Summary
Bu çalışmada optik takas ile kombine bir çift taraflı aydınlatma ışık sayfalık floresans mikroskobu (LSFM) fare kalp çalışmaya kullanmaktadır.
Abstract
Işık sayfalık floresans mikroskobu mikrometre yüksek bir Aksiyel çözünürlüğünden milimetre ölçek ile hızlı resim alma için yaygın olarak kullanılmış. Geleneksel ışık sayfalık teknikleri uygun örnek doku yönettiği bir tek aydınlatma ışın kullanımı dahil. Bir tek aydınlatma ışını kullanılarak üretilen büyük örnekleri görüntüleri şeritler veya eserler içeren ve düşük çözünürlüğe saçılma ve doku tarafından ışık emilimi nedeniyle muzdarip. Bu çalışmada bir çift taraflı aydınlatma ışını ve Basitleştirilmiş netlik fare kalp için teknik Temizleme optik kullanır. Bu teknikler yürekten lipidler kaldırarak daha derin görüntüleme için izin ve büyük bir alan görüntüleme, 10 x 10 x 10 mm3daha büyük üreten. Sonuç olarak, bu strateji ventrikül boyutları ölçmek, kardiyak lineage izlemek ve kardiyak spesifik proteinler ve iyon-kanalları Doğum sonrası yetişkin fare kalpler yeterli kontrast için kayma dağılımını yerelleştirmek bize sağlar ve çözünürlük.
Introduction
Işık sayfalık floresans mikroskobu ilk 1903 yılında geliştirilen bir teknik olduğunu ve bugün bir yöntem olarak gen ekspresyonu çalışma ve doku örnekleri1,2,33-b veya 4-D modelleri üretmek için kullanılır. Böylece sadece o uçağı dedektörü tarafından yakalanır örneği tek bir uçağı aydınlatmak için ışık ince bir levha bu görüntüleme yöntemini kullanır. Örnek sonra eksenel yönde her yakalamak için hareket edebilir, her seferinde bir bölümü katman ve 3B modele alınan görüntüleri4sonrası işlendikten sonra render. Ancak, emme ve fotonlar saçılma nedeniyle, LSFM ya da birkaç mikron kalınlığında veya optik şeffaf1örnekleri sınırlı olmuştur.
LSFM sınırlamaları optik şeffaf, zebra balığı gibi dokulara sahip organizmaların kapsamlı çalışmalar yol açmıştır. İnsanlar ve zebra balığı5,6arasında korunmuş gen olduğundan kalp geliştirme ve farklılaşma ilgili çalışmalar kez zebra balığı üzerinde yapılmaktadır. Bu çalışmalar kalp araştırma kardiyomiyopatiler6,7' ye ile ilgili gelişmeler yol açmıştır, ancak, bu hala memeliler gibi üst düzey organizmalar üzerinde benzer araştırma yapmak gerek vardır.
Memeli kalp doku kalınlığı ve opaklık doku, kırmızı kan hücreleri ve tek taraflı aydınlatma geleneksel LSFM yöntemleri1 altında örnek nedeniyle oluşur şeritleme hemoglobin nedeniyle emme nedeniyle bir meydan okuma sunuyor , 8. Bu sınırlamalar için telafi etmek için biz çift taraflı aydınlatma ve çözüm (jant) eşleşen bir kırılma indisi ile kombine netlik tekniği9 basitleştirilmiş bir sürümünü kullanmak için önerilen. Bu nedenle, bu sistem bakımı iyi nitelik kararlılık Aksiyel ve yanal8uçak iken 10 x 10 x 10 mm3 daha büyük bir örnek görüntüleme için sağlar.
Bu sistem ilk floresan boncuk cam boru içinde farklı konfigürasyonlarda düzenlenmiş kullanılarak kalibre. Sonra sistem Doğum sonrası ve yetişkin fare kalpler görüntü için kullanıldı. İlk olarak, Doğum sonrası fare kalp 7 gün (ventrikül boşluğuna, kalınlığı ventrikül duvar, vana yapıları ve trabeculation varlığını ortaya çıkarmak için P7) görüntüsü. İkinci olarak, bir çalışma cardiomyocytes 1 gün (P1) Cre etiketli cardiomyocytes ve Sarı floresan protein (YFP) ile Doğum sonrası fare kalp kullanarak hücre tanımlamak için yapılmıştır. Son olarak, yetişkin fareler 7,5 aylıkken böbrek dış medüller potasyum varlığı (ROMK) kanalları gen terapisi8' den sonra gözlemlemek için görüntüsü.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvanlar kullanımını içeren tüm yordamları Kaliforniya Üniversitesi, Los Angeles, California kurumsal inceleme komiteleri (IACUC) tarafından onaylanmış olması.
1. görüntüleme sistem kurulumu
Not: Resim 1 ve Şekil 2bakın.
- Sürekli dalga (CW) lazer 3 dalga boyu ile almak: 405 nm, 473 nm ve 532 nm. Place 2 (M1 ve M2) 150 mm ayrı yansıtır ve onları ayna uçaklarını kirişe 45 ° ile hizalayın.
Not: Uzak çift taraflı aydınlatma kurulum lazer yönlendirmek için bu adım gerçekleştirilir. Elde edilen ışın ilk ışın olarak aynı yönde olacaktır. - Bir 25-mm çap iris diyafram/iğne deliği (PH), 50-mm çapı nötr yoğunluk filtresi (NDF) ışını 0 - bir optik yoğunluk aralığı ile geçmek 4.0, bir ışın genişletici (BE), bir (S) 30 mm yarık uzunluğuna sahip ~ 0 - 6 mm ve bir ayna (M3) , tüm diğer her 150 mm konumlandırılmış. Ayna, ayna uçak ile 45 ° kirişe yerleştirin.
- M3 150 mm'den yerleştirilen bir 50: 50 ışın ayırıcı ışını geçmek. Bir ayna (M6) ışın bölücü 150 mm'den yerleştirin ve böylece onun ayna uçak 45 ° ileriye doğru yönde yayılan kirişe hizalayın. Yansıyan ışın çift aydınlatma ışık sayfanın bir tarafına oluşturmak için kullanın.
- Bir ayna (M4) ışın bölücü 150 mm'den yerleştirin ve böylece onun ayna uçak 45 ° ışın splitter üzerinden 90 ° açıyla yayılan kirişe hizalayın. İkinci bir ayna (M5) 150 mm M4 dan yerleştirin ve böylece onun ayna uçak M6 yansıyan ışın için 45 ° hizalayın. M5 yayılan ışını çift aydınlatma ışık sayfası ikinci tarafını oluşturmak için kullanın.
- Çift taraflı aydınlatma sistemi simetrik bir biçimde ayarlayın (bkz. Şekil 1). Bir silindirik lens (CL1) yer [çapı (d) =; 1 odak uzaklığı (f) = 50 mm] M5 M6 çift aydınlatma tertibat diğer tarafında üzerinden yayılan ışını doğrultusunda 150 mm bir tarafı ve başka bir aynı silindirik lens (CL2) üzerinde yayılan ışını doğrultusunda 150 mm s. 2 (M7 ve M8) her silindirik mercekler doğrultusunda 90 ° ışın yansıtmak için 50 mm mesafelerde yer aynalar.
- Bir çift lens dan akromatik bir kütleye oluştururlar. İlk lens, L1 yerleştirin (d =; 1 f = 100 mm), 100 mm M7 ve ikinci lens, L2 (d =; 1 f = 60 mm), 160 mm L1 üzerinden. Bu çift-aydınlatma aynı lensler (L3, L4) ile diğer tarafında M8 aynı mesafede yerleştirilmiş yineleyin.
- Yer, M9 ve M10, 60 mm lens L2 ve L4, sırasıyla ve ışın doğrultusunda yansıtır. Aydınlatma amaçları, OL1 ve OL2 yer (d = 2; f = 150 mm), 150 mm M9 ve M10 ve ışın ile uyumlu. Hedefleri yayılan ışını örnekleri görüntüleme için ışık sayfası oluşturur.
- 3-b Yazıcı örnek sahibi Akrilonitril bütadien stiren (ABS) yazdırmak için kullanın. Kapak cam parçası katıştırma [kırılma indisi (RI) 1.4745 =] odası aydınlatma ışık kırılma indisi eşleşmeyebilir en aza indirmek için dikey her tarafında. Odası objektif lensler yayılan kirişler arasında eşit olarak yerleştirin.
- 1 X büyütme objektif ve bilimsel tamamlayıcı metal oksit yarı iletken (sCMOS) kamera aydınlatma için dikey stereo mikroskopla uçak (bkz. Şekil 2) yükleyin.
2. görüntüleme sistemi kalibrasyon
- 0,53 mikron çapında olan flüoresan polistren boncuk almak.
- Floresan boncuk örnek bir kırılma indisi eşleşen çözüm (jant) boncuk çözümde sulandrarak 1:150, 000 için % 1 düşük-melt işaret özel ile hazır olun. Borosilikat cam boru bir parça ile bir iç çapı 12 mm ve 18 mm bir dış çapı 30 mm uzunluğa kes.
Not: Borosilikat cam boru kırılma indisi (1.47) eşleştirmek için kullanılır. - % 1'özel ile seyreltilmiş boncuk örnek mix ve boncuk/özel çözüm borosilikat boru içine pipette. Oda sıcaklığında (23 ° C) kuvvetlendirmek özel izin.
- ABS odası (Kimden adım 1,7) % 99.5 gliserol çözüm ile doldurun. Boncuk oda içinde içeren borosilikat cam boru yerleştirin. ABS odası çift aydınlatma sistem tarafından oluşturulan Gauss ışını ortasına öyle görüntüleme sistemi yerleştirin.
- Bir 3-b motorlu translasyonel sahne hareket ve ABS odası içinde örnek yönünü denetlemek için borosilikat cam tüp takın (bkz. ek Şekil 1).
- Görüntüleri en 30 kare / saniye (fps) saniyede sCMOS kamera kullanarak elde. Motor kontrolörü kullanarak, örnek 1 mm yanal yönde hareket ve görüntüleri, sCMOS kamera kullanarak her 1 mm artışı. Tüm örnek yansıma kadar devam edin.
- Alınan görüntüleri Görselleştirme yazılımları kullanarak yığını ( Tablo malzemelerigörmek). Bu boncuk görüntüleri kullanarak sistem noktaya yayılmış fonksiyonu (PSF) ölçmek. Bu PSF görüntü'sonraki adımlarında işleme sırasında deconvolution için kullanın.
3. numune hazırlama
- Kalpleri bir vahşi türü P1 fare ve bir çift Heterozigoz sarcolipin-Cre knockin fare ile Rosa26-YFP gen teşrih (SlnCre / +; R26YFP muhabir / +), P7.
Not: Fentobarbital ve Robbins ve ark. tarafından açıklanan tekniği kullanarak ötenazi gerçekleştirildi 10. Ulusal Kalp, akciğer ve kan Enstitüsü (NHLBI)10,11tarafından açıklanan tekniği göre diseksiyon gerçekleştirildi. - Kevin Sung vd tarafından açıklandığı gibi fare kalpleri temizleyerek bir kimyasal gerçekleştirmek 12.
Not: kullanılan kimyasalların toksik olan aşağıdaki adımları bir duman mahallede gerçekleştirilmesi gerekiyor.- 1 fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) 3 x kalpleri durulama x 10 dk için. Sonra durulama, kalpleri %4 paraformaldehyde çözeltilerine yerleştirin ve bu örnekler 4 ° C'de gecede kuluçkaya.
- Örnekleri % 0,5 w/v 2, 2'-Azobis dihydrochloride içeren bir % 4 akrilamid çözümde yerleştirin. Gecede 4 ° C'de kuluçkaya örnekleri sağlar. Gecede kuluçka sonra örnekleri kaldırmak ve onları için 2-3 h 37 ° C'de kuluçkaya.
- PBS örnekleriyle durulayın ve sonra %1.25 w/v Borik asit ve % 8 w/v Sodyum Lauryl sülfat çözeltilerine koyun. Onlar berraklaşana kadar 37 ° C'de örnekleri kuluçkaya. Bu örnek kalınlığına bağlı olarak birkaç saat sürebilir. Takas sonra örnekleri kaldırmak ve 1 gün için 1 x fosfat tamponlu tuz koyun.
- Çözüm Nonyonik yoğunluk gradient orta 40 g ile eşleşen bir kırılma indisi hazırlamak ( Tablo malzemelerigörmek) 0,02 M fosfat tampon (PB), % 0,1 ve 0,01 ara-%20 sodyum azid 30 ml. Sodyum hidroksit ile 7,5 pH çözüm getirmek.
- Temizlenen örnek jantlar 1.46-1,48 ve % 1'özel bir kırılma indisini ile yerleştirin. Örnek borosilikat cam boru içine yerleştirin ve oda sıcaklığında (23 ° C) kuvvetlendirmek özel izin.
- Bir 3-b motorlu translasyonel sahne hareketini denetlemek için borosilikat cam tüp takmak ve 3-b içinde örnek yönünü baskılı ABS odası ( Tamamlayıcı Şekil 1bakınız).
4. yetişkin kalp görüntüleme
- Bir özel kardiyak troponin T organizatörü (cTnT) ve yeşil flüoresan protein (GFP) içeren 8,7 1012 virüs türü adeno ilişkili virüs vektör 9 (AAV9) x 100-μL hacmindeki 2 aylık vahşi türü (C57BL/6) fare kuyruğu damar içine enjekte.
Not: AAV9 Yuan vd tarafından açıklanan tekniği göre geliştirilmiştir 13. bu AAV9-cTnT-ROMK-GFP üreten böbrek dış medüller Potasyum kanal (ROMK) bağlamak GFP neden olur (bkz. Tablo malzeme). - 7.5 ay-in yaş NHLBI11tarafından açıklanan tekniği göre yetişkin fare kalpleri parçalara. Adımları 3.1-3.3 kullanarak örnekleri hazırlayın.
- Motor kontrolörü motor aktüatör bağlayın. Aktüatör hareketini denetlemek için borosilikat cam tüp takmak ve 3-b içinde örnek yönünü ABS odası yazdırılır.
- Çift aydınlatma sistem tarafından oluşturulan Gauss ışını ortasına öyle örnek konumlandırın. SCMOS kamera 100 fps hızında çalıştırarak görüntüleri elde etmek.
- Motor kontrolörü kullanarak, örnek 1 mm eksenel yönde hareket ve sCMOS fotoğraf makinesi ile imge vasıl her 1 mm artışı elde. Tüm örnek yansıma kadar devam edin.
Not: Sistem özel geliştirilen alet-kontrol yazılımı tarafından kontrol edilir. - Alınan görüntüleri Görselleştirme yazılımları kullanarak yığını ( Tablo malzemelerigörmek). Bu görüntü yığınları ve görselleştirme yazılım14kullanarak 3 boyutlu görüntüleri geliştirin. PSF adım 2.6 ile elde edilen görüntü yığını deconvolve. Kalp kıvrımlarına gözlemlemek ve görüntüleri bu gri tonlama yoğunluk dayalı sahte renk eklemek için piksel eşik yoğunluk değeri ayarlayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Açıklanan tekniği fare kalp doku örnekleri bir optik takas ile kombine bir çift taraflı aydınlatma ışını daha derin bir görüntüleme derinliği ve daha büyük görüntüleme birimi yeterli görüntü çözünürlüğü (Şekil 1) ile elde etmek için burada kullanılmıştır. Sistem ayarlamak için floresan boncuk cam boru içinde ve görüntüleme sistemi içinde yerleştirildi. Boncuk sonra yansıma ve x-y uçak, y-z uçak, görüntülenir ve x-z düzlemde nokta elde etmek için işlev (PSF) sistem8için yayıldı. Dyanal ≈ yanal yönünde bir çözüm sistemi kalibrasyon üretilen 2.8 µm ve dXZ ≈ 17.4 µm ve gliserol gömme orta8kullanırken dYZ ≈ 17.9 µm eksenel yönde bir çözünürlük.
Floresan boncuk kalibrasyon için kullanılan sonra görüntüleme sistemi fare hearts 1 gün ve 7 gün Doğum sonrası (Şekil 2)8görüntü için kullanıldı. Ventrikül boşluğuna boyutları, kalp kapakları ve ventriküler trabeculation fare kalp bu albümdeki belirgindir. Cardiomyocyte ayırt etme kalp içinde çalışmaya, heterozigoz knockin fareler Cre etiketli cardiomyocytes ile Doğum sonrası görüntüsü. Cre etiketli cardiomyocytes kalp8 (Şekil 3) 3-b bir render birlikte uçak yarıçapının görüntülerdir.
Doğum sonrası fareler eğitim ek olarak, görüntüleme sistemi de yetişkin fare kalp çalışma kullanıldı. Başlangıçta, gen tedavisi GFP öğesini ROMK kanalları fare kalbine tanıtmak için kullanılmıştır. 7,5 aylıkken fare kalp görüntüsü ve bu ROMK kanallar ventrikül duvar (Şekil 4) görüntülenir. Bu adım yordam içinde büyük örnekleri resim ve histolojik kalp içinde boyama ile görmedim yapıları ayırt etmek için bu sistemi yeteneğini gösterir. Şekil 4 ROMK kanalları ile birlikte kalp83-b bir render her uçak yönden gösterir.
Resim 1 : Işık sayfalık floresans mikroskobu sistem Şematik diyagramı. 3 boyutlu bir işleme sisteminin bileşenleri ve sistemde kullanılan bileşenlerin odak uzaklık arasındaki mesafeleri de dahil olmak üzere hafif levha floresans mikroskobu, bu. Bu rakam Yichen Ding ve ark. değiştirildi 8. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Top hafif levha mikroskobu sistemi algılama ile görünümünü. Bu çift taraflı ışık mikroskobu sistemi üstten görünüm burada kiriş sistemi içinde her yerde karanlık mavi bölge temsil eder. Dahil akromatik birini ve aydınlatma amaç oluşan bölgeleri gösteren bir 2-boyutlu büyütülmüş bölümdür. Genişletilmiş bölüm ayrıca hafif levha oluşumu prensibi ve kirişler formu çift taraflı aydınlatma için nasıl birleştirilir göstermektedir. Bu rakam Yichen Ding ve ark. değiştirildi 8. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Doğum sonrası fare kalp 3 boyutlu görüntüleri. (bir) Bu panel Doğum sonrası fare kalp görüntüsünü ventrikül boşluğuna gösterilen 7 gün gösterir. (b) Bu panel ventrikül duvar kalınlığı gösterilen 7 gün Doğum sonrası fare kalp görüntüsünü gösterir. (c) Bu panel gün Vana yapıları yerini gösteren 1 Doğum sonrası fare kalp görüntüsünü gösterir. (d) Bu görüntü gün kalp avluda yer alan pectinate kas gösterilen 1 Doğum sonrası fare kalp genişlemiş bir bölümünden gösterir. (e) Bu görüntü trabeculation ventrikül Doğum sonrası fare kalp içinde 1 gün gösterir. Ölçek çubuğu: 1 mm. İlave kırmızı daire içinde bölgede iki yarı saydam fare kalp netlik tekniği ve borosilikat cam boru içine takılı olan geçiyor sonra gösterir. Bu rakam Yichen Ding ve ark. değiştirildi 8. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : Doğum sonrası bir mouse Cre etiketli cardiomyocytes görüntülerini kalp her uçaktan. P1 fare kalp ile Cre etiketli cardiomyocytes her kesit düzlemde yansıma: (bir) XY, (b) YZ ve (c) XZ. Bu kesit resimleri Cre etiketli cardiomyocytes varlığı atrium ve ventrikül P1 fare göster. (d) görüntüleri de kalp 3-b bir işleme oluşturmak için birleştirildi. İlave kırmızı daire içinde bölgede iki yarı saydam fare kalp netlik tekniği ve borosilikat cam boru içine takılı olan geçiyor sonra gösterir. Ölçek çubuğu: 1 mm. Bu rakam Yichen Ding ve ark. değiştirildi 8. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 : Her uçak ROMK kanallardan gösterilen yetişkin fare kalp görüntülerini. Fare kalp 7.5 ay-in yaş olup olmadığını göstermek için ve ROMK kanal konumunu görüntüsü. Kalp her kesit düzlemde yansıma: (bir) XY, (b) YZ ve (c) XZ. Gri ölçek değeri daha fazla ışık şiddeti ve daha az ışık şiddeti karşılık gelen koyu bölgelerle ilgili açık bölgelerle ile görüntü içinde optik yoğunluk gösterir. (d) görüntüleri de kalp 3-b bir işleme oluşturmak için birleştirildi ve ROMK kanalları yeşil görünecek şekilde orijinal grayscaled görüntüler sözde renkli. İlave kırmızı daire içinde bölgede tek yarı saydam yetişkin fare kalp netlik tekniği ve borosilikat cam boru içine takılı olan geçiyor sonra gösterir. Ölçek çubuğu: 1 mm. Bu rakam Yichen Ding ve ark. değiştirildi 8. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Tamamlayıcı Şekil 1: resim görüntüleme sistemi hafif levha içinde borosilikat boruları ile ABS odası. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
LSFM sistemi ve burada açıklanan tekniği kullanır onun gelişim Doğum sonrası ve yetişkin aşamasında görüntü fare kalp için bir optik temizlenmesi ile kombine bir çift taraflı aydınlatma ışını. Foton saçılma ve emilimi ile daha büyük ve kalın doku örnekleri1,3geleneksel tek aydınlatma ışını muzdarip. Çift taraflı kirişler örnek böylece şeritleme ve tek taraflı bir aydınlatma tarafından üretilen görüntüler sık görülen diğer yapıları etkisini en aza indirmek, daha da bir aydınlatma sağlar. Bu teknik de çift Gauss kirişler8konumunu ayarlayarak yansıma örnek boyutu artar. Tek bir aydınlatma zebra balığı ve Drosophila kalplerini gibi daha küçük kalpler için örnek boyutu sınırlı, ancak bu kirişler maksimum ayrılması doku örneği, Yetişkin fare kalp gibi boyutu birkaç milimetre görüntüleme için verir .
Optik şeffaf değildir dokularda Imaging floresan ışık saçılma doku örneği düzgün olmayabilir beri daha zordur. Bu derinlik için sınırlar hangi bir örnek yansıma ve floresan görüntüleme etkinliği. Bu nedenle, zebra balığı gibi optik saydam doku5doğal olan organizmalar kullanmak yaygındır. Ancak, doğal olarak optik şeffaf cilt var mı organizmalar üzerinde çalışmalar Imaging floresans gerçekleştirmek için doku coloration kaldırmak için geliştirilen farklı optik takas teknikler vardır. Burada doku bir hidrojel yerleştirilir sonra uzun bir süre boyunca inkübe ve nihayet yansıma ve kırılma örnek ve diğer medya1 miktarını azaltır bir takas çözüm yerleştirilir netlik, böyle bir optik temizleme tekniği olduğunu ,9. Bu çalışmada bu tekniği kullanılan reaktif açıklığın azaltmak için güncellenmiştir ve vakum pompaları veya azot gaz8eklenmesi gerek yoktu.
Bu teknik daha kalın opak örnekleri için geliştirilmiş görüntü çözünürlüğünü sağlasa da, gelecek çalışmalar gelişmiş olabilir bu stratejinin sınırlamalar vardır. Ek çalışmalar Bessel kiriş ve yeterli görüntüleme derinliği15,16at daha iyi bir çözünürlük sağlamak için bir iki fotonlu doğrusal olmayan uyarma ile yapılmıştır. Bu yöntemler şu anda küçük kalp modelleri incelemek için kullanılmıştır ama dinamik süreçler içinde gelişmekte olan embriyo çalışmaya adapte. Ayrıca, netlik yönteminde değişiklikler daha büyük doku örnekleri zararlı olabilir fluorophores azaltarak floresan görüntüleme verimliliğini artırabilirsiniz için kayıp sırasında takas işlemi8. Son zamanlarda, gelişimsel kardiyak mekaniği17aydınlatmak için sanal gerçeklik ile bu LSFM sistemi entegre etmiş.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Yazarlar Thao Nguyen ve Atsushi Nakano UCLA'dan fareler örnek görüntü sağlamak için teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışmada hibe NIH HL118650 (için Tzung K. Hsiai), HL083015 (için Tzung K. Hsiai), HD069305 (için N. C. Chi ve Tzung K. Hsiai.), HL111437 (için Tzung K. Hsiai ve N. C. Chi), HL129727 (için Tzung K. Hsiai) ve University of Texas sistemi yıldız (Juhyun için finansman tarafından desteklenen Lee).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CW Laser | Laserglow Technologies | LMM-GBV1-PF3-00300-05 | Excitation of fluorophores |
| Neutral density filter | Thorlabs | NDC-50C-4M | Controls amount of light entering system |
| Achromatic beam expander | Thorlabs | GBE05-A | Expands the beam of light |
| Mechanical slit | Thorlabs | VA100C | Controls width of beam |
| Beam splitter | Thorlabs | BS013 | Forms dual-illumination beam |
| Stereo microscope with 1X objective lense | Olympus | MVX10 | Used for observation of sample |
| ORCA-Flash4.0 LT sCMOS camera | Hamamatsu Photonics | C11440-42U | Used to capture Images |
| Acrylonitrile butadiene styrene (ABS) | Stratasys | uPrint | Material used to 3-D print a sample holder |
| Fluorescent polystyrene beads | Spherotech Inc | PP-05-10 | Used for imaging system calibration |
| Borosilicate glass tubing | Corning | Pyrex 7740 | Tubing for sample embedding |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | Fill for sample chamber |
| Phosphate-buffered saline | Fisher Scientific | BP39920 | Rinse solution for mouse hearts |
| Paraformaldehyde | Electron microscopy sciences | RT-15700 | First incubation solution |
| Acrylamide | Wako Chemicals | AAL-107 | Mixed with 2,2'-Azobis dihydrochloride for second incubation solution for mouse hearts |
| 2,2'-Azobis dihydrochloride | Wako Chemicals | VA-044 | Mixed with Acrylamide for second incubation solution for mouse hearts |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | 71725 | Mixed with Boric acid for third incubtion solution for mouse hearts |
| Boric acid | Fischer Scientific | A74-1 | Mixed with Sodium dodecyl sulfate for third incubtion solution for mouse hearts |
| Sigma D2158 | Sigma Aldrich | D2158 | Mixed with PB, Tween-20, and Sodium azide as a refractive index matching solution |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | 11332465001 | Mixed with Sigma D2158, PB, and Sodium azide as a refractive index matching solution |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002 | Mixed with Sigma D2158, PB, and Tween-20 as a refractive index matching solution |
| Adeno-associated virus vector 9 with a cardiac-specific Troponin T promoter tagged with GFP | Vector Biolabs | VB2045 | Expresses GFP when bound to ROMK |
| DC Servo Motor Actuator | Thorlabs | Z825B | Used for movement of sample in axial direction within light sheet |
| K-Cube Brushed DC Servo Motor Controller | Thorlabs | KDC101 | Connects to motor actuator and controls movement of the actuator |
| Amira | FEI Software | N/A | Visualization software for producing 2-D and 3-D images |
References
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Lee, J., et al. 4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation. Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1679-1690 (2016).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Huisken, J., Stainier, D. Y. Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology. Development. 136 (12), 1963-1975 (2009).
- Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovascular Research. 91 (2), 279-288 (2011).
- High, F. A., Epstein, J. A. The multifaceted role of Notch in cardiac development and disease. Nature Reviews Genetics. 9 (1), 49-61 (2008).
- Sachinidis, A. Cardiac specific differentiation of mouse embryonic stem cells. Cardiovascular Research. 58 (2), 278-291 (2003).
- Ding, Y., et al. Light-sheet fluorescence imaging to localize cardiac lineage and protein distribution. Scientific Reports. 7, 42209 (2017).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Robbins, N., Thompson, A., Mann, A., Blomkalns, A. L. Isolation and excision of murine aorta; a versatile technique in the study of cardiovascular disease. Journal of Visualized Experiments. (93), e52172 (2014).
- National Heart, L., Blood Institute, Standard Operating Procedures (SOP's) for Duchenne Animal Models. , (2015).
- Sung, K., et al. Simplified three-dimensional tissue clearing and incorporation of colorimetric phenotyping. Scientific Reports. 6, 30736 (2016).
- Yuan, Z., Qiao, C., Hu, P., Li, J., Xiao, X. A versatile adeno-associated virus vector producer cell line method for scalable vector production of different serotypes. Human Gene Therapy. 22 (5), 613-624 (2011).
- FEI, Amira User's Guide. , Konrad-Zuse-Zentrum fur Informationstechnik. Berlin. 59-138 (2017).
- Gao, L., et al. Noninvasive imaging of 3D dynamics in thickly fluorescent specimens beyond the diffraction limit. Cell. 151 (6), 1370-1385 (2012).
- Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy. Nature Methods. 8 (9), 757-760 (2011).
- Ding, Y., et al. Integrating light-sheet imaging with virtual reality to recapitulate developmental cardiac mechanics. JCI Insight. 2 (22), (2017).
