Summary
Это исследование использует технику микроскопии (LSFM) свет лист флуоресценции двусторонняя освещения в сочетании с оптическим выравниванием учиться мышиных сердца.
Abstract
Свет лист флуоресцентной микроскопии широко использовался для приобретения быстрого изображения с высоким разрешением осевой от микрометра миллиметровой шкалой. Традиционные методы свет лист связаны с использованием единого освещения пучка ортогонально направлены на образец ткани. Изображения крупных выборок, которые производятся с использованием единого освещения пучка содержат полосы или артефактов и страдают от сокращения резолюции из-за рассеяния и поглощения света в ткани. Это исследование использует двусторонняя освещения пучка и упрощенная ЯСНОСТИ оптических очистка техника для мышиных сердца. Эти методы позволяют глубже изображений путем удаления липиды из сердца и производят большое поле изображений, больше, чем 10 x 10 x 10 мм3. В результате, эта стратегия позволяет нам определить размеры желудочков, отслеживать линии сердца и локализовать пространственное распределение сердца специфических белков и каналы иона от послеродовой для сердца взрослых мыши с достаточным контрастом и резолюции.
Introduction
Микроскопии флуоресцирования свет листа была впервые разработана в 1903 году техника и сегодня используется как метод для изучения экспрессии генов, а также производить 3-D или 4-D моделей тканей образцы1,2,3. Этот метод визуализации использует тонкий лист света для освещения в одной плоскости образца так, что только что самолет захвачен детектора. Образца, затем могут быть перемещены в осевом направлении-захватить каждый слой, один раздел в то время и визуализации трехмерной модели после пост-обработки изображений4. Однако из-за поглощения и рассеяния фотонов, LSFM была ограничена образцов, которые являются либо несколько микрон или оптически прозрачные1.
Ограничения LSFM привели к обширные исследования организмов, которые имеют тканей, которые оптически прозрачным, как у рыбок данио. Исследования с участием сердца развития и дифференциации часто проводятся на данио рерио, поскольку есть сохранены генов между людьми и данио рерио5,6. Хотя эти исследования привели к достижениям в кардиологических исследованиях, связанных с кардиомиопатии6,7, по-прежнему существует необходимость в проведении аналогичного исследования высокого уровня организмов, таких как млекопитающие.
У млекопитающих сердечной ткани представляет собой проблему, из-за толщины и непрозрачность ткани, поглощение за счет гемоглобина в красных кровяных клеток и чередование, которое происходит из-за одностороннего освещения образца под традиционные методы LSFM1 , 8. чтобы компенсировать эти ограничения, мы предложили использовать двусторонняя освещения и упрощенная версия ЯСНОСТИ техника9 , в сочетании с показателем преломления соответствующие решения (колеса). Таким образом эта система позволяет для визуализации образца, это больше, чем 10 x 10 x 10 мм3 при поддержании хорошего качества резолюции в осевом и боковых плоскостей8.
Эта система была впервые калибруется с помощью флуоресцентных бусы, организовал в различных конфигурациях в стеклянных трубок. Затем система использовалась для изображения послеродовой и взрослых мышиных сердца. Во-первых послеродовой мыши сердце было imaged на 7 дней (P7) выявить полости желудочков, толщина стены желудочков, клапан структур и наличие trabeculation. Во-вторых было проведено исследование для определения ячеек, которые будут дифференцироваться в кардиомиоцитов, используя послеродовой мыши сердца на 1 день (P1) с КРР меченых кардиомиоцитов и желтый флуоресцентный белок (рекламы ЯФП). Наконец взрослых мышей на 7,5 месяцев были образы наблюдать присутствие почечной наружной медуллярного калия (ROMK) каналы после генной терапии8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры, связанные с использованием животных были одобрены организационного обзора комитетов (IACUC) в университете Калифорнии, Лос-Анджелес, Калифорния.
1. Визуализация системы установки
Примечание: См. рис. 1 и рис.
- Извлечение непрерывная волна лазера (CW) с 3 длинах волн: 405 нм, 473 Нм и 532 нм. 2 место-зеркала (M1 и M2) 150 мм друг от друга и привести их в соответствие с их самолеты зеркало под углом 45° к лучу.
Примечание: Этот шаг выполняется перенаправление лазера от двусторонняя освещения установки. Результате луч будет в том же направлении, как первоначальный луча. - Передайте луча через диаметром 25-мм ирисовой диафрагмой/отверстие (PH), фильтр нейтральной плотности диаметром 50 мм (NDF) с оптической плотности диапазоном 0 - 4.0, расширитель луча (BE), щели (S) 30 мм с шириной ~ 0 - 6 мм и зеркало (м3) , все расположены 150 мм друг от друга. Поместите зеркало с ее плоскости зеркало под углом 45° к лучу.
- Передайте луча через 50: 50 splitter луча, помещены 150 мм от м3. Поместите зеркало (M6) 150 мм от splitter луча и выровнять таким образом, чтобы его плоскости зеркало под углом 45° к Луч, который излучается в прямом направлении. Используйте отражение луча для формирования одной стороне листа свет двойной освещение.
- Поместите зеркало (M4) 150 мм от splitter луча и выровняйте его так, что его плоскость зеркало под углом 45° к лучу, породившего под углом в 90° от splitter луча. Разместите второй зеркало (M5) 150 мм от M4 и выровнять таким образом, чтобы его плоскости зеркало под углом 45° для света, отраженного от M6. Использование света, испускаемого от M5 сформировать на второй стороне листа свет двойной освещение.
- Настройка системы двусторонняя освещения в симметричной моды (см. Рисунок 1). Поместите один Цилиндрические линзы (CL1) [диаметр (d) = 1; фокусное расстояние (f) = 50 мм] 150 мм соответствует луча, излучаемый M5 на одной стороне и другой идентичные Цилиндрические линзы (CL2) 150 мм соответствует луча, излучаемый M6 на другой стороне сету двойной освещение p. место 2 зеркала (M7 и M8) каждый соответствует Цилиндрические линзы на расстоянии 50 мм, чтобы отразить луч на 90 °.
- Формируют ахроматические Дуплет из пары линз. Поместите первый объектив, L1 (d = 1; f = 100 мм), 100 мм от М7 и второй объектив, L2 (d = 1; f = 60 мм), 160 мм от L1. Повторите это на другой стороне двойной освещение с одинаковыми линзами (L3, L4) размещены на одинаковом расстоянии от M8.
- Место зеркала, M9 и M10, 60 мм от линзы L2 и L4, соответственно и в соответствии с пучка. Место освещение целей, OL1 и OL2 (d = 2; f = 150 мм), 150 мм от M9 и M10 и в соответствии с пучка. Света, испускаемого от целей образует свет лист для изображений образцов.
- Используйте трехмерный принтер для печати держателя образца из акрилонитрил бутадиен стирола (ABS). Вставлять кусок стекла [преломления (RI) = 1.4745] на каждой стороне камеры, перпендикулярно освещения пучка, чтобы свести к минимуму преломления рассогласовывать. Равномерно разместите камеры между балки, излучаемый объективов.
- Установка стерео микроскоп с 1 X увеличение объективной и научно комплементарный металло-оксидный полупроводник (sCMOS) камеры перпендикулярно освещения плоскости (см. Рисунок 2).
2. изображений системы калибровки
- Получения флуоресцентных шарики полистироля, которые являются 0,53 мкм в диаметре.
- Подготовьте образец флуоресцентные шарик путем разбавления шарик решения в соответствующие решения преломления (колеса) с указывая агарозы 1% температура расплава к 1: 150, 000. Вырежьте кусок трубки боросиликатное стекло с внутренним диаметром 12 мм и наружным диаметром 18 мм, длиной 30 мм.
Примечание: Трубки боросиликатное стекло используется для сопоставления преломления (1,47). - Смешать образец разбавленный шарик с агарозы 1% и Пипетка шарик/агарозы решения в трубки боросиликатное. Разрешить агарозы для закрепления при комнатной температуре (23 ° C).
- ABS камеры (от шага 1.7) заполняют раствором 99,5% глицерина. Поместите трубки боросиликатное стекло, содержащий бусины внутри камеры. Место ABS камеры в системе визуализации, так что это в центре гауссова пучка, созданных системой двойной освещения.
- Придаем 3-D моторизованных трансляционная стадии трубки боросиликатное стекло для контроля движения и ориентации образца в зале ABS (см. дополнительный рисунок 1).
- Получение изображений с помощью камеры sCMOS со скоростью 30 кадров в секунду (fps). Используя контроллер двигателя, переместить выборки 1 мм в направлении боковой и получить изображения на каждого приращения 1 мм, с помощью камеры sCMOS. Продолжайте, пока образ всей выборки.
- Стек изображений с помощью программного обеспечения для визуализации (см. Таблицу материалы). Измерьте точки распространения функция (PSF) системы с использованием этих изображений из бисера. Используйте этот ПСФ деконволюция во время обработки изображений в последующих шагах.
3. Пробоподготовка
- Вскрыть сердца от дикого типа P1 мыши и двойной гетерозиготных sarcolipin-Cre knockin мышь с Rosa26-рекламы ЯФП гена (SlnCre / +; R26рекламы ЯФП репортер / +) на P7.
Примечание: Euthanasia была выполнена с использованием Пентобарбитал и методике, описанной в Роббинс et al. 10. Вскрытие проводилось согласно методике, описанной в национальном сердца, легких и крови института (NHLBI)10,11. - Выполните химической очистки мышиных сердец, как описано Кевин Сена и др. 12.
Примечание: Следующие шаги должны производиться в Зонта, поскольку токсичных химикатов.- Промойте сердца в 1 x фосфат амортизированное saline (PBS) 3 x 10 мин. После ополаскивания, сердца в растворе параформальдегида 4% и инкубировать эти образцы на 4 ° C на ночь.
- Поместите образцы в 4% акриламида раствор, содержащий 0,5% w/v 2, 2'-Azobis дигидрохлорида. Разрешить образцы для инкубации при температуре 4 ° C на ночь. После ночи инкубации удалить образцы и инкубировать их при 37 ° C на 2-3 ч.
- Промойте образцы с PBS и затем разместить их в раствор 8% w/v лаурилсульфат натрия и 1,25% w/v борной кислоты. Проинкубируйте образцы при 37 ° C, до тех пор, пока они ясны. Это может занять несколько часов в зависимости от толщины образца. После очистки, удалите образцы и поместите их в 1 x фосфат амортизированное saline на 1 день.
- Подготовить преломления соответствующие решения с 40 g неионогенных плотность среды и градиента (см. Таблицу материалы) в 30 мл 0,02 М фосфатного буфера (PB), азид натрия 0,1% Tween-20 и 0,01%. Принести решение рН 7,5 с гидроксида натрия.
- Место очищается образца в колеса с преломления 1,46-1,48 и 1% агарозы. Вставьте образец трубки боросиликатное стекло и позволяют агарозы для закрепления при комнатной температуре (23 ° C).
- Придают 3-D моторизованных трансляционная стадии трубки боросиликатное стекло для контроля движения и ориентации образца в 3-D печати ABS камеры (см. дополнительный рисунок 1).
4. взрослых сердце изображений
- Inject 8,7 x 1012 вирусы типа аденоассоциированный вирус вектора 9 (AAV9), содержащий специфичные для сердечной тропонина T промоутер (cTnT) и Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП) в объеме 100 мкл в Вену хвост мыши 2-месячного дикого типа (C57BL/6).
Примечание: AAV9 был разработан согласно методике, описанной в Юань et al. 13. это вызывает GFP для привязки к почечной наружной медуллярного калия канал (ROMK) производства AAV9-cTnT-ROMK-GFP (см. Таблицу материалы). - Вскрыть сердца взрослого мыши в возрасте согласно методике, описанной в NHLBI117.5 месяцев. Подготовка образцов, используя шаги 3.1-3.3.
- Подключите контроллер двигателя моторного привода. Прикрепите привод для трубки боросиликатное стекло для управления движением и ориентации образца в 3-D печатных ABS камеры.
- Положение образца, так что это в центре гауссова пучка, созданных системой двойной освещения. Получение изображений с помощью камеры sCMOS в размере 100 fps.
- Используя контроллер двигателя, переместить выборки 1 мм в осевом направлении и получить изображения на каждого приращения 1 мм с sCMOS камерой. Продолжайте, пока образ всей выборки.
Примечание: Система контролируется специально разработанной инструмент контроль программного обеспечения. - Стек изображений с помощью программного обеспечения для визуализации (см. Таблицу материалы). Разработка трехмерных изображений, используя эти стеки изображений и визуализации программного обеспечения14. Deconvolve ФСФ из шага 2.6 с полученное изображение стека. Значение интенсивности пикселей порог для наблюдения контуры сердца и добавить псевдо-цвет изображения, основываясь на этой серой шкале интенсивности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Метод, описанный здесь используется двусторонняя освещения пучка, в сочетании с оптическим выравниванием образцов ткани сердца мыши для достижения глубокого изображений глубину и объем изображений с достаточной разрешающей (рис. 1). Для калибровки системы, флуоресцентный бусины были размещены внутри стеклянных трубок и системы обработки изображений. Бусины были затем образ визуализируется в плоскости x-y плоскости y-z, и в плоскости x-z, чтобы получить точку распространения функция (PSF) для системы8. Калибровка системы была принята резолюция в боковой направлении dбоковых ≈ 2.8 мкм и резолюцию в осевом направлениях dXZ ≈ 17.4 мкм и dYZ ≈ 17.9 мкм при использовании глицерина в качестве вложения средние8.
После того, как люминесцентные бусины были использованы для калибровки, система электронного фотографирования использовался для изображения сердца мыши на 1 день и 7 дней после родов (рис. 2)8. Размеры желудочков полости, клапанов сердца и желудочковой trabeculation очевидны в эти изображения сердца мыши. Для изучения cardiomyocyte дифференциации в сердце, гетерозиготных мышей knockin с КРР меченых кардиомиоцитов были образы послеродовой. Изображения Cre меченых кардиомиоцитов находятся в каждом направлении плоскости наряду с 3-D визуализации в сердце8 (рис. 3).
Помимо изучения послеродовой мышей, тепловизионная система также используется для изучения сердце взрослого мыши. Первоначально генной терапии был использован для внедрения GFP-меткой ROMK каналы в сердце мыши. На 7,5 месяцев образы сердце мыши и эти ROMK каналы были подробно освещены в стенке желудочка (рис. 4). Этот шаг в процедуре показана способность этой системы изображения крупных выборок и различать структуры, не видел с гистологическим пятнать в сердце. Рисунок 4 показывает ROMK каналы из каждой плоскости направлении вместе с 3-D визуализации сердца8.
Рисунок 1 : Принципиальная схема системы микроскопии флуоресцирования свет лист. Это 3-мерной визуализации системы микроскопии флуоресцирования света лист, включая расстояния между компонентами и фокусные компонентов, используемых в системе. Эта цифра была изменена от Yichen Дин и др. 8. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Вид света лист микроскопии системы обнаружения сверху. Это вид сверху микроскопии системы освещения, двусторонняя, где потемнела синий регион представляет луча в каждом месте службы в рамках системы. Включено 2-мерной расширенный раздел, который показывает один из регионов, состоящий из ахроматические Дуплеты и освещения цели. Этот расширенный раздел также показывает принцип формирования света листа и как лучи объединяются для формы, двусторонняя освещения. Эта цифра была изменена от Yichen Дин и др. 8. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : 3-D изображения послеродовой мышиных сердца. () Эта группа показывает изображение сердца послеродовой мыши на день 7 показаны полость желудочка. (b) Эта группа показывает изображение сердца послеродовой мыши на день 7 показаны толщина стенок желудочка. (c) Эта группа показывает изображение сердца послеродовой мыши на день 1 показано расположение структур клапана. (d) это изображение показывает расширенный раздел из сердца послеродовой мыши на день 1 показаны из мышц, расположенный в атриуме сердца. (e) это изображение показывает trabeculation в желудочке в сердце послеродовой мыши на 1 день. Линейки: 1 мм. Красный кружил область в пределах врезные показывает два сердца полупрозрачные мыши после прохождения ЧЕТКОСТЬ технику и вставляемые в трубки боросиликатное стекло. Эта цифра была изменена от Yichen Дин и др. 8. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Изображения Cre меченых кардиомиоцитов в послеродовой мыши сердце из каждой плоскости. Сердце мыши P1 был воспроизведен образ с КРР меченых кардиомиоцитов в каждой плоскости сечения: () XY, (b) YZ и (c) XZ. Эти поперечные изображения показывают наличие Cre меченых кардиомиоцитов в предсердия и желудочка P1 мыши. (d) изображения также были объединены для создания 3-D визуализации сердца. Красный кружил область в пределах врезные показывает два сердца полупрозрачные мыши после прохождения ЧЕТКОСТЬ технику и вставляемые в трубки боросиликатное стекло. Линейки: 1 мм. Эта цифра была изменена от Yichen Дин и др. 8. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 : Изображения показаны каналы ROMK из каждой плоскости сердца взрослого мыши. Сердце мыши было imaged на 7,5 месяцев, чтобы показать наличие и расположение ROMK каналов. Сердце было imaged в каждой плоскости сечения: () XY, (b) YZ и (c) XZ. Значение шкалы серого цвета показывает оптический интенсивности в пределах изображения, с светлее регионов, соответствующих более интенсивности света и тёмные, соответствующий меньше интенсивности света. (d) изображения также были объединены для создания 3-D визуализации сердца, и оригинальные образы серый были псевдо-цветной, так что ROMK каналы появляются зеленые. Красный кружил область в пределах врезные показывает полупрозрачные взрослых мыши сердца после прохождения ЧЕТКОСТЬ технику и вставляемые в трубки боросиликатное стекло. Линейки: 1 мм. Эта цифра была изменена от Yichen Дин и др. 8. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Дополнительные рисунок 1: изображение камеры ABS с трубки боросиликатное света листе система электронного фотографирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
LSFM система и метод, описанный здесь использует двусторонняя освещения пучка, в сочетании с оптическим выравниванием изображение сердца мыши на послеродовой и взрослых этапах ее развития. Традиционный одноместный освещения пучка страдает от фотон рассеяние и поглощение через ткань толще и более крупные образцы1,3. Двусторонняя балки обеспечивают более равномерное освещение образца, тем самым к минимуму эффект чередования и другие артефакты, которые часто видели в изображения, полученные путем одностороннего освещения. Этот метод также увеличивает размер образца, который может быть imaged, регулируя положение двойной гауссовых пучков8. Максимальное разделение этих лучей позволяет для визуализации образца ткани несколько миллиметров в размер, например, в сердце взрослого мыши, тогда как один освещения ограниченный размер выборки для небольших сердец как сердцах данио рерио и дрозофилы .
Флуоресценции изображений в тканях, которые не являются оптически прозрачные является более сложным, поскольку рассеяние света не может быть единым для всей образца ткани. Это ограничивает глубину которого образец может быть imaged и эффективности флуоресценции изображений. По этой причине он является общим для использования организмов, таких как данио рерио, которые естественно оптически прозрачные ткани5. Однако для выполнения флуоресценции изображений исследования на организмы, которые естественно не имеют оптически прозрачной кожей, есть различные оптические очистки методы, которые были разработаны для удаления окраска ткани. Один из таких методов очистки оптических является ЯСНОСТИ, где ткани помещается в гидрогель, а затем инкубировали в течение длительного периода времени и наконец помещены в расчистке решение, которое уменьшает количество отражения и преломления между образцом и других СМИ1 ,9. В этом исследовании эта техника была изменена, чтобы уменьшить количество очистки реагент, который используется и не требуют добавления вакуумных насосов или азота газов8.
Хотя этот метод обеспечивает улучшение изображений для толще непрозрачные образцов, существуют ограничения на этой стратегии, которые могли бы быть улучшены в будущих исследований. Дополнительные исследования были проведены с Бесселя балки и двух Фотон нелинейных возбуждения, чтобы обеспечить лучшее разрешение в достаточно изображений глубины15,16. Эти методы в настоящее время используется для изучения сердца моделей меньшего размера, но могут быть адаптированы для изучения динамических процессов в рамках развивающегося эмбриона. Кроме того, изменения в метод ЯСНОСТИ для больших образцов тканей может повысить эффективность флуоресцентного изображения путем сокращения числа флуорофоров, которые потенциально могут быть потеряны во время очистки процесса8. Недавно мы включили эту LSFM систему с виртуальной реальности для выяснения развития сердечной механики17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы выразить признательность Тхао Нгуен и Atsushi Nakano из Калифорнийского университета для предоставления мышей образца изображения. Это исследование было поддержано грантов низ HL118650 (для Tzung K. Hsiai), HL083015 (для Tzung K. Hsiai), HD069305 (для N. C. Чи и Tzung к Hsiai.), HL111437 (для Tzung K. Hsiai и N. C. Чи), HL129727 (для Tzung K. Hsiai) и университета штата Техас системы звезды, финансирование (для Juhyun Ли).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CW Laser | Laserglow Technologies | LMM-GBV1-PF3-00300-05 | Excitation of fluorophores |
| Neutral density filter | Thorlabs | NDC-50C-4M | Controls amount of light entering system |
| Achromatic beam expander | Thorlabs | GBE05-A | Expands the beam of light |
| Mechanical slit | Thorlabs | VA100C | Controls width of beam |
| Beam splitter | Thorlabs | BS013 | Forms dual-illumination beam |
| Stereo microscope with 1X objective lense | Olympus | MVX10 | Used for observation of sample |
| ORCA-Flash4.0 LT sCMOS camera | Hamamatsu Photonics | C11440-42U | Used to capture Images |
| Acrylonitrile butadiene styrene (ABS) | Stratasys | uPrint | Material used to 3-D print a sample holder |
| Fluorescent polystyrene beads | Spherotech Inc | PP-05-10 | Used for imaging system calibration |
| Borosilicate glass tubing | Corning | Pyrex 7740 | Tubing for sample embedding |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | Fill for sample chamber |
| Phosphate-buffered saline | Fisher Scientific | BP39920 | Rinse solution for mouse hearts |
| Paraformaldehyde | Electron microscopy sciences | RT-15700 | First incubation solution |
| Acrylamide | Wako Chemicals | AAL-107 | Mixed with 2,2'-Azobis dihydrochloride for second incubation solution for mouse hearts |
| 2,2'-Azobis dihydrochloride | Wako Chemicals | VA-044 | Mixed with Acrylamide for second incubation solution for mouse hearts |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | 71725 | Mixed with Boric acid for third incubtion solution for mouse hearts |
| Boric acid | Fischer Scientific | A74-1 | Mixed with Sodium dodecyl sulfate for third incubtion solution for mouse hearts |
| Sigma D2158 | Sigma Aldrich | D2158 | Mixed with PB, Tween-20, and Sodium azide as a refractive index matching solution |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | 11332465001 | Mixed with Sigma D2158, PB, and Sodium azide as a refractive index matching solution |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002 | Mixed with Sigma D2158, PB, and Tween-20 as a refractive index matching solution |
| Adeno-associated virus vector 9 with a cardiac-specific Troponin T promoter tagged with GFP | Vector Biolabs | VB2045 | Expresses GFP when bound to ROMK |
| DC Servo Motor Actuator | Thorlabs | Z825B | Used for movement of sample in axial direction within light sheet |
| K-Cube Brushed DC Servo Motor Controller | Thorlabs | KDC101 | Connects to motor actuator and controls movement of the actuator |
| Amira | FEI Software | N/A | Visualization software for producing 2-D and 3-D images |
References
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Lee, J., et al. 4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation. Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1679-1690 (2016).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Huisken, J., Stainier, D. Y. Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology. Development. 136 (12), 1963-1975 (2009).
- Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovascular Research. 91 (2), 279-288 (2011).
- High, F. A., Epstein, J. A. The multifaceted role of Notch in cardiac development and disease. Nature Reviews Genetics. 9 (1), 49-61 (2008).
- Sachinidis, A. Cardiac specific differentiation of mouse embryonic stem cells. Cardiovascular Research. 58 (2), 278-291 (2003).
- Ding, Y., et al. Light-sheet fluorescence imaging to localize cardiac lineage and protein distribution. Scientific Reports. 7, 42209 (2017).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Robbins, N., Thompson, A., Mann, A., Blomkalns, A. L. Isolation and excision of murine aorta; a versatile technique in the study of cardiovascular disease. Journal of Visualized Experiments. (93), e52172 (2014).
- National Heart, L., Blood Institute, Standard Operating Procedures (SOP's) for Duchenne Animal Models. , (2015).
- Sung, K., et al. Simplified three-dimensional tissue clearing and incorporation of colorimetric phenotyping. Scientific Reports. 6, 30736 (2016).
- Yuan, Z., Qiao, C., Hu, P., Li, J., Xiao, X. A versatile adeno-associated virus vector producer cell line method for scalable vector production of different serotypes. Human Gene Therapy. 22 (5), 613-624 (2011).
- FEI, Amira User's Guide. , Konrad-Zuse-Zentrum fur Informationstechnik. Berlin. 59-138 (2017).
- Gao, L., et al. Noninvasive imaging of 3D dynamics in thickly fluorescent specimens beyond the diffraction limit. Cell. 151 (6), 1370-1385 (2012).
- Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy. Nature Methods. 8 (9), 757-760 (2011).
- Ding, Y., et al. Integrating light-sheet imaging with virtual reality to recapitulate developmental cardiac mechanics. JCI Insight. 2 (22), (2017).
