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Biology

उपंयास कीटनाशक Chemistries मच्छरों के विषाक्तता के परीक्षण के लिए प्रोटोकॉल

Published: February 13, 2019 doi: 10.3791/57768
Automatic Translation
*1, *1, 1,2
1Department of Entomology, Purdue University, 2Purdue Institute for Inflammation, Immunology and Infectious Disease, Purdue University
* These authors contributed equally

Summary

प्रोटोकॉल डिमंकनाशी, adulticides और endectocides की नई कक्षाओं के रूप में विकास के लिए अपरिपक्व और वयस्क मच्छरों के लिए chemistries की विषाक्तता का आकलन करने के लिए वर्णित हैं । प्रोटोकॉल एकल बिंदु खुराक और बाद में मूल्यांकन पर एकाधिक chemistries के उच्च प्रवाह परीक्षण सक्षम करें खुराक प्रतिक्रिया परख के माध्यम से संपर्क पर विषाक्तता निर्धारित करने के लिए या घूस के माध्यम.

Abstract

कार्रवाई के उपंयास मोड के साथ कीटनाशकों की नई कक्षाएं Zika, डेंगू और मलेरिया जैसे रोगों संचारित कि मच्छरों की कीटनाशक प्रतिरोधी आबादी को नियंत्रित करने के लिए आवश्यक हैं । तेजी के लिए परख, मच्छर लार्वा और वयस्कों के खिलाफ unformulat उपंयास chemistries के उच्च प्रवाह विश्लेषण प्रस्तुत कर रहे हैं । हम एकल बिंदु के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन-खुराक और प्रतिक्रिया परख के लिए छोटे अणु chemistries की विषाक्तता का मूल्यांकन करने के लिए Zika के एडीज aegypti वेक्टर, डेंगू और पीत ज्वर, मलेरिया वेक्टर, Anopheles gambiae और उत्तरी घर मच्छर, Culex quinquefasciatus, संपर्क पर और घूस के जरिए । एक उदाहरण के रूप में, हम ऐमिट्रिप्टिलाइन, जी प्रोटीन के एक छोटे अणु विरोधी रिसेप्टर्स युग्मित, लार्वा, वयस्क सामयिक और वयस्क रक्त के माध्यम से खिला परख के विषाक्तता का मूल्यांकन किया । प्रोटोकॉल कीटनाशक क्षमता की जांच करने के लिए एक प्रारंभिक बिंदु प्रदान करते हैं । परिणाम वितरण के लिए उत्पाद अनुप्रयोगों और तंत्र का पता लगाने के लिए अतिरिक्त प्रयोगों के संदर्भ में चर्चा कर रहे हैं ।

Introduction

मच्छरों संक्रामक रोगों कि प्रभाव मानव स्वास्थ्य विश्व स्तर पर1के प्रेरणा का एजेंट संचारित । मानव स्वास्थ्य को प्रभावित करने वाले तीन सबसे महत्वपूर्ण मच्छर पीढ़ी एडीज, Anopheles, और Culexहैं । एडीज मच्छरों की प्रजातियों वेक्टर arboviruses जो Zika, डेंगू, पीत ज्वर और chikungunya का कारण है । Anopheles प्रजातियों वेक्टर मलेरिया परजीवी और Culex प्रजातियों पश्चिम नील नदी वायरस और filarial सूत्रकृमि2संचारित । विश्व स्वास्थ्य संगठन (डब्ल्यूएचओ) २०२०3 द्वारा दस उपेक्षित उष्णकटिबंधीय रोगों (NTD) के उंमूलन के लिए बुलाया गया है और सबसे व्यवहार्य रणनीति के रूप में मच्छर नियंत्रण की पहचान की । कीटनाशकों मच्छरों को नियंत्रित करने और रोग संचरण को कम करने के लिए शक्तिशाली उपकरण हैं4,5. हालांकि, कीटनाशक प्रतिरोधी मच्छर आबादी के उद्भव के कई रोगों के निरंतर नियंत्रण की धमकी6,7,8। अभिनव वेक्टर नियंत्रण कंसोर्टियम (IVCC) ने मच्छर नियंत्रण9के लिए प्रतिस्थापन कीटनाशक विकसित करने का पहला समर्पित प्रयास शुरू किया है । क्रिया के उपंयास मोड (मुआ) के साथ नए कीटनाशकों को पूरा करने के लिए जो लक्ष्य और रोग नियंत्रण प्राप्त करने की जरूरत है । खोज और उपंयास MoAs के साथ नए कीटनाशक वर्गों के विकास तेजी से, उच्च chemistries के प्रवाह विश्लेषण और उद्योग के मानकों की तुलना में10के लिए पूरे जीव परख की आवश्यकता होती है ।

कई परख लार्वा और वयस्क मच्छरों के लिए कीटनाशकों की repellency और विषाक्तता का मूल्यांकन करने के लिए उपलब्ध हैं, और कुछ उपन्यास के मूल्यांकन के लिए उपयुक्त है या तैयार की chemistries । डब्ल्यूएचओ प्रोटोकॉल11 एक संपर्क परख चौथे instar लार्वा के खिलाफ उत्पादों के परीक्षण के लिए प्रयोग किया जाता है । प्रकाशित अध्ययन भी लार्वा की एक किस्म का वर्णन करने के लिए छोटे अणु chemistries की विषाक्तता का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया एडीज aegypti के लार्वा , Anopheles gambiae और Culex quinquefasciatus10,12, 13,14,15,16. रोग नियंत्रण और रोकथाम के लिए केंद्र (सीडीसी) बोतल परख क्षेत्र में कीटनाशक प्रतिरोध का आकलन करने के लिए घातक एकाग्रता (नियंत्रण रेखा) और घातक समय (लेफ्टिनेंट) एक मानक नैदानिक की तुलना में मूल्यांकन के माध्यम से वयस्क मच्छरों की आबादी पकड़ लिया जाता है एक वाणिज्यिक कीटनाशक की खुराक17. डब्ल्यूएचओ संवेदनशीलता परीक्षण एक और दृष्टिकोण के लिए वयस्क मच्छरों में कीटनाशक प्रतिरोध का मूल्यांकन जिससे मच्छरों कीटनाशक के संपर्क में आ रहे है प्रदान करता है-गर्भवती कागज कांच शीशियों के अंदर 1 घंटे और मृत्यु के लिए 24 ज18में मूल्यांकन किया है । अंय परख सील पिंजरों और रिकॉर्ड मच्छर पछाड़ना और वांछित timepoints19में मौत के अंदर स्प्रे योगों । मच्छर छाती को सामयिक आवेदन के लिए विभिंन कीटनाशकों की शक्ति का मूल्यांकन किया गया है20। लिवरपूल कीट परीक्षण स्थापना (लाइट)21 मानक संचालन प्रक्रियाओंको रोजगार के लिए वयस्क मच्छरों के लिए chemistries की गतिविधियों का मूल्यांकन । लाइट वयस्क सामयिक परख ४८ एच में बनाए गए मृत्यु दर के साथ वयस्क मच्छरों के छाती के लिए परीक्षण उत्पाद की एक छोटी मात्रा पर लागू होता है । परख ठहराव प्रति व्यक्ति मच्छर21प्राप्त की खुराक के सक्षम बनाता है । लाइट तरसल परख एक रासायनिक उपचार सतह पर आराम वयस्क मच्छरों के लिए परीक्षण उत्पाद की विषाक्तता का मूल्यांकन करता है और इनडोर अवशिष्ट स्प्रे (आईआरएस) या कीटनाशक में उपयोग के रूप में विकास के लिए क्षमता के साथ chemistries की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया बिस्तर-जाल (ITNs) Anopheles मच्छरों को नियंत्रित करने के लिए ।

डब्ल्यूएचओ और सीडीसी परख उपंयास, unformulat chemistries परीक्षण के लिए सीमाएं हैं, और सीडीसी बोतल परख का लक्ष्य कम परख अवधि (दो घंटे) के बजाय विषाक्तता22,23से अधिक संवेदनशीलता का मूल्यांकन है । इसके अतिरिक्त, रक्त भोजन और प्रणालीगत-अभिनय उत्पादों (यानी, endectocides) के विकास के लिए क्षमता में दिया chemistries की विषाक्तता के मूल्यांकन के लिए परख की कमी है । यहां, हम उपंयास chemistries के mosquitocidal गतिविधि है कि पानी में घुलनशील है या लार्वा और एडीज, Anopheles और Culexके वयस्कों के खिलाफ कई कार्बनिक सॉल्वैंट्स में से एक के परीक्षण के लिए परख का वर्णन । सबसे पहले, हम एक लार्वा पहले हमारे समूह द्वारा वर्णित परख प्रदर्शन10,12,13,16, और यहां के रूप में (1) एक स्क्रीन तेजी से एक बिंदु खुराक में कई chemistries का मूल्यांकन करने के लिए प्रदर्शन किया, और (2) एक खुराक प्रतिक्रिया परख एक एकल रसायन विज्ञान के घातक एकाग्रता (जैसे, नियंत्रण रेखा५०, नियंत्रण रेखा७५ या नियंत्रण रेखा९०,) निर्धारित करने के लिए । अगले, हम घातक खुराक के निर्धारण के लिए दो वयस्क परख का वर्णन (LD) । इनमें से पहले एक सकारात्मक नियंत्रण की तुलना में वयस्क मच्छरों के खिलाफ सामयिक लागू, उपंयास chemistries के परीक्षण के लिए लाइट प्रोटोकॉल का एक अनुकूलन है । दूसरा रक्त भोजन के माध्यम से प्रणालीबद्ध दिया chemistries के मूल्यांकन के लिए एक खिला परख है ।

Protocol

नोट: सभी उपभेदों और निंनलिखित प्रोटोकॉल में वर्णित काम के लिए आवश्यक एजेंट, और आपूर्तिकर्ताओं सामग्री की तालिकामें सूचीबद्ध हैं ।

1. मच्छर के लार्वा और वयस्कों की संस्कृति

नोट: मच्छरों के कीटनाशक अतिसंवेदनशील उपभेदों मलेरिया अनुसंधान और रिएजेंट संदर्भ भंडार से उपलब्ध हैं । अनुशंसित उपभेदों इस प्रकार हैं: एडीज aegypti लिवरपूल (LVP) तनाव, Anopheles gambiae Kisumu (KISUMU1) तनाव और Culex quinquefasciatus जोहांसबर्ग (JHB) तनाव ।

  1. एक 12 ज दिन पर अंडे से संस्कृति मच्छर लार्वा 28 ° c और 75-85% सापेक्ष आर्द्रता (आरएच) में 25 सेमी x ४० सेमी प्लास्टिक ट्रे (~ ४०० लार्वा प्रति ट्रे) Nuss29द्वारा वर्णित के रूप में । लार्वा पिसे gerbil (A. aegypti और An. gambiae) या परतदार मछली का खाना (C. quinquefasciatus) खिलाएं । लार्वा परख के लिए, तीसरे लार्वा (L3) instar चरण में लार्वा इकट्ठा ।
  2. प्यूपा से रियर वयस्क मच्छरों कि ऊपर वर्णित शर्तों के तहत एक कीट में प्लास्टिक के कप और जगह के अंदर 20 एल प्लास्टिक पिंजरों को हस्तांतरित किया गया है । 20% चीनी समाधान पर मच्छरों बनाए रखने के रूप में29कहीं वर्णित है । 3-5 दिनों के बाद आपात स्थिति में वयस्कों लीजिए ।

2. लार्वा संपर्क परख (एकल बिंदु खुराक या खुराक प्रतिक्रिया परख)

नोट: परख chemistries कि पानी या dimethyl sulfoxide (DMSO) में घुलनशील हैं, बशर्ते कि परीक्षण कुओं में DMSO के अंतिम एकाग्रता 1% से अधिक नहीं है के साथ आयोजित किया जा सकता है । वैकल्पिक सॉल्वैंट्स एक विकल्प हो सकता है, लेकिन यह पहले की पुष्टि करने के लिए आवश्यक है कि अंतिम एकाग्रता ७२ एच पोस्ट जोखिम में 10% से अधिक मृत्यु दर का कारण नहीं है । परख एक बिंदु खुराक या खुराक प्रतिक्रिया परख के रूप में प्रदर्शन किया जा सकता है । यदि बाद प्रदर्शन, यह सांद्रता की एक सीमा (पांच के ंयूनतम), अपेक्षित नियंत्रण रेखा५०फैले परीक्षण की सिफारिश की है ।

  1. चित्रा 1में दिखाया गया के रूप में एक स्पष्ट 24 अच्छी तरह से ऊतक प्लेट के कुओं लेबल ।
  2. एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में परीक्षण रसायन विज्ञान के शेयर समाधान तैयार करते हैं ।
    1. प्रत्येक रसायन विज्ञान एक विश्लेषणात्मक संतुलन का उपयोग कर तौलना, और घुलनशीलता विशेषताओं पर निर्भर करता है, फिर से बाँझ ddH2ओ, DMSO या पसंद के अन्य उपयुक्त कार्बनिक विलायक में निलंबित ( चित्रा 2देखें).
      नोट: गणित को रसायन की शुद्धता को ध्यान में रखना चाहिए । उदाहरण के लिए, एक रसायन विज्ञान है कि ९९% शुद्ध है के लिए, भंग १०.१ एसीटोन के १,००० µ एल में मिलीग्राम एक 1% समाधान प्राप्त करने के लिए । आयल फिल्म और स्टोर के साथ सील-20 डिग्री सेल्सियस ।
  3. परीक्षण रसायन है कि मूल्यांकन किया जाएगा और तदनुसार शेयर समाधान से धारावाहिक कमजोर पड़ने तैयार की अंतिम एकाग्रता निर्धारित करते हैं, उपयुक्त विलायक का उपयोग कर ।
    नोट: एकाग्रता और रसायन विज्ञान और विलायक की मात्रा सूत्र का उपयोग कर गणना की जा सकती है c1* v1= c2* v2 जहां c1= की एकाग्रता का नमूना 1, c2= एकाग्रता का नमूना 2, V1= की मात्रा नमूना 1 और V2= नमूना 2 की मात्रा । चित्र 2 और तालिका 1में दिखाए गए उदाहरण परिकलन देखें.
    1. एक 10 मिमी स्टॉक समाधान और सीरियल कमजोर पड़ने के रूप में वांछित परीक्षण सांद्रता (तालिका 1b) प्राप्त करने के लिए आवश्यक तैयार करें ।
  4. एक व्यापक बोर प्लास्टिक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग करना, पांच L3 लार्वा एक ऊतक संस्कृति परीक्षण प्लेट की अच्छी तरह से स्थानांतरण; L3 लार्वा लंबाई (~ २.५-३.५ मिमी) और हेड कैप्सूल की चौड़ाई से पहचाना जा सकता है ~ ०.०२५ mm24। धीरे से एक 1 मिलीलीटर पिपेट के साथ पानी निकालें और ddH2ओ के वांछित मात्रा के साथ की जगह (नीचे देखें) । n = 4 प्राप्त करने के लिए दोहराएँ तकनीकी उपचार प्रति प्रतिकृति (यानी, उपचार के प्रति कुल 20 लार्वा).
  5. में से प्रत्येक के लिए परीक्षण रसायन विज्ञान के उपयुक्त मात्रा जोड़ें 24 अच्छी तरह से परीक्षण प्लेट में दोहराने कुओं और धीरे से रसायन विज्ञान के मिश्रण वर्दी सुनिश्चित करने के लिए थाली घूमता । लगातार शर्तों के तहत एक परीक्षण या विकास कक्ष में थाली प्लेस (जैसे, 25 डिग्री सेल्सियस और ~ 75-85% आरएच की सिफारिश की है, और एक 12 एच प्रकाश/
    नोट: प्रयोगों के बीच reproducibility के लिए, बाद में सुनिश्चित करें कि एक ही पर्यावरण की स्थिति के तहत परख प्रदर्शन कर रहे हैं ।
  6. स्कोर शीट (तालिका 2) पर 30 मिनट, 1, १.५, 2, 3, 24, ४८ और ७२ एच पोस्ट-एक्सपोजर (या वैकल्पिक समय अंक) पर प्रत्येक कुआं में मृत/गैर-उत्तरदायी लार्वा की संख्या रिकॉर्ड करें । धीरे से थाली की ओर नल । कोई आंदोलन मनाया जाता है, तो धीरे एक बाँझ दंर्तखोदनी के साथ लार्वा को छूने. स्कोर लार्वा कि दोहन करने के लिए जवाब नहीं है/
    नोट: अन्य रूपात्मक और व्यवहार phenotypes मनाया जा सकता है और दर्ज किया जा सकता है ।
  7. नियंत्रण मृत्यु दर के लिए सही संशोधित एबॉट के फार्मूले का उपयोग अगर चाहें, तो निंनानुसार:
    मृत्यु दर (%) = (X-y) * 100/(100-y),
    जहां X = इलाज नमूना में प्रतिशत मृत्यु दर, और Y = नियंत्रण में प्रतिशत मृत्यु दर ।
  8. एक हिस्टोग्राम या लघुगणक वक्र जैसे ग्राफ-पैड चश्मे 6 या इसी तरह की पसंद के सॉफ्टवेयर का उपयोग कर, और नियंत्रण के सापेक्ष घातक एकाग्रता (LC) मूल्यों की गणना के रूप में ग्राफ परिणाम.
  9. दोहराएं मच्छरों के एक अलग बैच का उपयोग कर परख n = 3 या अधिक जैविक प्रतिकृतियां प्राप्त करने के लिए ।

3. वयस्क सामयिक परख (एकल बिंदु खुराक या खुराक प्रतिक्रिया परख)

नोट: वयस्क सामयिक परख एक विलायक के रूप में एसीटोन का उपयोग कर आयोजित किया जाता है । वैकल्पिक सॉल्वैंट्स एक विकल्प हो सकता है, लेकिन यह पहले की पुष्टि करने के लिए आवश्यक है कि अंतिम एकाग्रता ४८ एच पोस्ट जोखिम में 10% से अधिक मृत्यु दर का कारण नहीं है । परख एक बिंदु खुराक या खुराक प्रतिक्रिया परख के रूप में प्रदर्शन किया जा सकता है और घातक खुराक (LD) का निर्धारण करने के लिए प्रयोग किया जाता है । यदि बाद प्रदर्शन, यह सांद्रता की एक सीमा (पांच के ंयूनतम), अपेक्षित LD५०फैले परीक्षण की सिफारिश की है ।

  1. निर्धारित वयस्क मादा मच्छरों की संख्या की परख पूरी करने के लिए आवश्यक है.
    नोट: एक एकल रसायन विज्ञान के साथ एक बिंदु खुराक परख ९० मच्छरों की एक ंयूनतम (30 सकारात्मक नियंत्रण के लिए, एसीटोन के लिए 30 केवल नकारात्मक नियंत्रण और परीक्षण रसायन विज्ञान के लिए 30) की आवश्यकता होगी ।
  2. संस्कृति 3 से 5 दिन पुराने वयस्क मादा मच्छरों और एक अलग से 20 मिलीलीटर प्लास्टिक की बाल्टी के लिए कदम एक aspirator (चित्रा 3) का उपयोग कर ।
  3. लेबल 9 ऑउंस पेपर कप के नाम और परीक्षण रसायन विज्ञान की एकाग्रता के साथ । एक अलग 10 सेमी x 10 सेमी मेष चौकों और प्रत्येक कप के लिए रबर बैंड सेट ( 4 चित्रादेखें) ।
  4. एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में एक मौजूदा कीटनाशक का चयन करें (उदाहरण के लिए, सिंथेटिक pyrethroid, बाईफ़ेन्थ्रिन) और एक 1% शेयर समाधान तैयार (10 µ जी/µ एल) एसीटोन में ।
    नोट: गणित को रसायन की शुद्धता को ध्यान में रखना चाहिए । उदाहरण के लिए, एक रसायन विज्ञान है कि ९९% शुद्ध है के लिए, भंग १०.१ एसीटोन के १,००० µ एल में मिलीग्राम एक 1% समाधान प्राप्त करने के लिए । आयल फिल्म और स्टोर के साथ सील-20 डिग्री सेल्सियस ।
  5. ऊपर के रूप में एक ही प्रक्रिया का उपयोग करना, परीक्षण रसायन विज्ञान के एक शेयर समाधान तैयार करते हैं ।
    नोट: कई परीक्षण chemistries अत्यधिक labile हैं, और समाधान अधिमानतः हर बार परख किया जाता है ताजा किया जाना चाहिए ।
  6. स्टॉक समाधान से सकारात्मक नियंत्रण और परीक्षण chemistries के धारावाहिक कमजोरियां तैयार के रूप में चित्रा 5 का उपयोग कर 20 मिलीलीटर कांच शीशियों पहले एसीटोन के साथ कुल्ला में दिखाया गया है ।
  7. एक 1 मिलीलीटर ग्लास एसीटोन के साथ सिरिंज पर्ज करें, एसीटोन के साथ भरें और सूक्ष्म applicator में सुरक्षित ०.२५ µ एल की एक मात्रा देने के लिए समायोजित
  8. दस के बैचों में काम कर रहे हैं, एक फ्रिज में या बर्फ पर 4 डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट तक के लिए एक aspirator और anesthetize का उपयोग पिंजरों से 3-5 दिन पुराने वयस्क मादा मच्छरों निकालें । अगले, स्थानांतरण मच्छरों एक पेट्री पकवान और बर्फ पर जगह के लिए 10 मिनट के लिए ।
  9. जल्दी से काम करना, ठीक चिमटी के साथ एक महिला को दूर, और परीक्षण के समाधान के ०.२५ µ एल लागू पृष्ठीय छाती सिरिंज माइक्रो-applicator का उपयोग कर । अवलोकन द्वारा रसायन विज्ञान के वितरण की पुष्टि एक विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग कर प्रत्येक मच्छर को सुनिश्चित करने के लिए परीक्षण रसायन विज्ञान की उचित मात्रा प्राप्त करता है ।
  10. एक लेबल कागज बर्फ पर आराम कर कप के लिए मच्छर स्थानांतरण, और दोहराने नौ बार n = 10 इलाज मच्छरों को प्राप्त करने के लिए । एक मेष एक रबर बैंड के साथ सुरक्षित वर्ग के साथ कप में मच्छरों को सील, और 28 डिग्री सेल्सियस और 75-85% आरएच की लगातार शर्तों के तहत एक प्लास्टिक टब या विकास कक्ष में स्थानांतरण (एक 12 ज दिन/
  11. ऊपर प्रयोग दोहराएं दो बार n = 3 तकनीकी प्रतिकृति (यानी, 30 मच्छरों कुल) प्रति उपचार या नियंत्रण समूह को प्राप्त करने के लिए ।
  12. दोहराएं चरण ३.७-३.१० पहले परीक्षण रसायन और फिर सकारात्मक नियंत्रण के साथ ।
    नोट: एक और उपयोगी नियंत्रण यदि पर्याप्त मच्छरों उपलब्ध है शामिल करने के लिए एक "खाली" 30 anesthetized मच्छरों कि या तो परीक्षण रसायन या विलायक प्राप्त नहीं है ।
  13. 30 मिनट, ६० मिनट, 2, 24 और ४८ h पोस्ट-एक्सपोज़र (या वैकल्पिक समय अंक) का उपयोग कर स्कोर शीट (तालिका 3) में "मृत/गैर-उत्तरदायी" मच्छरों की संख्या रिकॉर्ड करें । "मृत/गैर उत्तरदायी" अगर वे आंदोलन की कमी दिखाने के लिए, एक तरफ या पीठ पर और उड़ान भरने के लिए अक्षमता के साथ बिछाने के रूप में परिभाषित के रूप में मच्छरों स्कोर ।
  14. यदि वांछित, नियंत्रण मृत्यु दर संशोधित एबॉट के फार्मूले का उपयोग करने के लिए सही निंनानुसार:
    मृत्यु दर (%) = (X-y) * 100/(100-y),
    जहां X = इलाज नमूना में प्रतिशत मृत्यु दर, और Y = नियंत्रण में प्रतिशत मृत्यु दर ।
  15. हिस्टोग्राम या घातांक वक्र के रूप में परिणाम प्रदर्शित करें । एक खुराक प्रतिक्रिया परख के लिए, ld५०, ld७५ या ld९० मान परीक्षण रसायन नियंत्रण के सापेक्ष के लिए परिकलित करें ।
  16. दोहराएं परख के लिए ंयूनतम दो बार मच्छरों के अलग बैचों का उपयोग करने n = 3 या अधिक जैविक प्रतिकृतियां प्राप्त करते हैं ।

4. वयस्क खून पिलाने की परख (एकल बिंदु खुराक या खुराक प्रतिक्रिया परख)

  1. इकट्ठा लगभग १५० 4-5 दिन पुराने वयस्क मादा मच्छरों और एक अलग पिंजरे में स्थानांतरण । दोहराएँ 6 पिंजरों प्राप्त करने के लिए यदि एक खुराक प्रतिक्रिया परख प्रदर्शन. चीनी 1-24 एच के स्रोत को दूर करने से पहले खिला परख ।
  2. ऊपर वर्णित के रूप में रसायन विज्ञान के एक शेयर समाधान तैयार, रसायन विज्ञान की शुद्धता के लिए लेखांकन (एक ठेठ स्टॉक समाधान ८० पानी या नमक बफर में मिमी है), और बाद में पानी में धारावाहिक कमजोर पड़ने की तैयारी/
  3. जोड़ें ४० µ के कमजोर पड़ने के प्रत्येक के एल ९६० µ एल के defibrinated खरगोश रक्त वांछित परीक्षण एकाग्रता प्राप्त करने के लिए. एक रबर की अंगूठी के साथ एक खिला इकाई और सील करने के लिए झिल्ली फिल्म लागू करें । पिपेट के माध्यम से रक्त की 1 मिलीलीटर स्थानांतरण और एक हीटिंग इकाई के लिए खिला इकाई देते हैं ।
  4. धीरे से एक ताजा बनाया 10% लैक्टिक एसिड समाधान के साथ झिल्ली की सतह झाड़ू और वयस्क मच्छरों के पिंजरे में खिला इकाई जगह है । एक काले कपड़े या काला कचरा बैग के साथ पिंजरे कवर और मच्छरों एक घंटे के लिए फ़ीड करने के लिए अनुमति देते हैं ।
  5. परीक्षण समाधान और ऋणात्मक (केवल रक्त-केवल) नियंत्रण के शेष के लिए चरण ४.२-४.४ दोहराएँ ।
  6. खिलाने के पूरा होने पर, anesthetize मच्छरों के लिए 5 मिनट के लिए एक रेफ्रिजरेटर में 4 डिग्री सेल्सियस पर बाल्टी जगह । पुरुष मच्छरों और गैर खिलाया मादा मच्छरों को हटाने, और गिनती और पेट की परीक्षा द्वारा फेड और आंशिक रूप से खिलाया मच्छरों की कुल संख्या रिकॉर्ड ।
  7. आंशिक रूप से बनाए रखने और पूरी तरह से महिला मच्छरों को खिलाया, खुराक प्रति ५० रक्त खिलाया मच्छरों की एक ंयूनतम के लिए लक्ष्य ।
  8. 28 डिग्री सेल्सियस और ७५-८५% आरएच की लगातार शर्तों के तहत एक प्लास्टिक टब या विकास चैंबर के लिए बाल्टी स्थानांतरण (एक 12 घंटे/12 एच रात चक्र पर बेहतर है) ।
  9. ०.५, 1, १.५, 2, 24, ४८ और ७२ एच (या वांछित के रूप में वैकल्पिक समय-अंक) का उपयोग कर स्कोर शीट (तालिका 4) में मृत/गैर उत्तरदायी मच्छरों की कुल संख्या रिकॉर्ड करें ।
  10. तीसरे दिन के बाद रक्त पिलाने पर, पिंजरे में एक अंडा कप परिचय और एक ७२ ज अवधि में अंडे इकट्ठा । एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत प्रति उपचार उत्पादित अंडे की कुल संख्या की गणना ।
  11. प्रत्येक उपचार समूह और नियंत्रण के लिए फेड मच्छरों की कुल संख्या के एक समारोह के रूप में प्रतिशत मृत्यु दर और fecundity की गणना । संशोधित एबॉट के फार्मूले का इस्तेमाल अगर चाहें तो नियंत्रण मृत्युदर के लिए सही ।
  12. एक हिस्टोग्राम भूखंड या घातीय वक्र (यदि एक खुराक प्रतिक्रिया परख प्रदर्शन) पसंद के सॉफ्टवेयर का उपयोग कर के रूप में विषाक्तता और fecundity डेटा प्रदर्शित करें । यदि एक खुराक प्रतिसाद परख कर रहा है, ld५०, ld७५ या ld९० मान परीक्षण रसायन नियंत्रण के सापेक्ष के लिए परिकलित करें ।
  13. दोहराएं परख के लिए ंयूनतम दो बार मच्छरों के अलग बैचों का उपयोग करने n = 3 या अधिक जैविक प्रतिकृतियां प्राप्त करते हैं ।

Representative Results

चित्रा 6 डोपामाइन रिसेप्टर प्रतिपक्षी की पांच खुराकों के लिए जोखिम के बाद L3 Ae. aegypti के प्रतिशत मृत्यु से पता चलता है, पानी की तुलना में ऐमिट्रिप्टिलाइन केवल (नकारात्मक) नियंत्रण में 24, ४८ और ७२ ज. इस उदाहरण में, प्रत्येक समय-बिंदुओं पर एकत्र किया गया डेटा विशिष्ट लघुगणकीय वक्र प्रदर्शित करता है और लार्वा मृत्यु दर पर ऐमिट्रिप्टिलाइन के एक खुराक-निर्भर प्रभाव को प्रकट करता है. LC५० मान प्रयोग के समय के दौरान कम हो जाती है और ७२ एच डेटा (यानी, लघुगणकीय वक्र के मध्यबिंदु) का उपयोग करके परिकलित की जा सकती है.

चित्रा 7 3-5 के प्रतिशत मृत्यु दिवस पुरानी वयस्क महिलाओं एई. aegypti एक ४०० µ एम खुराक (10 µ जी/µ एल) डोपामाइन रिसेप्टर प्रतिपक्षी, ऐमिट्रिप्टिलाइन और सिंथेटिक pyrethroid की तुलना में के लिए जोखिम के बाद से पता चलता है, बाईफ़ेन्थ्रिन-सकारात्मक नियंत्रण (तकनीकी ग्रेड; ५०० pg/µ l), एसीटोन-केवल नकारात्मक नियंत्रण और अनुपचारित मच्छरों (खाली) । इस उदाहरण में, दोनों ऐमिट्रिप्टिलाइन और बाईफ़ेन्थ्रिन नकारात्मक नियंत्रण के सापेक्ष महत्वपूर्ण वयस्क मृत्युदर पैदा करते हैं । ध्यान दें कि वयस्क मृत्यु दर समय के साथ कम हो जाती है, शायद परीक्षण chemistries के चयापचय detoxification के कारण ।

चित्रा 8 प्रतिशत मृत्यु दर से पता चलता है (y धुरी छोड़ दिया) 3-5 दिन पुराने वयस्क महिला Ae. aegypti एक रक्त डोपामाइन रिसेप्टर प्रतिपक्षी, ऐमिट्रिप्टिलाइन के चार खुराकों में से एक के साथ इलाज भोजन खिलाया, और fecundity (सही y-अक्ष; औसत अंडा गणना/ मादा) मच्छरों को नियंत्रित करने की तुलना में पहले gonotrophic चक्र पोस्ट एक्सपोजर के लिए (केवल रक्त खिलाया, नकारात्मक नियंत्रण) । आंकड़ों से पता चलता है कि नियंत्रण के सापेक्ष वयस्क मृत्यु दर पर ऐमिट्रिप्टिलाइन का कोई महत्वपूर्ण प्रभाव नहीं है, लेकिन प्रदर्शित करता है कि ऐमिट्रिप्टिलाइन काफी उच्चतम खुराक पर fecundity बढ़ जाती है (४०० µ m).

Figure 1
चित्रा 1 . सेट अप लार्वा खुराक प्रतिक्रिया परख की । लार्वा खुराक प्रतिक्रिया परख के सेट अप दिखा छवि 24-वेल प्लेट में एडीज aegypti L3 लार्वा का उपयोग कर प्रदर्शन किया ।

Figure 2
चित्रा 2 . योजनाबद्ध (A) एकल बिंदु खुराक या (ख) 24-अच्छी तरह से थाली में खुराक प्रतिक्रिया लार्वा परख की स्थापना के लिए प्रक्रिया दिखा । कुओं के लिए पांच L3 लार्वा के हस्तांतरण के बाद, अतिरिक्त पानी धीरे पिपेट के माध्यम से हटा दिया है और ताजा, बाँझ ddH2ओ के साथ प्रतिस्थापित । अगला, स्टॉक और परीक्षण रसायन विज्ञान के धारावाहिक कमजोर पड़ने तैयार है और 1 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा में जोड़ा/ कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 . वयस्क मच्छरों की संस्कृति । 20 एल प्लास्टिक की बाल्टी वयस्क मच्छरों और एक aspirator के उपयोग की संस्कृति के लिए इस्तेमाल दिखा छवि मच्छरों को दूर करने के लिए।

Figure 4
चित्र 4 . वयस्क सामयिक परख 4-5 दिन पुरानी मादा एडीज aegypti का उपयोग कर प्रदर्शन किया । रसायन या विलायक के साथ उपचार के बाद, वयस्क मच्छरों पेपर कप में रखा और परख की अवधि के लिए एक परीक्षण कक्ष में स्थानांतरित कर रहे हैं ।

Figure 5
चित्रा 5 . स्टॉक और धारावाहिक कमजोर पड़ने । योजनाबद्ध आरेख (A) स्टॉक और (ख) धारावाहिक परीक्षण समाधान वयस्क सामयिक परख के लिए तैयार करने के लिए प्रक्रिया दिखा । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6 . एक लार्वा संपर्क खुराक प्रतिक्रिया परख से प्रतिनिधि डेटा । एक लार्वा संपर्क खुराक प्रतिक्रिया परख से प्रतिनिधि डेटा एडीज aegypti L3 लार्वा के प्रतिशत मृत्यु दर डोपामाइन रिसेप्टर प्रतिपक्षी के लिए प्रदर्शन के बाद दिखा, ऐमिट्रिप्टिलाइन पर 24, ४८ और ७२ एच. प्रत्येक डेटा बिंदु µ एम ± SEM में मतलब का प्रतिनिधित्व करता है । डेटा का प्रतिनिधित्व n = 3 जैविक प्रतिकृति ।

Figure 7
चित्र 7 . एक वयस्क सामयिक खुराक प्रतिक्रिया परख से प्रतिनिधि डेटा । एक वयस्क सामयिक खुराक प्रतिक्रिया परख से प्रतिनिधि डेटा डोपामाइन रिसेप्टर प्रतिपक्षी की विषाक्तता दिखा, ऐमिट्रिप्टिलाइन (10 µ जी/µ एल) करने के लिए 3-5 दिन पुरानी मादा एडीज सिंथेटिक pyrethroid के सापेक्ष aegypti , बाईफ़ेन्थ्रिन (५०० pg/µ l) सकारात्मक नियंत्रण) और नकारात्मक नियंत्रण (एसीटोन वाहन केवल) पर 2, 24 और ४८ ज। डेटा का प्रतिनिधित्व n = 3 जैविक प्रतिकृति । त्रुटि पट्टियां SEM इंगित करती हैं ।

Figure 8
चित्र 8 . एक वयस्क घूस परख से प्रतिनिधि डेटा । एक वयस्क घूस की विषाक्तता दिखा परख से प्रतिनिधि डेटा डोपामाइन रिसेप्टर प्रतिपक्षी, ऐमिट्रिप्टिलाइन पर १०० µ मीटर, २०० µ m और ४०० µ m खुराक 3-5 दिन पुरानी वयस्क मादा एडीज aegypti और fecundity पर प्रभाव (औसत कुल अंडे के रूप में व्यक्त पहले gonotrophic चक्र पर प्रति महिला गिनती) । डेटा का प्रतिनिधित्व n = 3 जैविक प्रतिकृति ± SEM ।

ए तीन chemistries के साथ एकल बिंदु खुराक परख
रसायन विज्ञान एकाग्रता (४०० उम)
ऐमिट्रिप्टिलाइन ८० mM स्टॉक: ऐमिट्रिप्टिलाइन x ९८% की 2 मिलीग्राम (पाउडर की शुद्धता) x ०.००१ g/1 मिलीग्राम x 1 मॉल/३१३.८६ g X 1 l/0.08 मॉल x 106 µ l/l = ७८.०६ µ l का पानी ।
सीरियल कमजोर पड़ने: ddH2ओ के साथ शेयर 1:2 पतला और फिर 1:4 10 मिमी प्राप्त करने के लिए । 10 मिमी स्टॉक के ४० µ एल जोड़ें अच्छी तरह से युक्त ९६० µ एल ddH20 के एक अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए ४०० µ m/  5 एमएम, २.५ एमएम, १.२५ एमएम और ०.६२५ एमएम स्टॉक्स हासिल करने के लिए 10 एमएम के शेयर 1:2 के सीरियल कमजोर पड़ने की तैयारी करें ।
सीआईएस-(जेड)-flupenthixol ८० मिमी स्टॉक: सीआईएस के 2 मिलीग्राम (जेड) flupenthixol x ९८% (पाउडर की शुद्धता) x ०.००१ g/1 मिलीग्राम x 1 मॉल/507.44 g सीआईएस (जेड) flupenthixol x 1 l/0.08 मॉल x 106 µ l/l = ४८.२८ µ l का पानी ।
सीरियल कमजोर पड़ने: के रूप में ऊपर ।
Amitraz ८० mM स्टॉक: Amitraz x ०.००१ g/1 मिलीग्राम x 1 मॉल/293.4 g of Amitraz x 1 l/0.08 मॉल x 106 µ l/1 l = ८५.२१ µ l की 2 मिलीग्राम DMSO (ध्यान दें: Amitraz में केवल घुलनशील है DMSO) ।
सीरियल कमजोर पड़ने: के रूप में ऊपर ।
B. खुराक प्रतिक्रिया परख
रसायन विज्ञान दोसे १ दोसे २ खुराक 3 खुराक 4 दोसे ५
४०० µ m २०० µ m १०० µ m ५० µ m २५ µ मी
जैसे, ऐमिट्रिप्टिलाइन, सीआईएस-(Z)-flupenthixol या amitraz ४० µ l ४० µ l ४० µ l ४० µ l ४० µ l
10 एमएम स्टॉक 5 मिमी स्टॉक २.५ mM स्टॉक १.२५ mM स्टॉक ०.६२५ mM स्टॉक

तालिका 1. उदाहरण के लिए गणना एडीज aegypti L3 लार्वा (एक) एकल बिंदु खुराक परख और (ख) खुराक प्रतिक्रिया परख.

Table 2
तालिका 2. उदाहरण स्कोर शीट मच्छर लार्वा खुराक प्रतिक्रिया परख से डेटा रिकॉर्ड करने के लिए इस्तेमाल किया । केवल 1% DMSO या अन्य विलायक के साथ नियंत्रण, पानी केवल या पानी । ठेठ छोटे अणु विरोधी chemistries परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया खुराक जैसे ऐमिट्रिप्टिलाइन 25 µ एम, ५० µ एम, १०० µ एम, २०० µ एम और ४०० µ एम हैं ।

मच्छर वयस्क (3-5 दिन पुराने) सामयिक परख
आरंभ की गई तिथि:
अन्वेषक:
प्रजातियों के तनाव:
परख प्रकार: एकल बिंदु खुराक/
अ. मृत्युदर (सं. मृत मच्छरों)
समय (घंटे) दोसे १ दोसे २ खुराक 3 खुराक 4 दोसे ५ नियंत्रण
०.५
1
१.५
2
२.५
B. प्रतिशत मृत्युदर
समय (घंटे) दोसे १ दोसे २ खुराक 3 खुराक 4 दोसे ५ नियंत्रण
०.५
1
१.५
2
२.५

तालिका 3. उदाहरण स्कोर शीट वयस्क सामयिक खुराक प्रतिक्रिया परख से डेटा रिकॉर्ड करने के लिए इस्तेमाल किया ।

मच्छर वयस्क (3-5 दिन पुरानी) घूस परख
आरंभ की गई तिथि:
अन्वेषक:
प्रजातियों के तनाव:
परख प्रकार: एकल बिंदु खुराक/
A. नंबर फेड मच्छरों
दोसे १ दोसे २ खुराक 3 खुराक 4 दोसे ५ नियंत्रण
फेड
तंग नहीं
कुल
% फेड
% नहीं खिलाया
ब. मृत्युदर (सं. मृत मच्छरों)
समय (घंटे) दोसे १ दोसे २ खुराक 3 खुराक 4 दोसे ५ नियंत्रण
2
24
४८
७२
C. प्रतिशत मृत्युदर
समय (घंटे) दोसे १ दोसे २ खुराक 3 खुराक 4 दोसे ५ नियंत्रण
2
24
४८
७२

तालिका 4. उदाहरण स्कोर शीट वयस्क खून पिलाने की परख से डेटा रिकॉर्ड करने के लिए इस्तेमाल किया । इस तरह के ऐमिट्रिप्टिलाइन के रूप में छोटे अणु विरोधी chemistries परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल ठेठ खुराक ५० µ मीटर, १०० µ मीटर, २०० µ मीटर और ४०० µ मीटर कर रहे हैं ।

Discussion

कीटनाशक मलेरिया25, डेंगू और Zika26जैसे मच्छर जनित रोगों से निपटने के लिए शक्तिशाली औजार हैं । व्यापक कीटनाशक उपयोग मच्छर आबादी है कि रासायनिक नियंत्रण के लिए प्रतिरोधी रहे है का उत्पादन किया है, कीटनाशक प्रतिरोध है, जो जारी रोग नियंत्रण के लिए एक सबसे बड़ा खतरा माना जाता है के विकास के लिए अग्रणी । पिछले दशक Anopheles एसपीपी की आबादी में एक नाटकीय वृद्धि देखी गई है । सिंथेटिक पायरेथ्रोइड्स के लिए प्रतिरोधी (एसपीएस)7अफ्रीका में बिस्तर जाल में इस्तेमाल किया । एडीज albopictus, डेंगू और Zika के एक वेक्टर की आबादी, फ्लोरिडा और ंयू जर्सी में सूचित किया गया है कि6organophosphates के लिए प्रतिरोधी रहे हैं । इसी तरह, डीडीटी और पायरेथ्रोइड्स के प्रतिरोध Anopheles और एडीज एसपीपी की आबादी में प्रलेखित किया गया है । कोलंबिया में27,28. ज्ञात आणविक लक्ष्यों पर विविध orthosteric या allosteric साइटों को बाँधने वाले नए डिमंकनाशी और adulticides को विकसित करने की तत्काल आवश्यकता है या जो नए लक्ष्य (अर्थात, उपन्यास मुआ chemistries)२९,३० और कम पर्यावरणीय प्रभाव है । वहीं मच्छर नियंत्रण के लिए endectocides के आसपास संभावितों की मान्यता भी बढ़ाकर31,३२,३३कर रही है ।

इस तरह के उत्पादों के तेजी से विकास की सुविधा के लिए, हम दो वितरण मार्गों के माध्यम से मच्छर के लार्वा और वयस्कों के लिए छोटे अणु chemistries की विषाक्तता का मूल्यांकन करने के लिए डिज़ाइन प्रोटोकॉल की एक श्रृंखला का वर्णन-संपर्क और घूस । ऐसी डब्ल्यूएचओ संवेदनशीलता परीक्षण और सीडीसी बोतल परख के रूप में प्रोटोकॉल विषाक्तता और मौजूदा कीटनाशक योगों1,2के repellency मूल्यांकन के लिए आम उपयोग में हैं । हालांकि, इन परख unformulat उपंयास रासायनिक संस्थाओं (NCEs) के विश्लेषण के लिए सीमाएं है और मध्यम या उच्च प्रवाह में chemistries की बड़ी संख्या के परीक्षण के लिए उत्तरदाई नहीं हैं ।

यहां हम एक मानक लार्वा परख का वर्णन तेजी से एक बिंदु खुराक में NCEs मूल्यांकन कि उच्च प्रवाह विश्लेषण के लिए पैमाने पर कर सकते हैं । हम भी वयस्क मच्छरों के लिए छोटे अणु chemistries के संपर्क विषाक्तता का मूल्यांकन करने के लिए एक लाइट21 द्वारा विकसित परख के एक अनुकूलन का वर्णन । अंत में, हम एक घूस परख का वर्णन करने के लिए वयस्क मादा मच्छरों को रक्त भोजन के माध्यम से दिया NCEs की विषाक्तता का मूल्यांकन और endectocide क्षमता का पता लगाने । इन लार्वा और वयस्क परख मात्रा की एक सीमा पर प्रदर्शन किया जा सकता है ताकि नियंत्रण रेखा और LD मूल्यों, क्रमशः निर्धारित करने के लिए, और दोनों लार्वा और वयस्क संपर्क परख एक या एक से अधिक मौजूदा रासायनिक योगों की तुलना में किया जा सकता है । वयस्क सामयिक परख भी व्यक्ति मच्छर प्रति LD मूल्यों की गणना में सक्षम बनाता है । प्रोटोकॉल एडीज, Anopheles और Culex16,29 की प्रजातियों का उपयोग किया जा सकता है और एक प्रजाति के विशिष्ट जैविक विशेषताओं को समायोजित करने के लिए संशोधित किया जा सकता है, यदि वांछित । हमारे अनुभव में, mosquitocidal chemistries आम तौर पर इन तीन पीढ़ी16,29भर में व्यापक गतिविधि का प्रदर्शन, लेकिन वहां selectivity प्रजातियों के आकलन के लिए मूल्य है ।

परख तेजी से कीटनाशक गतिविधि के लिए कई chemistries स्क्रीन करने के लिए एक प्रारंभिक बिंदु हैं । उन chemistries है कि एक या एक से अधिक परख में प्रदर्शन विषाक्तता माध्यमिक और तृतीयक परख के माध्यम से आगे विश्लेषण के लिए चुना जा सकता है । उदाहरण लाइट तरसल परख और चीनी खिला परख३४,३५शामिल हैं । अतिरिक्त परख के चयन आमतौर पर प्रत्याशित बाजार और आवेदन के आसपास विचार द्वारा निर्धारित किया जाता है, परिणाम संभव उत्पाद वितरण मोड के लिए अंतर्दृष्टि प्रदान करने के साथ । प्रतिनिधि परिणाम में यहां दिखाया गया है, हम ऐमिट्रिप्टिलाइन, स्तनधारी और invertebrate डोपामाइन रिसेप्टर्स कि एक उपंयास मुआ कीटनाशक10,12के रूप में क्षमता के लिए मूल्यांकन किया गया है के एक विरोधी की विषाक्तता का पता लगाने, 13 , 16. ऐमिट्रिप्टिलाइन μg रेंज में लार्वा और एई. aegytpi के वयस्कों के लिए विषाक्तता का प्रदर्शन larvicidal और adulticidal गतिविधि का सुझाव है, और एक ऐमिट्रिप्टिलाइन आधारित रासायनिक श्रृंखला की खोज के लिए तर्क प्रदान करने की पहचान उच्च शक्ति के साथ एनालॉग । मृत्यु दर या fecundity पर कोई महत्वपूर्ण प्रभाव एई में मनाया गया । aegypti से रक्त भोजन में ऐमिट्रिप्टिलाइन से अवगत कराया । जबकि defibrinated रक्त और प्रभावी खुराक प्रति मच्छर प्राप्त में रसायन विज्ञान की स्थिरता ज्ञात नहीं है, परख की उल्लेखनीय सीमाओं, डेटा का सुझाव है कि ऐमिट्रिप्टिलाइन और अंय GPCR-सक्रिय यौगिकों endectocides के रूप में कम क्षमता हो सकता है, पर सबसे कम में unformulat राज्य ।

सावधानियों परख के बीच जैविक भिन्नता को सीमित करने के लिए आवश्यक हैं. सभी परख तापमान और आर्द्रता के मानक शर्तों के तहत किया जाना चाहिए, अधिमानतः एक कीट विकास कक्ष में, ताकि reproducibility सुनिश्चित करने के लिए । यह phenotypic अंत अंक स्कोरिंग के लिए प्रक्रियाओं का मानकीकरण अनिवार्य है के रूप में इन अत्यधिक व्यक्तिपरक, विभिंन प्रयोगशाला कर्मियों द्वारा दर्ज आंकड़ों में महत्वपूर्ण बदलाव के लिए अग्रणी हो सकता है । लार्वा परख सबसे अच्छा chemistries है कि पानी में घुलनशील है के मूल्यांकन के लिए अनुकूल है, हालांकि परख ऐसे DMSO के रूप में कार्बनिक सॉल्वैंट्स का उपयोग किया जा सकता है बशर्ते कि अंतिम एकाग्रता से कम 1% प्रति अच्छी तरह से है । हम वयस्क सामयिक परख करने के लिए कई सीमाओं को पहचाना । सबसे पहले, यह तेजी से काम करने के लिए जब सीरियल कमजोर पड़ने की तैयारी और वाहक (एसीटोन) के रूप में खुराक देने के लिए आवश्यक है अत्यधिक अस्थिर और वाष्पीकरण दिया रसायन विज्ञान की राशि में भिन्नता का उत्पादन हो सकता है. दूसरा, देखभाल के लिए संज्ञाहरण की अवधि सीमा के रूप में इस मृत्यु दर में योगदान कर सकते है लिया जाना चाहिए । यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि ऐसे एसीटोन के रूप में सॉल्वैंट्स सामयिक परख, जो परीक्षण रसायन विज्ञान के कारण प्रभाव के साथ भ्रमित नहीं किया जाना चाहिए के पहले कई घंटे में एक तेजी से "दस्तक नीचे प्रभाव" उत्पादन कर सकते हैं । हम ध्यान दें कि मच्छर रक्त भोजन की मात्रा व्यक्तियों के बीच बदलता है, खुराक वयस्क घूस परख में वयस्क प्रति प्राप्त की एक आकलन उलझी । अंत में, परख डेटा मामलों में विचार नहीं किया जाना चाहिए, जहां नकारात्मक नियंत्रण में मृत्यु दर 10% से अधिक है ।

उत्पाद है कि अधिनियम synergistically तेजी से अपनी क्षमता के लिए मांयता प्राप्त कर रहे है मौजूदा उत्पादों की उपयोगिता का विस्तार और कीटनाशक प्रतिरोधी कीट के नियंत्रण आबादी15,16,३६। लार्वा परख formamidine कीटनाशक, amitraz और chemistries की एक किस्म है कि व्यवधान invertebrate octopamine रिसेप्टर्स14,15के बीच तालमेल की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । लार्वा परख और वयस्क सामयिक परख वर्णित परीक्षण chemistries के संयोजन के बीच synergistic या additive प्रभाव के मूल्यांकन के लिए उपयुक्त हैं । हम ध्यान दें कि इस तरह के piperonyl butoxide (PBO) के रूप में तालमेल तीन यहां वर्णित परख में से प्रत्येक में शामिल किया जा सकता है ।

उपर्युक्त परख जलीय और स्थलीय मच्छर जीवन चरणों के खिलाफ unformulat, छोटे अणु दवाओं के मूल्यांकन के लिए एक मानकीकृत प्रायोगिक श्रृंखला प्रदान करते हैं । इन परख विशेष रूप से विषाक्तता का मूल्यांकन करने के लिए डिज़ाइन कर रहे है और आम उपयोग में मौजूदा परख पर कई लाभ प्रदान करते हैं । महत्वपूर्ण बात, परख स्वचालन के लिए उत्तरदाई है और औद्योगिक पैमाने पर प्रदर्शन के लिए परीक्षण यौगिकों के हजारों के मूल्यांकन को सक्षम कर सकते हैं । अंत में, के रूप में क्षेत्र के उत्पादों के विकास पर विचार करता है कि नए MoAs के माध्यम से अधिनियम, उपंयास आणविक लक्ष्यों और जैव रासायनिक रास्ते के विघटन के माध्यम सहित, यह इस तरह की मृत्यु के रूप में उन लोगों के अलावा कई phenotypic अंतिमबिंदु स्कोर करने के लिए आवश्यक हो जाएगा और पक्षाघात. इसके बाद के संस्करण परख ऐसी जांच की अनुमति है, इस प्रकार कल अत्यधिक अभिनव कीटनाशक प्रौद्योगिकियों की दिशा में एक कदम प्रदान ।

Disclosures

लेखकों के हितों का कोई टकराव की घोषणा ।

Acknowledgments

लेखकों परख विकास और लाइट प्रोटोकॉल के प्रावधान के साथ सहायता के लिए एच राँसन, उष्णकटिबंधीय चिकित्सा के लिवरपूल स्कूल धंयवाद, और एम Scharf, सलाह के लिए इन्होने विश्वविद्यालय परख डिजाइन के बारे में ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Insecticide susceptible mosquito strains  Malaria Research and Reagent Reference Repository  https://www.beiresources.org/MR4Home.aspx; Recommended strains: Aedes aegypti Liverpool (LVP) strain, Anopheles gambiae Kisumu (KISUMU1) strain and Culex quinquefasciatus Johannesburg (JHB) strain
Acetone Mallinckrodt Chemical CAS 67-64-1 Use for dilutions and control
Amitraz Sigma-Aldrich  CAS 33089-61-1 Requires dilution in DMSO
Amitriptyline Sigma-Aldrich  CAS: 549-18-8 Can be diluted in acetone
Bifenthrin Sigma-Aldrich  CAS: 51529-01-2 Synthetic pyrethorid used as positive control
Cis-(Z)-flupenthixol Sigma-Aldrich  CAS: 51529-01-2 Pharmacologically tested as disruptor of dop-like receptors
Defibrinated rabbit blood Hemostat DRB0100 Blood source for adapted mosquitoes to artificial feeding
Dimethylsulphoxide (DMSO) Sigma-Aldrich  MKBF2985 Organic solvent used to disolve amitraz
Hemotek membrane feeding system  Hemotek Ltd Serial no. 1303 Used for feeding mosquitoes
Micro-applicator Burkard Manufacturing Co.  - Tool needed for topical application experiments
24-well cell culture plate with lid Corning Incorporated 3526 -
Advantage rubber bands Alliance Rubber Co. - Used to seal the paper cups
Glass syringe (1 ml) Becton Dickinson and Co. 512004 Needed for the micro-applications. Glass is better than plastic
Disposable scintillation vials (20 ml) Fisher Scientific 74505-20 Glass vials prevent evaporation
Tulle fabric, white Walmart - -
Paper cups Dixie Consumer Products LLC. PF15675/13D Used to keep adult mosquitoes in adult topical assays
Petri dishes (150 mm) Corning Life Sciences - Used to maintain the mosquitoes "slept" on cold without direct contact with ice
Transfer pipettes Fisher Scientific 13-711-7M Used to sort larvae
Stereo microscope Olympus SZ6045 Used to score larval assays and perform micro-applications
Tweezers (fine) Fontax  - Used to handle adult mosquitoes

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Brito-Sierra, C. A., Kaur, J., Hill, C. A. Protocols for Testing the Toxicity of Novel Insecticidal Chemistries to Mosquitoes. J. Vis. Exp. (144), e57768, doi:10.3791/57768 (2019).

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