Summary
هذه الدراسة يستخدم تقنية مجهرية () ورقة الضوء فلورية إضاءة الوجهين المزدوج جنبا إلى جنب مع مسح بصري لدراسة قلب موريني.
Abstract
الفلورية الضوء-ورقة الفحص المجهري تستخدم على نطاق واسع للحصول على الصور السريع مع ارتفاع قرار محوري من ميكرومتر إلى مقياس ملليمتر. التقنيات التقليدية للضوء--ورقة تنطوي على استخدام شعاع واحد الإضاءة الموجهة أورثوجونالي في عينة الأنسجة. صور لعينات كبيرة التي يتم إنتاجها باستخدام شعاع إضاءة واحدة تحتوي على تخطيطات أو التحف ويعانون من قرار تخفيض بسبب تشتت وامتصاص الضوء بواسطة الأنسجة. تستخدم هذه الدراسة شعاع إضاءة الوجهين المزدوج ومبسطة وضوح بصري مسح تقنية لقلب مورين. هذه التقنيات تسمح لتصوير أعمق عن طريق إزالة الدهون من القلب وإنتاج حقل كبير من التصوير، وأكبر من 10 × 10 × 10 ملم3. ونتيجة هذه الاستراتيجية تمكننا من قياس أبعاد البطين وتتبع نسب أمراض القلب، وتعريب التوزيع المكاني للبروتينات الخاصة بالقلب وقنوات أيون من بعد الولادة إلى قلوب الكبار الماوس مع تباين كافي و القرار.
Introduction
مجهرية الفلورية الضوء-ورقة تقنية وضعت في بادئ الأمر في عام 1903 ويستخدم اليوم كطريقة لدراسة التعبير الجيني وأيضا لإنتاج نماذج ثلاثية الأبعاد أو 4-د من الأنسجة العينات1،،من23. يستخدم هذا الأسلوب التصوير ورقة رقيقة من الضوء لإضاءة طائرة واحدة من عينة حيث أن فقط تلك الطائرة يتم التقاطها بواسطة الجهاز. يمكن ثم نقل العينة باتجاه المحوري لالتقاط كل طبقة، قسم واحد في كل مرة، وتقديم نموذج ثلاثي الأبعاد بعد تجهيز الصور المكتسبة4. ومع ذلك، نظراً لامتصاص وتشتت الفوتونات، كانت محدودة للعينات التي تكون أما بضعة ميكرونات سميكة أو شفافة بصريا1لسفم.
وأدت القيود المفروضة على لسفم لدراسات مستفيضة للكائنات التي لها الأنسجة التي تكون شفافة بصريا، مثل الزرد. غالباً ما تجري دراسات شملت التنمية القلب والتمايز الزرد أن هناك جينات المصانة بين البشر والزرد5،6. على الرغم من أن هذه الدراسات أدت إلى التقدم في مجال أبحاث أمراض القلب المتصلة بالقلب6،7، لا تزال هناك حاجة إجراء بحوث مماثلة على الكائنات ذات مستوى أعلى مثل الثدييات.
أنسجة القلب الثدييات تحديا نظراً لسمك والتعتيم للأنسجة، الاستيعاب سبب الهيموغلوبين في خلايا الدم الحمراء، وشريطية الذي يحدث بسبب الإضاءة على وجه واحد من العينة تحت الأساليب التقليدية في لسفم1 , 8-للتعويض عن هذه القيود، اقترحنا على استخدام الإضاءة الوجهين المزدوج ونسخة مبسطة من تقنية الوضوح9 جنبا إلى جنب مع إنكسار مطابقة الحل (دواليب). ولذلك، يسمح هذا النظام لتصوير عينة التي أكبر من 10 × 10 × 10 ملم3 في حين الحفاظ على قرار ذات نوعية جيدة في محوري والأفقي طائرات8.
أولاً معايرة هذا النظام استخدام الخرز الفلورسنت مرتبة في تكوينات مختلفة داخل أنابيب زجاجية. ثم، استخدم النظام لصورة قلوب مورين بعد الولادة والكبار. أولاً، تم تصويرها قلب الماوس بعد الولادة في 7 أيام (P7) للكشف عن تجويف البطين، وسمك جدار البطين وهياكل صمام، ووجود ترابيكوليشن. ثانيا، أجريت دراسة لتحديد الخلايا التي تفرق في cardiomyocytes باستخدام قلب ماوس بعد الولادة في اليوم 1 (P1) مع لجنة المساواة العرقية المسمى كارديوميوسيتيس وبروتين فلوري الصفراء (يفب). وأخيراً، تم تصويرها الفئران الكبار في أشهر 7.5 مراعاة وجود البوتاسيوم النخاع الخارجي الكلي قنوات (رومك) بعد العلاج الجيني8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع الإجراءات التي تنطوي على استخدام الحيوانات بلجان المراجعة المؤسسية (إياكوك) في جامعة كاليفورنيا، لوس أنجليس، كاليفورنيا.
1-تصوير نظام الإعداد
ملاحظة: انظر الشكل 1 و الشكل 2.
- استرداد ليزر (CW) موجات مستمرة مع أطوال موجية 3: 405 نانومتر، 473 نانومتر، و 532 نانومتر. 2 مكان المرايا (M1 و M2) 150 مم أربا ومواءمتها مع طائراتهم مرآة في 45° إلى الشعاع.
ملاحظة: يتم تنفيذ هذه الخطوة لإعادة توجيه الليزر بعيداً عن الإعداد الإضاءة الوجهين المزدوج. شعاع الناتجة ستكون في نفس اتجاه الشعاع الأولى. - تمرير الحزم عن طريق قطرها 25 ملم حجاب القزحية/ثقب (PH)، مرشح كثافة محايدة قطرها 50 مم (الجبهة) مع مجموعة كثافة بصرية من 0-4.0، شعاع المتوسع (BE)، فتحه 30 ملم (S) مع العرض ~ 0-6 مم، ومرآة (م 3) ، جميعا في وضع 150 مم من بعضها البعض. مكان النسخة المتطابقة مع طائرتها مرآة في 45° إلى الشعاع.
- تمرير الحزمة من خلال وضع 150 مم من M3 الخائن شعاع 50: 50. ضع مرآة (M6) 150 مم من التقسيم شعاع ومحاذاته حيث يكون طائرتها مرآة في 45° للحزم التي تنبعث في الاتجاه إلى الأمام. استخدام شعاع ينعكس على تشكيل جانب واحد من الورقة المزدوجة-الإضاءة الخفيفة.
- ضع مرآة (M4) 150 مم من التقسيم شعاع ومحاذاته حيث يكون طائرتها مرآة في 45° إلى شعاع التي كانت تنبعث بزاوية 90 درجة من التقسيم شعاع. ضع مرآة ثانية (M5) 150 مم من M4 ومحاذاته حيث يكون طائرتها مرآة في 45° للشعاع المنعكس من M6. استخدام شعاع ينبعث من M5 لتشكيل الجانب الثاني من الورقة المزدوجة-الإضاءة الخفيفة.
- إعداد نظام الإضاءة الوجهين المزدوج بشكل متماثل (انظر الشكل 1). ضع عدسة أسطوانية واحدة (CL1) [قطر (د) = 1؛ البعد البؤري (f) = 50 مم] 150 مم تمشيا مع شعاع ينبعث من M5 على جانب واحد وآخر أسطواني متطابقة العدسة (CL2) 150 مم تمشيا مع شعاع ينبعث من M6 على الجانب الآخر من سيتو المزدوج-الإضاءة ضع ص 2 مرايا (M7 و M8) كل ما يتماشى مع عدسات أسطوانية على مسافات من 50 مم تعكس شعاع على 90 درجة.
- نموذج يبنوا متعامي من زوج من العدسات. وضع العدسة الأولى، L1 (د = 1؛ و = 100 ملم)، 100 ملم من M7، والعدسة الثانية، L2 (د = 1؛ و = 60 مم)، 160 مم من المستوى 1. كرر هذا على الجانب الآخر من ثنائي-الإضاءة مع عدسات متطابقة (L3, L4) وضعت نفس المسافة من M8.
- مكان المرايا، M9 و M10، 60 ملم من العدسات L2 و L4، على التوالي، وتمشيا مع الحزم. وضع أهداف الإضاءة، OL1 و OL2 (د = 2؛ و = 150 مم)، 150 مم من M9 و M10 وتمشيا مع الحزم. شعاع ينبعث من الأهداف تشكل الورقة الضوء للتصوير العينات.
- استخدام طابعة ثلاثية الأبعاد لطباعة صاحب العينة من ستايرين بوتادين أكريلونيتريل (ABS). تضمين قطعة من الزجاج غطاء [الانكسار (RI) = 1.4745] على كل جانب من الدائرة، عمودي على شعاع الإضاءة، التقليل إلى أدنى حد الانكسار غير متطابقة. مكان الدائرة بين الشعاع المنبعث من العدسات الهدف بالتساوي.
- تثبيت مجهر ستيريو مع 1 × الهدف التكبير وكاميرا أشباه الموصلات (سكموس) أكسيد معدن المتمم علمية عمودي على الإضاءة طائرة (انظر الشكل 2).
2-تصوير نظام المعايرة
- استرداد الخرز البوليسترين الفلورسنت التي 0.53 ميكرومتر في القطر.
- تحضير العينة حبة الفلورسنت بتمييع الحل حبة في حل مطابقة إنكسار (دواليب) مع 1% ذوبان منخفضة تأشير [اغروس] إلى 1:150، 000. قص قطعة من زجاج البورسليكات الأنابيب قطر داخلي 12 مم وقطر خارجي من 18 ملم بطول 30 مم.
ملاحظة: يتم استخدام أنابيب زجاج البورسليكات لمطابقة الانكسار (1.47). - يخلط عينة حبة المخفف 1% [اغروس] و "الماصة؛" الحل حبة/[اغروس] إلى أنابيب البورسليكات. يسمح [اغروس] ترسيخ في درجة حرارة الغرفة (23 درجة مئوية).
- ملء قاعة ABS (من الخطوة 1، 7) مع حل والغليسيرول 99.5%. وضع أنابيب زجاج البورسليكات يحتوي على الخرز داخل الدائرة. ضع الدائرة القيمة المطلقة في نظام التصوير حيث أنها في مركز شعاع غاوسي تم إنشاؤها بواسطة نظام الإضاءة المزدوجة.
- إرفاق مرحلة متعدية يجهز ثلاثي الأبعاد لأنابيب زجاج البورسليكات للسيطرة على الحركة والتوجه للعينة داخل قاعة ABS (انظر تكميلية الشكل 1).
- الحصول على الصور باستخدام الكاميرا سكموس بمعدل 30 إطار في الثانية (fps). باستخدام وحدة تحكم المحرك، نقل العينة 1 مم في الاتجاه الأفقي، والحصول على الصور في كل زيادة 1 ملم باستخدام الكاميرا سكموس. تستمر حتى قد تم تصويرها نموذج كامل.
- كومة الصور المكتسبة باستخدام برمجيات تصور (انظر الجدول للمواد). تقيس الدالة نقطة انتشار (PSF) للنظام باستخدام هذه الصور حبة. استخدام هذا PSF deconvolution أثناء معالجة في خطوات لاحقة الصور.
3-نموذج إعداد
- تشريح القلوب من ماوس نوع البرية P1 وماوس knockin ساركوليبين متخالف مزدوجة-لجنة المساواة العرقية مع الجين Rosa26-يفب (SlnCre/+؛ R26يفب مراسل/+) في P7.
ملاحظة: أجرى القتل الرحيم باستخدام بينتوباربيتال والأسلوب الذي وصفته روبنز et al. 10-وأجرى التشريح وفقا للأسلوب الذي وصفته10،الوطني للقلب والرئة والدم معهد (NHLBI)11. - أداء مادة كيميائية تطهير قلوب موريني كما وصفها سونغ كيفن et al. 12.
ملاحظة: يجب أن تقوم بالخطوات التالية في غطاء دخان أن المواد الكيميائية المستخدمة مواد سامة.- شطف القلوب في 1 × مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) 3 x لمدة 10 دقائق. بعد الشطف، ضع القلوب في حل بارافورمالدهيد 4% واحتضان هذه العينات في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
- وضع العينات في محلول اكريلاميد 4% يحتوي على 0.5% w/v من 2، 2 '--أزوبيس هيدروكلوريد. تسمح العينات لاحتضانها في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. وبعد الاحتضان بين عشية وضحاها، إزالة العينات واحتضانها لهم في 37 درجة مئوية ح 2-3.
- شطف العينات مع برنامج تلفزيوني وثم وضعها في محلول 8% w/v دوديسيل كبريتات الصوديوم وحمض البوريك 1.25% w/v. احتضان هذه العينات في 37 درجة مئوية حتى هم واضحة. وهذا يمكن أن يستغرق عدة ساعات تبعاً لسمك العينة. بعد تطهير، إزالة العينات ووضعها في 1 × مخزنة الفوسفات المالحة لمدة يوم واحد.
- إعداد إنكسار مطابقة الحل مع 40 غ من كثافة النطاق المتوسط التدرج (انظر الجدول للمواد) في 30 مل م 0.02 الفوسفات المخزن المؤقت (PB)، 0.1% % توين-20، و 0.01 أزيد الصوديوم. تقديم الحل للرقم الهيدروجيني 7.5 مع هيدروكسيد الصوديوم.
- ضع العينة تم مسحها في دواليب مع الانكسار من 1.46-1.48 و 1% [اغروس]. إدراج النموذج في أنابيب زجاج البورسليكات والسماح [اغروس] ترسيخ في درجة حرارة الغرفة (23 درجة مئوية).
- إرفاق مرحلة متعدية يجهز ثلاثي الأبعاد لأنابيب زجاج البورسليكات للتحكم في الحركة والتوجه للعينة ضمن ثلاثي الأبعاد طباعة الدائرة ABS (انظر تكميلية الشكل 1).
4-تصوير القلب الكبار
- حقن 8.7 × 1012 فيروسات من نوع الفيروس المرتبط بالغدة ناقلات 9 (AAV9) يحتوي على مروج خاصة بالقلب تروبونين تي (كتنت) والبروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل) في وحدة تخزين 100 ميكروليتر في هذا السياق ذيل ماوس نوع البرية 2-شهر (C57BL/6).
ملاحظة: وضعت في AAV9 وفقا للأسلوب الموصوفة بيوان et al. 13-وهذا يتسبب في التجارة والنقل لربط قناة البوتاسيوم النخاع الخارجي الكلي (رومك) إنتاج AAV9-كتنت-رومك-التجارة والنقل (انظر الجدول للمواد). - تشريح قلوب الماوس الكبار في سن وفقا للأسلوب الذي وصفته NHLBI11أشهر 7.5. إعداد العينات باستخدام الخطوات 3.1-3.3.
- قم بتوصيل وحدة تحكم المحرك صمام المحرك. إرفاق صمام أنابيب زجاج البورسليكات للتحكم في الحركة واتجاه العينة ضمن ثلاثي الأبعاد طباعة الدائرة ABS.
- وضع العينة بحيث أنها في مركز شعاع غاوسي تم إنشاؤها بواسطة نظام الإضاءة المزدوجة. الحصول على الصور باستخدام الكاميرا سكموس بمعدل 100 في الثانية.
- باستخدام وحدة تحكم المحرك، نقل العينة 1 ملم باتجاه محوري، والحصول على الصور في كل زيادة 1 ملم مع الكاميرا سكموس. تستمر حتى قد تم تصويرها نموذج كامل.
ملاحظة: النظام يسيطر برمجيات المتقدمة المخصصة لمراقبة صك. - كومة الصور المكتسبة باستخدام برمجيات تصور (انظر الجدول للمواد). وضع صور ثلاثية الأبعاد باستخدام هذه رصات الصور و البرمجيات التصور14. ديكونفولفي PSF من الخطوة 2.6 مع مكدس الصورة المكتسبة. تعيين قيمة بكسل كثافة عتبة احترام ملامح القلب وإضافة الألوان الزائفة للصور استناداً إلى هذه الكثافة تدرج رمادي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الأسلوب الموصوفة هنا يستخدم شعاع إضاءة الوجهين المزدوج جنبا إلى جنب مع تطهير عينات أنسجة القلب الماوس ضوئية لتحقيق عمق تصوير أعمق وأكبر حجم تصوير مع القرار التصوير كافية (الشكل 1). لمعايرة النظام، وضعت الخرز نيون داخل أنابيب زجاجية ومن خلال نظام التصوير. ثم تصويرها الخرز وتصور في الطائرة x-y, y-z الطائرة، وفي الطائرة x-z، الحصول على النقطة نشر الدالة (PSF) لنظام8. معايرة نظام أصدر قرارا في الاتجاه الأفقيالأفقي د ≈ 2.8 ميكرون، وقرار في الاتجاهات المحورية ميكرومتر 17.4 دXZ ≈ وميكرومتر 17.9 دYZ ≈ عند استخدام الجلسرين ك المتوسطة تضمين8.
بعد أن تم استخدام الخرز الفلورسنت للمعايرة، استخدمت نظام التصوير صورة قلوب الماوس في يوم واحد، وفي 7 أيام بعد الولادة (الشكل 2)8. أبعاد تجويف البطين، وصمامات القلب، والبطين ترابيكوليشن تتجلى في هذه الصور من قلب الماوس. دراسة تفريق كارديوميوسيتي داخل القلب، تم تصويرها الفئران متخالف knockin مع لجنة المساواة العرقية المسمى كارديوميوسيتيس بعد الولادة. هذه صور كارديوميوسيتيس المسماة لجنة المساواة العرقية في كل اتجاه الطائرة جنبا إلى جنب مع عرض ثلاثي الأبعاد ل القلب8 (الشكل 3).
بالإضافة إلى دراسة الفئران بعد الولادة، ونظام التصوير استخدمت أيضا لدراسة قلب الماوس الكبار. في البداية، كان يستخدم العلاج الجيني لإدخال قنوات رومك معلم بروتينات فلورية خضراء في قلب الماوس. في أشهر 7.5، قلب الماوس تم تصويرها وكانت تصور هذه القنوات رومك في جدار البطين (الشكل 4). هذه الخطوة ضمن الإجراء يوضح قدرة هذا النظام الصور عينات كبيرة وتميز الهياكل لا ينظر مع تلطيخ نسيجية داخل القلب. ويبين الشكل 4 قنوات رومك من كل اتجاه الطائرة جنبا إلى جنب مع عرض ثلاثي الأبعاد ل القلب8.
الشكل 1 : رسم تخطيطي لنظام الفحص المجهري الفلورية الضوء-ورقة- هذا عرض ثلاثي الأبعاد نظام الفحص المجهري fluorescence الورقة الخفيفة، بما في ذلك المسافات بين المكونات والاطوال من المكونات المستخدمة في النظام. وقد تم تعديل هذا الرقم من دينغ ييتشين et al. 8- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : أعلى طريقة العرض ورقة الخفيفة الميكروسكوب النظام مع الكشف عن- هذا هو عرض أعلى لنظام الفحص المجهري الإضاءة الوجهين المزدوج حيث يمثل منطقة الأزرق مظلمة الشعاع في كل مكان داخل النظام. وشملت هو قسم موسع 2-الأبعاد يعرض واحدة من المناطق التي تتألف من doublets متعامي والإضاءة والهدف. ويبين هذا القسم الموسع أيضا مبدأ تشكيل الورقة الخفيفة وكيف يتم الجمع بين الحزم بشكل مزدوج الوجهين الإضاءة. وقد تم تعديل هذا الرقم من دينغ ييتشين et al. 8- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : صور ثلاثية الأبعاد للقلب موريني بعد الولادة- () هذا الفريق يظهر صورة لقلب الماوس بعد الولادة في اليوم السابع يظهر تجويف البطين. (ب) يظهر هذا الفريق صورة القلب الماوس بعد الولادة في اليوم السابع عرض سمك جدار البطين. (ج) يظهر هذا الفريق صورة قلب الماوس بعد الولادة في اليوم الأول عرض الموقع من بنيات صمام. (د) تظهر هذه الصورة قسم موسع من قلب الماوس بعد الولادة في اليوم الأول عرض العضلات بيكتيناتي الموجودة في الحديقة الشتوية للقلب. (ﻫ) تظهر هذه الصورة ترابيكولاتيون في البطين في قلب الماوس بعد الولادة في اليوم الأول. شريط مقياس: 1 مم. المنطقة تحليقا الأحمر داخل الإطار الداخلي يبين اثنين الماوس شفاف قلوبنا بعد أن خضع لأسلوب الوضوح ويتم إدراجها في أنابيب زجاج البورسليكات. وقد تم تعديل هذا الرقم من يكن دينغ et al. 8- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : صور كارديوميوسيتيس المسماة لجنة المساواة العرقية في ماوس بعد الولادة في القلب من كل طائرة. قلب الماوس P1 تم تصويرها مع cardiomyocytes المسماة لجنة المساواة العرقية في كل طائرة مستعرضة: () س، ص، (ب) YZ، و (ج) XZ. وتظهر هذه الصور المقطعية وجود cardiomyocytes المسماة لجنة المساواة العرقية في الاذين والبطين من الماوس P1. (د) كما تم دمج الصور لإنشاء عرض ثلاثي الأبعاد للقلب. المنطقة تحليقا الأحمر داخل الإطار الداخلي يبين اثنين الماوس شفاف قلوبنا بعد أن خضع لأسلوب الوضوح ويتم إدراجها في أنابيب زجاج البورسليكات. شريط مقياس: 1 مم. وقد تم تعديل هذا الرقم من يكن دينغ et al. 8- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 : صور قلب الماوس الكبار عرض القنوات رومك من كل طائرة. وكان تصويرها قلب الماوس 7.5 أشهر عمر لإظهار وجود وموقع القنوات رومك. القلب تم تصويرها في كل طائرة مستعرضة: () س، ص، (ب) YZ، و (ج) XZ. تشير القيمة تدرج الرمادي إلى كثافة بصرية داخل الصورة، مع المناطق الأفتح المقابلة لشدة الضوء أكثر وأكثر قتامة المناطق المقابلة لأقل كثافة الضوء. (د) كما تم دمج الصور لإنشاء عرض ثلاثي الأبعاد للقلب، وكانت الصور جرايسكاليد الأصلية الملونة الزائفة حتى تظهر القنوات رومك الأخضر. ويبين المنطقة تحليقا الأحمر داخل الإطار الداخلي قلب واحدة بماوس الكبار شفافة بعد أن خضع لأسلوب الوضوح ويتم إدراجها في أنابيب زجاج البورسليكات. شريط مقياس: 1 مم. وقد تم تعديل هذا الرقم من دينغ ييتشين et al. 8- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الإضافي رقم 1: صورة الدائرة ABS مع أنابيب البورسليكات داخل الورقة الخفيفة نظام التصوير- اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نظام لسفم والأسلوب الموصوفة هنا يستخدم شعاع إضاءة الوجهين المزدوج جنبا إلى جنب مع تطهير ضوئية للصورة قلب الماوس في مراحل ما بعد الولادة والكبار من تطورها. شعاع إضاءة تقليدية واحد يعاني من تشتت فوتون والاستيعاب من خلال عينات الأنسجة أكثر سمكا وأكبر1،3. توفر عوارض الوجهين المزدوج إضاءة حتى أكثر من العينة، وبالتالي تقليل تأثير شريطية وغيرها من الأعمال الفنية التي غالباً ما ينظر في الصور التي تنتجها إضاءة أحادية الجانب. هذه التقنية أيضا زيادة حجم العينة التي يمكن تصويرها بضبط موضع الحزم غاوسي المزدوج8. فصل الحد الأقصى لهذه الحزم يسمح للتصوير عينة أنسجة عدة ملليمترات في الحجم، مثل قلب الماوس الكبار، بينما إضاءة واحدة محدودية حجم العينة إلى قلوب أصغر مثل قلوب الزرد و المورفولوجية .
الأسفار التصوير في الأنسجة التي لا تتسم بالشفافية بصريا أكثر صعوبة نظراً تشتت الضوء قد لا تكون موحدة في جميع أنحاء عينة الأنسجة. وهذا يحد بالعمق للذي عينة يمكن تصويرها وفعالية تصوير الأسفار. ولهذا السبب، من الشائع استخدام الكائنات الحية مثل الزرد، التي بطبيعة الحال لديها أنسجة شفافة بصريا5. ومع ذلك، القيام بالأسفار التصوير الدراسات المتعلقة بالكائنات الحية التي لا تملك بطبيعة الحال الجلد شفافة بصريا، هناك تقنيات مسح بصري المختلفة التي وضعت لإزالة تلون الأنسجة. هو أسلوب مسح ضوئي واحد مثل هذا الوضوح، حيث هو وضعها في المائية، الأنسجة ثم المحتضنة لفترة طويلة من الزمن، وأخيراً وضع في حل مقاصة أن يقلل من مقدار الانعكاس والانكسار بين العينة وغيرها من وسائل الإعلام1 ،9. في هذه الدراسة، تعديل لتقليل الكمية من مسح كاشف استخدام هذه التقنية ولا تحتاج إلى إضافة مضخات التفريغ أو غاز النتروجين8.
على الرغم من أن هذا الأسلوب يوفر تحسين صورة من قرار لعينات معتمة أكثر سمكا، إلا أن هناك حدوداً لهذه الاستراتيجية التي يمكن تحسينها في الدراسات المستقبلية. وأجريت دراسات إضافية مع عوارض بيسل وآثاره غير خطية اثنين-فوتون لتوفير حل أفضل في التصوير يكفي أعماق15،16. هذه الأساليب قد استخدمت حاليا لدراسة نماذج القلب أصغر، لكن يمكن تكييفه لدراسة العمليات الدينامية داخل جنين النامي. أيضا، إلى الأسلوب الوضوح لعينات الأنسجة أكبر ويمكن تحسين فعالية التصوير الفلورسنت بتقليل عدد فلوروفوريس التي يمكن أن يحتمل أن يتم فقدان التغييرات أثناء تطهير عملية8. ومؤخرا، أدمجنا هذا النظام لسفم مع الواقع الافتراضي توضيح الميكانيكا القلب الإنمائية17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
المؤلفون يود أن يعرب عن امتنانه نغوين ثاو وناكانو أتسوشي من جامعة كاليفورنيا لتقديم نموذج الفئران للصورة. هذه الدراسة وأيده النجوم المنح HL118650 المعاهد الوطنية للصحة (إلى Tzung ك. هسياي)، HL083015 (إلى Tzung ك. هسياي)، HD069305 (لتشي جيم نون وهسياي ك. Tzung.)، HL111437 (إلى هسياي ك. Tzung وا. جيم تشي)، HL129727 (إلى Tzung ك. هسياي)، وجامعة تكساس نظام التمويل (جوهيون لي).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CW Laser | Laserglow Technologies | LMM-GBV1-PF3-00300-05 | Excitation of fluorophores |
| Neutral density filter | Thorlabs | NDC-50C-4M | Controls amount of light entering system |
| Achromatic beam expander | Thorlabs | GBE05-A | Expands the beam of light |
| Mechanical slit | Thorlabs | VA100C | Controls width of beam |
| Beam splitter | Thorlabs | BS013 | Forms dual-illumination beam |
| Stereo microscope with 1X objective lense | Olympus | MVX10 | Used for observation of sample |
| ORCA-Flash4.0 LT sCMOS camera | Hamamatsu Photonics | C11440-42U | Used to capture Images |
| Acrylonitrile butadiene styrene (ABS) | Stratasys | uPrint | Material used to 3-D print a sample holder |
| Fluorescent polystyrene beads | Spherotech Inc | PP-05-10 | Used for imaging system calibration |
| Borosilicate glass tubing | Corning | Pyrex 7740 | Tubing for sample embedding |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | Fill for sample chamber |
| Phosphate-buffered saline | Fisher Scientific | BP39920 | Rinse solution for mouse hearts |
| Paraformaldehyde | Electron microscopy sciences | RT-15700 | First incubation solution |
| Acrylamide | Wako Chemicals | AAL-107 | Mixed with 2,2'-Azobis dihydrochloride for second incubation solution for mouse hearts |
| 2,2'-Azobis dihydrochloride | Wako Chemicals | VA-044 | Mixed with Acrylamide for second incubation solution for mouse hearts |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | 71725 | Mixed with Boric acid for third incubtion solution for mouse hearts |
| Boric acid | Fischer Scientific | A74-1 | Mixed with Sodium dodecyl sulfate for third incubtion solution for mouse hearts |
| Sigma D2158 | Sigma Aldrich | D2158 | Mixed with PB, Tween-20, and Sodium azide as a refractive index matching solution |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | 11332465001 | Mixed with Sigma D2158, PB, and Sodium azide as a refractive index matching solution |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002 | Mixed with Sigma D2158, PB, and Tween-20 as a refractive index matching solution |
| Adeno-associated virus vector 9 with a cardiac-specific Troponin T promoter tagged with GFP | Vector Biolabs | VB2045 | Expresses GFP when bound to ROMK |
| DC Servo Motor Actuator | Thorlabs | Z825B | Used for movement of sample in axial direction within light sheet |
| K-Cube Brushed DC Servo Motor Controller | Thorlabs | KDC101 | Connects to motor actuator and controls movement of the actuator |
| Amira | FEI Software | N/A | Visualization software for producing 2-D and 3-D images |
References
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Lee, J., et al. 4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation. Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1679-1690 (2016).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Huisken, J., Stainier, D. Y. Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology. Development. 136 (12), 1963-1975 (2009).
- Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovascular Research. 91 (2), 279-288 (2011).
- High, F. A., Epstein, J. A. The multifaceted role of Notch in cardiac development and disease. Nature Reviews Genetics. 9 (1), 49-61 (2008).
- Sachinidis, A. Cardiac specific differentiation of mouse embryonic stem cells. Cardiovascular Research. 58 (2), 278-291 (2003).
- Ding, Y., et al. Light-sheet fluorescence imaging to localize cardiac lineage and protein distribution. Scientific Reports. 7, 42209 (2017).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Robbins, N., Thompson, A., Mann, A., Blomkalns, A. L. Isolation and excision of murine aorta; a versatile technique in the study of cardiovascular disease. Journal of Visualized Experiments. (93), e52172 (2014).
- National Heart, L., Blood Institute, Standard Operating Procedures (SOP's) for Duchenne Animal Models. , (2015).
- Sung, K., et al. Simplified three-dimensional tissue clearing and incorporation of colorimetric phenotyping. Scientific Reports. 6, 30736 (2016).
- Yuan, Z., Qiao, C., Hu, P., Li, J., Xiao, X. A versatile adeno-associated virus vector producer cell line method for scalable vector production of different serotypes. Human Gene Therapy. 22 (5), 613-624 (2011).
- FEI, Amira User's Guide. , Konrad-Zuse-Zentrum fur Informationstechnik. Berlin. 59-138 (2017).
- Gao, L., et al. Noninvasive imaging of 3D dynamics in thickly fluorescent specimens beyond the diffraction limit. Cell. 151 (6), 1370-1385 (2012).
- Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy. Nature Methods. 8 (9), 757-760 (2011).
- Ding, Y., et al. Integrating light-sheet imaging with virtual reality to recapitulate developmental cardiac mechanics. JCI Insight. 2 (22), (2017).
