Summary
Protocolli sono descritti per valutare la tossicità delle chimiche alle zanzare immature e adulte per lo sviluppo come nuove classi di larvicidi, adulticides ed endectocidi. I protocolli consentono un elevato throughput test delle chimiche multiple a punto singolo dose e successiva valutazione tramite test di risposta dose per determinare la tossicità per contatto o ingestione.
Abstract
Nuove classi di insetticidi con nuovi modi di azione sono necessari per controllare insetticida resistente popolazioni di zanzare che trasmettono malattie quali malaria, dengue e Zika. Saggi per una rapida, analisi di alto-rendimento delle chimiche inespressi romanzo contro adulti e larve di zanzara sono presentati. Descriviamo protocolli per singola punto-dose e dose risposta saggi per valutare la tossicità delle chimiche di piccola molecola al vettore Aedes aegypti di Zika, dengue e febbre gialla, il vettore della malaria, Anopheles gambiae e il Nord zanzara di casa, Culex quinquefasciatus, sul contatto e via ingestione. Ad esempio, abbiamo valutato la tossicità di amitriptilina, un antagonista di piccola molecola di recettori accoppiati a proteine G, via larvale, adulto d'attualità e adulto sangue-alimentazione analisi. I protocolli forniscono un punto di partenza per studiare il potenziale di insetticida. I risultati sono discussi nel contesto di ulteriori esperimenti per esplorare le applicazioni del prodotto e i meccanismi di consegna.
Introduction
Le zanzare trasmettere gli agenti causali di malattie infettive che influiscono sulla salute umana a livello globale1. I tre generi di zanzara più importanti che incidono sulla salute umana sono Aedes, Anopheles e Culex. Specie di zanzare Aedes vector arbovirus che causano Zika, dengue, febbre gialla e chikungunya. Specie Anopheles vector parassiti della malaria e specie Culex trasmettere virus West Nile e filarie2. L'organizzazione mondiale della sanità (OMS) ha chiamato per l'eradicazione di dieci trascurato tropicali malattie (NTD) dal 20203 e identificato il controllo delle zanzare come la strategia più valida. Gli insetticidi sono strumenti potenti per controllare le zanzare e ridurre malattia trasmissione4,5. Tuttavia, l'emergere delle popolazioni di zanzare insetticida-resistente minaccia al controllo costante di molte malattie6,7,8. Il Consorzio innovativo di controllo vettoriale (IVCC) ha lanciato il primo sforzo dedicato a sviluppare gli insetticidi di sostituzione per zanzara controllo9. Nuovi insetticidi con nuove modalità di azione (MoA) sono necessari per soddisfare che obiettivi e ottenere il controllo delle malattie. La scoperta e lo sviluppo di nuove classi di insetticida con romanzo MoAs richiedono dosaggi di tutto l'organismo per l'analisi rapida, ad alta produttività di componenti chimici e in confronto ad industria standard10.
Saggi multipli sono disponibili per valutare l'idrorepellenza e la tossicità degli insetticidi per zanzare adulte e larve, e alcune sono adatte per la valutazione di nuovi processi chimici formulati o inespressi. Il protocollo WHO11 è un dosaggio di contatto utilizzato per testare i prodotti contro le larve instar quarto. Studi pubblicati anche descrivono una varietà di analisi larvale usato per testare la tossicità dei prodotti chimici per piccola molecola alle larve di Aedes aegypti, Anopheles gambiae e Culex quinquefasciatus10,12, 13,14,15,16. I Centers for Disease Control and Prevention (CDC) bottiglia analisi biologica viene utilizzato per valutare la resistenza agli insetticidi in campo catturato popolazioni di zanzare adulte tramite valutazione di concentrazione letale (LC) e tempo letale (LT) in confronto ad uno standard diagnostico dose di un insetticida commerciale17. Il test di suscettibilità di OMS offre un altro approccio per valutare la resistenza agli insetticidi in adulte zanzare per cui le zanzare sono esposti a carta impregnata di insetticida all'interno di fiale di vetro per 1 h e mortalità è valutata a 24 h18. Altri saggi spruzzare formulazioni all'interno di gabbie sigillate e atterramento di zanzara record e la morte desiderata punti temporali19. L'applicazione topica sul torace di zanzara è stato utilizzato per valutare la potenza di diversi pesticidi20. Il Liverpool insetto test istituzione (LITE)21 si avvale di procedure operative Standardper valutare la bioattività delle chimiche alle zanzare adulte. Il dosaggio topico adulto LITE si applica una piccola quantità di prodotto in esame al torace di zanzare adulte con mortalità segnato a 48 h. L'analisi consente di quantificazione della dose ricevuta per singoli zanzara21. Il dosaggio tarsale LITE valuta la tossicità del prodotto in esame per le zanzare adulte che riposa su una superficie trattata chimicamente e viene utilizzato per identificare le composizioni chimiche con potenziale di sviluppo come spray residua interna (IRS) o utilizzare in zanzariere da letto trattata di insetticida (ITN) per controllare le zanzare anofele .
L'OMS e CDC saggi hanno limitazioni per le prove chimiche di romanzo, inespressi, e l'obiettivo di analisi biologica bottiglia CDC è la valutazione della suscettibilità per periodi di breve saggio (due ore) piuttosto che tossicità22,23. Inoltre, saggi per valutare la tossicità delle sostanze chimiche consegnato durante il pasto di sangue e potenziali per lo sviluppo di prodotti ad azione sistemica (cioè, endectocidi) sono carenti. Qui, descriviamo le analisi per testare l'attività mosquitocidal di nuovi processi chimici che sono solubili in acqua o in uno dei vari solventi organici contro le larve e adulti di Aedes, Anopheles e Culex. In primo luogo, dimostriamo un dosaggio larvale precedentemente descritto dal nostro gruppo10,12,13,16e qui eseguito come (1) uno schermo per valutare rapidamente processi chimici multipli ad un singolo punto della dose, e (2) un'analisi di risposta dose per determinare la concentrazione letale (ad es., LC50, LC75 o LC90,) di un singolo chimica. Successivamente, descriviamo due adulte analisi per la determinazione della dose mortale (LD). Il primo di questi è un adattamento del protocollo LITE per il collaudo di componenti chimici applicati per via topica, romanzo contro le zanzare adulte rispetto ad un controllo positivo. Il secondo è un saggio di alimentazione per la valutazione delle chimiche tramito sistematicamente il pasto di sangue.
Protocol
Nota: Tutti i ceppi e i reagenti necessari per il lavoro descritto nei protocolli seguenti, e fornitori sono elencati nella Tabella materiali.
1. cultura di zanzara larve e adulti
Nota: I ceppi sensibili di insetticida di zanzare sono disponibili dalla ricerca sulla Malaria e reagente di riferimento Repository. Consigliato ceppi sono come segue: Aedes aegypti Liverpool (LVP) ceppo, Anopheles gambiae Kisumu (KISUMU1) ceppo e Culex quinquefasciatus Johannesburg (JHB) ceppo.
- Le larve di zanzara di cultura dalle uova in una notte di h del giorno/12 h 12 ciclo a 28 ° C e 75-85% di umidità relativa (RH) in vassoi di plastica 25 x 40 cm (~ 400 larve per vassoio) come descritto da Nuss29. Nutrire le larve terra gerbillo (a. aegypti ed e gambiae) o mangime in fiocchi pesci (c. quinquefasciatus). Per i dosaggi larvali, raccogliere larve al terzo (L3) instar larvale.
- Posteriore zanzare adulte da pupe che sono stati trasferiti a bicchieri di plastica e posto all'interno di gabbie di plastica 20 L in uno insectary nelle condizioni descritte sopra. Mantenere le zanzare sulla soluzione 20% zucchero come descritto altrove29. Raccogliere gli adulti a 3-5 giorni di emersione dell'alberino.
2. larvale contatto dosaggio (Dose singola di punto o Dose risposta Assay)
Nota: L'analisi può essere condotta con processi chimici che sono solubili in acqua o dimetil solfossido (DMSO), purché la concentrazione finale di DMSO in pozzi di prova non supera l'1%. Solventi alternativi possono essere un'opzione, ma è essenziale per confermare prima che la concentrazione finale non causa più di 10% di mortalità a post-esposizione 72h. Il dosaggio può essere effettuato come una dose di singolo punto o analisi di dose risposta. Se si esegue quest'ultima, si raccomanda di testare una serie di concentrazioni (minimo cinque), che attraversa il previsto LC50.
- Etichettare i pozzetti di una piastra di tessuto chiaro 24 pozzetti come mostrato in Figura 1.
- Preparare una soluzione di riserva della prova chimica in una provetta da 1,5 mL.
- Pesare ogni chimica utilizzando una bilancia analitica e a seconda delle caratteristiche di solubilità, risospendere in sterile ddH2O, DMSO o altri solventi organici idonei di scelta (Vedi Figura 2).
Nota: I calcoli dovrebbero prendere in considerazione la purezza della chimica. Ad esempio, per una chimica che è puro al 99%, sciogliere 10,1 mg a 1.000 µ l di acetone per ottenere una soluzione di 1%. Sigillare con pellicola di paraffina e conservare a-20 ° C.
- Pesare ogni chimica utilizzando una bilancia analitica e a seconda delle caratteristiche di solubilità, risospendere in sterile ddH2O, DMSO o altri solventi organici idonei di scelta (Vedi Figura 2).
- Determinare la concentrazione finale della prova chimica che sarà valutato e prepara diluizioni seriali dalla soluzione stock di conseguenza, usando il solvente appropriato.
Nota: La concentrazione e il volume di chimica e di solvente può essere calcolati usando la formula C1* V1= C2* V2 dove C1= concentrazione del campione 1, C2= concentrazione di campione 2, V1= volume di campione 1 e V2= volume del campione 2. Vedere i calcoli di esempio illustrati nella Figura 2 e tabella 1.- Preparare una soluzione stock di 10 mM e diluizioni seriali come richiesto per ottenere concentrazioni di prova desiderata (tabella 1B).
- Utilizzando una pipetta di trasferimento in plastica wide-bore, trasferire cinque larve L3 nel pozzetto di una piastra di prova di coltura del tessuto; Le larve L3 possono essere riconosciute dalla lunghezza (~ 2,5-3,5 mm) e testa della capsula larghezza di ~ 0,025 mm24. Delicatamente togliere l'acqua con una pipetta da 1 mL e sostituire con il volume desiderato di ddH2O (Vedi sotto). Ripetere per ottenere n = 4 ripetizioni tecnici per trattamento (cioè, 20 larve totali al trattamento).
- Aggiungere il volume appropriato di prova chimica a ciascuno dei quattro pozzi replicati la piastra di prova 24 pozzetti e roteare delicatamente la piastra per assicurare una miscelazione uniforme della chimica. Posizionare la piastra in una camera di prova o la crescita in condizioni costanti (per esempio, 25 ° C e ~ 75-85% RH è consigliato e una h di luce/12 h 12 scuro ciclo se possibile).
Nota: Per la riproducibilità fra gli esperimenti, garantire analisi successive sono eseguite alle stesse condizioni ambientali. - Registrare il numero di larve morti/non-responsivi in ciascun pozzetto a 30 min, 1, 1,5, 2, 3, 24, 48 e 72 h post-esposizione (o punti ora alternativa) sulla scheda di valutazione (tabella 2). Picchiettare delicatamente il lato della piastra. Se non si osserva alcun movimento, toccare delicatamente la larva con uno stuzzicadenti sterile. Larve di punteggio che non rispondono per maschiatura/tocco come "morto".
Nota: Altri fenotipi morfologici e comportamentali possono essere osservati e possono essere registrati. - Correggere per la mortalità di controllo usando la formula di Abbott modificate se lo si desidera, come segue:
Mortalità (%) = (X-Y) * 100/(100-Y),
dove X = la mortalità percentuale nel campione trattato e Y = la mortalità percentuale nel controllo. - Grafico risultati come un istogramma o la curva logaritmica utilizzando software di scelta come grafico-pad Prisma 6 o simile e calcolare i valori di concentrazione letale (LC) rispetto al controllo.
- Ripetere il test utilizzando un batch distinto di zanzare per ottenere n = 3 o più biologici replicati.
3. adulto dosaggio topico (punto monodose o Dose risposta Assay)
Nota: Il dosaggio topico adulto è condotto utilizzando acetone come solvente. Solventi alternativi possono essere un'opzione, ma è essenziale per confermare prima che la concentrazione finale non causa più di 10% di mortalità a post-esposizione 48h. Il test può essere eseguito come un singolo punto di dose o analisi di risposta dose e viene utilizzato per determinare la dose mortale (LD). Se si esegue quest'ultima, si raccomanda di testare una serie di concentrazioni (minimo cinque), che attraversa il previsto LD50.
- Determinare il numero delle zanzare femmina adulte necessarie per completare il test.
Nota: Un'analisi della dose di punto con un singolo chimica richiederà un minimo di 90 zanzare (30 per il controllo positivo, 30 per il controllo negativo solo acetone e 30 per la prova chimica). - Cultura di 3 a 5-giorno-vecchio le zanzare femmina adulte e spostare in un secchio di plastica 20ml separato utilizzando un aspiratore (Figura 3).
- Etichetta 9 once bicchieri di carta con il nome e la concentrazione della prova chimica. Accantonato piazze maglia 10 x 10 cm e bande di gomma per ogni tazza (Vedi Figura 4).
- Selezionare un insetticida esistente come controllo positivo (ad es., i piretroidi sintetici, bifentrin) e preparare una soluzione madre (10 µ g / µ l) di 1% in acetone.
Nota: I calcoli dovrebbero prendere in considerazione la purezza della chimica. Ad esempio, per una chimica che è puro al 99%, sciogliere 10,1 mg a 1.000 µ l di acetone per ottenere una soluzione di 1%. Sigillare con pellicola di paraffina e conservare a-20 ° C. - Utilizzando la stessa procedura come sopra, preparare una soluzione di riserva della prova chimica.
Nota: Molti test chimici sono altamente labili e soluzioni dovrebbero essere preferibilmente fresco ogni volta che viene eseguita l'analisi biologica. - Preparare diluizioni seriali del controllo positivo e test chimici dalle soluzioni di riserva come mostrato nella Figura 5 tramite fiale di vetro da 20 mL, precedentemente sciacquati con acetone.
- Eliminare una siringa di vetro da 1 mL con acetone, riempire con acetone e proteggere nel micro-applicatore regolato per fornire un volume di 0,25 µ l.
- Lavorando in gruppi di dieci, rimuovere 3 - 5 - giorno-vecchie zanzare femmina adulte da gabbie utilizzando un aspiratore e anestetizzare per fino a cinque min a 4 ° C in un frigorifero o sul ghiaccio. Trasferimento zanzare a una capsula di Petri e posto sul ghiaccio per fino a 10 min.
- Lavorando in fretta, rimuovere una singola femmina con pinzette bene e applicare 0,25 µ l di soluzione di test al torace dorsale utilizzando la siringa micro-applicatore. Confermare la consegna di chimica di osservazione con un microscopio per dissezione per garantire ogni zanzara riceve il volume appropriato di prova chimica.
- Trasferire la zanzara a un bicchiere di carta con etichetta appoggiata sul ghiaccio e ripetere nove volte per ottenere n = 10 trattate zanzare. Sigillare le zanzare nella tazza con un reticolo quadrato fissate con un elastico e il trasferimento ad un alloggiamento in plastica vasca o crescita in condizioni di costante di 28 ° C e 75-85% RH (su un 12 h ciclo giorno/12 h notte è preferibile).
- Ripetere l'esperimento di cui sopra due volte per ottenere n = 3 replicati tecnici (vale a dire, 30 zanzare totale) per ogni gruppo di trattamento o di controllo.
- Ripetere i passaggi da 3,7-3.10 in primo luogo con la chimica di prova e quindi il controllo positivo.
Nota: Un altro controllo utile per includere se sufficienti zanzare sono disponibili è un "vuoto" di 30 zanzare anestetizzate che non ricevono o prova chimica o solvente. - Registrare il numero di zanzare "morti/non-responsive" a 30 min, 60 min, 2, 24 e 48 h post-esposizione (o punti ora alternativa) utilizzando la scheda di valutazione (tabella 3). Punteggio di zanzare come "morti/non-responsive" se essi mostrano mancanza di movimento, definito come posa su un lato o sul retro e con l'incapacità di volare.
- Se si desidera correggere per la mortalità di controllo usando la formula di Abbott modificate come segue:
Mortalità (%) = (X-Y) * 100/(100-Y),
dove X = la mortalità percentuale nel campione trattato e Y = la mortalità percentuale nel controllo. - Visualizzare i risultati come un istogramma o una curva esponenziale. Per un'analisi di risposta dose, calcolare il LD50, LD75 LD90 valore o per la chimica di prova rispetto al controllo.
- Ripetere il test almeno due volte con lotti separati di zanzare per ottenere n = 3 o più biologici replicati.
4. adulto dosaggio sangue-alimentazione (punto d'una sola Dose o Dose risposta Assay)
- Raccogliere circa 150 4-5-giorno vecchie adulto le zanzare femmina e trasferimento in una gabbia separata. Ripetere l'operazione per ottenere 6 gabbie se eseguire un'analisi di risposta di dose. Rimuovere la fonte di zucchero 1-24 h prima per il dosaggio di alimentazione.
- Preparare una soluzione stock di chimica come descritto sopra, contabilità per la purezza della chimica (una tipica soluzione di riserva è di 80 mM in acqua o tampone salino) e successivamente preparare diluizioni seriali nel serbatoio di accumulo come richiesto.
- Aggiungere 40 µ l di ciascuna delle diluizioni a 960 µ l di sangue di coniglio defibrinato per ottenere la concentrazione desiderata. Applicare strato di membrana per un'unità di alimentazione e sigillare con un anello di gomma. Trasferire 1 mL di sangue tramite pipetta e collegare l'unità di alimentazione di un impianto di riscaldamento.
- Delicatamente tampone la membrana in superficie con appena fatto 10% soluzione di acido lattico e posizionare l'unità di alimentazione nella gabbia delle zanzare adulte. Coprire la gabbia con un panno scuro o un sacchetto di spazzatura nero e consentire le zanzare sfamare per un'ora.
- Ripetere i passaggi 4.2-4.4 per il resto delle soluzioni di test e il controllo negativo (solo sangue).
- Al termine dell'allattamento, posto benne a 4 ° C in frigorifero per 5 min anestetizzare le zanzare. Rimuovere le zanzare maschile e le zanzare femmina non alimentato e contare e registrare il numero totale di nutriti e parzialmente alimentato le zanzare da esame dell'addome.
- Mantenere le zanzare femmina parzialmente e completamente nutrite, puntando per un minimo di 50 sangue-ha alimentato le zanzare per ogni somministrazione.
- Trasferimento secchi ad un alloggiamento in plastica vasca o crescita in condizioni di costante di 28 ° C e 75-85% RH (su un 12 h ciclo giorno/12 h notte è preferibile).
- Registrare il numero totale di morti/non-responsivi zanzare a 0,5, 1, 1.5, 2, 24, 48 e 72 h (o tempo-punti alternativi come desiderato) utilizzando il Punteggio foglio (tabella 4).
- Il terzo giorno post sangue alimentazione, introdurre un portauovo nella gabbia e raccogliere le uova per un periodo di 72 ore. Contare il numero totale di uova prodotte per ogni trattamento sotto un microscopio per dissezione.
- Calcolare la percentuale mortalità e fecondità in funzione del numero totale di zanzare nutriti per ciascun gruppo di trattamento e il controllo. Correggere per la mortalità di controllo utilizzando la formula di Abbott modificate se desiderato.
- Visualizzare i dati di tossicità e fecondità come una trama di istogramma o una curva esponenziale (se si esegue un'analisi di risposta dose) utilizzando software di scelta. Se si esegue un'analisi di risposta dose, calcolare il LD50, LD75 LD90 valore o per la chimica di prova rispetto al controllo.
- Ripetere il test almeno due volte con lotti separati di zanzare per ottenere n = 3 o più biologici replicati.
Representative Results
La figura 6 Mostra la mortalità percentuale di L3 Ae. aegypti dopo esposizione alle cinque dosi dell'antagonista del recettore della dopamina, amitriptilina rispetto l'acqua solo controllo (negativo) a 24, 48 e 72 h. In questo esempio, i dati raccolti in ogni tempo-punto visualizzare una tipica curva logaritmica e rivelano un effetto dose-dipendente di amitriptyline sulla mortalità larvale. Il valore di50 LC diminuisce nel corso di tempo dell'esperimento e può essere calcolato utilizzando i dati di 72 h (cioè, punto centrale della curva logaritmica).
La figura 7 Mostra la mortalità percentuale di 3 - 5-giorno-vecchio femmine adulte Ae. aegypti dopo l'esposizione ad una dose di 400 µM (10 µ g / µ l) dell'antagonista del recettore della dopamina, amitriptilina e rispetto i piretroidi sintetici, controllo positivo bifentrin (grado tecnico; 500 pg / µ l), controllo negativo solo acetone e zanzare non trattate (vuoto). In questo esempio, amitriptilina sia bifentrin causare mortalità significativa adulta rispetto al controllo negativo. Si noti che adulto mortalità diminuisce nel tempo, presumibilmente a causa di disintossicazione metabolica delle chimiche di prova.
Figura 8 Mostra la mortalità percentuale (asse y di sinistra) della femmina adulta 3-5 giorno vecchio Ae. aegypti ha alimentato un pasto di sangue trattato con uno dei quattro dosi dell'antagonista del recettore della dopamina, amitriptilina e la fecondità (asse y destra; conta delle uova medio / femmina) per il primo ciclo di gonotrophic post-esposizione rispetto alle zanzare di controllo (solo sangue-Federazione; controllo negativo). I dati rivelano che non c'è alcun effetto significativo di amitriptyline sulla mortalità adulti rispetto al controllo ma non dimostrare che amitriptilina aumenta significativamente la fecondità alla dose elevata (400 µM).
Figura 1 . Set-up del dosaggio risposta dose larvale. Immagine che mostra il set-up del larvale dose risposta test eseguiti utilizzando larve di Aedes aegypti L3 in piastra a 24 pozzetti.
Figura 2 . Schematica mostrando procedura per l'insieme del punto (A) singola dose o analisi larvale di (B) dose risposta in piastra a 24 pozzetti. A seguito di trasferimento delle larve L3 cinque pozzi, l'acqua in eccesso è delicatamente rimosso tramite pipetta e sostituito con ddH fresco, sterile2O. Successivamente, stock e diluizioni seriali della prova chimica sono preparati e aggiunto ad un volume finale di 1 mL/pozzetto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 . Cultura di zanzare adulte. Immagine che Mostra 20 L plastica secchio usato per cultura di zanzare adulte e l'uso di un aspiratore per rimuovere le zanzare.
Figura 4 . Adulto dosaggio topico eseguita utilizzando femmina 4-5 giornata vecchia Aedes aegypti. Dopo il trattamento con chimica o solvente, adulte zanzare inserite in bicchieri di carta e trasferite in una camera di prova per tutta la durata del test.
Figura 5 . Stock e diluizioni seriali. Diagramma schematico che mostra la procedura per la preparazione di brodo (A) e (B) seriale prova soluzioni per il dosaggio topico adulto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6 . Dati rappresentativi da un'analisi di risposta larvale dose contatto. Dati rappresentativi da un'analisi di risposta dose contatto larvale risultati percentuale mortalità delle larve di Aedes aegypti L3 dopo esposizione all'antagonista del recettore della dopamina, amitriptilina a 24, 48 e 72 h. Rappresenta ogni punto di dati significa in µM ± SEM. dati rappresentano n = 3 replicati biologici.
Figura 7 . Dati rappresentativi da un'analisi di risposta dose topica adulti. Dati rappresentativi da un'analisi di risposta dose topica adulti mostrando tossicità dell'antagonista del recettore della dopamina, amitriptilina (10 µ g / µ l) per 3-5 giorno vecchio femminile Aedes aegypti rispetto i piretroidi sintetici, bifentrin (500 pg / µ l) positivo controllo) e controllo (solo veicolo di acetone) a 2, 24 e 48 h. negativo I dati rappresentano n = 3 replicati biologici. Barre di errore indicano SEM
Figura 8 . Dati rappresentativi da un saggio di ingestione adulto. Dose di dati rappresentativi da un saggio di adulto ingestione Risultati tossicità dell'antagonista del recettore della dopamina, amitriptilina a 100 µM, 200 µM e 400 µM a 3-5 giorni vecchio adulto femmina Aedes aegypti e impatto sulla fecondità (espresso come l'uovo medio totale conteggio per donna nel corso del primo ciclo di gonotrophic). I dati rappresentano n = 3 replicati biologici ± SEM
| R. unico punto saggi di dose con tre prodotti chimici per | |||||
| Chimica | Concentrazione (400 uM) | ||||
| Amitriptilina | 80 mM Stock: 2 mg di amitriptilina X 98% (purezza di polvere) X 0,001 g / mg 1 X 1 mol mol di 313,86 g X 1 L/0.08 X 106 µ l/L = 78.06 µ l di acqua. | ||||
| Diluizioni seriali: Diluire 1:2 stock con ddH2O e poi 1:4 per ottenere 10 mM. Aggiungere 40 µ l di brodo di 10 mM contenente ben 960 µ l di ddH20 per ottenere una concentrazione finale di 400 µM/pozzetto. Preparare diluizioni seriali del magazzino 10 mM 1:2 per raggiungere 5 mM, 2,5 mM, 1,25 mM e scorte di 0,625 mM. | |||||
| CIS-(z)-flupenthixol | 80 mM Stock: 2 mg di cis (z) flupenthixol X 98% (purezza di polvere) X 0,001 g / mg 1 X 1 mol/507.44 g cis (z) flupenthixol X 1 L/0.08 mol X 106 µ l/L = 48.28 µ l di acqua. | ||||
| Diluizioni seriali: Come sopra. | |||||
| Amitraz | 80 mM Stock: 2 mg di Amitraz X 0,001 g / mg 1 X 1 mol/293.4 g di amitraz X 1 L/0.08 mol X 106 µ l/1 L = 85.21 µ l di DMSO (Nota: solo l'Amitraz è solubile in DMSO). | ||||
| Diluizioni seriali: Come sopra. | |||||
| Analisi di risposta Dose di B. | |||||
| Chimica | Dose 1 | Dose 2 | Dose 3 | Dose 4 | Dose 5 |
| 400 ΜM | 200 ΜM | 100 ΜM | 50 ΜM | 25 ΜM | |
| ad esempio, amitriptilina, cis-(Z)-flupenthixol o amitraz | 40 Μ l | 40 Μ l | 40 Μ l | 40 Μ l | 40 Μ l |
| stock di 10 mM | stock di 5 mM | stock di 2,5 mM | stock di 1,25 mM | 0,625 mM Stock | |
Tabella 1. Esempio di calcolo di Aedes aegypti larvali L3 (A) singolo punto dose test e (B) dose risposta test.
Tabella 2. Foglio di Punteggio di esempio utilizzato per registrare i dati del dosaggio di risposta dose larvale di zanzare. Controllo, solo acqua o acqua con 1% DMSO o altro solvente solo. Le dosi tipiche utilizzate per testare prodotti chimici per antagonista di piccole molecole quali amitriptilina sono 25 µM, 50 µM, 100 µM, 200 µM e 400 µM.
| Zanzara adulto (3-5 giorno vecchio) dosaggio topico | ||||||
| Data di avvio: | ||||||
| Investigatore: | ||||||
| Specie/varietà: | ||||||
| Tipo di analisi: Singolo punto dose/dose risposta | ||||||
| R. mortalità (No. zanzare morti) | ||||||
| Tempo (ore) | Dose 1 | Dose 2 | Dose 3 | Dose 4 | Dose 5 | Controllo |
| 0,5 | ||||||
| 1 | ||||||
| 1.5 | ||||||
| 2 | ||||||
| 2.5 | ||||||
| B. % mortalità | ||||||
| Tempo (ore) | Dose 1 | Dose 2 | Dose 3 | Dose 4 | Dose 5 | Controllo |
| 0,5 | ||||||
| 1 | ||||||
| 1.5 | ||||||
| 2 | ||||||
| 2.5 | ||||||
Tabella 3. Foglio di Punteggio di esempio utilizzato per registrare i dati del dosaggio di risposta dose topica adulti.
| Zanzara adulto (3-5 giorno vecchio) ingestione Assay | ||||||
| Data di avvio: | ||||||
| Investigatore: | ||||||
| Specie/varietà: | ||||||
| Tipo di analisi: Singolo punto dose/dose risposta | ||||||
| A. numero alimentato le zanzare | ||||||
| Dose 1 | Dose 2 | Dose 3 | Dose 4 | Dose 5 | Controllo | |
| Alimentato | ||||||
| Non Fed | ||||||
| Totale | ||||||
| % Fed | ||||||
| % Non Fed | ||||||
| B. mortalità (No. zanzare morti) | ||||||
| Tempo (ore) | Dose 1 | Dose 2 | Dose 3 | Dose 4 | Dose 5 | Controllo |
| 2 | ||||||
| 24 | ||||||
| 48 | ||||||
| 72 | ||||||
| C. % mortalità | ||||||
| Tempo (ore) | Dose 1 | Dose 2 | Dose 3 | Dose 4 | Dose 5 | Controllo |
| 2 | ||||||
| 24 | ||||||
| 48 | ||||||
| 72 | ||||||
Tabella 4. Foglio di Punteggio di esempio utilizzato per registrare i dati del dosaggio di sangue-alimentazione adulto. Le dosi tipiche utilizzate per testare prodotti chimici per antagonista di piccole molecole quali amitriptilina sono 50 µM, 100 µM, 200 µM e 400 µM.
Discussion
Gli insetticidi sono potenti strumenti per combattere le malattie trasmesse dalle zanzare come25di malaria, dengue e Zika26. Insetticida di vasto uso ha prodotto popolazioni di zanzare che sono resistenti alla lotta chimica, leader per lo sviluppo della resistenza agli insetticidi, che è considerata la più grande minaccia per continuato controllo delle malattie. L'ultimo decennio ha visto un aumento drammatico nelle popolazioni di Anopheles spp. resistente ai piretroidi sintetici (SPs) utilizzati in reti da letto in Africa7. Popolazioni di Aedes albopictus, un vettore di dengue e Zika, sono stati segnalati in Florida e New Jersey che sono resistenti a organofosfati6. Allo stesso modo, la resistenza al DDT e piretroidi è stata documentata in popolazioni di Anopheles e Aedes spp in Colombia27,28. C'è bisogno urgente di sviluppare nuove larvicidi e adulticides che si legano a diversi ortosterici o siti allosterici su bersagli molecolari noti o che disturbare nuovi obiettivi (cioè, romanzo chimiche di MoA)29,30 e hanno un impatto ambientale minimo. C'è in aumento anche il riconoscimento del potenziale intorno endectocidi per zanzara controllo31,32,33.
Per facilitare il rapido sviluppo di tali prodotti, descriviamo una serie di protocolli volti a valutare la tossicità dei prodotti chimici per piccola molecola di larve di zanzara e adulti tramite due percorsi di consegna - contatto e ingestione. Protocolli come il test di suscettibilità di OMS e il dosaggio di bottiglia di CDC sono di uso comune per valutare la tossicità e la repellenza di esistente formulazioni insetticide1,2. Tuttavia, queste analisi hanno limitazioni per le analisi di entità chimiche romanzo inespressi (NCEs) e non sono favorevoli a un numero elevato di processi chimici di prova della moderata o elevata velocità effettiva.
Qui descriviamo un'analisi larvale standard per valutare rapidamente NCEs nella dose di singolo punto che possa essere scalate per analisi di produttività elevata. Inoltre descriviamo un adattamento di un'analisi sviluppata da LITE21 per valutare la tossicità Contatta delle chimiche di piccola molecola alle zanzare adulte. Infine, descriviamo un saggio di ingestione per valutare la tossicità di NCEs consegnati tramite il pasto di sangue per le zanzare femmina adulte ed esplorare endectocide potenziali. Queste analisi larvale e adulte possono essere eseguite in una gamma di dosi al fine di determinare i valori di LC e LD, rispettivamente, e saggi di contatto sia larvale e adulti possono essere eseguiti rispetto ad una o più formulazioni chimiche esistenti. Il dosaggio topico adulto consente inoltre il calcolo dei valori di LD per singolo zanzara. I protocolli possono essere eseguiti utilizzando specie di Aedes, Anopheles e Culex16,29 e potrebbero essere modificati per accogliere le specifiche caratteristiche biologiche di una specie, se lo si desidera. Nella nostra esperienza, mosquitocidal chimiche esibiscono tipicamente vasta attività attraverso questi tre generi16,29, ma non c'è valore alla valutazione della selettività di specie.
I dosaggi sono un punto di partenza per schermo rapidamente più chimiche per attività insetticida. Quei processi chimici che presentano tossicità in uno o più saggi potrebbero essere selezionati per ulteriori analisi tramite analisi secondarie e terziarie. Gli esempi includono il dosaggio tarsale LITE e lo zucchero alimentazione saggi34,35. La selezione di ulteriori saggi è in genere determinata da considerazioni nei dintorni di mercato atteso e applicazione, con risultati fornendo spunti per modalità di consegna del prodotto possibile. Nei risultati della rappresentativi mostrati qui, esploriamo la tossicità di amitriptilina, un antagonista dei recettori dopaminergici mammiferi e invertebrati marini che di potenziale è stato valutato come un romanzo MoA insetticida10,12, 13 , 16. amitriptilina ha esibito la tossicità di larve e adulti di Ae. aegytpi in μg gamma suggerendo larvicida e adulticida attività e fornendo spiegazione razionale per un'esplorazione di una serie di chimica di base di amitriptilina per identificare analoghi con potenza elevata. In Ae. aegypti esposti ad amitriptilina nel pasto di sangue è stato osservato alcun effetto significativo sulla mortalità o fecondità. Mentre la stabilità della chimica nel sangue defibrinato e dose efficace ricevute al zanzara non è noto, notevoli limitazioni del test, i dati suggeriscono che amitriptilina e altri composti attivi GPCR possono avere poco potenziale come endectocidi, alle almeno in stato inespressi.
Precauzioni per limitare la variazione biologica tra i test sono essenziali. Tutte le analisi devono essere eseguite in condizioni standard di temperatura e umidità, preferibilmente in una camera di crescita degli insetti, al fine di garantire la riproducibilità. È assolutamente necessario standardizzare le procedure per segnare punti finali fenotipici come questi possono essere altamente soggettivi, che porta ad una variazione significativa dei dati registrati da personale di laboratorio diversi. Il dosaggio larvale è più adatto alla valutazione dei processi chimici che sono solubili in acqua, anche se il dosaggio può essere effettuato utilizzando solventi organici come DMSO, purché la concentrazione finale è inferiore all'1% per pozzetto. Riconosciamo diversi limiti per l'adulto dosaggio topico. In primo luogo, è necessario lavorare rapidamente quando preparare diluizioni seriali e consegnare le dosi come il vettore (acetone) è altamente volatile ed evaporazione può produrre variazione nella quantità di chimica consegnato. In secondo luogo, si dovrebbe prestare attenzione a limitare il periodo di anestesia come questo può contribuire alla mortalità. Si deve anche osservare che solventi quali l'acetone possono produrre un effetto rapido "knock-down" nelle parecchie ore prime del test d'attualità, che non deve essere confuso con effetti a causa della chimica di prova. Notiamo che il volume del pasto di sangue di zanzare varia tra gli individui, che complica una valutazione della dose ricevuta per adulto nel dosaggio adulto ingestione. Infine, analisi dati non devono essere considerati in casi dove la mortalità nel controllo negativo supera il 10%.
Prodotti che agiscono in sinergia sempre più sono riconosciuti per il loro potenziale di estendere l'utilità dei prodotti esistenti e forniscono il controllo di parassiti resistenti insetticida popolazioni15,16,36. Analisi larvali sono state usate per esaminare il sinergismo fra il pesticida formammidina, amitraz e una varietà di composizioni chimiche che interrompono invertebrati octopamina recettori14,15. L'analisi larvale e adulto dosaggio topico descritto sono adatti per la valutazione di effetti sinergici o additivi tra combinazioni di prodotti chimici per test. Notiamo che sinergizzanti come piperonil butossido (PBO) possono essere incorporati in ciascuno dei tre saggi descritti qui.
Le analisi sopra descritte forniscono una serie sperimentale standardizzata per la valutazione dei farmaci inespressi, piccola molecola contro le fasi della vita acquatica e terrestre zanzara. Queste analisi sono progettate specificamente per valutare la tossicità e offrono diversi vantaggi rispetto dei genitori saggi in comune uso. D'importanza, i dosaggi sono favorevoli all'automazione e possono essere eseguiti su scala industriale per consentire la valutazione di migliaia di sostanze da testare. Infine, come il campo ritiene che lo sviluppo di prodotti che agiscono tramite nuove MoAs, tra cui via rottura di nuovi bersagli molecolari e le vie biochimiche, sarà essenziale per segnare più endpoint fenotipiche oltre a quelle come la mortalità e paralisi. Le analisi di cui sopra consentono tali indagini, fornendo così un passo verso tecnologie altamente innovative, insetticida di domani.
Disclosures
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano H. Ranson, Liverpool School of Tropical Medicine per assistenza con sviluppo di analisi e predisposizione del protocollo LITE, e M. Scharf, Purdue University per la consulenza in materia di analisi di design.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Insecticide susceptible mosquito strains | Malaria Research and Reagent Reference Repository | https://www.beiresources.org/MR4Home.aspx; Recommended strains: Aedes aegypti Liverpool (LVP) strain, Anopheles gambiae Kisumu (KISUMU1) strain and Culex quinquefasciatus Johannesburg (JHB) strain | |
| Acetone | Mallinckrodt Chemical | CAS 67-64-1 | Use for dilutions and control |
| Amitraz | Sigma-Aldrich | CAS 33089-61-1 | Requires dilution in DMSO |
| Amitriptyline | Sigma-Aldrich | CAS: 549-18-8 | Can be diluted in acetone |
| Bifenthrin | Sigma-Aldrich | CAS: 51529-01-2 | Synthetic pyrethorid used as positive control |
| Cis-(Z)-flupenthixol | Sigma-Aldrich | CAS: 51529-01-2 | Pharmacologically tested as disruptor of dop-like receptors |
| Defibrinated rabbit blood | Hemostat | DRB0100 | Blood source for adapted mosquitoes to artificial feeding |
| Dimethylsulphoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | MKBF2985 | Organic solvent used to disolve amitraz |
| Hemotek membrane feeding system | Hemotek Ltd | Serial no. 1303 | Used for feeding mosquitoes |
| Micro-applicator | Burkard Manufacturing Co. | - | Tool needed for topical application experiments |
| 24-well cell culture plate with lid | Corning Incorporated | 3526 | - |
| Advantage rubber bands | Alliance Rubber Co. | - | Used to seal the paper cups |
| Glass syringe (1 ml) | Becton Dickinson and Co. | 512004 | Needed for the micro-applications. Glass is better than plastic |
| Disposable scintillation vials (20 ml) | Fisher Scientific | 74505-20 | Glass vials prevent evaporation |
| Tulle fabric, white | Walmart | - | - |
| Paper cups | Dixie Consumer Products LLC. | PF15675/13D | Used to keep adult mosquitoes in adult topical assays |
| Petri dishes (150 mm) | Corning Life Sciences | - | Used to maintain the mosquitoes "slept" on cold without direct contact with ice |
| Transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | Used to sort larvae |
| Stereo microscope | Olympus | SZ6045 | Used to score larval assays and perform micro-applications |
| Tweezers (fine) | Fontax | - | Used to handle adult mosquitoes |
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