Summary
介绍了评估化学物对未成熟蚊子和成年蚊子对发育的毒性的协议, 作为新型杀幼剂、掺假剂和内杀剂。该协议能够在单点剂量下对多种化学物质进行高通量测试, 并随后通过剂量反应分析进行评估, 以确定接触或摄入时的毒性。
Abstract
需要新型杀虫剂, 采用新的行动模式, 以控制传播寨卡、登革热和疟疾等疾病的蚊子的杀虫剂耐药人群。对未配制的新型化学体对蚊虫幼虫和成虫进行快速、高通量分析的方法提出了。我们描述了单点剂量和剂量反应检测的方案, 以评估小分子化学对寨卡伊蚊病媒介、登革热和黄热病、疟疾媒介、冈比亚按蚊和北部的毒性。家蚊,库蚊,接触和通过摄入。例如, 我们通过幼虫、成虫外用和成虫血液喂养试验, 评估了 g 蛋白偶联受体的小分子拮抗剂阿米替林的毒性。这些议定书为研究杀虫剂的可能性提供了一个起点。在其他实验的背景下讨论了结果, 以探讨产品应用和交付机制。
Introduction
蚊子传播影响全球人类健康的传染病的病原体1。影响人类健康的三个最重要的蚊子属是伊蚊、按蚊和库蚊。伊蚊种类传播导致寨卡、登革热、黄热病和基孔肯雅热的弓形虫病毒。按蚊传播疟原虫和库蚊传播西尼罗河病毒和丝虫病线虫2。世界卫生组织 (世卫组织) 呼吁到 2020年消除10 种被忽视的热带病 3, 并将灭蚊确定为最可行的战略。杀虫剂是控制蚊子和减少疾病传播的有力工具 4,5。然而, 抗虫蚊子种群的出现威胁到许多疾病的持续控制 6、7、8。创新病媒控制联合会 (ivcc) 发起了开发用于蚊虫控制的替代杀虫剂的首次专门工作9。需要使用具有新作用模式的新杀虫剂, 以实现世卫组织的目标和疾病控制。新的杀虫剂类别的发现和开发与新型 moa 要求进行全生物体检测, 以便对化学品进行快速、高通量的分析, 并与行业标准10进行比较。
可进行多重检测, 以评估杀虫剂对幼虫和成虫的驱避性和毒性, 其中一些是适用于评估新配方或未配方的化学品。世卫组织第11号议定书是一种接触检测方法, 用于对产品进行与第四幼虫的检测。发表的研究还描述了用于测试小分子化学对埃及伊蚊、冈比亚金银花和五库福菌幼虫毒性的各种幼虫检测方法 ,13,14,15,16。疾病控制和预防中心 (cdc) 瓶生物测定用于评估在现场捕获的成年蚊子人群中的杀虫剂耐药性, 通过评估致命浓度 (lc) 和致命时间 (lt) 与标准诊断相比商用杀虫剂的剂量17。世卫组织的易感试验提供了另一种方法来评估成年蚊子对杀虫剂的抗药性, 即蚊子在玻璃瓶内接触杀虫剂浸渍纸 1小时, 死亡率评估为 24小时18。其他检测配方在密封的笼子内喷洒, 并记录蚊子击倒和死亡在所需的时间点19。局部应用于蚊虫胸腔已被用于评价不同农药的药效 20。利物浦昆虫检测机构 (lite)21采用标准作业程序来评估化学对成年蚊子的生物活性。lite 成人局部检测将少量的检测产品应用于成人蚊子的胸部, 死亡率为48小时。该检测方法可对每只蚊子21的剂量进行定量。lite 表面分析评估了试验产品对位于经过化学处理的表面上的成年蚊子的毒性, 并用于确定有可能发展为室内残留喷剂 (irs) 或用于杀虫剂处理过的蚊帐 (itn) 的化学物质来控制按蚊
世卫组织和疾控中心的检测方法在测试新型非配方化学品方面有局限性, cdc 瓶生物测定的目标是在较短的检测周期 (两小时) 内评估敏感性, 而不是评估毒性 22,23。此外, 缺乏用于评估血粉中提供的化学物质的毒性和开发系统作用产品 (即内杀菌剂) 的潜力的检测方法。在这里, 我们描述的检测检测蚊子活性的新型化学剂是溶于水或几种有机溶剂之一的对幼虫和成虫, 按蚊和库蚊。首先, 我们演示了一个幼虫试验,我们的小组先前描述的 10,12, 13, 16, 并在这里执行作为 (1) 一个屏幕, 以快速评估多个化学在单点剂量,和 (2) 剂量反应测定, 以确定单个化学的致死浓度 (例如 lc 50、 lc75或 lc90)。接下来, 我们将描述两个用于测定致死剂量 (ld) 的成人检测方法。首先是对 lite 协议的改编, 该协议对局部应用的、新颖的化学体与阳性对照进行了测试。第二是喂养试验, 用于评估通过血粉系统提供的化学药品。
Protocol
注: 以下规程中描述的工作所需的所有菌株和试剂以及供应商都列在材料表中。
1. 蚊虫幼虫和成人的养殖
注: 杀虫剂易感的蚊虫菌株可从疟疾研究和试剂参考资料库中获得。推荐菌株如下:埃及伊蚊利物浦 (lvp) 菌株,冈比亚木木按蚊 (kisumu1) 菌株和约翰内斯堡库蚊(jhb) 菌株。
- 如 nuss29所述, 在25°c 和75-85 相对湿度 (rh) 的12小时夜间循环中, 在25厘米 x40 厘米塑料托盘 (每个托盘 ~ 400 幼虫) 中培养鸡蛋中的蚊虫幼虫。喂养幼虫地面沙鼠 (埃及和冈比亚) 或片状鱼类食品 (鱼)。对于幼虫检测, 在第三幼虫阶段收集幼虫。
- 在上述条件下, 从中转移到塑料杯中, 放在 2 0 升塑料笼子内的中, 后部的成年蚊子。如其他地方所述, 保持20% 糖溶液中的蚊子。收集成人在3-5天后出现。
2. 幼虫接触检测 (单点剂量或剂量响应检测)
注: 该检测可使用溶于水或二甲基亚硫酸盐 (dmso) 的化学药品进行, 条件是测试井中 dmso 的最终浓度不超过1%。替代溶剂可能是一种选择, 但必须首先确认, 在接触后 72小时, 最终浓度不会造成超过10% 的死亡率。该检测可作为单点剂量或剂量反应分析进行。如果执行后者, 建议测试范围内的浓度 (最少 5), 跨越预期的 lc50。
- 标记透明的24孔纸巾板的井, 如图 1所示。
- 在 1.5 ml 管中准备测试化学的库存解决方案。
- 使用分析天平称量每种化学物质, 并根据溶解度特性, 在无菌 dh2o、dmso 或其他合适的有机溶剂中重新悬浮 (见图 2)。
注: 计算应考虑到化学的纯度。例如, 对于99% 纯的化学物质, 在 1, 000μl 丙酮中溶解10.1 毫克, 以获得1% 的溶液。用石蜡薄膜密封, 存放在-20°c。
- 使用分析天平称量每种化学物质, 并根据溶解度特性, 在无菌 dh2o、dmso 或其他合适的有机溶剂中重新悬浮 (见图 2)。
- 确定将进行评估的测试化学的最终浓度, 并使用适当的溶剂从库存溶液中相应地制备连续稀释剂。
注: 化学和溶剂的浓度和体积可以用公式 c1 * v 1= c2* v 2 计算, 其中 c 1 = 样品1的浓度, c 2 = 样品浓度 2, v1=样品1和 v2 =样品2的体积。请参见图 2和表 1中所示的示例计算。- 根据需要准备 10 mm 库存溶液和串行稀释剂, 以获得所需的测试浓度 (表 1b)。
- 利用宽孔塑料转移移液器, 将 5个 l3 幼虫转移到组织培养试验板的井中;l3 幼虫可以通过长度 (~ 2.5-3.5 毫米) 和头部囊宽度识别 ~ 0.2525 毫米24。用1毫升移液器轻轻取水, 更换所需的 ddh2o体积(见下文)。重复每次处理获得 n = 4个技术复制 (即每次处理总有20个幼虫)。
- 在24井试验板中的四个复制井中的每一个中添加适当的测试化学量, 并轻轻旋流板, 以确保化学的均匀混合。将板材放置在恒定条件下的试验或生长室 (例如,建议使用25°c 和 ~ 75-85 rh, 如果可能的话, 采用12小时光/12小时的暗周期)。
注: 为了实验之间的重现性, 请确保在相同的环境条件下进行后续检测。 - 记录每口井中无死亡/无反应幼虫的数量, 记录在接触后30分钟、1、1.5、2、3、24、48和 72小时 (或替代时间点) (表 2)。轻轻轻点盘子的侧面。如果没有观察到任何运动, 用无菌牙签轻轻触摸幼虫。得分幼虫, 不响应的塔平触摸作为 "死"。
注: 其他形态和行为表型可以观察到, 并可以记录。 - 如果需要, 使用修改后的 abbott 公式来控制死亡率是正确的, 如下所示:
死亡率 (%) = (x-y) * 100/(100-Y),
其中 x = 处理样本中的死亡率百分比, y = 对照组中的死亡率百分比。 - 图形的结果作为直方图或对数曲线使用软件的选择, 如石墨垫棱镜6或类似, 并计算致命浓度 (lc) 值相对于控件。
- 使用单独的一批蚊子重复检测, 以获得 n = 3 或更多的生物复制。
3. 成人局部检测 (单点剂量或剂量反应检测)
注: 成人局部检测是使用丙酮作为溶剂进行的。替代溶剂可能是一种选择, 但必须首先确认最终浓度在接触48小时后不会造成超过10% 的死亡率。该检测可作为单点剂量或剂量反应分析进行, 并用于确定致死剂量 (ld)。如果执行后者, 建议测试范围内的浓度 (至少 5), 跨越预期的 ld50。
- 确定完成检测所需的成年雌性蚊子的数量。
注: 单种化学的点剂量检测至少需要90只蚊子 (30 种用于阳性对照, 30 种用于丙酮阴性对照, 30 种用于测试化学)。 - 培养3至5天龄的成年雌性蚊子, 并使用吸入器转移到单独的20毫升塑料桶 (图 3)。
- 标签9盎司纸杯的名称和浓度的测试化学。为每个杯子放置10厘米 x 10 厘米的网格方块和橡皮筋 (见图 4)。
- 选择现有杀虫剂作为阳性对照 (例如,合成拟除虫菊酯、双氟菊酯), 并在丙酮中制备1% 的库存溶液 (10μμl)。
注: 计算应考虑到化学的纯度。例如, 对于99% 纯的化学物质, 在 1, 000μl 丙酮中溶解10.1 毫克, 以获得1% 的溶液。用石蜡薄膜密封, 存放在-20°c。 - 使用与上述相同的过程, 准备测试化学的库存解决方案。
注: 许多测试化学品是高度不稳定的, 解决方案最好是在每次进行生物测定时都要新鲜。 - 准备从库存溶液中提取阳性控制和测试化学品的连续稀释, 如图 5所示, 使用以前用丙酮冲洗的20毫升玻璃瓶。
- 清除1毫升的丙酮玻璃注射器, 用丙酮填充, 并固定在调整后的微涂抹器中, 以提供0.25μl 的体积。
- 成批工作的 10, 使用吸入器将3-5天的成年雌性蚊子从笼子里取出, 并在冰箱或冰上的4°c 下麻醉5分钟。接下来, 将蚊子转移到培养皿中, 放在冰上长达 1 0分钟。
- 快速工作, 用精细的推子取出单个女性, 并使用注射器微涂抹器将0.25 微米的测试溶液应用到胸背。用解剖显微镜观察确认化学的传递, 以确保每只蚊子都能得到适当的测试化学量。
- 将蚊子转移到贴有标签的纸杯上, 在冰上休息, 并重复 9次, 以获得 n = 10只经过处理的蚊子。用橡皮筋固定的网状方块密封杯子中的蚊子, 并在28°c 和75-85 的恒温下转移到塑料桶或生长室 (在12小时的夜间周期内)。
- 重复上述实验两次, 以获得 n = 3个技术复制 (即, 总共30个蚊子) 每个治疗或控制组。
- 首先用测试化学重复步骤 3.7-3.10, 然后进行阳性控制。
注: 如果有足够的蚊子, 另一个有用的控制措施是30个未接受测试化学或溶剂的麻醉蚊子的 "空白"。 - 使用记分表记录 "无死亡/无反应" 蚊子的数量, 记录在接触后30分钟、60分钟、24小时和 48小时 (或替代时间点) (表 3)。如果蚊子表现出缺乏动作, 则将其打分为 "无反应", 定义为躺在一边或背上, 无法飞行。
- 如果需要, 请使用修改后的 abbott 公式更正控制死亡率, 如下所示:
死亡率 (%) = (x-y) * 100/(100-Y),
其中 x = 处理样本中的死亡率百分比, y = 对照组中的死亡率百分比。 - 将结果显示为直方图或指数曲线。对于剂量响应分析, 计算测试化学相对于对照的ld50、ld75或 ld90值。
- 重复检测至少两次使用单独批次的蚊子, 以获得 n = 3 或更多的生物复制。
4. 成人送血试验 (单点剂量或剂量反应测定)
- 收集大约 150个4-5 的成年雌性蚊子, 并转移到一个单独的笼子。如果进行剂量反应分析, 重复使用6个网箱。在喂养试验前1-24 去除糖的来源。
- 按上述方式制备化学库存溶液, 说明化学的纯度 (典型的库存溶液在水或盐缓冲液中为 80 mm), 然后根据需要在水缓冲液中制备连续稀释剂。
- 在960μl 的脱颤兔血液中加入 40μl, 以获得所需的检测浓度。将膜膜涂在进料装置上, 并用橡胶圈密封。通过移液器输送1毫升血液, 并将喂养装置连接到加热装置。
- 用新鲜制作的10% 乳酸溶液轻轻擦拭膜表面, 并将喂养单元放入成年蚊子的笼子中。用黑布或黑色垃圾袋覆盖笼子, 让蚊子喂一个小时。
- 对测试解决方案的其余部分和阴性 (仅限血液) 控制重复步骤 4.2-4.4。
- 喂养结束后, 将桶置于4°c 的冰箱中 5分钟, 以麻醉蚊子。清除雄性蚊子和无喂养的雌性蚊子, 并通过腹部检查, 统计和记录喂食蚊子和部分喂养蚊子的总数。
- 保留部分和完全喂养的雌性蚊子, 目标是每剂量至少有50只血液喂养的蚊子。
- 在28°c 和75-85% 的恒温下 (12小时至12小时的夜间循环), 将铲斗转移到塑料桶或生长室。
- 使用记分表记录0.5、1、1.5、2、24、48和72小时 (或所需的替代时间点) 的死/无反应蚊子总数 (表 4)。
- 在进食后的第三天, 将一个蛋杯引入笼子, 并在72小时内收集鸡蛋。在解剖显微镜下计算每次处理产生的鸡蛋总数。
- 计算每个治疗组的死亡率和繁殖力百分比, 作为每个治疗组和对照的喂养蚊子总数的函数。如果需要, 使用修改后的 abbott 公式来控制死亡率是正确的。
- 使用所选软件将毒性和繁殖力数据显示为直方图图或指数曲线 (如果执行剂量响应分析)。如果进行剂量响应分析, 则计算测试化学相对于对照的 ld50、ld 75或 ld90值。
- 重复检测至少两次使用单独批次的蚊子, 以获得 n = 3 或更多的生物复制。
Representative Results
图 6显示了埃及 l3 e . aegypti 在接触5剂多巴胺受体拮抗剂 (胺联替林) 后的死亡率百分比, 而在24、48和72小时仅对水 (阴性) 对照。在本例中, 在每个时间点收集的数据显示一个典型的对数曲线, 并揭示了阿米替林对幼虫死亡率的剂量依赖性效应。lc50值在实验过程中减小, 可以使用72小时数据 (即对数曲线的中点) 进行计算。
图 7显示了3-5天龄成年雌性埃及埃及埃及人在接触多巴胺受体拮抗剂 (胺吡啶) 的400μgμμl 后的死亡率百分比, 并与合成拟除虫菊酯进行了比较,双氟菊酯阳性对照 (技术级; 500 pgμμl)、仅有丙酮阴性的对照和未经处理的蚊子 (空白)。在这个例子中, 阿米替林和双氟菊酯都会引起明显的成人死亡率相对于负对照。请注意, 成人死亡率会随着时间的推移而降低, 可能是由于测试化学品的代谢解毒所致。
图 8显示了3-5天成年女性埃及埃及人的死亡率百分比 (左 y 轴), 用四剂多巴胺受体拮抗剂之一 (阿米替林) 和繁殖力 (右 y 轴; 平均蛋重/女性) 为第一个促性腺激素周期暴露与控制蚊子比较 (仅血液喂养; 负对照)。数据显示, 与对照相比, 阿米替林对成人死亡率没有显著影响, 但表明阿米替林在最高剂量 (400μm) 下显著增加了繁殖力。
图 1.幼虫剂量反应试验的建立.显示使用埃及伊蚊l3 幼虫在24孔板中进行的幼虫剂量反应检测的设置。
图 2.在24井板中建立 (a) 单点剂量或 (b) 剂量反应幼虫试验的示意图.在将 5个 l3 幼虫转移到水井后, 多余的水通过移液器轻轻去除, 取而代之的是新鲜的无菌 ddh2o.接下来, 制备了测试化学的库存和连续稀释剂, 并将其添加到 1 ml/井的最终体积中。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3.成年蚊子的文化.图片显示用于培养成年蚊子和使用吸入器去除蚊子的20升塑料桶.
图 4.使用4-5 的雌性埃及伊蚊进行成人外用检测.在化学或溶剂治疗后, 成年蚊子被放置在纸杯中, 并在检测期间转移到试验室。
图 5.库存和连续稀释.示意图, 显示成人局部检测的 (a) 库存和 (b) 系列检测解决方案的制备过程。请点击这里查看此图的较大版本.
图 6.来自幼虫接触剂量反应分析的代表性数据.幼虫接触剂量反应分析的代表性数据显示,埃及伊蚊l3 幼虫在暴露于多巴胺受体拮抗剂阿米替林后, 在24小时、48小时和72小时死亡的百分比。每个数据点表示μm±sem 中的平均值. 数据表示 n = 3个生物复制。
图 7.成人局部剂量反应分析的代表性数据.成人局部剂量反应分析显示多巴胺受体拮抗剂阿米替林 (10μμl) 对3-5天龄女性埃及伊蚊相对于合成拟除虫菊酯的毒性的代表性数据, 双氟菊酯 (500 pg/μl) 阳性控制) 和负控制 (仅限丙酮车), 在2小时、24小时和 48小时内.数据表示 n = 3个生物复制。错误条表示 sem。
图 8.成人摄入检测的代表性数据.成人摄入分析显示多巴胺受体拮抗剂、阿米替林在100μm、200μm 和400μm 剂量对3-5天成年成年雌性埃及伊蚊的毒性以及对生育力的影响 (以平均总卵表示) 的代表性数据在第一个淋病周期中, 每只雌性的计数)。数据表示 n = 3个生物复制±sem。
| a. 三种化学剂的单点剂量检测 | |||||
| 化学 | 浓度 (400 公里) | ||||
| 阿米 替 林 | 80 mm 库存: 2 毫克阿米替林 x 98% (粉末纯度) x 0.001 g\ 1 mg x 1 mol/313.86 g x 1 l1 lcp. 08 mol x 10μll = 78.06 微米的水。 | ||||
| 系列稀释:稀释库存 1: 2 与 ddh2o,然后 1: 4, 以达到 10 mm。在含有960μl 的 ddh 2 0 的井中加入40μl 的10 mm, 最终浓度为400μmc\ 井。 准备 10 mm 库存的串行稀释 1:2, 以实现 5 mm、2.5 mm、1.25 mm 和 0.625 mm 库存。 | |||||
| cis-(z)-氟本硫索 | 80 mm 库存: 2 毫克 cis (z) flupenthixol x 98% (粉末纯度) x 0.001 g\ 1 mg x 1 momos507.44 g cis (z) flupenthixol x 1 | ||||
| 系列稀释:如上。 | |||||
| 阿米特拉兹 | 80 mm 库存: 2 毫克 amitraz x 0.001 g/1 1 mg x 1 morsp 293.4 g 的 amitraz x 1 ls106μl/1 l = 85 x21 μl dmso (注: amitraz 仅溶于 dmso)。 | ||||
| 系列稀释:如上。 | |||||
| b. 剂量反应分析 | |||||
| 化学 | 剂量1 | 剂量2 | 剂量3 | 剂量4 | 剂量5 |
| 400μm | 200μm | 100μm | 50μm | 25μm | |
| 例如, 阿米替林、顺式 (z)-氟本硫索或阿米特拉兹 | 40μl | 40μl | 40μl | 40μl | 40μl |
| 10 mm 库存 | 5 mm 库存 | 2.5 mm 库存 | 1.25 mm 库存 | 0.625 mm 库存 | |
表1。埃及伊蚊 l3 幼虫 (a) 单点剂量试验和 (b) 剂量反应试验的实例计算。
表2。用于记录蚊子幼虫剂量反应分析数据的示例评分表.控制, 仅用水或水与 1% dmso 或其他溶剂只。用于测试小分子拮抗剂化学的典型剂量为25μm、50μm、100μm、200μm 和400μm。
| 蚊虫成人 (3-5天) 局部检测 | ||||||
| 开始日期: | ||||||
| 侦探： | ||||||
| 特殊应变: | ||||||
| 检测类型:单点剂量反应 | ||||||
| a. 死亡率 (否)。死蚊子) | ||||||
| 时间 (小时) | 剂量1 | 剂量2 | 剂量3 | 剂量4 | 剂量5 | 控制 |
| 0。5 | ||||||
| 1 | ||||||
| 1。5 | ||||||
| 2 | ||||||
| 2。5 | ||||||
| b. 死亡率 | ||||||
| 时间 (小时) | 剂量1 | 剂量2 | 剂量3 | 剂量4 | 剂量5 | 控制 |
| 0。5 | ||||||
| 1 | ||||||
| 1。5 | ||||||
| 2 | ||||||
| 2。5 | ||||||
表 3.用于记录成人局部剂量反应分析数据的示例评分表.
| 蚊虫成人 (3-5天) 摄入检测 | ||||||
| 开始日期: | ||||||
| 侦探： | ||||||
| 特殊应变: | ||||||
| 检测类型:单点剂量反应 | ||||||
| a. 数量美联储蚊子 | ||||||
| 剂量1 | 剂量2 | 剂量3 | 剂量4 | 剂量5 | 控制 | |
| 美联储 | ||||||
| 不需要美联储 | ||||||
| 总 | ||||||
| % 美联储 | ||||||
| % 不美联储 | ||||||
| b. 死亡率 (否)。死蚊子) | ||||||
| 时间 (小时) | 剂量1 | 剂量2 | 剂量3 | 剂量4 | 剂量5 | 控制 |
| 2 | ||||||
| 24 | ||||||
| 48 | ||||||
| 72 | ||||||
| c. 死亡率 | ||||||
| 时间 (小时) | 剂量1 | 剂量2 | 剂量3 | 剂量4 | 剂量5 | 控制 |
| 2 | ||||||
| 24 | ||||||
| 48 | ||||||
| 72 | ||||||
表4。用于记录成人血液喂养试验数据的示例记录表.用于测试小分子拮抗剂化学的典型剂量为50μm、100μm、200μm 和400μm。
Discussion
杀虫剂是防治疟疾25、登革热和寨卡26等蚊媒疾病的有力工具.广泛使用杀虫剂产生了对化学控制具有抗药性的蚊子种群, 导致产生了对杀虫剂的抗药性, 这被认为是对持续疾病控制的最大威胁。在过去十年中, 对非洲蚊帐中使用的合成拟除虫菊酯 (sp) 具有抗性的按蚊数量急剧增加.据报道, 在佛罗里达州和新泽西, 白纹伊蚊是登革热和寨卡的媒介, 对有机磷具有抗药性.同样, 哥伦比亚的按蚊和伊蚊群体中也有对滴滴涕和除虫菊酯的抗药性, 有 27,28.迫切需要开发新的杀幼剂和掺假物, 这些杀幼剂和掺假剂结合在已知的分子靶点上, 或破坏新的目标 (即新型 moa 化学体)29、30和对环境的影响最小。人们也日益认识到, 在控制蚊虫方面, 有可能使用内杀剂控制 31、32、33.
为了促进此类产品的快速发展, 我们描述了一系列旨在通过接触和摄入这两种输送途径评估小分子化学对蚊子幼虫和成虫的毒性的协议。世卫组织药敏试验和 cdc 瓶检测等协议通常用于评估现有杀虫制剂1,2的毒性和驱血性。然而, 这些检测对于未配制的新型化学实体 (nces) 的分析有局限性, 并且不适合在中等或高吞吐量下测试大量化学物质。
在这里, 我们描述了一个标准的幼虫检测, 以单点剂量快速评估 nce, 可以缩放为高通量分析。我们还描述了 lite21开发的一种检测方法的适应性, 该方法用于评估小分子化学对成年蚊子的接触毒性。最后, 我们描述了一种摄入检测方法, 以评估通过血粉传递的 nce 对成年雌性蚊子的毒性, 并探索潜在的致虫药。这些幼虫和成虫检测可以在一系列剂量下进行, 以便分别确定 lc 和 ld 值, 幼虫和成人接触检测可以与一个或多个现有化学制剂进行比较。成人局部检测还可以计算单个蚊子的 ld 值。这些协议可以使用伊蚊、按蚊和库蚊16、29的物种来执行, 如果需要, 可以进行修改, 以适应物种的具体生物特征。根据我们的经验, 蚊子的化学通常表现出广泛的活性, 在这三个属16,29, 但有价值的物种选择性评估。
该检测是快速筛选多种化学物质的起始点, 用于杀虫活性。那些在一种或多种检测中表现出毒性的化学品可以通过二次和三级检测进行进一步分析。这方面的例子包括 lite 颅骨试验和 34,35的糖喂养试验.额外检测的选择通常取决于围绕预期市场和应用的考虑因素, 其结果为可能的产品交付模式提供了见解。在这里显示的代表性结果中, 我们探讨了阿米替林的毒性, 阿米替林是哺乳动物和无脊椎动物多巴胺受体的拮抗剂, 被评估为一种新型的 moa 杀虫剂10,12的潜力,13,16. 阿米替林在微克范围内对埃及的幼虫和成虫表现出毒性, 表明其杀虫和杀虫活性, 并为探索阿米蒂以的化学系列以确定其毒性提供了理由。具有很强效力的类似物。在血液中暴露于阿米替林的埃及人身上, 没有观察到对死亡率和繁殖力的显著影响。虽然不了解除颤血液中化学的稳定性和每只蚊子收到的有效剂量, 但该检测的明显局限性, 数据表明, 阿米替林和其他 gpcr 活性化合物作为内杀剂可能没有什么潜力,至少在未制定的状态。
限制检测之间的生物变异的预防措施是必不可少的。所有检测应在标准的温度和湿度条件下进行, 最好是在昆虫生长室, 以确保重现性。必须规范表型终点评分程序, 因为这些程序可能具有很强的主观性, 导致不同实验室人员记录的数据发生重大差异。幼虫检测最适合于评价溶于水的化学物质, 但该检测方法可使用 dmso 等有机溶剂进行, 前提是最终浓度低于每口水1%。我们认识到成人局部检测的几个局限性。首先, 在制备连续稀释剂和作为载体 (丙酮) 提供剂量时, 必须快速工作, 蒸发可能会产生化学量的变化。其次, 应注意限制麻醉时间, 因为这会导致死亡。还应该注意的是, 像丙酮这样的溶剂可以在局部检测的前几个小时产生快速的 "击倒" 效应, 这不应该与测试化学引起的效果相混淆。我们注意到, 蚊子血粉的体积因个人而异, 使成人摄入检测中对每个成人的剂量的评估复杂化。最后, 在阴性对照中的死亡率超过10% 的情况下, 不应考虑检测数据。
人们日益认识到, 协同作用的产品有可能扩大现有产品的效用, 并控制 15、16、36种具有杀虫剂耐药性的害虫种群.幼虫检测已被用来检测甲胺类农药, 阿米特拉兹和各种化学破坏无脊椎动物章鱼胺受体14,15之间的协同作用。所描述的幼虫试验和成虫外用试验方法适用于评价试验化学品组合之间的协同作用或加性作用。我们注意到, 可将丁氧基吡咯烷酮 (pbo) 等协同剂纳入此处描述的三项检测中的每一种。
上述检测为评价未配制的小分子药物对抗水生和陆生生命阶段提供了标准化的实验系列。这些检测是专门为评估毒性而设计的, 与常用的现有检测方法相比, 具有多种优势。重要的是, 该检测方法易于自动化, 可在工业规模上进行, 以便对数千种测试化合物进行评估。最后, 当该领域考虑通过新的 moa 起作用的产品的开发时, 包括通过破坏新的分子目标和生化途径, 除了死亡率和死亡率等外, 还必须对多个表型终点进行评分。瘫痪。上述方法允许进行此类调查, 从而为明天高度创新的杀虫技术迈出了一步。
Disclosures
提交人声明没有利益冲突。
Acknowledgments
作者感谢利物浦热带医学院 h. ranson 在分析开发和提供 lite 协议方面提供的帮助, 并感谢普渡大学 m. scarf 提供有关检测设计的建议。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Insecticide susceptible mosquito strains | Malaria Research and Reagent Reference Repository | https://www.beiresources.org/MR4Home.aspx; Recommended strains: Aedes aegypti Liverpool (LVP) strain, Anopheles gambiae Kisumu (KISUMU1) strain and Culex quinquefasciatus Johannesburg (JHB) strain | |
| Acetone | Mallinckrodt Chemical | CAS 67-64-1 | Use for dilutions and control |
| Amitraz | Sigma-Aldrich | CAS 33089-61-1 | Requires dilution in DMSO |
| Amitriptyline | Sigma-Aldrich | CAS: 549-18-8 | Can be diluted in acetone |
| Bifenthrin | Sigma-Aldrich | CAS: 51529-01-2 | Synthetic pyrethorid used as positive control |
| Cis-(Z)-flupenthixol | Sigma-Aldrich | CAS: 51529-01-2 | Pharmacologically tested as disruptor of dop-like receptors |
| Defibrinated rabbit blood | Hemostat | DRB0100 | Blood source for adapted mosquitoes to artificial feeding |
| Dimethylsulphoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | MKBF2985 | Organic solvent used to disolve amitraz |
| Hemotek membrane feeding system | Hemotek Ltd | Serial no. 1303 | Used for feeding mosquitoes |
| Micro-applicator | Burkard Manufacturing Co. | - | Tool needed for topical application experiments |
| 24-well cell culture plate with lid | Corning Incorporated | 3526 | - |
| Advantage rubber bands | Alliance Rubber Co. | - | Used to seal the paper cups |
| Glass syringe (1 ml) | Becton Dickinson and Co. | 512004 | Needed for the micro-applications. Glass is better than plastic |
| Disposable scintillation vials (20 ml) | Fisher Scientific | 74505-20 | Glass vials prevent evaporation |
| Tulle fabric, white | Walmart | - | - |
| Paper cups | Dixie Consumer Products LLC. | PF15675/13D | Used to keep adult mosquitoes in adult topical assays |
| Petri dishes (150 mm) | Corning Life Sciences | - | Used to maintain the mosquitoes "slept" on cold without direct contact with ice |
| Transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | Used to sort larvae |
| Stereo microscope | Olympus | SZ6045 | Used to score larval assays and perform micro-applications |
| Tweezers (fine) | Fontax | - | Used to handle adult mosquitoes |
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