Summary
Deze studie gebruikt een tweezijdig verlichting licht vel fluorescentie microscopie (LSFM) techniek gecombineerd met optische clearing om te studeren het lymfkliertest hart.
Abstract
Licht vel fluorescentie microscopie is wijd verbeid gebruikt voor snelle Beeldacquisitie met een hoge axiale resolutie van micrometer op millimeter schaal. Traditionele licht vel technieken omvatten het gebruik van een interne verlichting lichtbundel orthogonaal gericht monster weefsel. Beelden van grote monsters die worden geproduceerd met behulp van een interne verlichting straal bevatten strepen of artefacten en lijden aan een lagere resolutie als gevolg van de verstrooiing en absorptie van licht door het weefsel. Deze studie gebruikt een tweezijdig verlichting lichtbundel en een vereenvoudigde duidelijkheid optische techniek voor het lymfkliertest hart wissen. Deze technieken zorgen voor diepere beeldvorming door het verwijderen van lipiden uit het hart en produceren van een groot gebied van imaging, groter is dan 10 x 10 x 10 mm-3. Dientengevolge, deze strategie ons in staat stelt te kwantificeren van de ventriculaire afmetingen, bijhouden van de cardiale bloedlijn en lokaliseren van de ruimtelijke spreiding van de cardiale-specifieke proteïnen en ionenkanalen van de postnatale aan volwassen muis hart met voldoende contrast en resolutie.
Introduction
Licht vel fluorescentie microscopie was een techniek die in 1903 voor het eerst ontwikkeld en vandaag wordt gebruikt als een methode om te studeren van genexpressie en ook om 3D- of 4-D modellen van weefsel monsters1,2,3te produceren. Een dun blad van licht deze beeldvorming methode gebruikt voor het verlichten van een enkel vliegtuig van een sample zodat alleen dat vliegtuig is vastgelegd door de detector. Het monster kan vervolgens worden verplaatst in de axiale-richting te vangen elk layer, een sectie op een moment, en het renderen van een 3D-model na de nabewerking van de beelden van de verworven4. Echter als gevolg van de absorptie en verstrooiing van fotonen, heeft LSFM is beperkt tot monsters die ofwel een paar microns dik of optisch transparant1.
De beperkingen van LSFM hebben geleid tot uitgebreide studies van organismen die weefsels die optisch transparant zijn, zoals de zebravis hebben. Studies waarbij cardiale ontwikkeling en differentiatie worden vaak uitgevoerd op zebrafish aangezien er geconserveerde genen tussen mens en zebrafish5,6. Hoewel deze studies hebben geleid tot vooruitgang in de cardiale onderzoek met betrekking tot hartziekten6,7, moet er nog een soortgelijk onderzoek op een hoger niveau organismen zoals zoogdieren.
Zoogdieren cardiale weefsel uitdaging een vanwege de dikte en de opaciteit van het weefsel, de absorptie te wijten aan hemoglobine in rode bloedcellen en de striping die optreedt als gevolg van ' single-sided verlichting van het monster onder traditionele LSFM methoden1 , 8. om te compenseren voor deze beperkingen, hebben wij voorgesteld om tweezijdig verlichting en een vereenvoudigde versie van de duidelijkheid techniek9 gecombineerd met een brekingsindex bijpassende oplossing (velgen) te gebruiken. Dus, dit systeem zorgt voor de beeldvorming van een steekproef die groter is dan 10 x 10 x 10 mm-3 terwijl het handhaven van een goede kwaliteit-resolutie op de axiale en laterale vliegtuigen8.
Dit systeem werd eerst gekalibreerd met behulp van fluorescerende kralen gerangschikt in verschillende configuraties binnen de glazen buis. Het systeem werd vervolgens gebruikt om het imago van postnatale en volwassen lymfkliertest harten. Ten eerste was het postnatale muis hart beeld op 7 dagen (P7) te onthullen de ventriculaire Holte, de dikte van de ventriculaire muur, de structuren van de klep en de aanwezigheid van trabeculation. Ten tweede, een studie werd uitgevoerd om cellen die in cardiomyocytes onderscheiden zou met behulp van een postnatale muis hart op 1 dag (P1) met Cre-geëtiketteerden cardiomyocytes en gele fluorescerende eiwit (YFP). Tot slot werden volwassen muizen op 7,5 maanden beeld om te zien hoe de aanwezigheid van renale buitenste Wallenberg kalium (ROMK) kanalen na gene therapie8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures met betrekking tot het gebruik van dieren zijn goedgekeurd door de institutionele beoordeling commissies (IACUC) aan de Universiteit van Californië, Los Angeles, Californië.
1. imaging System Setup
Opmerking: Zie Figuur 1 en Figuur 2.
- Ophalen van een continuous wave (CW) laser met 3 golflengten: 405 nm, 473 nm, en 532 nm. Plaats 2 spiegels (M1 en M2) 150 mm uit elkaar en sluiten ze bij hun spiegel vliegtuigen op 45° naar lichtbundels.
Opmerking: Deze stap wordt uitgevoerd voor het omleiden van de laser uit de buurt van de tweezijdig verlichting setup. De resulterende lichtbundel zullen in dezelfde richting als de eerste bundel. - Passeren van de lichtbundel door middel van een 25-mm diameter iris diafragma/gaatje (PH), een diameter van 50-mm filter met neutrale dichtheid (NDF) met een bereik van de optische dichtheid van 0 - 4.0, een bundel expander (BE), een 30 mm gleuf (S) met de breedte van ~ 0 - 6 mm, en een spiegel (M3) , alle 150 mm van elkaar gepositioneerd. Plaats de spiegel met haar spiegelvlak 45 ° naar lichtbundels.
- Het doorgeven van de lichtbundel door middel van een 50:50 balk splitter geplaatst 150 mm bevinden van M3. Plaats een spiegel (M6) 150 mm bevinden van de balk splitter en uitlijnen zodat haar spiegelvlak op 45° naar de balk die wordt uitgestoten in de voorwaartse richting. Gebruik de teruggekaatste lichtbundel om te vormen van één kant van het lichte blad van dual-verlichting.
- Plaats een spiegel (M4) 150 mm bevinden van de balk splitter en uitlijnen zodat haar spiegelvlak is 45 ° naar lichtbundels die in een hoek van 90° van de balk splitter werd uitgestoten. Plaats een tweede spiegel (M5) 150 mm bevinden van M4 en uitlijnen zodat haar spiegelvlak op 45° naar het licht weerkaatst door M6. Gebruik de bundel uitgezonden van M5 om te vormen van de tweede kant van het lichte blad van dual-verlichting.
- De tweezijdig verlichting systeem in een symmetrische mode ingesteld (Zie Figuur 1). Plaats een cilindrische lens (CL1) [diameter (d) = 1; brandpuntsafstand (f) = 50 mm] 150 mm in overeenstemming met de bundel uitgezonden van M5 aan één kant en een andere identieke cilindrische lens (CL2) 150 mm in overeenstemming met de lichtbundel door M6 aan de andere kant van de dual-verlichting-setu uitgestoten p. plaats 2 spiegels (M7 en de M8) elke in overeenstemming met de cylindrische lenzen op afstanden van 50 mm aan de lichtbundel op 90 °.
- Vormen een achromatische doublet uit een paar lenzen. Plaats de eerste lens, L1 (d = 1; f = 100 mm), 100 mm van de M7 en de tweede lens, L2 (d = 1; f = 60 mm), 160 mm van L1. Herhaal dat dit aan de andere kant van de dual-verlichting met identieke lenzen (L3, L4) dezelfde afstand tot M8 geplaatst.
- Plaats spiegels, M9 en M10, 60 mm van lenzen L2 en L4, respectievelijk, en in overeenstemming met de lichtbundel. Plaats de doelstellingen van de verlichting, OL1 en OL2 (d = 2; f = 150 mm), 150 mm van de M9 en M10 en in overeenstemming met de lichtbundel. De lichtbundel uitgestoten uit de doelstellingen vormt het lichte blad voor beeldvorming van de monsters.
- Een 3D-printer gebruiken om af te drukken van de monsterhouder van acrylonitril-butadieen-styreen (ABS). Het insluiten van een stuk cover glas [brekingsindex (RI) = 1.4745] aan iedere kant van de zaal, loodrecht op de straal van de verlichting, om te minimaliseren brekingsindex mismatching. Gelijkmatig plaats de kamer tussen de balken uitgestoten uit de objectieven.
- Installeer een stereomicroscoop met een 1 X vergroting doelstelling en een wetenschappelijke aanvullend metalen zuurstofverbinding semiconductor (sCMOS) camera loodrecht op de verlichting vliegtuig (Zie Figuur 2).
2. imaging systeem kalibratie
- Ophalen fluorescerende polystyreen kralen die 0.53 micrometer in diameter.
- Het monster fluorescerende kraal bereid door verdunning van de kraal-oplossing in een passende oplossing voor brekingsindex (velgen) met 1% laag-smelt aanwijsapparaat agarose te 1:150, 000. Knip een stukje van borosilicaatglas slang met een binnendiameter van 12 mm en een buitendiameter van 18 mm tot een lengte van 30 mm.
Opmerking: De borosilicaatglas slang wordt gebruikt om te voldoen aan de brekingsindex (1.47). - Meng het monster van de verdunde kraal met 1% agarose en Pipetteer de parel/agarose-oplossing in de borosilicaat-buis. Laat de agarose te stollen bij kamertemperatuur (23 ° C).
- Vul de ABS-zaal (uit stap 1.7) met een 99,5% glycerol-oplossing. Plaats de borosilicaatglas slang bevattende de bolletjes in de kamer. Plaats de ABS-zaal in de imaging systeem, zodat er in het midden van de Gaussiaanse bundel gemaakt door de dubbele verlichting systeem.
- Een 3D-gemotoriseerde translationeel stadium hechten aan de borosilicaatglas slang om controle van de beweging en de richting van het monster in de vergaderzaal van de ABS (Zie aanvullende figuur 1).
- Verwerven van beelden met behulp van de sCMOS camera met een snelheid van 30 frames per seconde (fps). Met behulp van de motorcontroller, het monster 1 mm in zijdelingse richting bewegen en verwerven van beelden bij elke toename van de 1-mm met behulp van de sCMOS camera. Totdat het gehele monster heeft zijn beeld.
- Stapelen van de verworven afbeeldingen via een visualisatie software (Zie Tabel van materialen). Meet het punt verspreiden functie (PSF) van het systeem met behulp van deze beelden van de kraal. Gebruik deze PSF voor deconvolutie tijdens de beeldverwerking in latere stappen.
3. de monstervoorbereiding
- Ontleden van harten uit een wild type P1 muis en een dubbel heterozygoot sarcolipin-Cre knockin muis met de Rosa26-YFP gen (SlnCre / +; R26YFP verslaggever / +) op P7.
Opmerking: Euthanasie werd uitgevoerd met behulp van pentobarbital en de techniek beschreven door Robbins et al. 10. de dissectie werd uitgevoerd volgens de techniek beschreven door de National Heart, Lung en Blood Institute (NHLBI)10,11. - Uitvoeren van een chemische stof ruimen van de lymfkliertest harten, zoals beschreven door Kevin Sung et al. 12.
Opmerking: De volgende stappen moeten worden uitgevoerd in een zuurkast omdat de chemische stoffen die worden gebruikt giftig zijn.- Spoel de harten in 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) 3 x gedurende 10 minuten. Na het spoelen, plaatst u de harten in een 4% paraformaldehyde-oplossing en na een nacht bebroeden deze monsters bij 4 ° C.
- Leg de monsters in een 4% acrylamide oplossing met 0,5% w/v van 2, 2'-Azobis-dihydrochloride. Toestaan dat de monsters na een nacht bebroeden bij 4 ° C. Na de overnachting incubatie, verwijderen van de monsters en hen Incubeer bij 37 ° C gedurende 2-3 uur.
- Spoel de monsters met PBS en plaats ze in een oplossing van 8% w/v natrium dodecyl sulfaat en boorzuur van 1,25% w/v. Incubeer de monsters bij 37 ° C totdat ze duidelijk zijn. Dit kan enkele uren duren afhankelijk van de dikte van het monster. Na wissen, verwijderen van de monsters en plaats ze in 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing voor 1 dag.
- Bereiden van een bijpassende oplossing met 40 g van nonionic dichtheid kleurovergang medium brekingsindex (Zie Tabel van materialen) in 30 mL 0,02 M fosfaatbuffer (PB), 0,1% Tween-20 en 0,01% natriumazide. Breng de oplossing aan een pH van 7.5 met natriumhydroxide.
- Leg het gewiste monster in velgen met een brekingsindex van 1.46-1,48 en 1% agarose. Het monster invoegen borosilicaatglas slang en laat de agarose te stollen bij kamertemperatuur (23 ° C).
- Een 3D-gemotoriseerde translationeel stadium hechten aan de borosilicaatglas slang om de beweging te controleren en richting van het monster in de 3-D afgedrukt ABS kamer (Zie aanvullende figuur 1).
4. volwassen hart Imaging
- Injecteren 8,7 x 1012 virussen van het type adeno-associated virus vector 9 (AAV9) met daarin een promotor van de cardiale-specifieke troponine T (cTnT) en de groen fluorescente proteïne (GFP) in een volume van 100-μL in de ader van de staart van de muis van een 2 maanden durende wild type (C57BL/6).
Opmerking: De AAV9 is ontwikkeld volgens de techniek beschreven door Yuan et al. 13. Hierdoor GFP te binden aan het renale buitenste Wallenberg kalium kanaal (ROMK) AAV9-cTnT-ROMK-GFP produceren (Zie Tabel van materialen). - De volwassen muis harten ontleden op 7,5 maanden oud volgens de techniek beschreven door de NHLBI11. Voorbereiding van de monsters met behulp van stappen 3.1-3.3.
- De motorcontroller verbinden met de motor actuator. De bedieningssleutel hechten aan de borosilicaatglas slang om de beweging te controleren en oriëntatie van het monster in de 3-D afgedrukt ABS kamer.
- Plaats het monster zodat er in het midden van de Gaussiaanse bundel gemaakt door de dubbele verlichting systeem. Verwerven van beelden met behulp van de sCMOS camera met een snelheid van 100 fps.
- Met behulp van de motorcontroller, het monster 1 mm in axiale richting bewegen en afbeeldingen op elke 1-mm increment verwerven met de camera van de sCMOS. Totdat het gehele monster heeft zijn beeld.
Opmerking: Het systeem wordt beheerd door een aangepaste ontwikkelde instrument-control software. - Stapelen van de verworven afbeeldingen via een visualisatie software (Zie Tabel van materialen). Ontwikkelen van 3D-beelden met behulp van deze afbeeldingsstapels en de visualisatie software14. Deconvolve de PSF van stap 2.6 met de verworven afbeeldingsstapel. Stel een pixelwaarde van de drempel intensiteit te observeren de contouren van het hart en pseudo-kleur toevoegen aan de afbeeldingen op basis van de intensiteit van deze grijs-schaal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De techniek beschreven gebruikt hier een tweezijdig verlichting lichtbundel, gecombineerd met een optische clearing van muis hart weefselsteekproeven te komen tot een diepere imaging diepte en een grotere beeldvorming volume met voldoende grafische resolutie (Figuur 1). Als u wilt kalibreren van het systeem, werden fluorescerende kralen geplaatst in de glazen buis en binnen het imaging systeem. De parels werden vervolgens beeld en gevisualiseerd in de x-y vlak, y-z vlak, en in het x-z vlak, met het oog op het punt verspreiden functie (PSF) voor de systeem-8. De kalibratie van het systeem produceerde een resolutie in de laterale richting van dlaterale ≈ 2.8 µm en een resolutie in de axiale richting dXZ ≈ 17.4 µm en dYZ ≈ 17.9 µm bij gebruik van glycerol als de insluiten middellange8.
Nadat de fluorescerende parels werden gebruikt voor de kalibratie, werd de imaging systeem gebruikt om het imago van muis harten op 1 dag en 7 dagen na de geboorte (Figuur 2)8. De afmetingen van de ventriculaire Holte, hartkleppen en ventriculaire trabeculation zijn duidelijk in deze beelden van het hart van de muis. Studeren een differentiatie van de cardiomyocyte in het hart, werden heterozygoot knockin muizen met Cre-geëtiketteerden cardiomyocytes postnatale beeld. De beelden van de Cre-geëtiketteerden cardiomyocytes zijn in de richting van elk vliegtuig samen met een 3D-weergave van het hart8 (Figuur 3).
Naast het bestuderen van postnatale muizen, werd het imaging systeem ook gebruikt voor het bestuderen van het hart volwassen muis. Gentherapie werd aanvankelijk gebruikt te introduceren GFP-gelabeld ROMK kanalen in het hart van de muis. 7,5 maanden, het hart van de muis was beeld en deze ROMK kanalen zijn gevisualiseerd in de ventriculaire muur (Figuur 4). Deze stap in de procedure illustreert het vermogen van image grote monsters & onderscheiden structuren niet gezien met de histologische vlekken in het hart van dit systeem. Figuur 4 toont de kanalen van de ROMK van elk vliegtuig richting samen met een 3D-weergave van de hart-8.
Figuur 1 : Schematisch diagram van het systeem licht vel fluorescentie microscopie. Dit is een 3-dimensionale weergave van het lichte blad fluorescentie microscopie systeem, met inbegrip van de afstanden tussen de onderdelen en de brandpunten van de onderdelen die worden gebruikt in het systeem. Dit cijfer is gewijzigd van Yichen Ding et al. 8. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Top weergave van licht blad microscopie systeem met detectie. Dit is het bovenaanzicht van de tweezijdig verlichting microscopie systeem waarbij de verduisterde blauwe regio vertegenwoordigt de balk op elke locatie binnen het systeem. Inbegrepen is een 2-dimensionale uitgebreide sectie die toont een van de regio's bestaande uit de verlichting doelstelling en Achromatische paren. Deze uitgebreide sectie toont ook het beginsel van lichte vel vorming en hoe de balken worden gecombineerd om vorm een tweezijdig verlichting. Dit cijfer is gewijzigd van Yichen Ding et al. 8. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : 3D-beelden van postnatale lymfkliertest hart. (een) dit paneel bevat een afbeelding van het postnatale muis hart op dag 7 toont de ventrikel holte. (b) dit paneel bevat een afbeelding van het postnatale muis hart op dag 7 weergegeven: de dikte van de wand van de hartkamer. (c) dit paneel toont het beeld van het hart van postnatale muis op dag 1 toont de locatie van de structuren van het ventiel. (d) dit beeld toont een uitgebreide sectie van het postnatale muis hart op dag 1 toont de pectinate spier gelegen in het atrium van het hart. (e) dit beeld toont trabeculation in de ventrikel in de postnatale muis hart op dag 1. Schaal bar: 1 mm. De rood-omcirkeld regio binnen de inzet toont twee doorschijnend muis harten na het ondergaan van de techniek van de duidelijkheid en de borosilicaatglas slang wordt ingevoegd. Dit cijfer is gewijzigd van Yichen Ding et al. 8. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Beelden van de Cre-geëtiketteerden cardiomyocytes in een postnatale muis hart van elk vliegtuig. Het hart van de muis P1 was beeld met Cre-geëtiketteerden cardiomyocytes in elk transversale vlak: (een) XY, (b) YZ, en (c) XZ. Deze transversale beelden tonen de aanwezigheid van Cre-geëtiketteerden cardiomyocytes in het atrium en het ventrikel van de P1-muis. (d) de beelden waren ook samengevoegd tot een 3D-weergave van het hart. De rood-omcirkeld regio binnen de inzet toont twee doorschijnend muis harten na het ondergaan van de techniek van de duidelijkheid en de borosilicaatglas slang wordt ingevoegd. Schaal bar: 1 mm. Dit cijfer is gewijzigd van Yichen Ding et al. 8. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 : Afbeeldingen van het hart van de volwassen muis met de kanalen van de ROMK van elk vliegtuig. Het hart van de muis was beeld op 7,5 maanden van leeftijd te tonen van de aanwezigheid en de locatie van ROMK kanalen. Het hart was beeld in elk transversale vlak: (een) XY, (b) YZ, en (c) XZ. De grijstinten waarde geeft de optische intensiteit in het beeld, met de lichtste gedeelten overeenkomt met meer lichtintensiteit en de donkerste gedeelten overeenkomt met minder licht intensiteit. (d) de beelden waren ook samengevoegd tot een 3D-weergave van het hart, en de originele beelden van de grayscaled werden pseudo-gekleurde, zodat de ROMK kanalen worden groen weergegeven. De rood-omcirkeld regio binnen de inzet toont een enkele doorschijnend volwassen muis hart na het ondergaan van de techniek van de duidelijkheid en de borosilicaatglas slang wordt ingevoegd. Schaal bar: 1 mm. Dit cijfer is gewijzigd van Yichen Ding et al. 8. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Aanvullende figuur 1: foto van de zaal van de ABS met de borosilicaat-buis binnen het lichte blad van het imaging systeem. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het LSFM systeem en de hier beschreven techniek maakt gebruik van een tweezijdig verlichting lichtbundel, gecombineerd met een optische clearing naar afbeelding het hart van de muis in postnatale en volwassen stadia van haar ontwikkeling. Een traditionele interne verlichting straal lijdt aan foton verstrooiing en absorptie via dikker en groter weefsel monsters1,3. De tweezijdig balken zorgen voor een gelijkmatiger verlichting van het monster, aldus het minimaliseren van het effect van striping en andere artefacten die vaak in beelden geproduceerd door een eenzijdige verlichting gezien worden. Deze techniek verhoogt ook de grootte van de steekproef die door aanpassen van de positie van de dubbele Gaussian balken8beeld kan worden. De maximale scheiding van deze balken zorgt voor de beeldvorming van een weefsel monster enkele millimeters groot, zoals de volwassen muis hart, overwegende dat een interne verlichting de grootte van de steekproef aan kleinere hart zoals de harten van zebravis en Drosophila beperkt .
Fluorescentie beeldvorming in weefsels die niet optisch transparant is moeilijker omdat lichtverstrooiing mogelijk niet uniforme gedurende het monster weefsel. Dit beperkt de diepte aan die een monster image kan worden gemaakt en de doeltreffendheid van de fluorescentie imaging. Om deze reden is het gebruikelijk om het gebruiken van organismen zoals de zebravis, hebben natuurlijk optisch transparante weefsel5. Voor het uitvoeren van fluorescentie imaging studies over organismen die natuurlijk geen optisch transparante huid, zijn er echter verschillende optische clearing technieken die zijn ontwikkeld voor het verwijderen van de kleur van het weefsel. Een dergelijke optische clearing-techniek is duidelijkheid, waar het weefsel is geplaatst in een hydrogel, dan gedurende een lange periode van tijd geïncubeerd, en tot slot geplaatst in een clearing-oplossing die de hoeveelheid van de reflectie en de breking tussen het monster en andere media1 vermindert ,9. In deze studie, deze techniek is gewijzigd ter vermindering van het bedrag van clearing reagens gebruikt en de toevoeging van vacuümpompen of stikstof gas8niet meer vereist.
Maar deze techniek een betere beeldresolutie voor dikker ondoorzichtige monsters biedt, zijn er beperkingen met betrekking tot deze strategie die kan worden verbeterd in toekomstige studies. Bijkomende studies zijn uitgevoerd met Bessel-balken en de niet-lineaire excitatie van een twee-foton om een betere resolutie op voldoende imaging diepten15,16te verstrekken. Deze methoden zijn momenteel gebruikt om kleinere cardiale modellen bestuderen maar zou kunnen worden aangepast om te bestuderen van de dynamische processen binnen een zich ontwikkelende embryo. Ook wijzigingen in de methode van de duidelijkheid voor grotere weefselsteekproeven kon de doelmatigheid van fluorescerende beeldvorming door het verminderen van het aantal fluorophores dat potentieel kan worden verloren tijdens het opruimen8verwerken. Wij hebben onlangs, dit LSFM systeem geïntegreerd met de virtuele werkelijkheid developmental cardiale mechanica17ophelderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs wil dankbaarheid uiten aan Thao Nguyen en Atsushi Nakano uit UCLA voor het verstrekken van het monster van de muizen naar afbeelding. Deze studie werd ondersteund door subsidies NIH HL118650 (naar Tzung K. Hsiai), HL083015 (naar Tzung K. Hsiai), HD069305 (te N. C. Chi Tzung K. Hsiai.), HL111437 (aan Tzung K. Hsiai en N. C. Chi), HL129727 (naar Tzung K. Hsiai) en Universiteit van Texas systeem "STARS" financiering (Juhyun Lee).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CW Laser | Laserglow Technologies | LMM-GBV1-PF3-00300-05 | Excitation of fluorophores |
| Neutral density filter | Thorlabs | NDC-50C-4M | Controls amount of light entering system |
| Achromatic beam expander | Thorlabs | GBE05-A | Expands the beam of light |
| Mechanical slit | Thorlabs | VA100C | Controls width of beam |
| Beam splitter | Thorlabs | BS013 | Forms dual-illumination beam |
| Stereo microscope with 1X objective lense | Olympus | MVX10 | Used for observation of sample |
| ORCA-Flash4.0 LT sCMOS camera | Hamamatsu Photonics | C11440-42U | Used to capture Images |
| Acrylonitrile butadiene styrene (ABS) | Stratasys | uPrint | Material used to 3-D print a sample holder |
| Fluorescent polystyrene beads | Spherotech Inc | PP-05-10 | Used for imaging system calibration |
| Borosilicate glass tubing | Corning | Pyrex 7740 | Tubing for sample embedding |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | Fill for sample chamber |
| Phosphate-buffered saline | Fisher Scientific | BP39920 | Rinse solution for mouse hearts |
| Paraformaldehyde | Electron microscopy sciences | RT-15700 | First incubation solution |
| Acrylamide | Wako Chemicals | AAL-107 | Mixed with 2,2'-Azobis dihydrochloride for second incubation solution for mouse hearts |
| 2,2'-Azobis dihydrochloride | Wako Chemicals | VA-044 | Mixed with Acrylamide for second incubation solution for mouse hearts |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | 71725 | Mixed with Boric acid for third incubtion solution for mouse hearts |
| Boric acid | Fischer Scientific | A74-1 | Mixed with Sodium dodecyl sulfate for third incubtion solution for mouse hearts |
| Sigma D2158 | Sigma Aldrich | D2158 | Mixed with PB, Tween-20, and Sodium azide as a refractive index matching solution |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | 11332465001 | Mixed with Sigma D2158, PB, and Sodium azide as a refractive index matching solution |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002 | Mixed with Sigma D2158, PB, and Tween-20 as a refractive index matching solution |
| Adeno-associated virus vector 9 with a cardiac-specific Troponin T promoter tagged with GFP | Vector Biolabs | VB2045 | Expresses GFP when bound to ROMK |
| DC Servo Motor Actuator | Thorlabs | Z825B | Used for movement of sample in axial direction within light sheet |
| K-Cube Brushed DC Servo Motor Controller | Thorlabs | KDC101 | Connects to motor actuator and controls movement of the actuator |
| Amira | FEI Software | N/A | Visualization software for producing 2-D and 3-D images |
References
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Lee, J., et al. 4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation. Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1679-1690 (2016).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Huisken, J., Stainier, D. Y. Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology. Development. 136 (12), 1963-1975 (2009).
- Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovascular Research. 91 (2), 279-288 (2011).
- High, F. A., Epstein, J. A. The multifaceted role of Notch in cardiac development and disease. Nature Reviews Genetics. 9 (1), 49-61 (2008).
- Sachinidis, A. Cardiac specific differentiation of mouse embryonic stem cells. Cardiovascular Research. 58 (2), 278-291 (2003).
- Ding, Y., et al. Light-sheet fluorescence imaging to localize cardiac lineage and protein distribution. Scientific Reports. 7, 42209 (2017).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Robbins, N., Thompson, A., Mann, A., Blomkalns, A. L. Isolation and excision of murine aorta; a versatile technique in the study of cardiovascular disease. Journal of Visualized Experiments. (93), e52172 (2014).
- National Heart, L., Blood Institute, Standard Operating Procedures (SOP's) for Duchenne Animal Models. , (2015).
- Sung, K., et al. Simplified three-dimensional tissue clearing and incorporation of colorimetric phenotyping. Scientific Reports. 6, 30736 (2016).
- Yuan, Z., Qiao, C., Hu, P., Li, J., Xiao, X. A versatile adeno-associated virus vector producer cell line method for scalable vector production of different serotypes. Human Gene Therapy. 22 (5), 613-624 (2011).
- FEI, Amira User's Guide. , Konrad-Zuse-Zentrum fur Informationstechnik. Berlin. 59-138 (2017).
- Gao, L., et al. Noninvasive imaging of 3D dynamics in thickly fluorescent specimens beyond the diffraction limit. Cell. 151 (6), 1370-1385 (2012).
- Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy. Nature Methods. 8 (9), 757-760 (2011).
- Ding, Y., et al. Integrating light-sheet imaging with virtual reality to recapitulate developmental cardiac mechanics. JCI Insight. 2 (22), (2017).
