coloque o peixe em um béquer contendo água de infecção mais 336 µ g/mL de Metanossulfonato de 3-aminobenzoato de etilo (tricaina) e incube-os peixes nesta solução tricaina por 20 min no RT
Nota: As redes de pesca foram esterilizados com uma solução de água sanitária 10%.
- Dissecação
- Preparação de peixes
- Escave um peixe para fora a solução tricaina com uma colher de plástico descartável e coloque-o na superfície de dissecação.
- Posição o peixe com o seu lado ventral virada para cima e pino através do maxilar inferior, com a extremidade romba do pino angular longe do centro do corpo. Coloque outro pino só posterior ao ânus, também em ângulo longe do corpo.
- Exposição do trato intestinal
- Limpe a superfície ventral do peixe com uma limpeza de fiapos, embebida em etanol 70%.
- É necessário esterilize um bisturi e Tesoura Vannas mergulhando-os em etanol a 70% e em chamas-los.
- Faça uma pequena incisão longitudinal na barriga apenas sob a pele, penetrando as escalas e usando o bisturi. Tenha cuidado para não cortar muito profundamente, como o trato intestinal está localizado logo abaixo da pele.
- Usando a tesoura, estenda a incisão cuidadosamente ao longo do comprimento do corpo, evitando o ânus e a corte não mais profundo do que o nível da pele.
- Fazer dois cortes laterais com a tesoura em direção a cabeça do peixe para permitir uma abertura da incisão.
- Pino da pele de cada lado das incisões laterais à superfície dissecação, dobrando os pinos para fora, longe do corpo.
Nota: As pontas dos pinos foram previamente esterilizadas por flamejante-los com álcool.
-
Remoção do trato intestinal
Nota: O trato intestinal deve ser visível como um tubo pálido, muito fino, em cima de outros órgãos.- Flama-esterilizar o fórceps e então usá-los para remover todo trato intestinal (geralmente de 12 a 15 mm de comprimento). Coloque o intestino em um tubo de homogeneização contendo grânulos de vidro (ver passos 1.4.1–1.4.2) e 1 mL de 1X PBS ou LB, no gelo.
- Preparação de peixes
- Homogeneização
- Preparar os tubos de homogeneização com antecedência pelo derramamento ~1.5 g de grânulos de vidro de 1 mm em 2 mL tampa de rosca tubos (preenchê-los aproximadamente na metade do caminho) e então esterilizá-los em autoclave.
- Adicione 1 mL de LB estéril ou 1X PBS.
- Uma vez que os intestinos de zebrafish tem sido parafuso adicionado (etapa 1.3.3.1) para os tubos, as tampas na muito firmemente e prenda os tubos num homogeneizador vórtice.
- Homogeneizar as amostras por 1 min na configuração máxima e, em seguida, fixe-los no gelo para 1 a 2 min. Repita este ciclo de homogeneização mais uma vez para uma homogeneização completa.
Nota: Vários métodos alternativos para homogeneização também irão funcionar.
- Quantificar os níveis de colonização intestinal
- Prepare tubos (tubos de ensaio de vidro pequeno ou tubos de microcentrifuga de 1,5 mL) para a diluição serial do homogenate adicionando 900 µ l de LB ou 1X PBS a cada tubo. Para cada peixe, preparar tubos de 5 – 6 e fazer 10 vezes diluições em série do homogenate intestinal adicionando-se 100 µ l de homogeneizado para o primeiro tubo, num Vortex para mistura e em seguida, adicionar 100 µ l do tubo do primeiro para o segundo tubo.
- Repita este procedimento até que todas as diluições foram preparadas.
- Placa de 100 a 200 µ l de cada diluição em placas de ágar LB contendo 100 µ g/mL de estreptomicina (se usando cepas resistentes de estreptomicina) e 40 µ g/mL de X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside). Incube as placas a 30 ° C para 16 – 18 h.
- Após a incubação durante a noite, contagem das colónias V. cholerae nas placas, usando um contador de colônia automática ou manualmente, contando as colônias; é útil marcar as colônias contadas com uma ponta de marcador.
- Determine o CFU por intestino de peixe multiplicando-se a contagem de placa pelo factor de diluição da suspensão, tendo em conta o volume que foi chapeado.
2. medição de diarreia de peixe
Nota: Quatro métricas diferentes foram usadas para avaliar a diarreia de peixe: os níveis de mucina na água, os níveis de proteína excretados geral em água, o OD600 da água e o V. cholerae CFU na água13. Diarreia normalmente torna-se visualmente evidente aproximadamente 6 h após a exposição do zebrafish para V. cholerae conforme descrito acima.
-
Determinar os níveis de mucina
Nota: A secreção de mucina é induzida durante a colonização de V. cholerae e é uma boa medida de níveis de excreção, especialmente no início de infecção13. O ensaio de mucina é uma variação sobre o ácido periódico microtiter Schiff ensaio19.- Preparar os seguintes materiais: solução de ácido periódico a 50% (p/v) e solução de 0,1% ácido periódico trabalho (10 µ l do estoque 50% ácido periódico adicionado a 5 mL de ácido acético 7% — usar imediatamente depois de fazer), padrões de mucina, placas de microtitulação 96 poços, Schiff reagente.
- Preparar padrões de mucina, suspendendo as seguintes quantidades de mucina (a partir de um tipo de suínos estômago III) em um tampão de acetato de sódio (100 mM de sódio acetato, 5mM EDTA, pH 5.5 com ácido acético glacial): 400 µ g/mL, 300 µ g/mL, 200 µ g/mL, 150 µ g/mL , 100 µ g/mL, 75 µ g/mL, 50 µ g/mL, 25 µ g/mL e 10 µ g/mL.
Preparar a placa adicionando-se 100 µ l de infecção a água a cada poço que será usado no ensaio da seguinte forma: em branco 1X PBS; padrões de mucina conforme descrito acima, ou uma amostra de água da infecção de peixe. Fazer cada amostra em triplicado.
- Preparar padrões de mucina, suspendendo as seguintes quantidades de mucina (a partir de um tipo de suínos estômago III) em um tampão de acetato de sódio (100 mM de sódio acetato, 5mM EDTA, pH 5.5 com ácido acético glacial): 400 µ g/mL, 300 µ g/mL, 200 µ g/mL, 150 µ g/mL , 100 µ g/mL, 75 µ g/mL, 50 µ g/mL, 25 µ g/mL e 10 µ g/mL.
- Adicione 50 µ l de solução de ácido periódico fresca de 0,1% para cada um bem com uma pipeta multicanal e misturá-lo pipetando subindo e descendo várias vezes.
- Embrulhe em filme plástico da placa e incubar a 37 ° C para 1-1.5 h.
- Fixe a placa até à temperatura de 5 a 10 min. Adicione 100 µ l de solução de fucsina (do reagente de Schiff) a cada poço e pipeta para cima e para baixo misturá-lo.
- Embrulhe o prato em filme plástico e incube-lo à temperatura ambiente em uma plataforma de balanço até que desenvolveu a cor; a cor é geralmente desenvolvida dentro de 20 min. ler a absorvância a 560 nm, utilizando um leitor de placa.
- Traça uma curva padrão de mucina (OD560vs µ g/mL mucina padrão). Determine os níveis de mucina do soldado desconhecido, identificando onde o OD560 cada desconhecido cai na curva padrão e ler a concentração de mucina correspondente para esse valor.
- Preparar os seguintes materiais: solução de ácido periódico a 50% (p/v) e solução de 0,1% ácido periódico trabalho (10 µ l do estoque 50% ácido periódico adicionado a 5 mL de ácido acético 7% — usar imediatamente depois de fazer), padrões de mucina, placas de microtitulação 96 poços, Schiff reagente.
-
Determinar os níveis de proteína
Nota: Além de mucina, níveis de proteína total na água são outro proxy para os níveis de diarreia (fezes nublado, líquido) produzidos pelos peixes. Este procedimento usa um ensaio de Bradford padrão para estimar os níveis de proteína. Níveis de proteína são estimados com base em cima de uma curva padrão de albumina de soro bovino (BSA).- Misture 100 µ l de uma das normas de BSA (ver nota abaixo) ou 100 µ l de água de infecção (água do Béquer contendo o peixe infectado) com 900 µ l de Bradford reagente de ensaio (Reagente de ensaio da proteína de Pierce funciona bem para isso) em uma cubeta descartável. Incube as amostras à temperatura ambiente por 2 min.
Nota: As seguintes normas de BSA foram utilizadas: 1.800 µ g/mL, 1.000 µ g/mL, 750 µ g/mL, 500 µ g/mL, 250 µ g/mL, 125 µ g/mL, 50 µ g/mL e 25 µ g/mL. Os padrões de BSA foram diluídos em água destilada esterilizada. - Leia o OD660 de cada norma, ou prove-los usando um espectrofotômetro.
- Traça a curva padrão BSA (OD660vs µ g/mL). Determine os níveis de proteína do soldado desconhecido, identificando onde OD660 cada desconhecido cai sobre a curva padrão de BSA e ler a concentração de mucina correspondente para esse valor.
- Misture 100 µ l de uma das normas de BSA (ver nota abaixo) ou 100 µ l de água de infecção (água do Béquer contendo o peixe infectado) com 900 µ l de Bradford reagente de ensaio (Reagente de ensaio da proteína de Pierce funciona bem para isso) em uma cubeta descartável. Incube as amostras à temperatura ambiente por 2 min.
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Medida OD600
Nota: A presença de diarreia (fezes nublado, líquido) manifesta-se visivelmente após vários h e uma simples determinação de600 OD podem ser usados para quantificar isso.- Inverta o tubo contendo água a infecção várias vezes para distribuir o conteúdo. Adicione 1 mL da amostra de água para uma cubeta descartável. Use 1 mL de água estéril infecção como controlo negativo.
- Realizar uma medição "em branco", utilizando o espectrofotômetro a 600 nm, utilizando a amostra de controlo negativo. Leia cada amostra de água a 600 nm e registar os resultados.
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Determinação de excretada V. cholerae UFC/mL após a infecção
Nota: Um componente importante da diarreia produzida pelo zebrafish é excretado V. cholerae. A determinação da CFU/mL pode ser utilizada para fins tais como estimar a replicação bacteriana no trato intestinal peixe e como uma medida de uma dose infecciosa em experimentos de transmissão. Esta medida é feita melhor quando uma infecção transitória tem ocorrido. Se uma infecção de 24 h é usada, este ensaio medirá o inóculo combinado, mais o excretados V. cholerae.- Tirar uma amostra de água no ponto de tempo desejado e diluí-la em série conforme descrito anteriormente.
- As diluições de série em meios selectivos (ágar-ágar LB contendo estreptomicina ou outro antibiótico apropriado ou DCLS) da placa e incube-os a 30 ° C por 24 h.
- Conte as colônias. Calcule o UFC / mL de água, conforme descrito na etapa 1.5.
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Representative Results
V. cholerae colonização do trato intestinal de zebrafish
Para fornecer um exemplo dos níveis típicos de colonização que observamos, nós inoculado 5 x 106 UFC da pandemia EL Tor V. cholerae estirpe N16961 em 200 mL de água numa proveta contendo vários zebrafish. Após 6 h de infecção, os peixes foram lavados em água doce e transferidos para um copo de 200 mL de água esterilizada infecção conforme descrito no protocolo. 18 h após a transferência (ou 24 h após a infecção primária), os peixes foram sacrificados e seus intestinos foram levados para determinar os níveis de colonização. Aproximadamente 105 a 106 V. cholerae células por intestino de peixes foram observadas normalmente a pós-infecção de 24h de trato intestinal (hpi) (Figura 1) com o tamanho do inóculo 5 x 106 .
Quantificação de diarreia de peixe
Diarreia foi quantificada utilizando os quatro ensaios simples descritos acima. O primeiro ensaio, o CFU de excretados V. cholerae, é mostrado na Figura 1. Diluições em série de hpi de 24 a água foram chapeadas para contar o V. cholerae CFU. Níveis relativamente elevados de excretados V. cholerae são geralmente observados; Neste exemplo, aproximadamente 105 V. cholerae por mL de água foram detectados. Peixe não infectados não produzem detectados V. cholerae (dados não mostrados).
O segundo ensaio usado para quantificar a diarreia é mucina excretada. A Figura 2 mostra os efeitos de três diferentes V. cholerae infecciosas doses nos níveis de mucina na água 24 hpi. Uma maior dose infecciosa está correlacionada com uma maior excreção de mucina na água. Como um controle, quatro peixes foram colocado em um béquer idêntica de água, mas PBS foi adicionado ao invés da suspensão de V. cholerae . O peixe de controle excretada mucina muito pouco.
O terceiro ensaio de quantificação diarreicas é o OD600 de hpi de 24 a água. Como mostrado na Figura 3, o OD600 desta água foi significativamente maior no copo contendo zebrafish infectado com o V. cholerae do que no copo contendo zebrafish não infectado.
Finalmente, os níveis de proteínas totais foram medidos na água. Água que contém os peixes infectados continha níveis de proteína total quase o dobro que o observaram na água contendo os peixes não infectados (Figura 4). Coletivamente, estes quatro ensaios ilustram os efeitos de V. cholerae infecção tem na excreção de zebrafish.
Figura 1: Colonização Intestinal de zebrafish por V. cholerae. Os peixes foram infectados por 6h, então lavados e incubados durante um total de 24 h. O lado esquerdo da figura ilustra o total CFU por intestino de quatro peixes (pontos negros). O lado direito da figura indica o V. cholerae CFU / mL medido em água 24 hpi (quadrados pretos). Os meios de ambos os conjuntos de dados são mostrados com uma grande linha horizontal e o desvio padrão são indicados por barras de erro. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: ensaio de mucina. Três diferentes V. cholerae doses infecciosas foram usados, juntamente com um controle não infectado, conforme indicado sob o x-eixo. Os valores médios da mucina detectado na água pelo ácido periódico modificados do ensaio Schiff (PAS) são indicados por barras pretas acima cada dose infecciosa. As barras de erro indicam o desvio padrão. Os asteriscos indicam p < 0,05 conforme determinado pelo aluno é unpaired t-teste. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Ensaio de600 OD como um proxy para diarreia. O OD600 de 1 mL de água a partir do Béquer contendo qualquer V. cholerae infectados ou não infectado peixe foi medido. As barras pretas indicam o valor médio e as barras de erro indicam o desvio padrão. Os asteriscos indicam p < 0,05 conforme determinado pelo aluno é unpaired t-teste. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Total de níveis de proteína na água. A proteína total foi estimada por um ensaio de Bradford conforme descrito. As barras pretas indicam os valores médios e as barras de erro indicam o desvio padrão. Os asteriscos indicam p < 0,05 conforme determinado pelo aluno é unpaired t-teste. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O peixe-zebra é um modelo relativamente novo para o estudo V. cholerae , mas é uma grande promessa para a futura descoberta de aspectos anteriormente desconhecidos de V. cholerae biologia e patogênese11,12,13 . O modelo de zebrafish adulto tem as vantagens de ser ambos um natural V. cholerae host que contém microbiota intestinal intacta, madura e um modelo ambiental. Desvantagens do modelo são que os dois fatores de virulência humano principais, toxina da cólera e toxina-coregulated pilus, não são necessárias para zebrafish colonização ou patogênese12. No entanto, este como alternativa poderia ser visto como uma outra vantagem que poderia permitir a identificação do romance V. cholerae colonização fatores e facilitar o estudo de outras toxinas de V. cholerae . Isto é especialmente relevante para a grande maioria dos não-O1/O139 "ambiental" V. cholerae estirpes, a maioria dos quais fazer não produzir toxina da cólera ou pilus toxina-coregulated e ainda pode ainda causar doença20,21.
Os problemas mais prováveis de surgir usando este modelo estão relacionados com a microbiota intestinal abundante. Chapeamento em meios não seletivos fará este modelo essencialmente inutilizável como será impossível identificar as colônias de V. cholerae . Mesmo usando mídia seletiva ou parcialmente seletiva como LB plus estreptomicina ou DCLS, um fundo de colônias da microbiota intestinal estará presente. É essencial para verificar se as colônias que estão sendo contadas estão bona fide V. cholerae , Emendando as colônias produzidas pelo chapeamento na mídia menos selectivo num suporte muito seletiva como TCBS. Alternativamente, a inserção de um melhor marcador seletivo no genoma de uma estirpe de interesse seria simplificar a identificação do V. cholerae de homogenates intestinal.
A vantagem dos ensaios utilizados para quantificar o zebrafish diarreia é que eles são simples e barata para executar13. A desvantagem é que estes ensaios são largamente inespecíficos, além de contagem excretados V. cholerae CFU diretamente, e pode se tornar difícil determinar se a diarreia é diretamente devido à patogênese de V. cholerae , ou a algum outro fator de estresse . O desenvolvimento de variações destes ou outros ensaios para melhorar a sua vontade de especificidade provável ajuda no futuro medições de V. cholerae patogênese no zebrafish.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Graças a melodia Neely, Jon Allen, Abuaita de Basileia e Donna Runft por seus esforços em ajudar a desenvolver o modelo de zebrafish. A pesquisa relatada aqui foi apoiada pelo Instituto Nacional de alergia e doenças infecciosas do institutos nacionais da saúde sob números do prêmio R21AI095520 e R01AI127390 (para Jeffrey H. Withey). O conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial do institutos nacionais da saúde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrument | |||
| Shaker incubator | New Brunswick Scientific, Edison, NJ | Excella E25 | |
| Incubator | NUAIRE, Plymouth, MN | Auto Flow | |
| Spectrophotometer | Thermo, Waltham, MA | Geaesys 6 | |
| Vortex homogenizer | Minibeadbeater24 | 112011 | |
| Weighing Machine | Ohaus, Columbia, MD | Adventurer Pro | |
| Heat Stirer | Corning, Corning, NY | PC-420D | |
| Burner | |||
| automated colony counter | REVSCI | 120417B | |
| Materials | |||
| 400 ml glass beakers | Pyrex | ||
| perforated lids | Microtip holder with holes from tip box | ||
| disposable plastic spoons | Office Depot, Boca Raton, FL | D15-25-7008 | |
| Fish Tank System | Aquaneering, San Diego, CA | ||
| RO Water Purifier | Aqua FX | TK001 | |
| Fish net | Marina | ||
| fish food | Tetra fin | ||
| Brine Shrimp | Red jungle brand | O.S.I. pro 80 | |
| Styrofoam board | |||
| Pins | |||
| Scalpels | Fine Scientific tools, Foster City, CA | 10000-10 | |
| Forceps | Fine Scientific tools, Foster City, CA | 11223-20 | |
| Vannas scissors | Fine Scientific tools, Foster City, CA | 15000-11 | |
| 2 ml screw cap tubes | Fisher Scientific, Hampton, NH | 02-681-375 | |
| 1 mm glass beads | Bio Spec | 11079110 | |
| Glass beads for spreading | Sigma, St. Louis, MO | 18406-500G | |
| Petri plate | Fisher Brand, Hampton, NH | FB0875713 | |
| 1.5 ml centrifuge tube | Midsci, Valley Park, MO | AVSS1700 | |
| 50 ml centrifuge tube | Corning Falcon, Corning, NY | 352098 | |
| Test tubes | Pyrex | 9820 | |
| Glass Pipette | Fisher Brand, Hampton, NH | 13675K | |
| Micro pipettes | Sartorius Biohit, Göttingen, Germany | m1000/m200/m20 | |
| Tips | Genesee Scientific, San Diego, CA | 24-150RS/24-412 | |
| Chemicals | |||
| Instant Ocean salts | |||
| phosphate buffered saline | VWR Life Science, Radnor, PA | K813-500ml | |
| Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma, St. Louis, MO | A5040 | |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside | Sigma, St. Louis, MO | 10651745001 | |
| Schiff’s reagent | Sigma, St. Louis, MO | 84655-250 mL | |
| periodic acid | Fisher Scientific, Hampton, NH | 10450-60-9 | |
| Mucin from porcine stomach | Sigma, St. Louis, MO | M2378-100G | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific, Hampton, NH | 9046-46-8 | |
| Pierce 660nm Protein Assay Reagent | Thermo, Waltham, MA | 22660 | |
| LB medium | |||
| Trypton | BD Biosciences, San Jose, CA | 211705 | |
| Teast Extract | BD Biosciences, San Jose, CA | 212750 | |
| NACL | Fisher Scientific, Hampton, NH | BP358-212 | |
| Agar | BD Biosciences, San Jose, CA | 214010 | |
| TCBS Agar | BD Biosciences, San Jose, CA | 265020 | |
| DCLS Agar | Sigma, St. Louis, MO | 70135-500gm | |
| Software | |||
| Microsoft office | |||
| Prism 5 |
References
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