Summary
Описываются протоколы для оценки токсичности химия для незрелых и взрослых комаров для развития как новые классы ларвициды, особями и endectocides. Протоколы позволяют высок объём тестирование нескольких химия в одной точке дозы и последующей оценки через дозы ответ анализа для определения токсичности на контакт или проглатывания.
Abstract
Новые классы инсектицидов с роман видов действий необходимы для управления инсектициды устойчивых популяций комаров, которые передают заболевания как Зика, денге и малярия. Анализы для быстрого, представлены высок объём анализ unformulated Роман химия против личинок комаров и взрослых. Мы описываем протоколы для одной точки дозы и дозы ответа анализов для оценки токсичности малые молекулы химия Aedes aegypti вектор Зика, денге и желтая лихорадка, малярия вектор, Anopheles gambiae и Северной Дом комаров, Culex quinquefasciatus, на контакт и через проглатывание. В качестве примера мы оценивали токсичность амитриптилин, антагонистом малые молекулы G белка-рецепторы, через личинок, взрослых актуальные и взрослых крови кормления пробирного. Протоколы обеспечивают отправной точкой для расследования инсектицидами потенциал. Результаты обсуждаются в контексте дополнительных экспериментов для изучения продукта приложений и механизмы доставки.
Introduction
Комары переносчиками возбудителей инфекционных заболеваний, которые влияют на здоровье человека глобально1. Три наиболее важных родов комаров, влияющих на здоровье человека являются Aedes, малярийные комары и Culex. Видов комаров Aedes вектор арбовирусов, которые вызывают Зика, денге, желтой лихорадки и чикунгуньей. Видов Anopheles вектор малярийных паразитов и Culex видов передавать вирус Западного Нила и филярий нематод2. Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) вызываемый 20203 для искоренения из десяти забытых тропических болезней (НТД) и определили комарами как наиболее жизнеспособной стратегии. Инсектицидов являются мощными инструментами для уничтожения комаров и для уменьшения болезни передачи4,5. Однако появление инсектицидами устойчивостью комаров населения угрожает продолжение контроля за многих заболеваний6,,7-8. Инновационные векторного управления консорциума (ИКБП) запустила первый целенаправленные усилия для разработки замены инсектицидов для комаров управления9. Новые инсектициды с роман видов действий (MoA) необходимы для целей ВОЗ и достижения контроля заболеваний. Открытие и разработка новых классов инсектицидов с Роман Моа требуют весь организм анализов для быстрой и высок объём анализа химия и по сравнению с отрасли стандартов10.
Несколько анализов доступны для оценки отталкивающих свойств и токсичность инсектицидов личинок и взрослых комаров, и некоторые из них подходят для оценки романа сформулированы или unformulated химия. ВОЗ протокол11 относится контакт используется для тестирования продуктов против четвертого instar личинки. Опубликованные исследования также описывают разнообразные личиночной анализов используется для проверки на токсичность малые молекулы химия для личинки Aedes aegypti, Anopheles gambiae и Culex quinquefasciatus10,12, 13,14,,1516. Центры по контролю над заболеваниями и профилактике (CDC) бутылка биопроб используется для оценки резистентности к инсектицидам, в поле поймали популяции взрослых комаров через оценку летальная концентрация (LC) и смертоносных время (LT) по сравнению с стандартный диагностический доза в коммерческих инсектицидов17. Испытание восприимчивости ВОЗ предлагает другой подход к оценке инсектицидам в взрослых комаров, whereby комаров подвержены инсектицидом бумаги внутри стеклянных флаконов для 1 h и смертности оценивается в 24 h18. Другие анализы распыления составов внутри закрытой клетки и запись комаров сногсшибательно и смерть желаемого timepoints19. Нанесение на грудную клетку комаров был использован для оценки потенции различных пестицидов20. Создание тестирования насекомых Ливерпуль (LITE)21 использует стандартные оперативные процедурыдля оценки отпорности химия для взрослых комаров. LITE взрослых актуальные assay применяется небольшой объем тестирования продукта к грудной клетки взрослых комаров с смертности, забил на 48 ч. Assay позволяет количественной оценки дозы, полученной на отдельных комаров21. LITE преплюсневой оценивает токсичности тест продукта для взрослых комаров, опираясь на химически обработанную поверхность и используется для идентификации химия с потенциалом развития как крытый остаточного спреи (IRS) или использовать в инсектицидами противомоскитных сеток (ОИС) для управления малярийных комаров.
ВОЗ и CDC анализов имеют ограничения для тестирования роман, unformulated химия, и CDC бутылка биопроб цель оценки восприимчивости за короткий пробирного периодов (два часа) вместо токсичности22,23. Кроме того анализы для оценки токсичности химия в крови еды и потенциал для развития продуктов системного действия (например, endectocides) отсутствуют. Здесь мы описываем анализов для проверки активности mosquitocidal Роман химия, которые растворяются в воде или один из нескольких органических растворителей против личинок и взрослых Aedes, малярийные комары и Culex. Во-первых, мы демонстрируем личиночной пробирного ранее описанные в нашей группе10,12,13,16и здесь выступали как (1) доза экрана быстро оценить несколько химия в одной точке, и (2) ответ пробирного дозы для определения летальная концентрация (например, LC50, LC75 или90,LC) одного химии. Далее мы опишем два взрослых анализов для определения летальной дозы (LD). Первым из них является адаптация LITE протокол для тестирования злободневно прикладной, Роман химия против взрослых комаров по сравнению с позитивного управления. Во-вторых, кормления assay для оценки химия, системно доставлены через крови еды.
Protocol
Примечание: Все штаммы и реагентов, необходимых для работы описаны в следующих протоколов и поставщиков, перечислены в Таблице материалов.
1. Культура комаров личинок и взрослых
Примечание: Инсектицид чувствительными штаммами комаров доступны из исследований малярии и реагента ссылка репозитория. Рекомендуется штаммы являются следующие: Aedes aegypti Ливерпуль (LVP) штамма, штамм Anopheles gambiae Кисуму (KISUMU1) и Culex quinquefasciatus Йоханнесбург (JHB) штамма.
- Личинки комаров культуры от яйца на 12 h день/12 h ночь цикл на 28 ° C и 75-85% относительная влажность (RH) в пластиковых лотках 25 x 40 см (~ 400 личинок в лоток) как описано Nuss29. Кормить личинок земли песчанки (A. aegypti и An. gambiae) или хлопьеобразный корм для рыб (C. quinquefasciatus). Для личинок анализов Соберите личинок на третьем личиночной стадии instar (L3).
- Сзади взрослых комаров из куколок, которые были переданы в пластиковые стаканчики и место внутри 20 Л пластиковых клетки в insectary на условиях, описанных выше. Сохранить комаров на раствор 20% сахара, как описано в других разделах29. Сбор на 3-5 дней поста появление взрослых.
2. личиночной контакт Assay (разовая доза точки или дозы ответ Assay)
Примечание: Assay может проводиться с химия, которые растворяются в воде или этанного сульфоксида (ДМСО), при том условии, что конечная концентрация ДМСО в пробных скважин не превышает 1%. Альтернативных растворителей может быть вариант, но это необходимо сначала подтвердить, что конечная концентрация не вызывает, более чем на 10% смертности на 72 h пост экспозиции. Assay может выполняться как единую точку дозы или дозы ответ анализа. Если выполнение последнего, рекомендуется проверить диапазон концентраций (минимум пять), охватывающих Ожидаемые LC50.
- Ярлык скважин ясно 24-ну ткани пластины, как показано на рисунке 1.
- Подготовьте раствор тест химии в 1,5 мл.
- Вес каждой химии, используя аналитический баланс и в зависимости от характеристик растворимости, вновь приостановить в стерильных ddH2O, ДМСО или других подходящих органических растворителей выбора (см. Рисунок 2).
Примечание: Расчеты следует учитывать чистоту химии. Например для химии, что 99% чистого, растворяют 10.1 мг в 1000 мкл ацетона для получения 1% раствора. Печать с парафином фильм и хранить при температуре от-20 ° C.
- Вес каждой химии, используя аналитический баланс и в зависимости от характеристик растворимости, вновь приостановить в стерильных ddH2O, ДМСО или других подходящих органических растворителей выбора (см. Рисунок 2).
- Определите окончательный концентрация химии тест, который будет оцениваться и подготовить серийных разведений от Стоковый раствор, соответственно, с помощью соответствующего растворителя.
Примечание: Концентрация и объем химии и растворителя может рассчитываться с помощью формулы C1* V1= C2* V2 где C1= концентрация пробы 1, C2= концентрация образца 2, V1= объем Пример 1 и2V = объем образца 2. Смотрите пример вычисления, показан на рисунке 2 и в таблице 1.- Подготовьте раствор 10 мм и серийных разведений, необходимых для получения желаемого тест концентрации (Таблица 1B).
- С помощью пипетки пластиковые передачи всей родила, передать пять L3 личинки также культуры ткани испытательной пластине; L3 личинки могут быть признаны Длина (~ 2,5-3,5 мм) и руководитель капсулы ширина ~240,025 мм. Аккуратно удалите воду с 1 мл пипетки и заменить требуемый объем ddH2O (см. ниже). Повторите для получения n = 4 технические реплицирует за лечение (т.е., 20 личинки всего за лечение).
- Добавьте соответствующий объем тестирования химии в каждую из четырех реплицировать скважин в 24-ну испытательной пластине и слегка взболтать пластина обеспечить равномерное перемешивание химии. Место пластину в тест или рост палата при постоянных условиях (например, 25 ° C и ~ 75-85%, RH рекомендуется и 12 h свет/12 h темные цикл, если это возможно).
Примечание: Для воспроизводимости между эксперименты, убедитесь, что последующие анализы выполняются на тех же условиях окружающей среды. - Записать количество мертвых/неотвечающим личинок в каждой скважине на 30 мин, 1, 1,5, 2, 3, 24, 48 и 72 ч после воздействия (или альтернативного времени точек) на судейскую (Таблица 2). Аккуратно нажмите стороне пластины. Если не движение наблюдается, нежно коснуться личинка с стерильных зубочисткой. Оценка личинки, которые не реагируют на нажатие/touch как «мертвых».
Примечание: Другие морфологических и поведенческих фенотипов может наблюдаться и могут быть записаны. - Исправление для управления смертности с использованием модифицированных Эбботт формулы при желании, следующим образом:
Смертность (%) = (X-Y) * 100/(100-Y),
где X = процент смертности в образец с обработанной и Y = процент смертности в элементе управления. - Графа гистограммы или логарифмическая кривая с помощью программного обеспечения выбора таких призму граф pad 6 или аналогичные результаты и вычислить значения смертоносных концентрации (LC) относительно элемента управления.
- Повторить пробу с помощью отдельной партии комаров для получения n = 3 или более биологических реплицирует.
3. Взрослый актуальные Assay (разовая доза точки или дозы ответ Assay)
Примечание: Взрослый актуальные assay проводится с помощью ацетона в качестве растворителя. Альтернативных растворителей может быть вариант, но это необходимо сначала подтвердить, что конечная концентрация не вызывает, более чем на 10% смертности на 48 h пост экспозиции. Assay может выполняться как единый пункт дозы или дозы ответ пробирного и используется для определения летальной дозы (LD). Если выполнение последнего, рекомендуется проверить диапазон концентраций (минимум пять), охватывающих ожидаемых LD50.
- Определите количество взрослых женщин комаров, необходимых для завершения анализа.
Примечание: Доза пробирного точки с одного химии потребует минимум 90 комаров (30 для позитивного управления, 30 для ацетон только отрицательный контроль и 30 для тестирования химии). - Культура 3-5-дневных взрослых женщин комаров и перейти к отдельным 20 мл Пластиковое ведро с помощью аспиратор (рис. 3).
- Этикетка 9 унций стаканчиков с именем и концентрация тестирования химии. Отложите квадраты сетки 10 см х 10 см и резинки для каждой чашки (см. Рисунок 4).
- Выберите существующих инсектицидов как позитивный элемент управления (например, синтетические пиретроиды, бифентрин) и подготовить 1% раствор (10 мкг/мкл) в ацетоне.
Примечание: Расчеты следует учитывать чистоту химии. Например для химии, что 99% чистого, растворяют 10.1 мг в 1000 мкл ацетона для получения 1% раствора. Печать с парафином фильм и хранить при температуре от-20 ° C. - Используя ту же процедуру, как указано выше, подготовьте раствор тестирования химии.
Примечание: Многие испытания химия являются весьма лабильным, и решения должны предпочтительно на свежие, каждый раз, когда выполняется биопроб. - Подготовить серийных разведений положительный контроль и тестирование химия от акций решения, как показано на рисунке 5 с помощью 20 мл стеклянных флаконов ранее промывают ацетоном.
- Очистка стекла 1 мл шприц с ацетоном, залейте ацетона и зафиксируйте в микро аппликатор, скорректированы доставить объем 0,25 мкл.
- Работая в десять партий, удалите 3 - 5 - дневных взрослых женщин комаров из клеток, используя отсос и анестезировать до пяти минут при температуре 4 ° C в холодильник или на льду. Далее передать комаров Петри блюдо и место на льду для до 10 мин.
- Работать быстро, удалите незамужней женщиной с тонкой пинцет и применять 0,25 мкл раствора теста к спинной грудной клетки, с помощью шприца микро аппликатор. Подтвердите, что поставка химии наблюдения с использованием рассечения микроскоп для обеспечения каждого комара получает соответствующий объем тестирования химии.
- Передать комаров помечены бумажный стаканчик, отдыхая на льду и повторять девять раз для получения n = 10 обработанных комаров. Уплотнение комаров в чашке с сеткой площади обеспеченные с резинкой и передачи пластиковые ванну или рост палата при постоянных условиях 28 ° C и 75-85% RH (на 12 ч в день/12 h ночной цикл предпочтительнее).
- Повторите выше эксперимент дважды, чтобы получить n = 3 технических реплицирует (т.е. 30, всего комаров) в группе лечения или контроля.
- Повторите шаги 3,7-3.10 сначала с химии тест, а затем положительный контроль.
Примечание: Еще один полезный управления, чтобы включить наличии достаточных комаров является «пустой» 30 наркотизированных комаров, которые не получают тестирования химии или растворителя. - Записать количество «мертвых/неотвечающим» комаров на 30 мин, 60 мин., 2, 24 и 48 ч после воздействия (или альтернативного времени точек) с использованием Оценка лист (Таблица 3). Оценка комаров, как «мертвые/неотвечающим» если они показывают отсутствие движения, определяется как укладке на боку или на спине и с неспособностью летать.
- При необходимости, исправьте для управления смертности с использованием модифицированных Эбботт формулы следующим образом:
Смертность (%) = (X-Y) * 100/(100-Y),
где X = процент смертности в образец с обработанной и Y = процент смертности в элементе управления. - Отобразить результаты в виде гистограммы или экспоненциальной кривой. Для assay ответ дозы Вычислите LD50, LD75 или90 значения LD для тестирования химии относительно элемента управления.
- Повторите assay, по крайней мере дважды с использованием отдельных пакетов комаров для получения n = 3 или более биологических реплицирует.
4. Взрослый крови кормления Assay (разовая доза точки или дозы ответ Assay)
- Сбор около 150 4-5-дневный старые взрослых женщин комаров и Трансфер в отдельной клетке. Повторите для получения 6 клетки, если выполнение пробирного ответ дозы. Удалите источник сахара 1-24 часа до их кормления assay.
- Подготовить раствор химии, как описано выше, учет за чистоту химии (типичная Стоковый раствор является 80 мм в воде или соли буфера) и впоследствии подготовить серийных разведений в воде/буфера при необходимости.
- Добавьте 40 мкл каждого из разведений 960 мкл дефибринированной крови кролика для получения желаемого тестовой концентрации. Нанесите слой мембраны к блоку питания и печать с резиновым кольцом. Передача 1 мл крови через пипетку и подключите блок питания к нагревательный элемент.
- Аккуратно тампоном поверхности мембраны с свежезаваренным сделал 10% раствор молочной кислоты и место кормления блок в клетку взрослых комаров. Накрыть клетка с темной тканью или черный мусорный мешок и комаров прокормить в течение одного часа.
- Повторите шаги 4.2-4.4 на оставшийся период тестирования решений и отрицательного контроля (только для крови).
- По окончании кормления место ведра на 4 ° C в холодильник на 5 минут, чтобы анестезировать комаров. Удаление мужской комаров и не кормили женского комаров и рассчитывать и записывать общее количество кормили и частично кормить комаров обследование органов брюшной полости.
- Сохраняют частично и полностью кормили женского комаров, направленный как минимум 50 крови кормить комаров за дозу.
- Передаче Ведра пластиковые ванну или рост палата при постоянных условиях 28 ° C и 75-85% RH (на 12 ч в день/12 h ночной цикл предпочтительнее).
- Запишите общее число погибших/неотвечающим комаров на 0,5, 1, 1.5, 2, 24, 48 и 72 ч (или альтернативных время очки как желаемого), используя счет листа (Таблица 4).
- На третий день пост крови кормление, ввести яйца Кубка в клетку и собирать яйца в течение 72 ч. Подсчитать общее количество яиц производится за лечение под микроскопом рассечения.
- Рассчитайте процент смертности и плодовитости в зависимости от общего числа кормить комаров для каждой группе лечения и управления. Исправление для управления смертности с использованием модифицированных Эбботт формулы, при желании.
- Токсичность и плодовитость данные выводятся в виде гистограммы сюжет или экспоненциальную кривую, (если выполнение пробирного ответ доза) с помощью программного обеспечения по выбору. Если выполнение пробирного ответ дозы, вычислить LD50, LD75 или90 значения LD для тестирования химии относительно элемента управления.
- Повторите assay, по крайней мере дважды с использованием отдельных пакетов комаров для получения n = 3 или более биологических реплицирует.
Representative Results
На рисунке 6 показан процент смертности L3 А.е. aegypti после воздействия 5 доз антагонист рецепторов дофамина, амитриптилин по сравнению с водой только (отрицательный) управления на 24, 48 и 72 ч. В этом примере данные, собранные в каждой из точек времени отображения типичного логарифмическая кривая и выявить дозозависимый эффект Амитриптилин на личиночной смертности. LC50 значение уменьшается эксперимента в течение времени и может быть рассчитана с использованием данных, 72 h (т.е. середину логарифмическая кривая).
Рисунок 7 показывает процент смертности взрослых женщин 3 - 5-дневных А.е. aegypti после облучения в дозе 400 мкм (10 мкг/мкл) антагонист рецепторов дофамина, амитриптилин и по сравнению с синтетическим пиретроидам, бифентрин положительный контроль (технический сорт; 500 ПГ/мкл), ацетон только отрицательный контроль и неочищенных комаров (пустая строка). В этом примере Амитриптилин и бифентрин вызывают значительные смертности взрослого населения относительно негативных элемента управления. Обратите внимание, что смертности взрослого населения уменьшается с течением времени, предположительно из-за метаболической дезинтоксикации тест химия.
На рисунке 8 показан процент смертности (левая ось y) 3-5 день старые взрослая самка А.е. aegypti кормили крови еды относились с одним из четырех доз антагонистов рецептора допамина, амитриптилин и плодовитость (правой оси; среднее яйцо фото / женщины) для первой экспозиции пост gonotrophic цикла по сравнению с контролем комаров (кровь кормили только; отрицательный контроль). Данные показывают, что статистически значимого влияния Амитриптилин на смертности взрослого населения относительно элемента управления но продемонстрировать, что Амитриптилин значительно увеличивает плодовитость в высокой дозе (400 мкм).
Рисунок 1 . Set-up личиночной дозы ответ assay. Изображения показаны set-up пробирного ответ личиночной дозы, с помощью личинки Aedes aegypti L3 в 24-ну пластины.
Рисунок 2 . Схематический показ процедуры для набора дозы (A) одной точки или (B) доза ответ личиночной пробирного в пластине 24-а. После передачи пяти L3 личинки скважин избыток воды осторожно удаляется через пипетку и заменены свежими, стерильные ddH2O. Далее фондовая и серийных разведений тест химии подготавливаются и добавлен в окончательный объем 1 мл/хорошо. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 . Культуры взрослых комаров. Пластмассовое ведро 20 Л изображения показаны используется для культуры взрослых комаров и использования Аспиратор для удаления комаров.
Рисунок 4 . Взрослый актуальные пробирного, с использованием 4-5 день старые самки Aedes aegypti. Последующее лечение с химией или растворителей, взрослых комаров помещаются в бумажных стаканчиков и переданы испытательную камеру в течение assay.
Рисунок 5 . Фондовая и серийных разведений. Схематическая диаграмма, показывающая процедура подготовки акций (A) и (B) решения серийный тест для взрослых актуальные assay. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6 . Репрезентативных данных от личинок контактной дозы ответ пробирного. Репрезентативных данных из ответа личиночной контактной дозы пробирного показаны процент смертности личинки Aedes aegypti L3, после воздействия антагонист рецепторов дофамина, амитриптилин на 24, 48 и 72 ч. Каждая точка данных представляет среднее ± мкм SEM. данных представляют n = 3 биологических реплицирует.
Рисунок 7 . Репрезентативных данных от актуальные доза для взрослых ответ assay. Репрезентативных данных из актуальных доза для взрослых ответ assay показаны токсичность антагонист рецепторов дофамина, амитриптилин (10 мкг/мкл) в 3-5 день старые женщины Aedes aegypti по отношению к синтетическим пиретроидам, бифентрин (500 ПГ/мкл) позитивные контроль) и отрицательный контроль (ацетон автомобиль только) на 2, 24 и 48 h. Данные представляют собой n = 3 биологических реплицирует. Планки погрешностей указывают SEM.
Рисунок 8 . Репрезентативных данных от взрослых при приеме внутрь assay. Репрезентативных данных от взрослых при приеме внутрь assay показаны токсичность антагонист рецепторов дофамина, амитриптилин на 100 мкм, 200 мкм и 400 мкм в дозе 3-5 день старых взрослых женщин Aedes aegypti и воздействие на плодовитость, (выражается в среднем всего яйцо Граф одну женщину за первый цикл gonotrophic). Данные представляют собой n = ± 3 биологических реплицирует SEM.
| A. централизованное дозы анализов с тремя химия | |||||
| Химия | Концентрация (400 мкм) | ||||
| Амитриптилин | 2 мг 80 мм складе: Амитриптилин X 98% (чистота порошка) X 0,001 г / 1 мг X 1 моль /313.86 g X 1 Л/0,08 моль6 X 10 мкл/Л = 78.06 мкл воды. | ||||
| Серийных разведений: Разбавьте штока 1:2 с ddH2O, а затем 1:4 до достижения 10 мм. 40 мкл 10 мм запасов, хорошо содержащие 960 мкл ddH20 для достижения конечной концентрации 400 мкм/хорошо. Подготовьте серийных разведений акций 1:2 для достижения 5 мм, 2,5 мм, 1,25 мм и запасов 0,625 мм 10 мм. | |||||
| СНГ-(z)-flupenthixol | 2 мг 80 мм складе: СНГ (z) flupenthixol X 98% (чистота порошка) X 0,001 г / 1 мг X 1 моль/507.44 g СНГ (z) flupenthixol L/0.08 X 1 моль6 X 10 мкл/Л = 48.28 мкл воды. | ||||
| Серийных разведений: Как указано выше. | |||||
| Амитраз | 80 мм фондовой: 2 мг амитраз X 0,001 г / 1 мг X 1 моль/293.4 g амитраз L/0.08 X 1 моль X 106 мкл/1 L = 85.21 мкл ДМСО (Примечание: амитраз растворим только в ДМСО). | ||||
| Серийных разведений: Как указано выше. | |||||
| B. доза ответ пробирного | |||||
| Химия | Доза-1 | Доза 2 | Доза 3 | Доза 4 | Доза 5 |
| 400 МКМ | 200 МКМ | 100 МКМ | 50 МКМ | 25 МКМ | |
| Например, амитриптилин, СНГ-(Z)-flupenthixol или амитраз | 40 МКЛ | 40 МКЛ | 40 МКЛ | 40 МКЛ | 40 МКЛ |
| 10 мм фондовой | 5 мм фондовой | 2.5 мм фондовой | фондовая 1,25 мм | 0,625 мм фондовой | |
Таблицы 1. Пример вычисления для Aedes aegypti личинок L3 (A) одной точки дозы пробирного и (B) доза ответ пробирного.
В таблице 2. Пример Оценка лист используется для записи данных из комаров личиночной дозы ответ assay. Управления, только вода или вода с 1% ДМСО или другого растворителя только. Типичные дозы, используемые для тестирования малые молекулы антагонист химия как Амитриптилин являются 25 мкм, 50 мкм, 100 мкм, 200 мкм и 400 мкм.
| Взрослых комаров (3-5 день старого) актуальные Assay | ||||||
| Дата начала: | ||||||
| Следователь: | ||||||
| Вид/сорт: | ||||||
| Проба тип: Одной точке доза/доза реакция | ||||||
| А. смертность (No. мертвой комаров) | ||||||
| Время (часы) | Доза-1 | Доза 2 | Доза 3 | Доза 4 | Доза 5 | Управления |
| 0.5 | ||||||
| 1 | ||||||
| 1.5 | ||||||
| 2 | ||||||
| 2.5 | ||||||
| B. процент смертности | ||||||
| Время (часы) | Доза-1 | Доза 2 | Доза 3 | Доза 4 | Доза 5 | Управления |
| 0.5 | ||||||
| 1 | ||||||
| 1.5 | ||||||
| 2 | ||||||
| 2.5 | ||||||
Таблица 3. Пример Оценка лист используется для записи данных из актуальные доза для взрослых ответ пробирного.
| Взрослых комаров (3-5 день старого) при приеме внутрь Assay | ||||||
| Дата начала: | ||||||
| Следователь: | ||||||
| Вид/сорт: | ||||||
| Проба тип: Одной точке доза/доза реакция | ||||||
| A. количество кормить комаров | ||||||
| Доза-1 | Доза 2 | Доза 3 | Доза 4 | Доза 5 | Управления | |
| Кормить | ||||||
| Не ФРС | ||||||
| Итого | ||||||
| % ФРС | ||||||
| % Не ФРС | ||||||
| B. смертность (No. мертвой комаров) | ||||||
| Время (часы) | Доза-1 | Доза 2 | Доза 3 | Доза 4 | Доза 5 | Управления |
| 2 | ||||||
| 24 | ||||||
| 48 | ||||||
| 72 | ||||||
| C. процент смертности | ||||||
| Время (часы) | Доза-1 | Доза 2 | Доза 3 | Доза 4 | Доза 5 | Управления |
| 2 | ||||||
| 24 | ||||||
| 48 | ||||||
| 72 | ||||||
Таблица 4 . Пример Оценка лист используется для записи данных из взрослых крови кормления assay. Типичные дозы, используемые для тестирования малые молекулы антагонист химия как Амитриптилин являются 50 мкм, 100 мкм, 200 мкм и 400 мкм.
Discussion
Инсектицидов являются мощными инструментами для борьбы с комарами заболеваниями как малярия25, денге и Зика26. Обширные Инсектицид использования выпустила популяций комаров, что устойчивы к химическому элементу управления, ведущих к развитию резистентности к инсектицидам, который считается единственной крупнейшей угрозой продолжение заболеваниями. Последнее десятилетие было отмечено резкое увеличение популяций Anopheles spp. устойчив к синтетических пиретроидов (SPs) используется в сеток в Африке7. Популяций Aedes albopictus, вектор денге и Зика, были зарегистрированы в Флорида и Нью-Джерси, которые устойчивы к органофосфатов6. Аналогичным образом устойчивость к ДДТ и пиретроидам задокументировано в популяциях Anopheles и Aedes spp. в Колумбии27,28. Существует настоятельная необходимость разработать новые ларвициды и особями, которые связывают различные orthosteric или аллостерический сайты по известным молекулярным мишеням или нарушить новые цели (т.е., Роман MoA химия)29,30 и у минимального воздействия на окружающую среду. Растет также признание потенциала вокруг endectocides для комаров управления31,32,33.
Чтобы облегчить быстрое развитие таких продуктов, мы описывают последовательность протоколов, предназначенных для оценки токсичности малые молекулы химия личинки комаров и взрослых по двум маршрутам доставки - контакт и употребления. Протоколы, такие как тест восприимчивости ВОЗ и пробирного бутылка CDC в общем используются для оценки токсичности и отталкивающих свойств существующих инсектицидные составы1,2. Однако эти анализы имеют ограничения для анализа unformulated Роман химических образований (NCEs) и не поддаются тестирования большого числа химия в средней или высокой пропускной способности.
Здесь мы опишем стандартный личиночной пробирного быстро оценить NCEs в дозе одной точки, которую можно масштабировать для высокой пропускной способности анализа. Мы также обсудим адаптацию разработанной LITE21 для оценки контактной токсичность малые молекулы химия для взрослых комаров assay. Наконец мы опишем заглатывания assay для оценки токсичности NCEs доставлены через еды крови взрослых женщин комаров и исследовать потенциал endectocide. Эти личинок и взрослых анализов могут быть выполнены в диапазоне доз для того, чтобы определить значения LC и LD, соответственно, и личинок и взрослых контакт анализов могут быть выполнены по сравнению с одной или более существующих химических составов. Взрослый актуальные assay также позволяет расчет значений LD на отдельных Москито. Протоколы могут быть выполнены с использованием вида Aedes, малярийные комары и Culex16,29 и может быть изменена с учетом специфики биологических видов, при желании. По нашему опыту mosquitocidal химия обычно демонстрируют широкую активность через эти три родов16,29, но есть значение оценки видов селективности.
Анализы являются отправной точкой для быстро экран несколько химия для инсектицидное действие. Химия, которые проявляют токсичность в один или несколько анализов может быть выбран для дальнейшего анализа через вторичных и третичных анализов. Примеры включают LITE преплюсневой пробирного и сахар, кормления анализов34,35. Обычно выбор дополнительных анализов определяется соображениями вокруг предполагаемого рынка и приложение, с результатами, обеспечивая понимание режимы доставки продукта. В представительных результаты, показанные здесь мы исследуем токсичность амитриптилин, антагонист беспозвоночных и млекопитающих дофаминовых рецепторов, который был оценен потенциал как Роман MoA инсектицидами10,12, 13 , 16. Амитриптилин выставлены токсичности для личинок и взрослых А.е. aegytpi мкг предлагая диапазон борьбе и adulticidal активности и обоснованием изучение химических серии Амитриптилин для идентификации аналогов с высокой потенции. В А.е. aegypti подвержены Амитриптилин в крови еды было отмечено статистически значимого влияния на смертность или плодовитость. Хотя стабильность химии в дефибринированной крови и эффективной дозы, полученной за комаров не известно, существенных ограничений assay, данные показывают, что Амитриптилин и других GPCR-активных соединений могут иметь мало потенциал как endectocides, в крайней мере в unformulated состояние.
Важное значение имеют меры предосторожности для ограничения биологические различия между анализов. Все анализы должны выполняться при стандартных условиях температуры и влажности, предпочтительно в камере роста насекомых, с тем чтобы обеспечить воспроизводимость. Крайне важно, чтобы стандартизировать процедуры забил фенотипические конечные точки, как они могут быть весьма субъективным, ведущих к значительные вариации в данных Записанная персоналом различных лабораторных. Личинок assay лучше всего подходит для оценки химия, которые растворимы в воде, хотя assay может производиться с использованием органических растворителей, таких как ДМСО, условии, что окончательное концентрация составляет менее 1% хорошо. Мы признаем несколько ограничений для взрослых актуальные assay. Во-первых это необходимо для работы быстро при подготовке серийных разведений и доставку дозы как перевозчик (ацетон) является крайне неустойчивым и испарения может производить изменения в размере химии доставлены. Во-вторых следует позаботиться о том, для ограничения периода анестезии, поскольку это может способствовать смертности. Следует также отметить, что растворители, как ацетон может производить быстрый эффект «нокдаун» в первые несколько часов тематического анализа, который не следует путать с эффектами из-за тестирования химии. Мы отмечаем, что объем еды крови комаров колеблется между людьми, осложняет оценку дозы, полученной на взрослого в assay взрослых при приеме внутрь. Наконец анализа данных не следует рассматривать в тех случаях, когда смертность в отрицательный контроль превышает 10%.
Продукты, которые действуют синергически все шире признаются для их потенциал для расширения полезности существующих продуктов и обеспечения контроля вредителей инсектициды устойчивых популяций15,16,36. Личиночной анализов были использованы для изучения синергизма между formamidine пестицидов, амитраз и разнообразные химия, которые нарушают беспозвоночных октопамин рецепторов14,15. Личинок пробирного и взрослых актуальные assay описал подходят для оценки синергического или аддитивные эффекты между комбинаций тестовых химия. Мы отмечаем, что синергисты например пиперонилбутоксид (PBO) могут быть включены в каждый из трех анализов, описанных здесь.
Описанные выше анализов обеспечивают стандартизированные экспериментальной серии для оценки unformulated, малые молекулы препаратов против водных и наземных москитной жизни этапы. Эти анализы предназначены специально для оценки токсичности и предлагают несколько преимуществ над существующими assays общего использования. Важно отметить, что анализы поддаются автоматизации и может быть выполнена в промышленных масштабах для включения оценки тысячи испытаний соединений. Наконец, как поле считает развитие продуктов, которые действуют через новый Моа, в том числе через нарушение Роман молекулярным мишеням и биохимические пути, будет необходимо набрать несколько фенотипических конечных точек в дополнение к тем, таких, как смертность и паралич. Выше анализы позволяют такие расследования, обеспечивая тем самым шаг к инновационным инсектицидные технологии завтрашнего.
Disclosures
Авторы заявляют отсутствие конфликта интересов.
Acknowledgments
Авторы благодарят H. Ranson, Ливерпуль школа тропической медицины для помощи с развитием пробирного и положение протокола, LITE, и м. шарф, Университет Purdue для консультаций относительно пробирного дизайн.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Insecticide susceptible mosquito strains | Malaria Research and Reagent Reference Repository | https://www.beiresources.org/MR4Home.aspx; Recommended strains: Aedes aegypti Liverpool (LVP) strain, Anopheles gambiae Kisumu (KISUMU1) strain and Culex quinquefasciatus Johannesburg (JHB) strain | |
| Acetone | Mallinckrodt Chemical | CAS 67-64-1 | Use for dilutions and control |
| Amitraz | Sigma-Aldrich | CAS 33089-61-1 | Requires dilution in DMSO |
| Amitriptyline | Sigma-Aldrich | CAS: 549-18-8 | Can be diluted in acetone |
| Bifenthrin | Sigma-Aldrich | CAS: 51529-01-2 | Synthetic pyrethorid used as positive control |
| Cis-(Z)-flupenthixol | Sigma-Aldrich | CAS: 51529-01-2 | Pharmacologically tested as disruptor of dop-like receptors |
| Defibrinated rabbit blood | Hemostat | DRB0100 | Blood source for adapted mosquitoes to artificial feeding |
| Dimethylsulphoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | MKBF2985 | Organic solvent used to disolve amitraz |
| Hemotek membrane feeding system | Hemotek Ltd | Serial no. 1303 | Used for feeding mosquitoes |
| Micro-applicator | Burkard Manufacturing Co. | - | Tool needed for topical application experiments |
| 24-well cell culture plate with lid | Corning Incorporated | 3526 | - |
| Advantage rubber bands | Alliance Rubber Co. | - | Used to seal the paper cups |
| Glass syringe (1 ml) | Becton Dickinson and Co. | 512004 | Needed for the micro-applications. Glass is better than plastic |
| Disposable scintillation vials (20 ml) | Fisher Scientific | 74505-20 | Glass vials prevent evaporation |
| Tulle fabric, white | Walmart | - | - |
| Paper cups | Dixie Consumer Products LLC. | PF15675/13D | Used to keep adult mosquitoes in adult topical assays |
| Petri dishes (150 mm) | Corning Life Sciences | - | Used to maintain the mosquitoes "slept" on cold without direct contact with ice |
| Transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | Used to sort larvae |
| Stereo microscope | Olympus | SZ6045 | Used to score larval assays and perform micro-applications |
| Tweezers (fine) | Fontax | - | Used to handle adult mosquitoes |
References
- World Health Organization. A global brief on vector-borne diseases. , Available from: www.who.int/about/Licensing/copyright_form/en (2014).
- World Health Organization. Vector-borne diseases. , Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs387/en (2016).
- World Health Organization. Report by the Secretariat. Neglected tropical diseases; Prevention, control, elimination and eradication. , Available from: http://www.who.int/neglected_diseases/A66_20_Eng.pdf (2013).
- Tolle, M. A., et al. Mosquito-borne diseases. Curr Probl Pediatr Adolesc Health Care. 39 (4), 97-140 (2009).
- Chen, C. D., et al. Dengue vectors surveillance in endemic areas in kuala lumpur city centre and selangor state, malaysia. Dengue Bulletin. 30, (2006).
- Marcombe, S., et al. Insecticide resistance status of united states populations of Aedes albopictus and mechanisms involved. PLoS ONE. 9 (7), e101992 (2014).
- Ranson, H., et al. Pyrethroid resistance in African anopheline mosquitoes: what are the implications for malaria control? Trends in Parasitology. , 1-8 (2010).
- Hemingway, J., Ranson, H. Insecticide resistance in insect vectors of human disease. Annual Review of Entomology. 45, 371-391 (2000).
- Hemingway, J., Beaty, B. J., Rowland, M., Scott, T. W., Sharp, B. L. The Innovative Vector Control Consortium: improved control of mosquito-borne diseases. Trends in Parasitology. 22 (7), 308-312 (2006).
- Meyer, J. M., et al. A "genome-to-lead" approach for insecticide discovery: Pharmacological characterization and screening of Aedes aegypti D 1-like dopamine receptors. PLOS Neglected Tropical Diseases. 6 (1), e1478 (2012).
- World Health Organization. Instructions for determining the susceptibility or resistance of mosquito larvae to insecticides. , Available from: http://apps.who.int/iris/handle/10665/69615 (1981).
- Hill, C. A., et al. Re-invigorating the insecticide discovery pipeline for vector control: GPCRs as targets for the identification of next gen insecticides. Pestide Biochemistry and Physiology. 106 (3), 141-148 (2013).
- Conley, J. M., et al. Evaluation of AaDOP2 Receptor antagonists reveals antidepressants and antipsychotics as novel lead molecules for control of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeautics. 352 (1), 53-60 (2015).
- Ahmed, M. A. I., Matsumura, F. Synergistic actions of formamidine insecticides on the activity of pyrethroids and neonicotinoids against Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 49 (6), 1405-1410 (2012).
- Ahmed, M. A. I., Vogel, C. F. A. Synergistic action of octopamine receptor agonists on the activity of selected novel insecticides for control of dengue vector Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) mosquito. Pesticide Biochemistry and Physiology. 120, 51-56 (2015).
- Hill, C. A., et al. Comparative pharmacological characterization of D1-like dopamine receptors from Anopheles gambiae, Aedes aegypti and Culex quinquefasciatus suggests pleiotropic signaling in mosquito vector lineages. Parasites Vectors. 9 (1), 192 (2016).
- Centers for Disease Control and Prevention. Guideline for evaluating insecticide resistance in vectors using the CDC bottle bioassay. , Available from: https://www.cdc.gov/malaria/resources/pdf/fsp/ir_manual/ir_cdc_bioassay_en.pdf (2011).
- World Health Organization. Test procedures for insecticide resistance monitoring in malaria vector mosquitoes. , Available from: http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/250677/1/9789241511575-eng.pdf (2013).
- Geneva: World Health Organization. Guidelines for efficacy testing of insecticides for indoor and outdoor ground-applied space spray applications control of neglected tropical diseases who pesticide evaluation scheme. , Available from: http://www.who.int/iris/handle/10665/70070 2-53 (2009).
- Pridgeon, J. W., et al. Susceptibility of Aedes aegypti, Culex quinquefasciatus Say, and Anopheles quadrimaculatus Say to 19 pesticides with different modes of action. Journal of Medical Entomolog. 45 (1), 82-87 (2008).
- Liverpool Insect Testing Establishment. , Available from: http://www.lite-testing-facility.com (2018).
- Aïzoun, N., et al. Comparison of the standard WHO susceptibility tests and the CDC bottle bioassay for the determination of insecticide susceptibility in malaria vectors and their correlation with biochemical and molecular biology assays in Benin, West Africa. Parasites Vectors. 6, 147 (2013).
- Owusu, H. F., Jančáryová, D., Malone, D., Müller, P. Comparability between insecticide resistance bioassays for mosquito vectors: time to review current methodology? Parasites Vectors. 8, 357 (2015).
- Savignac, R., Maire, A. A simple character for recognizing second and third instar larvae of five Canadian mosquito genera (Diptera: Culicidae). , (1981).
- Bhatt, S., et al. Coverage and system efficiencies of insecticide-treated nets in Africa from 2000 to 2017. eLife. 4, 174 (2015).
- Zaim, M., et al. Alternative insecticides: an urgent need. Trends in Parasitology. 18 (4), 161-163 (2002).
- Fonseca, I., Quinoñes, M. L. Resistencia a insecticidas en mosquitos (Diptera: Culicidae): mecanismos, deteccion y vigilancia en salud publica. Revista Colombiana de Entomologia. 31 (2), 107-115 (2005).
- Fonseca-Gon Alez, I., Qu, M. L., Lenhart, A., Brogdon, W. G. Insecticide resistance status of Aedes aegypti (L.) from Colombia. Pest Management Science. 67, 430-437 (2011).
- Nuss, A. B., et al. Dopamine receptor antagonists as new mode-of-action insecticide leads for control of Aedes and Culex mosquito vectors. PLOS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 1-19 (2015).
- Shidrawi, G. R. A WHO Global Programme for monitoring vector resistance to pesticides. Bulletin of the World Health Organization. 68 (4), 403 (1990).
- Sylla, M., Kobylinski, K. C., Foy, B. D. Gates grand challenges explorations award: endectocides for controlling transmission of mosquito-borne diseases. Malariaworld Journal. 4 (5), (2013).
- Foy, B. D., Kobylinski, K. C., da Silva, I. M., Rasgon, J. L., Sylla, M. Endectocides for malaria control. Trends in Parasitology. 27 (10), 423-428 (2011).
- Chaccour, C. J., et al. Ivermectin to reduce malaria transmission: a research agenda for a promising new tool for elimination. Malaria Journal. 12 (1), 153 (2013).
- Olson, D. M., Fadamiro, H., Lundgren, J. G., Heimpel, E. Effects of sugar feeding on carbohydrate and lipid metabolism in a parasitoid wasp. Physiol Entomol. 25, 17-26 (2000).
- World Health Organization. Report of the WHO Informal Consultation. Evaluation and testing of insecticides. , Available from: http://www.who.int/whopes/resources/ctd_whopes_ic_96.1/en/ (1996).
- Huang, Q., Deng, Y., Zhan, T., He, Y. Synergistic and antagonistic effects of piperonyl butoxide in fipronil-susceptible and resistant rice stem borrers, Chilo suppressalis. Journal of Insect Science. 10, 182 (2010).
