Summary
Os protocolos são descritos para avaliar a toxicidade de produtos químicos para mosquitos imaturos e adultos para o desenvolvimento como novas classes de larvicidas, adulticides e Endectocidas. Os protocolos permitem o elevado-throughput teste de químicas múltiplas na dose de ponto único e posterior avaliação através do ensaio de resposta de dose para determinar a toxicidade em contato ou ingestão.
Abstract
Novas classes de inseticidas com novos modos de ação são necessários para controlar populações resistentes ao inseticida de mosquitos que transmitem doenças como Zika, dengue e malária. Ensaios para rapid, análises de alta produtividade de unformulated novela químicas contra larvas de mosquito e adultos são apresentadas. Descrevemos os protocolos para ponto-dose única e dose resposta ensaios para avaliar a toxicidade de químicas pequena molécula para o vetor Aedes aegypti de Zika, dengue e febre amarela, o vetor da malária, Anopheles gambiae e o norte da mosquito da casa, Culex quinquefasciatus, no contato e através da ingestão. Como exemplo, avaliamos a toxicidade da amitriptilina, um antagonista de pequenas moléculas de receptores acoplado à proteína G, através de larva, adulto tópico e adulto sangue-alimentação do ensaio. Os protocolos fornecem um ponto de partida para investigar o potencial inseticida. Os resultados são discutidos no contexto de experimentos adicionais para explorar as aplicações de produtos e mecanismos de entrega.
Introduction
Os mosquitos transmitem os agentes causadores de doenças infecciosas que impactam a saúde humana global1. Os três gêneros de mosquito mais importantes que afetam a saúde humana são Aedes, Anopheles e Culex. Espécies de mosquitos Aedes vector os arbovírus que causam Zika, dengue, febre amarela e a chikungunya. Espécies de Anopheles vector parasitas da malária e espécie Culex transmite o vírus do Nilo Ocidental e filarial nematodes2. A Organização Mundial de saúde (OMS) tem chamado para a erradicação de dez negligenciadas tropicais doenças (NTD) por 20203 e identificado o controle do mosquito como a estratégia mais viável. Inseticidas são ferramentas poderosas para controlar os mosquitos e reduzir a transmissão de doença4,5. No entanto, o surgimento de populações resistentes ao inseticida mosquito ameaça o controle contínuo de muitas doenças6,7,8. O consórcio inovador de controle vetorial (IVCC) lançou o primeiro esforço dedicado para desenvolver inseticidas de substituição para mosquito controle9. Novas inseticidas com novos modos de ação (MoA) são necessários para quem atingir metas e alcançar o controle da doença. A descoberta e o desenvolvimento de novas classes de inseticida com romance MoAs exigem ensaios todo organismo para análise rápida, alta produtividade de químicas e em comparação com padrões de indústria10.
Vários ensaios estão disponíveis para avaliar a toxicidade de inseticidas para larvas e mosquitos adultos e repelência, e alguns são adequados para a avaliação de romance químicas formuladas ou unformulated. O WHO protocolo11 é um ensaio de contato usado para testar produtos contra larvas de quarto instar. Estudos publicados também descrevem uma variedade de ensaios larvas usado para testar a toxicidade de produtos químicos de pequenas moléculas para larvas de Aedes aegypti, Anopheles gambiae e Culex quinquefasciatus10,12, 13de15,de14,,16. O Centers for Disease Control and Prevention (CDC) garrafa bioensaio é usado para avaliar a resistência de inseticida em campo pegou as populações de mosquitos adultos através da avaliação da concentração letal (LC) e tempo letal (LT) em comparação com um padrão de diagnóstico dose de um inseticida comercial17. O teste de sensibilidade WHO oferece uma outra abordagem para avaliar a resistência de inseticida em mosquitos adultos, pelo qual os mosquitos são expostos ao papel impregnado de inseticida dentro de frascos de vidro para 1h e mortalidade é avaliada em 24 h18. Outros ensaios pulverizar formulações dentro de jaulas seladas e record mosquito knockdown e morte em momentos desejado19. Aplicação tópica no tórax de mosquito tem sido usada para avaliar potência de diversos pesticidas20. O Liverpool inseto testes estabelecimento (LITE)21 emprega procedimentos operacionais padrãopara avaliar a bioatividade de químicas aos mosquitos adultos. O ensaio da tópico LITE adulto aplica-se um pequeno volume de produto de teste no tórax de mosquitos adultos com mortalidade marcada a 48 h. O ensaio permite a quantificação da dose recebida por mosquito individuais21. O ensaio do Tarso LITE avalia a toxicidade do produto de teste aos mosquitos adultos descansando sobre uma superfície quimicamente tratada e é usado para identificar produtos químicos com potencial de desenvolvimento como pulverizadores residuais indoor (IRS) ou usar na cama-redes de insecticida tratada (com insecticida MTI) para controlar os mosquitos Anopheles .
A OMS e ensaios de CDC têm limitações para testes químicos de novela, unformulated, e o objetivo do bioensaio de garrafa CDC é avaliação de susceptibilidade durante períodos de ensaio curto (duas horas) ao invés de toxicidade22,23. Além disso, ensaios para avaliar a toxicidade de produtos químicos entregues na refeição de sangue e potencial para desenvolvimento de produtos de ação sistêmica (ou seja, Endectocidas) são escassos. Aqui, descrevemos ensaios para testar a atividade de medicina de romance químicas que são solúveis em água ou em um dos vários solventes orgânicos contra as larvas e adultos de Aedes, Anopheles e Culex. Primeiro, podemos demonstrar um ensaio larval anteriormente descrito pelo nosso grupo10,12,13,16e realizado aqui como (1) uma tela para avaliar rapidamente químicas múltiplas em um único ponto de dose, e (2) um ensaio de resposta de dose para determinar a concentração letal (por exemplo, LC50, LC75 ou LC90,) de uma química única. Em seguida, descreveremos dois adultos ensaios para a determinação da dose letal (LD). A primeira delas é uma adaptação do protocolo LITE para teste de química aplicada topicamente, a novela contra mosquitos adultos em comparação com um controle positivo. O segundo é um ensaio de alimentação para a avaliação dos produtos químicos entregadas sistemicamente via a refeição de sangue.
Protocol
Nota: Todas as tensões e os reagentes necessários para o trabalho descreveram nos seguintes protocolos e fornecedores estão listados na Tabela de materiais.
1. cultura de Mosquito larvas e adultos
Nota: Cepas suscetíveis de inseticida de mosquitos estão disponíveis a partir da pesquisa de malária e repositório de referência reagente. Recomendado cepas são os seguintes: tensão de Liverpool (LVP) Aedes aegypti , Anopheles gambiae Kisumu (KISUMU1) de tensão e Culex quinquefasciatus estirpe de Joanesburgo (JHB).
- Ciclo de larvas de mosquito de cultura de ovos numa noite de dia/12 h 12 h em 28 ° C e 75-85% umidade relativa (RH) em bandejas plásticas de 25 cm x 40 cm (~ 400 larvas por bandeja) conforme descrito por Nuss29. Alimente as larvas terreno gerbil (a. aegypti e an gambiae) ou comida de peixe de floco (c. quinquefasciatus). Para ensaios larvas, colete larvas a terceira fase de ínstar larval (L3).
- Traseira mosquitos adultos de pupas que tenham sido transferidas para copos de plástico e coloque dentro de gaiolas de plástico 20L em um insetário nas condições descritas acima. Manter os mosquitos na solução de 20% de açúcar, conforme descrito em outro lugar,29. Colete os adultos no surgimento de post de 3-5 dias.
2. larval ensaio contato (Dose única de ponto ou ensaio de resposta de Dose)
Nota: O ensaio pode ser realizado com produtos químicos que são solúveis em água ou dimetil sulfóxido (DMSO), desde que a concentração final de DMSO em poços de teste não ultrapasse 1%. Solventes alternativos podem ser uma opção, mas é essencial para confirmar primeiro que a concentração final não causa mais do que 10% de mortalidade na exposição de post 72 h. O ensaio pode ser realizado como uma dose de ponto único ou ensaio de resposta de dose. Se executar este último, é aconselhável testar uma gama de concentrações (mínimo de cinco anos), abrangendo o esperado LC50.
- Rotule os poços de uma placa de tecido claro 24-bem como mostrado na Figura 1.
- Prepare uma solução stock da química de teste em um tubo de 1,5 mL.
- Pesar cada química usando uma balança analítica e dependendo das características de solubilidade, re-suspender em ddH estéril2O, DMSO ou outro solvente orgânico apropriado de escolha (ver Figura 2).
Nota: Os cálculos devem ter em conta a pureza da química. Por exemplo, para uma química que é 99% puro, dissolva 10,1 mg em 1.000 µ l de acetona para obter uma solução de 1%. Selo com a película de parafina e armazenar a-20 ° C.
- Pesar cada química usando uma balança analítica e dependendo das características de solubilidade, re-suspender em ddH estéril2O, DMSO ou outro solvente orgânico apropriado de escolha (ver Figura 2).
- Determine a concentração final do teste de química que será avaliado e prepara diluições em série a partir da solução estoque em conformidade, usando o solvente apropriado.
Nota: A concentração e o volume de química e de solvente podem ser calculadas usando a fórmula C1* V1= C2* V2 onde C1= concentração da amostra 1, C2= concentração da amostra 2, V1= volume de amostra 1 e V2= volume da amostra 2. Veja os cálculos do exemplo mostrados na Figura 2 e tabela 1.- Prepare uma solução stock de 10 mM e diluições em série como necessário para obter concentrações desejadas (tabela 1B).
- Utilizando uma pipeta de transferência plástico largo-furo, transferir cinco larvas L3 para o poço de uma placa de teste de cultura de tecidos; Larvas L3 podem ser reconhecidas pelo comprimento (~ 2.5-3.5 mm) e largura da cápsula de cabeça ~ 0,025 mm24. Delicadamente, retire a água com uma pipeta de 1 mL e substituir com o volume desejado de DDQ2O (veja abaixo). Repetir para obter n = 4 técnicas repetições por tratamento (ou seja, 20 larvas totais por tratamento).
- Adicionar o volume apropriado de química de teste para cada um dos quatro poços replicar em placa de 24 poços de teste e agite suavemente a placa para garantir uma mistura uniforme de química. Coloque a placa em uma câmara de teste ou crescimento sob condições constantes (por exemplo, 25 ° C e ~ 75-85% RH é recomendado e um 12 h luz/12h escuro ciclo se possível).
Nota: Para reprodutibilidade entre experiências, certifique-se de ensaios subsequentes são realizados sob as mesmas condições ambientais. - Registrar o número de mortos/não-responsivos larvas em cada poço em 30 min, 1, 1,5, 2, 3, 24, 48 e 72 h pós-exposição (ou pontos de tempo alternativa) na folha de Pontuação (tabela 2). Bata levemente o lado da placa. Se nenhum movimento for observado, toque suavemente a larva com um palito de dente estéril. Larvas de pontuação que não respondem para rosqueamento/toque como "mortos".
Nota: Outros fenótipos morfológicos e comportamentais podem ser observados e podem ser gravados. - Corrigi para mortalidade de controle usando a fórmula a modificada do Abbott, se desejado, como segue:
Mortalidade (%) = (X-Y) * 100/(100-Y),
onde X = a mortalidade por cento na amostra tratada e Y = a mortalidade por cento no controle. - Resultados do gráfico como um histograma ou curva logarítmica utilizando o software de escolha como Graph pad Prism 6 ou similar e calcular os valores de concentração letal (LC) em relação ao controle.
- Repita o teste usando um lote separado de mosquitos para obter n = repetições de 3 ou mais biológicas.
3. adulto ensaio tópico (Dose única de ponto ou ensaio de resposta de Dose)
Nota: O ensaio adulto tópico é conduzido usando acetona como solvente. Solventes alternativos podem ser uma opção, mas é essencial para confirmar primeiro que a concentração final não causa mais do que 10% mortalidade em exposição de post de 48 h. O ensaio pode ser executado como um único ponto de dose ou ensaio de resposta de dose e é usado para determinar a dose letal (LD). Se executar este último, é aconselhável testar uma gama de concentrações (mínimo de cinco anos), abrangendo o esperado LD50.
- Determine o número de mosquitos fêmeas adultos necessários para completar o ensaio.
Nota: Um ensaio de dose de ponto com uma química única exigirá um mínimo de 90 mosquitos (30 para o controlo positivo, 30 para o controle negativo apenas acetona e 30 para o teste de química). - Cultura de 3 a 5 dias de idade de mosquitos fêmeas adultos e mover para um balde de plástico separado 20ml usando um aspirador (Figura 3).
- Etiqueta 9 oz copos de papel com o nome e a concentração do teste de química. Retiradas praças de malha 10 x 10 cm e bandas de borracha para cada copo (ver Figura 4).
- Selecione um inseticida existente como um controle positivo (por exemplo, os piretroides sintéticos, bifentrina) e prepare uma solução stock de 1% (10 µ g / µ l) em acetona.
Nota: Os cálculos devem ter em conta a pureza da química. Por exemplo, para uma química que é 99% puro, dissolva 10,1 mg em 1.000 µ l de acetona para obter uma solução de 1%. Selo com a película de parafina e armazenar a-20 ° C. - Usando o mesmo procedimento como acima, prepare uma solução stock de química o teste.
Nota: Muitos químicos do teste são altamente instáveis e soluções devem ser feitas de preferência fresco cada vez que o bioensaio é executado. - Preparar diluições em série do controlo positivo e teste químicos de soluções padrão, como mostrado na Figura 5 usando 20 mL frascos de vidro previamente lavados com acetona.
- Purgar uma seringa de vidro de 1 mL com acetona, encha com acetona e fixe o aplicador microajustado para entregar um volume de 0,25 µ l.
- Trabalhando em lotes de dez, remova 3 - 5 - dias velhos mosquitos fêmeas adultos de gaiolas usando um aspirador e anestesiar para até cinco min a 4 ° C em uma geladeira ou no gelo. Em seguida, transferir os mosquitos para um prato de Petri e lugar no gelo por até 10 min.
- Trabalhando rapidamente, remover uma única fêmea com uma pinça fina e aplicar 0,25 µ l de solução de teste ao nível do tórax dorsal utilizando o microaplicador de seringa. Confirme a entrega da química pela observação usando um microscópio de dissecação para garantir que cada mosquito recebe o volume apropriado de teste de química.
- Transferir o mosquito para um copo de papel rotulado descansando no gelo e repita nove vezes para obter n = 10 mosquitos tratados. Sele os mosquitos na Taça com uma malha quadrada presa com um elástico e a transferência para uma câmara de crescimento ou banheira plástica sob condições constantes de 28 ° C e 75-85% RH (em um 12 h ciclo dia/12 h noite é preferível).
- Repetir o experimento acima duas vezes para obter n = 3 repetições de técnicas (ou seja, 30 total de mosquitos) por grupo de tratamento ou controle.
- Repita as etapas de 3.7-3.10 primeiro com a química de teste e, em seguida, o controlo positivo.
Nota: Outro controle útil incluir se suficiente mosquitos estão disponíveis é um "em branco" de 30 mosquitos anestesiados que não recebem ou teste de química ou solvente. - Registrar o número de mosquitos "morto/não-responsivos" em 30 min, 60 min, 2, 24 e 48 h pós-exposição (ou pontos de tempo alternativa) usando a folha de Pontuação (tabela 3). Marcar os mosquitos como "morto/não-responsivos" se apresenta ausência de movimento, definido como a imposição de um lado ou na parte de trás e com a incapacidade de voar.
- Se desejado, corrigi para mortalidade de controle usando fórmula a Abbott está modificada como segue:
Mortalidade (%) = (X-Y) * 100/(100-Y),
onde X = a mortalidade por cento na amostra tratada e Y = a mortalidade por cento no controle. - Exibir resultados como um histograma ou uma curva exponencial. Para um ensaio de resposta de dose, calcule o LD50, LD75 ou valor de90 LD para o teste de química em relação ao controle.
- Repetir o ensaio pelo menos duas vezes usando lotes separados de mosquitos para obter n = repetições de 3 ou mais biológicas.
4. adulto ensaio sangue-alimentação (Dose única de ponto ou ensaio de resposta de Dose)
- Coletamos aproximadamente 150 4-5 dias velhos adultos mosquitos fêmeas e transferência para uma gaiola separada. Repita o procedimento para obter 6 gaiolas se realizando um ensaio de resposta de dose. Remova a fonte do prior de açúcar 1-24 h para o ensaio de alimentação.
- Prepare uma solução stock de química, como descrito acima, representando a pureza da química (uma solução típica é 80 mM de água ou sal buffer) e posteriormente, preparar diluições em série em água/buffer, conforme necessário.
- Adicione 40 µ l de cada uma das diluições para 960 µ l de sangue de coelho desfibrinado para obter a concentração desejada. Aplique a película de membrana para uma unidade de alimentação e selar com um anel de borracha. Transferir 1 mL de sangue através de uma pipeta e anexar a unidade de alimentação para uma unidade de aquecimento.
- Delicadamente cotonete na membrana de superfície com recém feito 10% solução de ácido láctico e o lugar da unidade de alimentação dentro da jaula de mosquitos adultos. Cobrir a gaiola com um pano escuro ou um saco de lixo preto e permitir que os mosquitos alimentar durante uma hora.
- Repita as etapas de 4.2-4.4 para o restante das soluções de teste e o controlo negativo (somente sangue).
- Após a conclusão de alimentação, coloque baldes a 4 ° C no frigorífico durante 5 min anestesiar os mosquitos. Remover o macho de mosquitos e mosquitos fêmeas não-alimentados, conta e registrar o número total de alimentados e parcialmente alimentados mosquitos através de exame do abdômen.
- Manter mosquitos fêmeas parcialmente e totalmente alimentados, apontando para um mínimo de 50 mosquitos alimentados com sangue por dose.
- Transferi baldes para uma câmara de crescimento ou banheira plástica sob condições constantes de 28 ° C e 75-85% RH (em um 12 h ciclo dia/12 h noite é preferível).
- Registrar o número total de mosquitos mortos/não-responsivos em 0,5, 1, 1.5, 2, 24, 48 e 72 h (ou tempo-pontos alternativos como desejado), usando a pontuação da folha (tabela 4).
- No terceiro dia pós sangue alimentação, introduzir uma xícara ovo na gaiola e coletar ovos durante um período de 72 h. Conte o número total de ovos produzidos por tratamento sob um microscópio de dissecação.
- Calcule a porcentagem mortalidade e fecundidade em função do número total de mosquitos alimentados para cada grupo de tratamento e o controle. Corrigi para mortalidade de controle usando a fórmula do modificado do Abbott, se desejado.
- Exibir dados de toxicidade e fecundidade como uma trama do histograma ou curva exponencial (se executar um ensaio de resposta de dose) utilizando o software de escolha. Se executar um ensaio de resposta de dose, calcule o LD50, LD75 ou valor de90 LD para o teste de química em relação ao controle.
- Repetir o ensaio pelo menos duas vezes usando lotes separados de mosquitos para obter n = repetições de 3 ou mais biológicas.
Representative Results
A Figura 6 mostra a mortalidade por cento de L3 Ae. aegypti após exposição a cinco doses da antagonista do receptor de dopamina, amitriptilina, em comparação com a água apenas controlo (negativo) em 24, 48 e 72 h. Neste exemplo, os dados coletados em cada um dos pontos de tempo exibir uma típica curva logarítmica em revelam um efeito dependente da dose de amitriptilina na mortalidade larval. O valor de50 LC diminui ao longo do tempo do experimento e pode ser calculado usando os dados de 72 h (ou seja, ponto médio da curva logarítmica).
A Figura 7 mostra a mortalidade por cento de 3 - 5 dias de idade fêmeas adultas Ae. aegypti após a exposição a uma dose de 400 µM (10 µ g / µ l) da antagonista do receptor de dopamina, amitriptilina e em comparação com os piretroides sintéticos, controle positivo bifentrina (grau técnico; 500 pg / µ l), controle negativo apenas acetona e mosquitos não tratados (em branco). Neste exemplo, tanto a amitriptilina e bifentrina causam mortalidade adulta significativa em relação ao controle negativo. Note-se que a mortalidade de adulta diminui ao longo do tempo, presumivelmente devido a desintoxicação metabólica de teste químicas.
A Figura 8 mostra a mortalidade por cento (à esquerda do eixo y) de fêmea adulta de 3 a 5 dias velho Ae. aegypti alimentou uma refeição de sangue tratada com uma das quatro doses do antagonista de receptor de dopamina, amitriptilina e a fecundidade (eixo y direito; contagem média de ovo / feminino) para a primeira exposição de post do ciclo gonotrophic em comparação com os mosquitos de controle (alimentados com sangue só; controle negativo). Os dados revelam que não há nenhum efeito significativo sobre a mortalidade de adulto em relação ao controle de amitriptilina, mas demonstrar que amitriptilina aumenta significativamente a fecundidade a dose mais elevada (400 µM).
Figura 1 . Set-up do ensaio larval dose resposta. Imagem mostrando a configuração do ensaio de resposta de dose larval realizada utilizando larvas de Aedes aegypti L3 em placa de 24.
Figura 2 . Esquemático aparecendo procedimento para o conjunto do ponto (A) uma única dose ou ensaio de larvas (B) dose resposta em placa de 24. Após a transferência de cinco larvas L3 para poços, excesso de água delicadamente é removido através da pipeta e substituído por ddH fresco, estéril2O. Em seguida, estoque e diluições em série do teste de química são preparadas e adicionadas a um volume final de 1 mL/poço. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 . Cultura de mosquitos adultos. Imagem mostrando 20L balde de plástico usado para cultura de mosquitos adultos e o uso de um aspirador para remover os mosquitos.
Figura 4 . Adulto ensaio tópico realizado utilizando fêmea de 4 a 5 dias velho Aedes aegypti. Seguir tratamento com química ou solventes, adultos de mosquitos são colocados em copos de papel e transferidos para uma câmara de teste para a duração do ensaio.
Figura 5 . Estoque e diluições em série. Diagrama esquemático mostrando o procedimento para a preparação de estoque (A) e (B) soluções de serial de teste para o ensaio adulto tópica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 . Dados representativos de um ensaio de resposta de dose contato larval. Dados representativos de um ensaio de resposta de dose contato larval mostrando mortalidade porcentagem de larvas de Aedes aegypti L3 após a exposição para o antagonista de receptor de dopamina, amitriptilina em 24, 48 e 72 h. Cada ponto de dados representa a média em µM ± SEM. dados representam n = 3 repetições biológicas.
Figura 7 . Dados representativos de um ensaio de resposta de dose tópica adulto. Dados representativos de um ensaio de resposta de dose tópica adulto apresentando toxicidade do antagonista dos receptores da dopamina, amitriptilina (10 µ g / µ l) de 3 a 5 dias velho fêmea Aedes aegypti em relação a piretroides sintéticos, bifentrina (500 pg / µ l) positiva controle) e controle (só veículo acetona) no 2, 24 e 48 h. negativo Dados representam n = 3 repetições biológicas. Barras de erro indicam SEM.
Figura 8 . Dados representativos de um ensaio de ingestão adulto. Dados representativos de um ensaio de ingestão adulto apresentando toxicidade do antagonista do receptor de dopamina, amitriptilina em 100 µM e 200 µM 400 µM a dose de 3 a 5 dias velho adulto fêmea Aedes aegypti e impacto sobre a fecundidade (expressado como o ovo total médio contar por fêmea durante o primeiro ciclo de gonotrophic). Dados representam n = 3 réplicas biológicas ± SEM.
| R. ensaios de dose única ponto com três químicos | |||||
| Química | Concentração (400 hum) | ||||
| Amitriptilina | estoque de 80mm: 2 mg de amitriptilina X 98% (pureza de pó) X 0,001 g / mg 1 X 1 mol de 313,86 g X 1 L/0,08 mol X 106 µ l/L = 78.06 µ l de água. | ||||
| Diluições de série: Dilua o estoque 1:2 com O ddH2e, em seguida, 1:4 para atingir 10 mM. Adicione 40 µ l de estoque de 10 mM para bem contendo 960 µ l de DDQ20 a obter uma concentração final de 400 µM/poço. Prepare diluições em série do estoque de 10 mM 1:2 para atingir 5 mM, 2.5 mM, 1.25 mM e estoques de 0,625 mM. | |||||
| CIS-(z)-flupenthixol | estoque de 80mm: 2 mg de cis (z) flupenthixol X 98% (pureza de pó) X 0,001 g / mg 1 X 1 mol/507.44 g cis (z) flupenthixol L/0.08 X 1 mol X 106 µ l/L = 48.28 µ l de água. | ||||
| Diluições de série: Como acima. | |||||
| Amitraz | estoque de 80mm: 2 mg de Amitraz X 0,001 g / mg 1 X 1 mol/293.4 g de amitraz L/0.08 X 1 mol X 106 µ l/1 L = 85.21 µ l de DMSO (Nota: Amitraz só é solúvel em DMSO). | ||||
| Diluições de série: Como acima. | |||||
| Ensaio de resposta de Dose de B. | |||||
| Química | Dose de 1 | Dose 2 | Dose 3 | Dose 4 | Dose de 5 |
| 400 ΜM | 200 ΜM | 100 ΜM | 50 ΜM | 25 ΜM | |
| por exemplo, amitriptilina, cis-(Z)-flupenthixol ou amitraz | 40 Μ l | 40 Μ l | 40 Μ l | 40 Μ l | 40 Μ l |
| estoque de 10 mM | estoque de 5 mM | estoque de 2,5 mM | estoque de 1,25 mM | Estoque de 0,625 mM | |
Tabela 1. Cálculos de exemplo para Aedes aegypti larva L3 (A) único ponto do ensaio de dose e ensaio de resposta de dose (B).
Tabela 2. Folha de Pontuação exemplo usada para gravar dados de ensaio mosquito larval dose resposta. Controle, somente água ou água com 1% DMSO ou outro solvente apenas. Doses típicos usados para testar produtos químicos antagonista de pequenas moléculas como a amitriptilina são 25 µM e 50 µM, 100 µM, 200 µM, 400 µM.
| Ensaio de tópica mosquito adulto (idade de 3 a 5 dias) | ||||||
| Data de início: | ||||||
| Investigador: | ||||||
| Espécie/tensão: | ||||||
| Do tipo de ensaio: Único ponto dose/dose resposta | ||||||
| R. mortalidade (n. º mosquitos mortos) | ||||||
| Tempo (horas) | Dose de 1 | Dose 2 | Dose 3 | Dose 4 | Dose de 5 | Controle |
| 0,5 | ||||||
| 1 | ||||||
| 1.5 | ||||||
| 2 | ||||||
| 2.5 | ||||||
| Mortalidade por cento de B. | ||||||
| Tempo (horas) | Dose de 1 | Dose 2 | Dose 3 | Dose 4 | Dose de 5 | Controle |
| 0,5 | ||||||
| 1 | ||||||
| 1.5 | ||||||
| 2 | ||||||
| 2.5 | ||||||
Tabela 3. Folha de Pontuação exemplo usada para gravar dados de ensaio de resposta de dose tópica adulto.
| Ensaio de ingestão mosquito adulto (idade de 3 a 5 dias) | ||||||
| Data de início: | ||||||
| Investigador: | ||||||
| Espécie/tensão: | ||||||
| Do tipo de ensaio: Único ponto dose/dose resposta | ||||||
| R. número alimentados mosquitos | ||||||
| Dose de 1 | Dose 2 | Dose 3 | Dose 4 | Dose de 5 | Controle | |
| Alimentados | ||||||
| Não Fed | ||||||
| Total | ||||||
| % Fed | ||||||
| % Não Fed | ||||||
| B. mortalidade (n. º mosquitos mortos) | ||||||
| Tempo (horas) | Dose de 1 | Dose 2 | Dose 3 | Dose 4 | Dose de 5 | Controle |
| 2 | ||||||
| 24 | ||||||
| 48 | ||||||
| 72 | ||||||
| Mortalidade por cento C. | ||||||
| Tempo (horas) | Dose de 1 | Dose 2 | Dose 3 | Dose 4 | Dose de 5 | Controle |
| 2 | ||||||
| 24 | ||||||
| 48 | ||||||
| 72 | ||||||
Tabela 4. Folha de Pontuação exemplo usada para gravar dados de ensaio de sangue-alimentação adulto. Doses típicos usados para testar produtos químicos antagonista de pequenas moléculas como a amitriptilina são 50 µM e 100 µM, 200 µM 400 µM.
Discussion
Inseticidas são ferramentas poderosas para combater doenças transmitidas por mosquitos, como malária25, dengue e Zika26. Inseticida de amplo uso produziu populações de mosquitos que são resistentes ao controle químico, levando ao desenvolvimento de resistência de inseticida, que é considerada a maior ameaça à continuou controle da doença. Na última década tem visto um aumento dramático em populações de Anopheles spp. resistentes aos piretroides sintéticos (SPs) usados em mosquiteiros em África7. Populações de Aedes albopictus, um vetor de dengue e Zika, têm sido relatados na Flórida e Nova Jersey, que são resistente a organofosforados6. Da mesma forma, a resistência ao DDT e piretroides tem sido documentada em populações de Anopheles e Aedes spp. na Colômbia27,28. Há necessidade urgente de desenvolver novas larvicidas e adulticides que se ligam a diverso orthosteric ou alostéricos sites em alvos moleculares conhecidos ou que perturbam novos alvos (i.e., romance químicos de MoA)29,30 e têm um impacto ambiental mínimo. Existe também uma crescente reconhecimento do potencial em torno de Endectocidas para mosquito controle31,32,33.
Para facilitar o rápido desenvolvimento de tais produtos, nós descrevemos uma série de protocolos para avaliar a toxicidade de produtos químicos pequena molécula de larvas de mosquito e adultos através de duas rotas de entrega - contato e ingestão. Protocolos como o teste de sensibilidade do WHO e o ensaio de garrafa do CDC são de uso comum para avaliar a toxicidade e repelência de formulações insecticidas existentes1,,2. No entanto, estes ensaios têm limitações para as análises de entidades químicas romance unformulated (NCEs) e não são passíveis de testar um grande número de produtos químicos em moderada ou alta taxa de transferência.
Aqui descrevemos um ensaio larval padrão para avaliar rapidamente NCEs na dose do único ponto que pode ser dimensionado para análises de alta taxa de transferência. Também descrevemos uma adaptação de um ensaio desenvolvido pelo LITE21 para avaliar a toxicidade de contato de químicas pequena molécula aos mosquitos adultos. Finalmente, descrevemos um ensaio de ingestão para avaliar a toxicidade de NCEs entregadas via a refeição de sangue para mosquitos fêmeas adultos e explorar potenciais Endectocidas. Estes ensaios de larvas e adultos podem ser realizados em um intervalo de doses para determinar valores de LC e LD, respectivamente, e ensaios de contato larvas e adultos podem ser realizados em comparação com um ou mais formulações químicas existentes. O ensaio adulto tópico também permite o cálculo dos valores LD por mosquito individual. Os protocolos podem ser executados usando espécies de Aedes, Anopheles e Culex16,29 e podem ser modificados para acomodar as características biológicas específicas de uma espécie, se desejado. Em nossa experiência, medicina químicas normalmente apresentam ampla atividade através destes três gêneros de16,29, mas não há valor para avaliação da seletividade de espécies.
Os ensaios são um ponto de partida para vários produtos químicos para atividade inseticida de tela rapidamente. Aqueles que apresentam toxicidade em um ou mais ensaios químicos poderiam ser selecionados para mais análises através de ensaios secundários e terciários. Exemplos incluem o ensaio do Tarso LITE e açúcar alimentando ensaios34,35. A seleção dos ensaios adicionais normalmente é determinada por considerações em torno do mercado antecipado e aplicação, com resultados fornecendo insights para modos de entrega de produto possível. Os resultados representativos mostrados aqui, nós exploramos a toxicidade da amitriptilina, um antagonista dos receptores de dopamina mamíferos e invertebrados que foi avaliado pelo potencial como um romance MoA inseticida10,12, 13 , 16. amitriptyline exibiu toxicidade para larvas e adultos de Ae. aegytpi em sugerir a gama de μg larvicidal adulticidal atividade e fornecer lógica para uma exploração de uma série de química baseados em amitriptilina para identificar análogos com alta potência. Nenhum efeito significativo na mortalidade ou fecundidade foi observado em Ae. aegypti expostas a amitriptilina na refeição de sangue. Enquanto a estabilidade da química no sangue desfibrinado e dose efetiva recebidas por mosquito não é conhecida, notáveis limitações do ensaio, os dados sugerem que amitriptilina e outros compostos ativos GPCR podem ter pouco potencial como Endectocidas, no pelo menos em estado unformulated.
Precauções para limitar a variação biológica entre ensaios são essenciais. Todos os ensaios devem ser realizados sob condições normais de temperatura e umidade, de preferência em uma câmara de crescimento de insetos, a fim de garantir a reprodutibilidade. É imperativo para padronizar procedimentos para marcar pontos de extremidade fenotípicos como estes podem ser altamente subjetivos, levando a uma variação significativa nos dados gravados pelo pessoal do laboratório diferente. O ensaio larval é mais adequado para avaliação de produtos químicos que são solúveis em água, embora o ensaio pode ser executado utilizando solventes orgânicos como DMSO, desde que a concentração final é menos de 1% por poço. Reconhecemos várias limitações para o ensaio da tópica adulto. Em primeiro lugar, é necessário trabalhar rapidamente quando preparar diluições em série e entregar doses como a transportadora (acetona) é altamente volátil e evaporação pode produzir variação na quantidade de química entregues. Em segundo lugar, deve-se ter cuidado para limitar o período de anestesia como isto pode contribuir para a mortalidade. Também deve ser notado que solventes como acetona podem produzir um efeito "knock-down" rápido nas primeiras horas do ensaio tópica, que não deve ser confundido com efeitos devido à química teste vários. Notamos que o volume da refeição de sangue mosquito varia entre indivíduos, complicando a avaliação da dose recebida por adulto no ensaio de ingestão adulto. Finalmente, dados de ensaio não devem ser considerados em casos onde a mortalidade no controle negativo superior a 10%.
Produtos que actuam de forma sinérgica são cada vez mais reconhecidos por seu potencial para estender a utilidade dos produtos existentes e fornecer controle de populações de pragas resistentes ao inseticida15,16,36. Ensaios larvas têm sido utilizados para examinar o sinergismo entre o pesticida formamidina, amitraz e uma variedade de produtos químicos que perturbam octopamina invertebrados receptores14,15. O ensaio larval e adulto ensaio tópico descritas são adequados para avaliar os efeitos sinérgicos ou aditivos entre combinações de teste químicas. Notamos que os agentes sinérgicos como Butóxido de piperonila (PBO) podem ser incorporados em cada um dos três ensaios descritos aqui.
Os ensaios acima descritos fornecem uma série experimental padronizada para avaliação de drogas unformulated, pequena molécula contra estágios de vida do mosquito aquáticos e terrestres. Estes ensaios são projetados especificamente para avaliar a toxicidade e oferecem várias vantagens sobre existentes ensaios em comum uso. Importante, os ensaios são passíveis de automação e podem ser realizados em escala industrial, para permitir a avaliação de milhares de compostos de teste. Por último, como o campo considera o desenvolvimento de produtos que atuam através do novo MoAs, incluindo através de rompimento de novos alvos moleculares e vias bioquímicas, será essencial para marcar vários pontos de extremidade fenotípicos para além dos tais como mortalidade e paralisia. Os ensaios acima permitem tais investigações, proporcionando assim um passo para tecnologias de inseticida altamente inovadoras de amanhã.
Disclosures
Os autores declaram não há conflitos de interesse.
Acknowledgments
Os autores agradecer H. Ranson, escola Liverpool da Medicina Tropical para obter assistência com desenvolvimento de ensaio e disposição do protocolo LITE, e design de M. Scharf, Universidade de Purdue para Conselho a respeito do ensaio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Insecticide susceptible mosquito strains | Malaria Research and Reagent Reference Repository | https://www.beiresources.org/MR4Home.aspx; Recommended strains: Aedes aegypti Liverpool (LVP) strain, Anopheles gambiae Kisumu (KISUMU1) strain and Culex quinquefasciatus Johannesburg (JHB) strain | |
| Acetone | Mallinckrodt Chemical | CAS 67-64-1 | Use for dilutions and control |
| Amitraz | Sigma-Aldrich | CAS 33089-61-1 | Requires dilution in DMSO |
| Amitriptyline | Sigma-Aldrich | CAS: 549-18-8 | Can be diluted in acetone |
| Bifenthrin | Sigma-Aldrich | CAS: 51529-01-2 | Synthetic pyrethorid used as positive control |
| Cis-(Z)-flupenthixol | Sigma-Aldrich | CAS: 51529-01-2 | Pharmacologically tested as disruptor of dop-like receptors |
| Defibrinated rabbit blood | Hemostat | DRB0100 | Blood source for adapted mosquitoes to artificial feeding |
| Dimethylsulphoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | MKBF2985 | Organic solvent used to disolve amitraz |
| Hemotek membrane feeding system | Hemotek Ltd | Serial no. 1303 | Used for feeding mosquitoes |
| Micro-applicator | Burkard Manufacturing Co. | - | Tool needed for topical application experiments |
| 24-well cell culture plate with lid | Corning Incorporated | 3526 | - |
| Advantage rubber bands | Alliance Rubber Co. | - | Used to seal the paper cups |
| Glass syringe (1 ml) | Becton Dickinson and Co. | 512004 | Needed for the micro-applications. Glass is better than plastic |
| Disposable scintillation vials (20 ml) | Fisher Scientific | 74505-20 | Glass vials prevent evaporation |
| Tulle fabric, white | Walmart | - | - |
| Paper cups | Dixie Consumer Products LLC. | PF15675/13D | Used to keep adult mosquitoes in adult topical assays |
| Petri dishes (150 mm) | Corning Life Sciences | - | Used to maintain the mosquitoes "slept" on cold without direct contact with ice |
| Transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | Used to sort larvae |
| Stereo microscope | Olympus | SZ6045 | Used to score larval assays and perform micro-applications |
| Tweezers (fine) | Fontax | - | Used to handle adult mosquitoes |
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