Summary
Questo studio utilizza una tecnica di microscopia (LSFM) foglio di luce di fluorescenza-retro illuminazione combinata con compensazione ottica per studiare il cuore murino.
Abstract
Microscopia di fluorescenza di luce-foglio è stato ampiamente utilizzata per l'acquisizione rapida immagine con un'alta risoluzione assiale da micrometro scala del millimetro. Tecniche tradizionali di luce-foglio implicano l'uso di un fascio di illuminazione singola direzionato ortogonalmente al tessuto dell'esempio. Immagini di grandi campioni che sono prodotte utilizzando un fascio di illuminazione singola contengono strisce o artefatti e soffrono di una risoluzione ridotta dovuto la dispersione e l'assorbimento della luce da parte del tessuto. Questo studio utilizza un fascio di fronte-retro illuminazione e una semplificata chiarezza ottica, tecniche di taglio per il cuore murino. Queste tecniche permettono di imaging più profondo rimuovendo i lipidi dal cuore e producono un grande campo di formazione immagine, maggiore di 10 x 10 x 10 mm3. Di conseguenza, questa strategia permette di quantificare le dimensioni ventricolari, traccia la linea cardiaca e localizzare la distribuzione spaziale delle proteine cardiache specifiche e canali ionici da post-natali ai cuori di topo adulto con sufficiente contrasto e ad alta risoluzione.
Introduction
Microscopia di fluorescenza di luce-foglio era una tecnica sviluppata nel 1903 ed è usata oggi come un metodo per studiare l'espressione genica ed anche a produrre modelli 3D o 4D di tessuto campioni1,2,3. Questo metodo di imaging utilizza un sottile foglio di luce per illuminare un unico piano di un campione in modo che solo quell'aereo è catturato dal rivelatore. Il campione può quindi essere spostato in direzione assiale per catturare ogni strato, una sezione alla volta e il rendering di un modello 3D dopo il post-processing delle immagini acquisite4. Tuttavia, dovuto l'assorbimento e la dispersione dei fotoni, LSFM è stato limitato ai campioni che sono entrambi a pochi micron di spessore o sono otticamente trasparente1.
Le limitazioni di LSFM hanno portato a studi approfonditi di organismi che hanno i tessuti che sono otticamente trasparenti, come il pesce zebra. Studi condotti su differenziazione e sviluppo cardiaco sono spesso condotte su zebrafish poiché ci sono geni conservati tra esseri umani e zebrafish5,6. Anche se questi studi hanno portato a progressi nella ricerca cardiaca legate a cardiomiopatie6,7, c'è ancora la necessità di condurre una simile ricerca sugli organismi di livello superiore come i mammiferi.
Mammiferi del tessuto cardiaco presenta una sfida a causa dello spessore e l'opacità del tessuto, l'assorbimento a causa dell'emoglobina nei globuli rossi e lo striping che si verifica a causa di illuminazione unilaterale del campione sotto tradizionale LSFM metodi1 , 8. per compensare queste limitazioni, abbiamo proposto di utilizzare-retro illuminazione e una versione semplificata della chiarezza tecnica9 combinati con un indice di rifrazione corrispondente soluzione (cerchi). Di conseguenza, questo sistema permette l'imaging di un campione che è maggiore di 10 x 10 x 10 mm3 mentre mantenendo una buona qualità risoluzione assiale e laterale piani8.
Questo sistema è stato calibrato prima utilizzando perline fluorescenti disposti in diverse configurazioni all'interno della tubazione di vetro. Quindi, il sistema è stato usato all'immagine cuori murini postnatali e adulti. In primo luogo, il cuore del topo postnatale era imaged in 7 giorni (P7) per rivelare la cavità ventricolare, lo spessore della parete ventricolare, le strutture di valvola e la presenza di trabeculation. In secondo luogo, è stato condotto uno studio per identificare le celle che vuoi differenziare in cardiomiociti utilizzando un cuore del topo postnatale al giorno 1 (P1) con Cre-labeled cardiomiociti e la proteina fluorescente gialla (YFP). Infine, topi adulti a 7,5 mesi erano imaged per osservare la presenza di potassio midollare esterna renale canali (ROMK) dopo la terapia di gene8.
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Protocol
Tutte le procedure che prevedono l'uso di animali sono state approvate da comitati di revisione istituzionale (IACUC) presso la University of California, Los Angeles, California.
1. imaging System Setup
Nota: Vedere Figura 1 e Figura 2.
- Recuperare un laser ad onda continua (CW) con 3 lunghezze d'onda: 405 nm, 473 nm e 532 nm. Posto 2 specchi (M1 e M2) distanza di 150 mm e allinearli con i loro aerei di specchio a 45° alla trave.
Nota: Questo passaggio viene eseguito per reindirizzare il laser lontano il setup di fronte-retro illuminazione. Il fascio risultante sarà nella stessa direzione del raggio iniziale. - Passare il raggio attraverso un diametro di 25 mm diaframma/pinhole (PH), un filtro di densità neutra (NDF) di diametro 50 mm con una gamma di densità ottica pari a 0 - 4.0, un espansore del fascio (BE), una fessura di 30 mm (S) con la larghezza di ~ 0 - 6 mm e uno specchio (M3) , tutti posizionati 150 mm da altro. Posizionare lo specchio con il suo piano di specchiatura a 45° alla trave.
- Passare il raggio attraverso un divisore di fascio di 50: 50 a 150 mm dalla M3. Posizionare uno specchio (M6) 150 mm dal divisore di fascio e allinearlo in modo che il piano di specchiatura è a 45° per la trave che viene emesso in avanti. Utilizzare il fascio riflesso per formare un lato del foglio doppio-illuminazione luce.
- Posizionare uno specchio (M4) 150 mm dal divisore di fascio e allinearlo in modo che il piano di specchiatura è a 45° per la trave che è stata emessa ad un angolo di 90° dal divisore di fascio. Inserire un secondo specchio (M5) 150 mm dalla M4 e allinearlo affinché il piano di specchiatura è a 45° per il fascio riflettuto da M6. Utilizzare il fascio emesso dalla M5 per formare il secondo lato del foglio doppio-illuminazione luce.
- Impostare il sistema di illuminazione su due lati in modo simmetrico (Vedi Figura 1). Inserire una lente cilindrica (CL1) [Diametro (d) = 1; lunghezza focale (f) = 50 mm] 150 mm in linea con il fascio emesso dalla M5 su un lato e un altro identico lente cilindrica (CL2) 150 mm in linea con il fascio emesso dalla M6 sul lato opposto della setu dual-illuminazione p. Posizionare 2 specchi (M7 e M8) ogni in linea con le lenti cilindriche a distanza di 50 mm per riflettere il fascio a 90 °.
- Formare un doppietto acromatico da un paio di lenti. Posizionare il primo obiettivo, L1 (d = 1; f = 100 mm), 100 mm da M7 e la seconda lente, L2 (d = 1; f = 60 mm), 160 mm da L1. Ripetere che questo sul lato opposto del doppio-illuminazione con obiettivi identici (L3, L4) posizionato alla stessa distanza da M8.
- Posto specchi, M9 e M10, 60mm da lenti L2 e L4, rispettivamente e in linea con il fascio. Posizionare gli obiettivi di illuminazione, OL1 e OL2 (d = 2; f = 150 mm), 150 mm da M9 e M10 e in linea con il fascio. Il fascio emesso dagli obiettivi forma il foglio leggero per i campioni di imaging.
- Utilizzare una stampante 3D per stampare il portacampioni da acrilonitrile butadiene stirene (ABS). Incorporare un pezzo di vetro di copertura [indice di rifrazione (RI) = 1.4745] su ogni lato della camera, perpendicolare al fascio di illuminazione, per ridurre al minimo l'indice di rifrazione di disadattamento. Posizionare in modo uniforme la camera tra i raggi emessi dalle lenti dell'obiettivo.
- Installare un microscopio stereo con un 1 obiettivo di ingrandimento e una fotocamera di semiconduttore (sCMOS) scientifico ossido di metallo complementare perpendicolare all'illuminazione aereo (Vedi Figura 2).
2. calibrazione del sistema imaging
- Recuperare fluorescente perle di polistirolo che sono 0,53 μm di diametro.
- Preparare il campione di perlina fluorescente diluendo la soluzione di perlina in una soluzione corrispondente indice di rifrazione (cerchi) con puntamento agarosio all'1% basso-fusione di 1: 150, 000. Tagliare un pezzo di tubo di vetro borosilicato con un diametro interno di 12 mm e un diametro esterno di 18 mm per una lunghezza di 30 mm.
Nota: Il tubo di vetro borosilicato viene utilizzato per abbinare l'indice di rifrazione (1,47). - Mescolare il campione diluito perlina con 1% di agarosio e dispensare la soluzione di agarosio/tallone nel tubo borosilicato. Consentire l'agarosio a solidificare a temperatura ambiente (23 ° C).
- Riempire la camera ABS (dal punto 1.7) con una soluzione di glicerolo al 99,5%. Posizionare il tubo di vetro borosilicato contenente le microsfere all'interno della camera. Posizionare la camera di ABS in sistema di imaging in modo che è al centro del fascio gaussiano creato dal sistema di doppia illuminazione.
- Allegare una fase traslazionale motorizzata 3-d per il tubo di vetro borosilicato per controllare il movimento e l'orientamento del campione all'interno della camera ABS (Vedi Supplemental figura 1).
- Acquisire immagini tramite la fotocamera di sCMOS a una velocità di 30 fotogrammi al secondo (fps). Utilizzando il controller del motore, spostare il campione 1 mm in direzione laterale e acquisire immagini a ogni incremento di 1 mm utilizzando la fotocamera sCMOS. Continuare fino a quando l'intero campione è stato ripreso.
- Impilare le immagini acquisite utilizzando un software di visualizzazione (Vedi Tabella materiali). Misurare la funzione di diffusione del punto (PSF) del sistema utilizzando queste immagini della perla. Utilizzare questo PSF per deconvoluzione durante l'elaborazione nei passaggi successivi di immagini.
3. preparazione del campione
- Sezionare i cuori da un mouse di tipo selvaggio P1 e da un doppio eterozigote sarcolipin-Cre knockin mouse con il gene Rosa26-YFP (SlnCre / +; R26reporter YFP / +) a P7.
Nota: L'eutanasia è stata effettuata usando pentobarbital e la tecnica descritta da Robbins et al. 10. la dissezione è stata realizzata secondo la tecnica descritta dal National Heart, Lung e Blood Institute (NHLBI)10,11. - Eseguire un prodotto chimico di compensazione dei cuori murini come descritto da Kevin Sung et al. 12.
Nota: La seguente procedura dovrebbe essere eseguita in una cappa poiché i prodotti chimici utilizzati sono tossici.- Sciacquare i cuori in 1x tampone fosfato salino (PBS) 3 x per 10 min. Dopo il risciacquo, mettere i cuori in una soluzione di paraformaldeide 4% e incubare questi campioni a 4 ° C durante la notte.
- Posizionare i campioni in una soluzione di 4% di acrilammide contenente 0.5% p/v di 2, 2'-Azobis dicloridrato. Consentire ai campioni di incubare a 4 ° C durante la notte. Dopo l'incubazione overnight, rimuovere i campioni e li Incubare a 37 ° C per 2-3 ore.
- Sciacquare i campioni con PBS e poi metterli in una soluzione di solfato dodecilico di sodio di 8% w/v e 1,25% w/v acido borico. Incubare i campioni a 37 ° C fino a quando non sono chiare. Questo può richiedere diverse ore a seconda dello spessore del campione. Dopo aver eliminato, rimuovere i campioni e metterli in 1x tampone fosfato salino per 1 giorni.
- Preparare un indice di rifrazione corrispondente soluzione con 40 g di medio gradiente di densità non ionico (Vedi Tabella materiali) in 30 mL di tampone fosfato 0,02 M (PB), 0.1% Tween-20 e 0,01% di sodio azide. Portare la soluzione a un pH di 7,5 con idrossido di sodio.
- Posizionare il campione deselezionato in cerchi con un indice di rifrazione di 1,46-1,48 e 1% di agarosio. Inserire il campione nel tubo di vetro borosilicato e consentire l'agarosio a solidificare a temperatura ambiente (23 ° C).
- Allegare una fase traslazionale motorizzata 3-d per il tubo di vetro borosilicato per controllare il movimento e orientamento del campione entro il 3-d stampato alloggiamento ABS (Vedi Supplemental figura 1).
4. Imaging del cuore adulto
- Iniettare 8,7 x 1012 virus di tipo vettoriale virus adeno-associato 9 (AAV9) che contiene un promotore specifico troponina T (cTnT) e la proteina fluorescente verde (GFP) in un volume di 100 μL in vena caudale di un mouse di tipo selvaggio 2-mese (C57BL/6).
Nota: Il AAV9 è stato sviluppato secondo la tecnica descritta da Yuan et al. 13. in questo modo GFP da associare al canale midollare esterna renale del potassio (ROMK) producendo AAV9-cTnT-ROMK-GFP (Vedi Tabella materiali). - Sezionare i cuori di topo adulto a 7,5 mesi dell'età secondo la tecnica descritta da NHLBI11. Preparare i campioni utilizzando passaggi 3.1-3.3.
- Collegare il controller del motore per l'attuatore motore. Collegare l'attuatore al tubo di vetro borosilicato per controllare il movimento e orientamento del campione entro il 3-d stampato camera di ABS.
- Posizionare il campione in modo che è al centro del fascio gaussiano creato dal sistema di doppia illuminazione. Acquisire immagini tramite la fotocamera di sCMOS ad un tasso di 100 fps.
- Utilizzando il controller del motore, spostare il campione 1 mm in direzione assiale e acquisire immagini a ogni incremento di 1 mm con la fotocamera di sCMOS. Continuare fino a quando l'intero campione è stato ripreso.
Nota: Il sistema è controllato da un software di controllo di strumenti personalizzati. - Impilare le immagini acquisite utilizzando un software di visualizzazione (Vedi Tabella materiali). Sviluppare le immagini 3D utilizzando queste serie di immagini e il software di visualizzazione14. Deconvoluzione il PSF da passo 2.6 con lo stack di immagine acquisita. Impostare un valore di intensità di soglia pixel per osservare i contorni del cuore e aggiungere pseudo-colore alle immagini basate su questa intensità di scala di grigi.
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Representative Results
La tecnica descritta qui usato un fascio di fronte-retro illuminazione combinato con una compensazione ottica dei campioni di tessuto del cuore del mouse per ottenere una maggiore profondità di imaging e un più grande volume di imaging con sufficiente formazione immagine ad alta risoluzione (Figura 1). Per calibrare il sistema, perline fluorescenti sono stati collocati all'interno dei tubi di vetro e all'interno del sistema di imaging. Le perle sono stati poi ripreso e visualizzate nel piano x-y, y-z aereo, e nel piano x-z, per ottenere il punto di diffusione funzione (PSF) per il sistema8. La calibrazione del sistema prodotto una risoluzione in direzione lateralelaterale d ≈ 2,8 µm e una risoluzione in direzioni assiale di dXZ ≈ 17,4 µm e dYZ ≈ 17,9 µm quando si utilizza il glicerolo come l'incorporamento media8.
Dopo le perline fluorescenti sono state utilizzate per la taratura, il sistema di imaging è stato utilizzato cuori del mouse dell'immagine a 1 giorno e 7 giorni post-partum (Figura 2)8. Le dimensioni della cavità ventricolare, valvole cardiache e trabeculation ventricolare sono evidenti in queste immagini del cuore del mouse. Per studiare una cardiomyocyte differenziazione all'interno del cuore, topi eterozigoti knockin con cardiomiociti Cre-identificati erano imaged postnatale. Le immagini dei cardiomyocytes Cre-identificati sono in ogni direzione piano insieme con un rendering 3D del cuore8 (Figura 3).
Oltre a studiare topi postnatali, il sistema di imaging è stato anche utilizzato per studiare il cuore di topo adulto. Inizialmente, la terapia genica è stato utilizzato per introdurre canali ROMK GFP-etichettato nel cuore del mouse. A 7,5 mesi, il cuore del topo era imaged e questi canali ROMK sono stati visualizzati nella parete ventricolare (Figura 4). Questo passaggio all'interno della routine illustra la capacità di questo sistema per campioni di grandi dimensioni di immagine e distinguere strutture non visualizzate con la colorazione istologica all'interno del cuore. La figura 4 Mostra i canali ROMK da ogni direzione piano insieme con un rendering 3D del cuore8.
Figura 1 : Diagramma schematico del sistema di microscopia di fluorescenza di luce-foglio. Si tratta di un rendering 3-dimensionale del sistema di microscopia di fluorescenza foglio leggero, tra cui le distanze tra i componenti e le lunghezze focali dei componenti utilizzati nel sistema. Questa figura è stata modificata da Yichen Ding et al. 8. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Punto di vista del sistema di microscopia foglio leggero con rilevamento superiore. Questa è la vista dall'alto del sistema di microscopia-retro illuminazione dove l'oscura regione blu rappresenta il raggio in ogni posizione all'interno del sistema. È inclusa una sezione allargata 2-dimensionale che illustra una delle regioni composto doppietti acromatici e obiettivo di illuminazione. Questa sezione allargata Mostra anche il principio di formazione di foglio leggero e come le travi vengono combinate per illuminazione forma un fronte-retro. Questa figura è stata modificata da Yichen Ding et al. 8. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Immagini 3D del cuore murino postnatale. (un) questo pannello mostra un'immagine del cuore del mouse postnatale giorno 7 risultati della cavità del ventricolo. (b) questo pannello mostra un'immagine del cuore del mouse postnatale giorno 7 mostrando lo spessore della parete del ventricolo. (c) questo pannello mostra l'immagine del cuore del mouse postnatale giorno 1 Mostra la posizione delle strutture valvola. (d) questa immagine mostra una sezione allargata dal cuore del mouse postnatale giorno 1 che mostra il muscolo pettinato situato nell'atrio del cuore. (e) questa immagine mostra trabeculation nel ventricolo all'interno del cuore di topo postnatale al giorno 1. Barra della scala: 1 mm. La regione cerchiato di rosso all'interno l'inserto mostra due cuori di traslucido del mouse dopo aver subito la tecnica di chiarezza e viene inserito il tubo di vetro borosilicato. Questa figura è stata modificata da Yichen Ding et al. 8. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Immagini dei cardiomyocytes Cre-identificato in un topo postnatale del cuore da ogni aereo. Il cuore del topo P1 era imaged con cardiomiociti Cre-etichettati in ogni piano della sezione trasversale: (un) XY, (b), YZ e (c), XZ. Queste immagini trasversali mostrano la presenza di cardiomiociti Cre-identificato nell'atrio e ventricolo del mouse P1. (d) le immagini inoltre sono stati fusi per creare un rendering 3D del cuore. La regione cerchiato di rosso all'interno l'inserto mostra due cuori di traslucido del mouse dopo aver subito la tecnica di chiarezza e viene inserito il tubo di vetro borosilicato. Barra della scala: 1 mm. Questa figura è stata modificata da Yichen Ding et al. 8. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 : Immagini del cuore di topo adulto Mostra i canali ROMK da ogni aereo. Il cuore del topo era imaged 7,5 mesi dell'età per mostrare la presenza e la posizione dei canali ROMK. Il cuore era imaged in ogni piano della sezione trasversale: (un) XY, (b), YZ e (c), XZ. Il valore di scala di grigi indica l'intensità ottica all'interno dell'immagine, con le regioni più leggere corrispondente più intensità luminosa e le regioni più scure corrispondenti a minore intensità di luce. (d) le immagini inoltre sono stati fusi per creare un rendering 3D del cuore, e le immagini originali di grigi erano pseudo-colorate in modo che i canali ROMK appaiono in verdi. La regione cerchiato di rosso all'interno l'inserto mostra un cuore di topo adulto traslucido singolo dopo aver subito la tecnica di chiarezza e viene inserito il tubo di vetro borosilicato. Barra della scala: 1 mm. Questa figura è stata modificata da Yichen Ding et al. 8. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Supplementare figura 1: immagine della camera ABS con il tubo borosilicato all'interno del foglio di luce del sistema di imaging. Per favore clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
Il sistema LSFM e la tecnica qui descritta utilizza un fascio di fronte-retro illuminazione combinato con una compensazione ottica a immagine del cuore del topo nelle fasi post-natali e adulti del suo sviluppo. Un fascio di illuminazione singola tradizionale soffre di photon scattering e assorbimento attraverso tessuti più spessi e più grandi campioni1,3. Le travi-retro forniscono un'illuminazione più uniforme del campione, riducendo al minimo l'effetto di striping e altri reperti che sono spesso visto nelle immagini prodotte da un'illuminazione su un solo lato. Questa tecnica aumenta anche la dimensione del campione che può essere imaged regolando la posizione dei Fasci gaussiani doppi8. La massima separazione di queste travi consente per l'imaging di un campione di tessuto diversi millimetri di dimensioni, come il cuore di topo adulto, mentre una singola illuminazione limitato la dimensione del campione ai cuori più piccoli come i cuori di zebrafish e Drosophila .
Fluorescenza imaging nei tessuti che non sono otticamente trasparenti è più impegnativo poiché la dispersione della luce potrebbe non essere uniforme in tutto il campione di tessuto. Questo limita la profondità a cui un campione può essere imaged e l'efficacia di formazione immagine di fluorescenza. Per questo motivo, è comune l'uso di organismi quali il pesce zebra, che naturalmente hanno tessuto otticamente trasparente5. Tuttavia, per eseguire studi sugli organismi che non hanno naturalmente pelle otticamente trasparente di formazione immagine di fluorescenza, ci sono tecniche di compensazione ottica diverse che sono state sviluppate per rimuovere la colorazione del tessuto. Una tale tecnica di schiarimento ottico è chiarezza, dove il tessuto è collocato in un idrogel, quindi incubato per un lungo periodo di tempo e infine collocato in una soluzione di schiarimento che riduce la quantità di riflessione e rifrazione tra il campione e altri media1 ,9. In questo studio, questa tecnica è stata modificata per ridurre la quantità di reagente usato di compensazione e non richiedono l'aggiunta di pompe per vuoto o azoto gas8.
Sebbene questa tecnica fornisce una risoluzione dell'immagine migliorata per campioni opachi più spessi, ci sono limitazioni a questa strategia che potrebbe essere migliorata negli studi futuri. Ulteriori studi sono stati condotti con fasci di Bessel e un'eccitazione non lineare del due-fotone per fornire una migliore risoluzione a formazione immagine sufficiente profondità15,16. Questi metodi sono stati utilizzati attualmente per studiare modelli cardiaci più piccoli ma potrebbero essere adattati per studiare i processi dinamici all'interno di un embrione di sviluppo. Inoltre, modifiche al metodo di chiarezza per i più grandi campioni di tessuto potrebbero migliorare l'efficacia dell'imaging fluorescente riducendo il numero di fluorofori che possono potenzialmente essere persi durante lo schiarimento processo8. Recentemente, abbiamo integrato questo sistema LSFM con realtà virtuale per delucidare inerente allo sviluppo meccanica cardiaca17.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Gli autori vorrebbero esprimere gratitudine a Thao Nguyen e Atsushi Nakano da UCLA per fornire il campione di topi all'immagine. Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni NIH HL118650 (per Tzung K. Hsiai), HL083015 (per Tzung K. Hsiai), HD069305 (per N. C. Chi e Tzung K. Hsiai.), HL111437 (per Tzung K. Hsiai e N. C. Chi), HL129727 (per Tzung K. Hsiai) e University of Texas System Star finanziamenti (per match Lee).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CW Laser | Laserglow Technologies | LMM-GBV1-PF3-00300-05 | Excitation of fluorophores |
| Neutral density filter | Thorlabs | NDC-50C-4M | Controls amount of light entering system |
| Achromatic beam expander | Thorlabs | GBE05-A | Expands the beam of light |
| Mechanical slit | Thorlabs | VA100C | Controls width of beam |
| Beam splitter | Thorlabs | BS013 | Forms dual-illumination beam |
| Stereo microscope with 1X objective lense | Olympus | MVX10 | Used for observation of sample |
| ORCA-Flash4.0 LT sCMOS camera | Hamamatsu Photonics | C11440-42U | Used to capture Images |
| Acrylonitrile butadiene styrene (ABS) | Stratasys | uPrint | Material used to 3-D print a sample holder |
| Fluorescent polystyrene beads | Spherotech Inc | PP-05-10 | Used for imaging system calibration |
| Borosilicate glass tubing | Corning | Pyrex 7740 | Tubing for sample embedding |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | Fill for sample chamber |
| Phosphate-buffered saline | Fisher Scientific | BP39920 | Rinse solution for mouse hearts |
| Paraformaldehyde | Electron microscopy sciences | RT-15700 | First incubation solution |
| Acrylamide | Wako Chemicals | AAL-107 | Mixed with 2,2'-Azobis dihydrochloride for second incubation solution for mouse hearts |
| 2,2'-Azobis dihydrochloride | Wako Chemicals | VA-044 | Mixed with Acrylamide for second incubation solution for mouse hearts |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | 71725 | Mixed with Boric acid for third incubtion solution for mouse hearts |
| Boric acid | Fischer Scientific | A74-1 | Mixed with Sodium dodecyl sulfate for third incubtion solution for mouse hearts |
| Sigma D2158 | Sigma Aldrich | D2158 | Mixed with PB, Tween-20, and Sodium azide as a refractive index matching solution |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | 11332465001 | Mixed with Sigma D2158, PB, and Sodium azide as a refractive index matching solution |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002 | Mixed with Sigma D2158, PB, and Tween-20 as a refractive index matching solution |
| Adeno-associated virus vector 9 with a cardiac-specific Troponin T promoter tagged with GFP | Vector Biolabs | VB2045 | Expresses GFP when bound to ROMK |
| DC Servo Motor Actuator | Thorlabs | Z825B | Used for movement of sample in axial direction within light sheet |
| K-Cube Brushed DC Servo Motor Controller | Thorlabs | KDC101 | Connects to motor actuator and controls movement of the actuator |
| Amira | FEI Software | N/A | Visualization software for producing 2-D and 3-D images |
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