Summary
Protokoll finns beskrivna för att bedöma toxiciteten av kemiska sammansättningar omogna och vuxna mygg för utveckling som nya klasser av larvicides, adulticides och endektocider. Protokollen aktivera hög genomströmning tester av flera kemiska sammansättningar på enpunkts-dos och efterföljande utvärdering via dos svar assay att bestämma toxicitet vid kontakt eller via förtäring.
Abstract
Nya klasser av insekticider med nya verkningssätt behövs för att styra insektsmedel resistenta populationer av myggor som överför sjukdomar såsom Zika, denguefeber och malaria. Analyser för snabb, hög genomströmning analyser av unformulated roman kemier mot mygglarver och vuxna presenteras. Vi beskriver protokoll för enstaka punkt-dos och dosen svar analyser att utvärdera toxiciteten av liten molekyl kemier till Aedes aegypti vektor Zika, denguefeber och gula febern, vektorn som malaria, Anopheles gambiae och norra hus mygga, Culex quinquefasciatus, på kontakt och via förtäring. Som ett exempel utvärderat vi toxiciteten av amitriptylin, en liten molekyl antagonist av G-proteinkopplade receptorer, via larver, vuxen aktuella och vuxen blod-utfodring assay. Protokollen ger en utgångspunkt för att undersöka insektsmedel potentiella. Resultaten diskuteras i samband med ytterligare experiment att utforska produkt program och mekanismer för leverans.
Introduction
Myggor överför smittämnen av smittsamma sjukdomar som påverkar människors hälsa globalt1. De tre viktigaste mygga släkten påverkar folkhälsan är Aedes, Anopheles, och Culex. Arter av Aedes myggor vektor de arboviruses som orsakar Zika, denguefeber, gula febern och chikungunya. Anopheles arter vektor malariaparasiter och Culex arter överför West Nile-virus och timori nematoder2. World Health organisation (WHO) har kallas för utrotning av tio försummade tropiska sjukdomar (NTD) av 20203 och identifierats myggbekämpning som mest livskraftig strategi. Insekticider är kraftfulla verktyg att kontrollera myggor och minska sjukdom överföring4,5. Uppkomsten av insektsmedel-resistenta mygga populationer hotar dock fortsatt kontroll av många sjukdomar6,7,8. Den innovativa Vector kontroll Consortium (IVCC) har lanserat den första dedikerade ansträngningen för att utveckla ersättare insekticider för mygga kontroll9. Nya insekticider med nya verkningssätt (MoA) behövs för att uppfylla som mål och uppnå sjukdomskontroll. Upptäckten och utvecklingen av nya insektsmedel klasser med romanen MoAs kräver hela organismen analyser för snabb, hög genomströmning analys av kemiska sammansättningar och jämfört med industrin standards10.
Flera analyser finns tillgängliga att utvärdera avskräckning och toxicitet av insekticider till larver och vuxna myggor, och vissa är lämpliga för utvärdering av romanen formulerad eller unformulated kemier. WHO protokoll11 är en kontakt analys används för att testa produkter mot fjärde instar larver. Publicerade studier också beskriva en mängd larver analyser används för att testa toxiciteten av liten molekyl kemier till larver av Aedes aegypti, Anopheles gambiae och Culex quinquefasciatus10,12, 13,14,15,16. Centers for Disease Control and Prevention (CDC) flaska Biotest används för att bedöma insektsmedel motstånd i fältet Fångad populationer av vuxna myggor via utvärdering av dödlig koncentration (LC) och dödliga tid (LT) jämfört med en standard diagnostiska dosen av en kommersiell insektsmedel17. WHO känslighet test erbjuder en annan metod för att utvärdera insektsmedel motstånd vuxna myggor whereby myggor utsätts för insektsmedel-impregnerat papper inuti glasampuller för 1 h och dödlighet bedöms på 24 h18. Andra analyser spraya formuleringar släpper förseglade burar och rekord mygga knockdown och död vid önskade tidpunkter19. Topikal applicering till mygga bröstkorgen har använts för att utvärdera styrkan av olika bekämpningsmedel20. De Liverpool insekt testning etablering (LITE)21 sysselsätter standardrutineratt utvärdera bioaktiviteten av kemiska sammansättningar vuxna mygg. LITE vuxen aktuella analysen gäller en liten volym av testprodukten bröstkorgen av vuxna myggor med dödlighet gjorde på 48 h. Analysen möjliggör kvantifiering av den dosen som mottagits per enskilda mygga21. LITE böjd analysen utvärderar toxiciteten av testprodukten vuxna mygg vilar på ett kemiskt behandlad yta och används för att identifiera kemiska sammansättningar med utvecklingspotential som inomhus kvarstående sprayer (IRS) eller använda i insektsmedel behandlade myggnät (ITN) att styra Anopheles myggor.
WHO och CDC analyser har begränsningar för att testa nya, unformulated kemier, för att målet med CDC flaska bioassayen är utvärdering av känslighet över kort assay perioder (två timmar) snarare än toxicitet22,23. Dessutom analyser för att utvärdera toxiciteten av kemiska sammansättningar levereras i blodmjöl och potential för utveckling av systemisk verkande produkter (dvs. endektocider) saknas. Här beskriver vi analyser för att testa nya kemiska sammansättningar som är lösliga i vatten eller en av flera organiska lösningsmedel mot larver och vuxna Aedes, Anopheles och Culexmosquitocidal verksamhet. Det första vi demonstrera en larval assay tidigare beskrivs av vår grupp10,12,13,16, och utförs här som (1) en skärm för att snabbt utvärdera flera kemiska sammansättningar på enda punkt dos, och (2) en dos svar analysen till att bestämma en enda kemi dödlig koncentration (t.ex. LC50, LC75 eller LC90,). Därefter beskriver vi två vuxna analyser för bestämning av dödlig dos (LD). Först av dessa är en anpassning av det LITE-protokollet för testning av lokalt applicerad, roman kemier mot vuxna mygg i jämförelse med en positiv kontroll. Andra är en utfodring analys för utvärdering av kemiska sammansättningar levereras systemiskt via blodmjöl.
Protocol
Obs: Alla stammar och reagenser som krävs för arbetet som beskrivs i följande protokoll och leverantörer listas i Tabell för material.
1. kultur av mygga larver och vuxna
Obs: Insekticid känsliga stammar av myggor finns från Malaria forskning och reagens referens Repository. Rekommenderas stammar är följande: Aedes aegypti Liverpool (LVP) stam, Anopheles gambiae Kisumu (KISUMU1) stam och Culex quinquefasciatus Johannesburg (JHB) stam.
- Kultur mygglarver från ägg på en 12 h dag/12 h natt cykel vid 28 ° C och 75-85% relativ luftfuktighet (RH) i 25 cm x 40 cm plast fack (~ 400 larver per bricka) som beskrivs av Nuss29. Mata de larver marken gerbil (A. aegypti och An. gambiae) eller flaga fiskmat (C. quinquefasciatus). För larval analyser, samla larver på den tredje larvstadium för (L3) instar.
- Bakre vuxna myggor från puppor som har överförts till plastmuggar och plats inuti 20 L plast burar i en insectary enligt de villkor som beskrivs ovan. Upprätthålla myggor på 20% sockerlösning som beskrivs på andra ställen29. Samla vuxna på 3-5 dagar efter uppkomst.
2. larval kontakt Assay (punkt engångsdos eller dos svar Assay)
Obs: Analysen kan utföras med kemiska sammansättningar som är lösliga i vatten eller dimetyl sulfoxid (DMSO), förutsatt att den slutliga koncentrationen av DMSO i test brunnar inte överstiger 1%. Alternativa lösningsmedel kan vara ett alternativ, men det är viktigt att först bekräfta att slutliga koncentration inte orsakar mer än 10% dödlighet på 72 h efter exponering. Analysen kan utföras som en enda dos eller dosen svar assay. Om det senare, det rekommenderas att testa en serie koncentrationer (minst fem), som spänner över de förvänta LC50.
- Etikett brunnarna klara 24-väl vävnad platta som visas i figur 1.
- Förbereda en stamlösning av test kemin i en 1,5 mL tub.
- Väga varje kemi använder en Analysvåg, och beroende på löslighet egenskaper, återsuspendering i sterila ddH2O, DMSO eller andra lämpliga organiska lösningsmedel av val (se figur 2).
Anmärkning: Beräkningarna bör beakta renheten av kemi. Till exempel för en kemi som är 99% ren, lös 10,1 mg i 1000 µL av aceton till att få en 1% lösning. Försegla med paraffin filma och förvaras vid-20 ° C.
- Väga varje kemi använder en Analysvåg, och beroende på löslighet egenskaper, återsuspendering i sterila ddH2O, DMSO eller andra lämpliga organiska lösningsmedel av val (se figur 2).
- Avgöra den slutliga koncentrationen av test kemi som kommer att utvärderas och förbereda seriespädningar från stamlösning därefter, med hjälp av lämpligt lösningsmedel.
Obs: Koncentration och volym av kemi och lösningsmedel kan beräknas med formeln C1* V1= C2* V2 där C1= koncentration av prov 1, C2= koncentration av prov 2, V1= volymen av prov 1 och V2= volymen av prov 2. Se exempel beräkningar visas i figur 2 och tabell 1.- Förbereda en 10 mM stamlösning och seriella utspädningar som krävs för att erhålla önskad testkoncentrationer (tabell 1B).
- Med pipett wide-bore plast överföring överföra fem L3 larver till brunnen av en vävnadskultur test platta. L3 larver kan erkännas av längd (~ 2,5-3,5 mm) och huvud kapsel bredd ~ 0,025 mm24. Försiktigt bort vattnet med en 1 mL pipett och ersätta med önskad volym ddH2O (se nedan). Upprepa att erhålla n = 4 tekniska replikat per behandling (dvs. 20 larver totalt per behandling).
- Lägga till lämplig volym av test kemi i alla fyra replikera brunnarna i 24-väl testa plattan och snurra försiktigt på plattan för att säkerställa enhetlig blandning av kemi. Placera plattan i en test- eller tillväxt kammare konstant villkor (t.ex. 25 ° C och ~ 75-85% RH rekommenderas, och en 12 h ljus/12 h mörka cykel om möjligt).
Obs: För reproducerbarhet mellan experiment, säkerställa efterföljande analyser utförs under samma miljöförhållanden. - Registrera antalet döda/icke-lyhörd larver i varje brunn på 30 min, 1, 1.5, 2, 3, 24, 48 och 72 h efter exponering (eller alternativa tidpunkter) i bladet Poäng (tabell 2). Knacka försiktigt på sidan av plattan. Om ingen rörelse observeras, tryck försiktigt larven med en steril tandpetare. Poäng larver som inte reagerar knacka/touch som ”död”.
Obs: Andra morfologiska och beteendemässiga fenotyper kan observeras och kan registreras. - Korrigera för kontrollgruppens mortalitet med den modifierade Abbotts formel om så önskas enligt följande:
Dödlighet (%) = (X-Y) * 100/(100-Y),
där X = procent dödlighet i behandlade prov och Y = procent dödlighet i kontrollen. - Diagram resultat som ett histogram eller logaritmisk kurva med programvara val såsom graf-pad Prism 6 eller liknande, och beräkna dödlig koncentration (LC) värden i förhållande till kontroll.
- Upprepa analysen använder ett separat parti av myggor för att erhålla n = 3 eller mer biologiska replikat.
3. vuxna aktuell Assay (punkt engångsdos eller dos svar Assay)
Obs: Vuxen aktuella analysen utförs med aceton som lösningsmedel. Alternativa lösningsmedel kan vara ett alternativ, men det är viktigt att först bekräfta att slutliga koncentration inte orsakar mer än 10% dödlighet på 48 h efter exponering. Analysen kan utföras som en enda dos eller dosen svar haltbestämning och används för att bestämma dödlig dos (LD). Om det senare, det rekommenderas att testa en serie koncentrationer (minst fem), som spänner över de förvänta LD50.
- Bestämma antalet vuxna kvinnliga myggor som krävs för att slutföra analysen.
Obs: En punkt dos analysen med en enda kemi kommer att kräva ett minimum av 90 myggor (30 för den positiva kontrollen, 30 för aceton-bara negativ kontroll och 30 för test kemi). - Kultur 3 till 5 dagar gamla vuxna kvinnliga myggor och flytta till en separat 20 mL plast hink med en insugningsventil (figur 3).
- Märk 9 oz pappersmuggar med namn och koncentration av test kemi. Avsätta 10 x 10 cm maska torg och gummiband för varje kopp (se figur 4).
- Välj en befintlig insekticid som positiv kontroll (t.ex. den syntetiska pyretroidbaserade, bifentrin) och förbereda 1% stamlösning (10 µg/µL) i aceton.
Anmärkning: Beräkningarna bör beakta renheten av kemi. Till exempel för en kemi som är 99% ren, lös 10,1 mg i 1000 µL av aceton till att få en 1% lösning. Försegla med paraffin filma och förvaras vid-20 ° C. - Med samma procedur som ovan, förbereda en stamlösning av test kemi.
Obs: Många test kemiska sammansättningar är mycket labila och lösningar bör helst göras färsk varje gång bioassayen utförs. - Bered seriella utspädningar av den positiva kontrollen och testa kemiska sammansättningar från stamlösningar som visas i figur 5 med 20 mL injektionsflaskor av glas tidigare sköljas med aceton.
- Rensa en 1 mL glasspruta med aceton, fyll med aceton och säkra i mikro-applikatorn justerat för att leverera en mängd 0,25 µL.
- Arbetar i partier av tio, ta bort 3 - 5 - dagar gamla vuxna kvinnliga myggor från burar med en insugningsventil och söva för upp till fem minuter vid 4 ° C i kylskåp eller på is. Nästa, överföra myggor till en petriskål och plats på is för upp till 10 min.
- Arbeta snabbt, ta bort en enda kvinna med fina pincett, och gälla dorsala bröstkorgen med hjälp av spruta mikro-applikatorn 0,25 µL av provlösningen. Bekräfta leverans av kemi genom observation med dissekera Mikroskop för att säkerställa varje mygga får lämplig volym av test kemi.
- Överföra mygga till en märkt papper kopp vilar på is, och upprepa nio gånger att få n = 10 behandlade myggor. Försegla myggor i koppen med en maskstorlek som är fyrkantig säkrade med gummiband och överföring till en plast badkar eller tillväxt kammare konstant villkor vid 28 ° C och 75-85% RH (på en 12 h dag/12 h natt cykel är att föredra).
- Upprepa ovanstående experimentet två gånger för att få n = 3 tekniska replikat (dvs 30 myggor totalt) per behandling eller kontrollgruppen.
- Upprepa steg 3,7-3.10 först med test kemi och sedan den positiva kontrollen.
Obs: En annan användbar kontroll att inkludera om tillräcklig myggor finns är en ”tom” av 30 sövda myggor som inte får antingen test kemi eller lösningsmedel. - Registrera antalet ”döda/icke-lyhörd” myggor på 30 min, 60 min, 2, 24 och 48 h efter exponering (eller alternativa tidpunkter) med hjälp av bladet Poäng (tabell 3). Poäng myggor som ”döda/icke-lyhörd” om de visar brist på rörelse, definierat som på ena sidan eller på baksidan och med oförmåga att flyga.
- Om du vill korrigera för kontrollgruppens mortalitet med den modifierade Abbotts formel enligt följande:
Dödlighet (%) = (X-Y) * 100/(100-Y),
där X = procent dödlighet i behandlade prov och Y = procent dödlighet i kontrollen. - Visa resultat som ett histogram eller en exponentiell kurva. För en dos svar analys, beräkna den LD50, LD75 eller LD90 värde för testet kemi i förhållande till kontroll.
- Upprepa analysen minst två gånger med separata satser av myggor för att erhålla n = 3 eller mer biologiska replikat.
4. vuxen blod-utfodring Assay (punkt engångsdos eller dos svar Assay)
- Samla cirka 150 4-5-dagars gamla vuxna kvinnliga myggor och överföring till en separat bur. Upprepa för att få 6 burar om utför en dos svar analys. Ta bort källan av socker 1-24 h före utfodring analysen.
- Förbereda en stamlösning av kemi som beskrivs ovan, står för renhet av kemi (en typisk stamlösning är 80 mM i vatten eller salt buffert), och därefter förbereda seriespädningar i vatten/buffert som krävs.
- Lägga till 40 µL av varje spädningarna 960 µL av defibrinated kanin blod att erhålla den önska testkoncentrationen. Gälla en Matande enhet membranet film och förslut med en gummiring. Överför 1 mL blod via pipett och montera utfodring ett värmeelement.
- Försiktigt gjorde pinnen membranet yta med nymalen 10% mjölksyra lösning och plats utfodring enheten in buren av vuxna myggor. Täck buren med en mörk duk eller svart soppåse och låt myggor att mata i en timme.
- Upprepa steg 4.2-4.4 för återstoden av testlösningar och den negativa kontrollen (endast blod).
- Efter utfodring, placera hinkar vid 4 ° C i ett kylskåp för 5 min att söva myggor. Ta bort manliga myggor och icke-matade kvinnliga myggor, och räkna och anteckna antalet matas och delvis matas myggor vid undersökning av buken.
- Behålla delvis och helt fodrat kvinnliga myggor, siktar på minst 50 blod matad myggor per dos.
- Överföra hinkar till en plast badkar eller tillväxt kammare konstant villkor vid 28 ° C och 75-85% RH (på en 12 h dag/12 h natt cykel är att föredra).
- Registrera det totala antalet döda/icke-lyhörd myggor på 0,5, 1, 1.5, 2, 24, 48 och 72 h (eller alternativa tidpunkter som önskat) använda poängen blad (tabell 4).
- På tredje dagen inlägg blod utfodring, införa en äggkopp i buren och samla ägg under 72 h. Räknas det totala antalet ägg som produceras per behandling i dissekera Mikroskop.
- Beräkna procent dödlighet och fruktsamhet som en funktion av det totala antalet matas myggor för varje behandlingsgrupp och kontroll. Korrigera för kontrollgruppens mortalitet med den modifierade Abbotts formel om så önskas.
- Visa toxicitet och fruktsamhet data som ett histogram tomt eller en exponentiell kurva (om utför en dos svar assay) med programvara av val. Om en dos svar assay, beräkna den LD50, LD75 eller LD90 värde för testet kemi i förhållande till kontroll.
- Upprepa analysen minst två gånger med separata satser av myggor för att erhålla n = 3 eller mer biologiska replikat.
Representative Results
Figur 6 visar procent dödlighet av L3 Ae. aegypti efter exponering för fem doser av dopamin-receptorantagonist, amitriptylin i jämförelse med vattnet bara (negativ) kontroll vid 24, 48 och 72 h. I det här exemplet de insamlade vid varje tid-punkt visas en typisk logaritmisk kurva och avslöjar en dosberoende effekt av amitriptylin på larval dödlighet. LC50 värdet minskar under tiden av experimentet och kan beräknas med hjälp av 72 h data (dvs., mittpunkten av logaritmisk kurvan).
Figur 7 visar procent dödligheten hos 3 - 5 dagar gamla vuxna honor Ae. aegypti efter exponering för en 400 µM dos (10 µg/µL) av den dopamin-receptorantagonist, amitriptylin och i jämförelse med de syntetiska pyretroidbaserade, bifentrin-positiv kontroll (teknisk kvalitet; 500 pg/µL), aceton-bara negativ kontroll och obehandlad myggor (tomt). I det här exemplet orsakar både amitriptylin och bifentrin betydande dödlighet hos vuxna i förhållande till den negativa kontrollen. Observera att dödlighet hos vuxna minskar över tiden, förmodligen på grund av metabola avgiftning av test kemiska sammansättningar.
Figur 8 visar procent dödlighet (vänster y-axeln) av 3-5 dag gammal vuxen hona Ae. aegypti matas en blodmjöl som behandlats med en av fyra doser av dopamin-receptorantagonist, amitriptylin och fruktsamhet (axeln höger; genomsnittliga ägg greve / kvinnliga) för den första gonotrophic cykel post exponeringen jämfört med kontroll myggor (blod-matade bara; negativ kontroll). Data visar att det finns ingen signifikant effekt av amitriptylin på dödlighet hos vuxna i förhållande till kontroll men visar att amitriptylin avsevärt ökar fruktsamhet vid den högsta dosen (400 µM).
Figur 1 . Set-up larval dos svar analysens. Bilden visar på uppbyggnaden av larval dos svar analysen utförs med Aedes aegypti L3 larver i plattan 24 brunnar.
Figur 2 . Schematisk visar proceduren för uppsättning a enda dos eller (B) dos svar larval assay i plattan 24 brunnar. Efter överföring av fem L3 larver till brunnar, överflödigt vatten försiktigt bort via pipett och ersättas med färska, sterila ddH2O. Nästa, lager och seriespädningar av test kemi är beredd och läggs till en slutlig volym av 1 mL per brunn. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 . Kultur av vuxna myggor. Bilden visar 20 L plasthink för kultur av vuxna myggor och användning av en insugningsventil brukade ta bort myggor.
Figur 4 . Adult aktuell analys utförs med 4-5 dagars gammal kvinna Aedes aegypti. Efter behandling med kemi eller lösningsmedel, vuxen myggor placeras i pappersmuggar och överförts till en provkammare för varaktigheten av analysen.
Figur 5 . Lager och seriespädningar. Schematiskt diagram visar förfarandet för utarbetande av (A) stock och (B) serial testlösningar för vuxna aktuella analysen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 . Representativa uppgifter från en larval kontakt dos svar assay. Representativa uppgifter från en larval kontakt dosrespons analysen visar procent dödlighet av Aedes aegypti L3 larver efter exponering för dopamin-receptorantagonist, amitriptylin vid 24, 48 och 72 h. Varje datapunkt representerar medelvärdet i µM ± SEM. Data representerar n = 3 biologiska replikat.
Figur 7 . Representativa uppgifter från en aktuell vuxendos svar assay. Representativa uppgifter från en aktuell vuxendos svar analys visar toxicitet av dopamin-receptorantagonist, amitriptylin (10 µg/µL) till 3-5 dagars gammal kvinnlig Aedes aegypti i förhållande till de syntetiska pyretroidbaserade, bifentrin (500 pg/µL) positiva kontroll) och negativ kontroll (endast aceton-fordon) vid 2, 24 och 48 timmar. Uppgifterna representerar n = 3 biologiska replikat. Felstaplar visar SEM.
Figur 8 . Representativa uppgifter från en vuxen förtäring assay. Representativa uppgifter från en vuxen förtäring-analysen visar toxicitet av dopamin-receptorantagonist, amitriptylin vid 100 µM, 200 µM och 400 µM dosen till 3-5 dagars gamla vuxna kvinnliga Aedes aegypti och effekter på fruktsamhet (uttryckt som den genomsnittliga totala ägg (räknas per hona över den första gonotrophic-cykeln). Uppgifterna representerar n = 3 biologiska replikat ± SEM.
| A. enda dos analyser med tre kemier | |||||
| Kemi | Koncentration (400 uM) | ||||
| Amitriptylin | 80 mM lager: 2 mg amitriptylin X 98% (renhet pulver) X 0,001 g / 1 mg X 1 mol /313.86 g X 1 L/0,08 mol X 106 µL/L = 78.06 µL av vatten. | ||||
| Seriespädningar: Späd lager 1:2 med ddH2O och sedan 1:4 att uppnå 10 mM. Tillsätt 40 µL 10 mM lager till brunn innehållande 960 µL av ddH20 att uppnå en slutlig koncentration på 400 µM per brunn. Bered seriella utspädningar av 10 mM lager 1:2 att uppnå 5 mM, 2,5 mM, 1,25 mM och 0,625 mM lager. | |||||
| CIS-(z)-flupenthixol | 80 mM lager: 2 mg cis (z) flupenthixol X 98% (renhet pulver) X 0,001 g / 1 mg X 1 mol/507.44 g cis (z) flupenthixol X 1 L/0.08 mol X 106 µL/L = 48.28 µL av vatten. | ||||
| Seriespädningar: Som ovan. | |||||
| Amitraz | 80 mM lager: 2 mg Amitraz X 0,001 g / 1 mg X 1 mol/293.4 g av amitraz X 1 L/0.08 mol X 106 µL/1 L = 85.21 µL av DMSO (Obs: Amitraz är endast lösliga i DMSO). | ||||
| Seriespädningar: Som ovan. | |||||
| B. dos svar assay | |||||
| Kemi | Dos 1 | Dos 2 | Dos 3 | Dosen 4 | Dosen 5 |
| 400 ΜM | 200 ΜM | 100 ΜM | 50 ΜM | 25 ΜM | |
| t.ex. amitriptylin, cis-(Z)-flupenthixol eller amitraz | 40 ΜL | 40 ΜL | 40 ΜL | 40 ΜL | 40 ΜL |
| 10 mM lager | 5 mM lager | 2,5 mM lager | 1,25 mM lager | 0,625 mM lager | |
Tabell 1. Exempel beräkningar för Aedes aegypti larver L3 a single peka dos assay och (B) dos svar haltbestämning.
Tabell 2. Exempel Poäng blad används för att registrera data från mygga larvformer dos svar analysens. Kontroll, endast vatten eller vatten med 1% DMSO eller andra lösningsmedel endast. Typiska doser används för att testa småmolekylära antagonist kemier såsom amitriptylin är 25 µM, 50 µM, 100 µM, 200 µM och 400 µM.
| Mygga vuxen (3-5 dag gamla) aktuell analys | ||||||
| Datum initieras: | ||||||
| Utredare: | ||||||
| Art/stam: | ||||||
| Assay typ: Enda punkt dos/dos respons | ||||||
| A. dödlighet (nr. Döda myggor) | ||||||
| (Timmar) | Dos 1 | Dos 2 | Dos 3 | Dosen 4 | Dosen 5 | Kontroll |
| 0,5 | ||||||
| 1 | ||||||
| 1.5 | ||||||
| 2 | ||||||
| 2.5 | ||||||
| B. procent dödlighet | ||||||
| (Timmar) | Dos 1 | Dos 2 | Dos 3 | Dosen 4 | Dosen 5 | Kontroll |
| 0,5 | ||||||
| 1 | ||||||
| 1.5 | ||||||
| 2 | ||||||
| 2.5 | ||||||
Tabell 3. Exempel Poäng blad används för att registrera data från aktuell vuxendos svar analysens.
| Mygga vuxen (3-5 dag gamla) intag Assay | ||||||
| Datum initieras: | ||||||
| Utredare: | ||||||
| Art/stam: | ||||||
| Assay typ: Enda punkt dos/dos respons | ||||||
| A. antal matas myggor | ||||||
| Dos 1 | Dos 2 | Dos 3 | Dosen 4 | Dosen 5 | Kontroll | |
| Utfodras | ||||||
| Inte Fed | ||||||
| Totalt | ||||||
| % Fed | ||||||
| % Inte Fed | ||||||
| B. dödlighet (nr. Döda myggor) | ||||||
| (Timmar) | Dos 1 | Dos 2 | Dos 3 | Dosen 4 | Dosen 5 | Kontroll |
| 2 | ||||||
| 24 | ||||||
| 48 | ||||||
| 72 | ||||||
| C. procent dödlighet | ||||||
| (Timmar) | Dos 1 | Dos 2 | Dos 3 | Dosen 4 | Dosen 5 | Kontroll |
| 2 | ||||||
| 24 | ||||||
| 48 | ||||||
| 72 | ||||||
Tabell 4. Exempel Poäng blad används för att registrera data från vuxna blod-utfodring analysens. Typiska doser används för att testa småmolekylära antagonist kemier såsom amitriptylin är 50 µM, 100 µM, 200 µM och 400 µM.
Discussion
Insekticider är kraftfulla verktyg att bekämpa myggor sjukdomar såsom malaria25, denguefeber och Zika26. Omfattande insektsmedel användning har producerat mygga populationer att är resistenta mot kemisk bekämpning, leder till resistensutveckling insektsmedel, som anses vara det enskilda största hotet mot fortsatt sjukdomskontroll. Det senaste decenniet har sett en dramatisk ökning av populationer av Anopheles spp. resistenta mot syntetiska Pyretroider (SPs) används i myggnät i Afrika7. Populationer av Aedes albopictus, en vektor av denguefeber och Zika, har rapporterats i Florida och New Jersey som är resistenta mot organiska fosfater6. På samma sätt har motstånd mot DDT och pyretroider dokumenterats i populationer av Anopheles och Aedes spp. i Colombia27,28. Det finns akut behov av att utveckla nya larvicides och adulticides som binder till olika orthosteric eller Alloster platser på kända molekylära mål eller att störa nya mål (dvs, romanen MoA kemier)29,30 och har minimal miljöpåverkan. Det ökar också erkännande av potential runt endektocider för mosquito control31,32,33.
För att underlätta den snabba utvecklingen av sådana produkter, beskriver vi en serie av protokoll utformade för att utvärdera toxiciteten av liten molekyl kemier mygglarver och vuxna via två leveransvägar - kontakt och förtäring. Protokoll som WHO känslighet testet och CDC flaska analysen inte används för utvärdering av toxicitet och avskräckning befintliga insektsbekämpning formuleringar1,2. Dock dessa analyser har begränsningar för analyser av unformulated roman kemiska entiteter (NCEs) och är inte mottagliga för testa ett stort antal kemiska sammansättningar i måttlig eller hög genomströmning.
Här beskriver vi en standard larval analysen för att snabbt utvärdera NCEs i enda dos som kan skala för hög genomströmning analyser. Vi beskriver också en anpassning av en analysmetod som utvecklats av de LITE21 att utvärdera kontakt toxiciteten av liten molekyl kemier vuxna mygg. Slutligen vi beskriva ett intag test för att utvärdera toxiciteten av NCEs levereras via blod måltiden till vuxna kvinnliga myggor och utforska endectocide potential. Dessa larver och vuxna analyser kan utföras på en rad olika doser för att fastställa värden för LC och LD, respektive, och både larver och vuxna kontakt analyser kan utföras i jämförelse med en eller flera befintliga kemiska beredningar. Adult aktuella analysen möjliggör också beräkningen av LD värden per enskilda mygga. Protokollen kan utföras med arter av Aedes, Anopheles och Culex16,29 och kunde modifieras för att passa specifika biologiska egenskaper av en art, om så önskas. Vår erfarenhet mosquitocidal kemier uppvisar vanligtvis bred aktivitet över dessa tre släkten16,29, men det finns värde att bedömning av arter selektivitet.
Analyserna är en utgångspunkt för att snabbt skärmen flera kemiska sammansättningar för insektsbekämpning verksamhet. Dessa kemiska sammansättningar som uppvisar toxicitet i en eller flera analyser kan väljas för ytterligare analyser via sekundära och tertiära analyser. Exempel är LITE böjd assay och socker utfodring analyser34,35. Val av ytterligare analyser bestäms vanligtvis av överväganden kring förväntade marknaden och ansökan, med resultat som ger insikter till möjliga produkt leveranslägen. I de representativa resultat visas här, utforskar vi toxiciteten av amitriptylin, en antagonist av däggdjur och ryggradslösa dopaminreceptorer som har utvärderats för potential som en roman MoA insektsmedel10,12, 13 , 16. amitriptylin uppvisade toxicitet larver och vuxna av Ae. aegytpi i den μg utbud tyder på larvicid adulticidal aktivitet och ger grund för en utforskning av en amitriptylin-baserade kemisk serie att identifiera analoger med hög potens. Ingen signifikant effekt på mortalitet eller fruktsamhet hos Ae. aegypti utsätts för amitriptylin i blod måltiden. Även stabiliteten i kemi i defibrinated blod och effektiv dos som mottagits per mygga inte är känd, anmärkningsvärda begränsningar i analysen, data tyder på att amitriptylin och andra GPCR-aktiva föreningar kan ha lite potential som endektocider, på minst i unformulated staten.
Försiktighetsåtgärder för att begränsa biologisk variation mellan analyser är nödvändiga. Alla analyser ska utföras under standart villkorar av temperatur och fuktighet, helst i en insekters tillväxt kammare, för att säkerställa reproducerbarhet. Det är absolut nödvändigt att standardisera förfarandena för scoring fenotypiska slutpunkter eftersom dessa kan vara mycket subjektivt, vilket leder till betydande variation i data inspelad av olika laboratoriepersonal. Larval analysen är bäst lämpade för utvärdering av kemiska sammansättningar som är lösligt i vatten, även om analysen kan utföras med organiska lösningsmedel som DMSO förutsatt att den slutliga koncentrationen är mindre än 1% per brunn. Vi känner igen flera begränsningar till de vuxna aktuell analysen. Först är det nödvändigt att arbeta snabbt när du förbereder seriella utspädningar och levererar doser som transportören (aceton) är mycket volatila och avdunstning kan ge variation av mängden kemi levereras. För det andra bör vara försiktig att begränsa perioden av anestesi eftersom detta kan bidra till mortalitet. Det bör också noteras att lösningsmedel som aceton kan producera en snabb ”knock-down”-effekt i de första flera timmarna av aktuella analysen, som inte ska förväxlas med effekter på grund av test kemi. Vi noterar att volymen av mygga blod måltiden varierar mellan individer, komplicerar en bedömning av den dosen som mottagits per vuxen i vuxen förtäring-analysen. Slutligen bör analysen data inte betraktas i de fall där dödligheten i den negativa kontrollen överstiger 10%.
Produkter som fungerar synergistiskt är alltmer erkända för sin potential att förlänga nyttan av befintliga produkter och ger kontroll av insektsmedel resistenta pest populationer15,16,36. Larval analyser har använts för att undersöka synergier mellan formamidine bekämpningsmedlet, amitraz och en mängd kemiska sammansättningar som stör ryggradslösa oktopamin receptorer14,15. Den larval assay och vuxen aktuell analys beskrivs är lämpliga för att utvärdera synergistisk eller additiva effekter mellan kombinationer av test kemiska sammansättningar. Vi noterar att synergister såsom piperonyl butoxide (PBO) kan införlivas i varje av de tre analyser som beskrivs här.
De ovan beskrivna analyserna ger en standardiserad experimentell serie för utvärdering av unformulated, liten molekyl läkemedel mot akvatiska och terrestra mygga levnadsstadier. Dessa analyser är specifikt utformade för att utvärdera toxicitet och erbjuder flera fördelar jämfört med befintliga analyser gemensam användning. Ännu viktigare, analyserna är mottagliga för automatisering och kan utföras i industriell skala att möjliggöra utvärdering av tusentals test föreningar. Slutligen som fältet anser utveckling av produkter som fungerar via nya MoAs, inklusive via störningar av romanen molekylära mål och biokemiska vägar, det kommer att vara nödvändigt att Poäng flera fenotypiska slutpunkter utöver dem som dödlighet och förlamning. De ovanstående analyserna tillåta sådana utredningar, vilket ger ett steg mot morgondagens innovativa insektsbekämpning teknik.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Författarna tackar H. Ranson, Liverpool skola för tropisk medicin för hjälp med assay utveckling och tillhandahållande av det LITE-protokollet, och M. Scharf, Purdue University för råd angående assay design.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Insecticide susceptible mosquito strains | Malaria Research and Reagent Reference Repository | https://www.beiresources.org/MR4Home.aspx; Recommended strains: Aedes aegypti Liverpool (LVP) strain, Anopheles gambiae Kisumu (KISUMU1) strain and Culex quinquefasciatus Johannesburg (JHB) strain | |
| Acetone | Mallinckrodt Chemical | CAS 67-64-1 | Use for dilutions and control |
| Amitraz | Sigma-Aldrich | CAS 33089-61-1 | Requires dilution in DMSO |
| Amitriptyline | Sigma-Aldrich | CAS: 549-18-8 | Can be diluted in acetone |
| Bifenthrin | Sigma-Aldrich | CAS: 51529-01-2 | Synthetic pyrethorid used as positive control |
| Cis-(Z)-flupenthixol | Sigma-Aldrich | CAS: 51529-01-2 | Pharmacologically tested as disruptor of dop-like receptors |
| Defibrinated rabbit blood | Hemostat | DRB0100 | Blood source for adapted mosquitoes to artificial feeding |
| Dimethylsulphoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | MKBF2985 | Organic solvent used to disolve amitraz |
| Hemotek membrane feeding system | Hemotek Ltd | Serial no. 1303 | Used for feeding mosquitoes |
| Micro-applicator | Burkard Manufacturing Co. | - | Tool needed for topical application experiments |
| 24-well cell culture plate with lid | Corning Incorporated | 3526 | - |
| Advantage rubber bands | Alliance Rubber Co. | - | Used to seal the paper cups |
| Glass syringe (1 ml) | Becton Dickinson and Co. | 512004 | Needed for the micro-applications. Glass is better than plastic |
| Disposable scintillation vials (20 ml) | Fisher Scientific | 74505-20 | Glass vials prevent evaporation |
| Tulle fabric, white | Walmart | - | - |
| Paper cups | Dixie Consumer Products LLC. | PF15675/13D | Used to keep adult mosquitoes in adult topical assays |
| Petri dishes (150 mm) | Corning Life Sciences | - | Used to maintain the mosquitoes "slept" on cold without direct contact with ice |
| Transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | Used to sort larvae |
| Stereo microscope | Olympus | SZ6045 | Used to score larval assays and perform micro-applications |
| Tweezers (fine) | Fontax | - | Used to handle adult mosquitoes |
References
- World Health Organization. A global brief on vector-borne diseases. , Available from: www.who.int/about/Licensing/copyright_form/en (2014).
- World Health Organization. Vector-borne diseases. , Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs387/en (2016).
- World Health Organization. Report by the Secretariat. Neglected tropical diseases; Prevention, control, elimination and eradication. , Available from: http://www.who.int/neglected_diseases/A66_20_Eng.pdf (2013).
- Tolle, M. A., et al. Mosquito-borne diseases. Curr Probl Pediatr Adolesc Health Care. 39 (4), 97-140 (2009).
- Chen, C. D., et al. Dengue vectors surveillance in endemic areas in kuala lumpur city centre and selangor state, malaysia. Dengue Bulletin. 30, (2006).
- Marcombe, S., et al. Insecticide resistance status of united states populations of Aedes albopictus and mechanisms involved. PLoS ONE. 9 (7), e101992 (2014).
- Ranson, H., et al. Pyrethroid resistance in African anopheline mosquitoes: what are the implications for malaria control? Trends in Parasitology. , 1-8 (2010).
- Hemingway, J., Ranson, H. Insecticide resistance in insect vectors of human disease. Annual Review of Entomology. 45, 371-391 (2000).
- Hemingway, J., Beaty, B. J., Rowland, M., Scott, T. W., Sharp, B. L. The Innovative Vector Control Consortium: improved control of mosquito-borne diseases. Trends in Parasitology. 22 (7), 308-312 (2006).
- Meyer, J. M., et al. A "genome-to-lead" approach for insecticide discovery: Pharmacological characterization and screening of Aedes aegypti D 1-like dopamine receptors. PLOS Neglected Tropical Diseases. 6 (1), e1478 (2012).
- World Health Organization. Instructions for determining the susceptibility or resistance of mosquito larvae to insecticides. , Available from: http://apps.who.int/iris/handle/10665/69615 (1981).
- Hill, C. A., et al. Re-invigorating the insecticide discovery pipeline for vector control: GPCRs as targets for the identification of next gen insecticides. Pestide Biochemistry and Physiology. 106 (3), 141-148 (2013).
- Conley, J. M., et al. Evaluation of AaDOP2 Receptor antagonists reveals antidepressants and antipsychotics as novel lead molecules for control of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeautics. 352 (1), 53-60 (2015).
- Ahmed, M. A. I., Matsumura, F. Synergistic actions of formamidine insecticides on the activity of pyrethroids and neonicotinoids against Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 49 (6), 1405-1410 (2012).
- Ahmed, M. A. I., Vogel, C. F. A. Synergistic action of octopamine receptor agonists on the activity of selected novel insecticides for control of dengue vector Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) mosquito. Pesticide Biochemistry and Physiology. 120, 51-56 (2015).
- Hill, C. A., et al. Comparative pharmacological characterization of D1-like dopamine receptors from Anopheles gambiae, Aedes aegypti and Culex quinquefasciatus suggests pleiotropic signaling in mosquito vector lineages. Parasites Vectors. 9 (1), 192 (2016).
- Centers for Disease Control and Prevention. Guideline for evaluating insecticide resistance in vectors using the CDC bottle bioassay. , Available from: https://www.cdc.gov/malaria/resources/pdf/fsp/ir_manual/ir_cdc_bioassay_en.pdf (2011).
- World Health Organization. Test procedures for insecticide resistance monitoring in malaria vector mosquitoes. , Available from: http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/250677/1/9789241511575-eng.pdf (2013).
- Geneva: World Health Organization. Guidelines for efficacy testing of insecticides for indoor and outdoor ground-applied space spray applications control of neglected tropical diseases who pesticide evaluation scheme. , Available from: http://www.who.int/iris/handle/10665/70070 2-53 (2009).
- Pridgeon, J. W., et al. Susceptibility of Aedes aegypti, Culex quinquefasciatus Say, and Anopheles quadrimaculatus Say to 19 pesticides with different modes of action. Journal of Medical Entomolog. 45 (1), 82-87 (2008).
- Liverpool Insect Testing Establishment. , Available from: http://www.lite-testing-facility.com (2018).
- Aïzoun, N., et al. Comparison of the standard WHO susceptibility tests and the CDC bottle bioassay for the determination of insecticide susceptibility in malaria vectors and their correlation with biochemical and molecular biology assays in Benin, West Africa. Parasites Vectors. 6, 147 (2013).
- Owusu, H. F., Jančáryová, D., Malone, D., Müller, P. Comparability between insecticide resistance bioassays for mosquito vectors: time to review current methodology? Parasites Vectors. 8, 357 (2015).
- Savignac, R., Maire, A. A simple character for recognizing second and third instar larvae of five Canadian mosquito genera (Diptera: Culicidae). , (1981).
- Bhatt, S., et al. Coverage and system efficiencies of insecticide-treated nets in Africa from 2000 to 2017. eLife. 4, 174 (2015).
- Zaim, M., et al. Alternative insecticides: an urgent need. Trends in Parasitology. 18 (4), 161-163 (2002).
- Fonseca, I., Quinoñes, M. L. Resistencia a insecticidas en mosquitos (Diptera: Culicidae): mecanismos, deteccion y vigilancia en salud publica. Revista Colombiana de Entomologia. 31 (2), 107-115 (2005).
- Fonseca-Gon Alez, I., Qu, M. L., Lenhart, A., Brogdon, W. G. Insecticide resistance status of Aedes aegypti (L.) from Colombia. Pest Management Science. 67, 430-437 (2011).
- Nuss, A. B., et al. Dopamine receptor antagonists as new mode-of-action insecticide leads for control of Aedes and Culex mosquito vectors. PLOS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 1-19 (2015).
- Shidrawi, G. R. A WHO Global Programme for monitoring vector resistance to pesticides. Bulletin of the World Health Organization. 68 (4), 403 (1990).
- Sylla, M., Kobylinski, K. C., Foy, B. D. Gates grand challenges explorations award: endectocides for controlling transmission of mosquito-borne diseases. Malariaworld Journal. 4 (5), (2013).
- Foy, B. D., Kobylinski, K. C., da Silva, I. M., Rasgon, J. L., Sylla, M. Endectocides for malaria control. Trends in Parasitology. 27 (10), 423-428 (2011).
- Chaccour, C. J., et al. Ivermectin to reduce malaria transmission: a research agenda for a promising new tool for elimination. Malaria Journal. 12 (1), 153 (2013).
- Olson, D. M., Fadamiro, H., Lundgren, J. G., Heimpel, E. Effects of sugar feeding on carbohydrate and lipid metabolism in a parasitoid wasp. Physiol Entomol. 25, 17-26 (2000).
- World Health Organization. Report of the WHO Informal Consultation. Evaluation and testing of insecticides. , Available from: http://www.who.int/whopes/resources/ctd_whopes_ic_96.1/en/ (1996).
- Huang, Q., Deng, Y., Zhan, T., He, Y. Synergistic and antagonistic effects of piperonyl butoxide in fipronil-susceptible and resistant rice stem borrers, Chilo suppressalis. Journal of Insect Science. 10, 182 (2010).
