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Bioengineering

Murine दिल के अध्ययन के लिए लाइट-शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी

Published: September 15, 2018 doi: 10.3791/57769
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 2, 4, 3, 1,2, 1
1Department of Bioengineering, University of California Los Angeles, 2Department of Bioengineering, University of Texas at Arlington, 3School of Optical and Electronic Information, Huazhong University of Science and Technology, 4Department of Biomedical Engineering, OSHU

Summary

इस अध्ययन के एक दोहरे तरफा रोशनी प्रकाश चादर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (LSFM) ऑप्टिकल समाशोधन के साथ संयुक्त तकनीक murine दिल का अध्ययन करने के लिए उपयोग करता है ।

Abstract

प्रकाश चादर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी व्यापक रूप से माइक्रोमीटर मिलीमीटर पैमाने से एक उच्च अक्षीय संकल्प के साथ तेजी से छवि अधिग्रहण के लिए इस्तेमाल किया गया है । पारंपरिक प्रकाश चादर तकनीक नमूना ऊतक पर orthogonally निर्देशित एक एकल रोशनी बीम का उपयोग शामिल है । बड़े नमूनों है कि एक एकल दीप्ति बीम का उपयोग कर उत्पादित कर रहे हैं की छवियाँ धारियों या कलाकृतियों होते हैं और ऊतक के द्वारा प्रकाश के बिखरने और अवशोषण के कारण एक कम संकल्प से पीड़ित हैं. इस अध्ययन के एक दोहरे तरफा रोशनी बीम और murine दिल के लिए एक सरल स्पष्टता ऑप्टिकल समाशोधन तकनीक का उपयोग करता है । इन तकनीकों गहरी इमेजिंग के लिए दिल से लिपिड को दूर करने और इमेजिंग, 10 x 10 x 10 मिमी3से अधिक की एक बड़ी क्षेत्र का उत्पादन द्वारा अनुमति देते हैं । नतीजतन, यह रणनीति हमें वेंट्रिकुलर आयामों को बढ़ाता है, कार्डियक वंश को ट्रैक करती है, और हृदय के विशिष्ट प्रोटीन और आयन-चैनलों के स्थानिक वितरण के बाद प्रसव के लिए पर्याप्त कंट्रास्ट के साथ वयस्क माउस दिलों को स्थानीयकृत और संकल्प.

Introduction

लाइट-शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी एक तकनीक पहले १९०३ में विकसित किया गया था और आज जीन अभिव्यक्ति का अध्ययन करने के लिए एक विधि के रूप में प्रयोग किया जाता है और यह भी 3 डी या 4 ऊतक नमूने1,2,3के डी मॉडल का उत्पादन करने के लिए. इस इमेजिंग विधि प्रकाश की एक पतली चादर का उपयोग करता है एक नमूना के एक विमान इतना रोशन है कि केवल कि विमान डिटेक्टर द्वारा कब्जा कर लिया है । नमूना तो प्रत्येक परत पर कब्जा करने के लिए अक्षीय-दिशा में ले जाया जा सकता है, एक समय में एक अनुभाग, और प्राप्त4के बाद प्रसंस्करण के बाद एक 3-डी मॉडल रेंडर. हालांकि, अवशोषण और फोटॉनों के बिखरने के कारण, LSFM नमूने है कि या तो कुछ माइक्रोन मोटी या ऑप्टिकली पारदर्शी1रहे है करने के लिए सीमित किया गया है ।

LSFM की सीमाएं जीवों के व्यापक अध्ययन है कि ऊतकों कि ऑप्टिकली पारदर्शी हैं, जैसे zebrafish के लिए नेतृत्व किया है । हृदय विकास और भेदभाव को शामिल अध्ययन अक्सर zebrafish पर आयोजित के बाद से वहां मनुष्यों और zebrafish के बीच जीन संरक्षित कर रहे है5,6। हालांकि इन अध्ययनों से cardiomyopathies6,7से संबंधित कार्डिएक अनुसंधान में प्रगति के लिए नेतृत्व किया है, वहां अभी भी एक ऐसे स्तनधारियों के रूप में उच्च स्तर के जीवों पर इसी तरह के अनुसंधान का संचालन करने की आवश्यकता है ।

स्तनधारी कार्डियक ऊतक मोटाई और ऊतक की अस्पष्टता के कारण एक चुनौती प्रस्तुत करता है, लाल रक्त कोशिकाओं में हीमोग्लोबिन के कारण अवशोषण, और पट्टी कि पारंपरिक LSFM तरीकों के तहत नमूना के एक तरफा रोशनी के कारण होता है1 , 8. इन सीमाओं के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए, हम दोहरे तरफा रोशनी और एक अपवर्तन सूचकांक मिलान समाधान (रिम्स) के साथ संयुक्त स्पष्टता तकनीक9 का एक सरलीकृत संस्करण का उपयोग करने का प्रस्ताव. इसलिए, यह सिस्टम एक नमूना है कि 10 x 10 x 10 मिमी3 से अधिक है के लिए इमेजिंग के लिए अनुमति देता है, जबकि अक्षीय और पार्श्व विमानों में एक अच्छी गुणवत्ता संकल्प बनाए रखने8।

इस प्रणाली को पहले फ्लोरोसेंट मोती कांच टयूबिंग के भीतर विभिंन विंयास में व्यवस्था का उपयोग करने पर तुले थे । फिर, प्रणाली के बाद प्रसव और वयस्क murine दिल छवि के लिए इस्तेमाल किया गया था । सबसे पहले, प्रसव के बाद माउस दिल 7 दिन (P7) में imaged था वेंट्रिकुलर गुहा, वेंट्रिकुलर दीवार की मोटाई, वाल्व संरचनाओं, और trabeculation की उपस्थिति प्रकट करते हैं । दूसरे, एक अध्ययन के लिए कोशिकाओं है कि cardiomyocytes में 1 दिन (P1) Cre के साथ-cardiomyocytes और पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (YFP) लेबल के बाद प्रसव का उपयोग करके अंतर होगा की पहचान करने के लिए आयोजित किया गया था । अंत में, ७.५ महीने में वयस्क चूहों जीन थेरेपी8के बाद गुर्दे की बाहरी दिमाग़ी पोटेशियम (ROMK) चैनलों की उपस्थिति का पालन करने के लिए imaged थे ।

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Protocol

सभी जानवरों के उपयोग को शामिल प्रक्रियाओं कैलिफोर्निया, लॉस एंजिल्स, कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय में संस्थागत समीक्षा समितियों (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया है ।

1. इमेजिंग सिस्टम सेटअप

नोट: चित्रा 1 और चित्रा 2देखें.

  1. ४०५ एनएम, ४७३ एनएम, और ५३२ एनएम: 3 तरंग दैर्ध्य के साथ एक सतत तरंग (CW) लेजर पुनः प्राप्त करें । प्लेस 2 (M1 और M2) १५० mm दर्पण के अलावा और उंहें ४५ डिग्री पर बीम को अपने दर्पण विमानों के साथ संरेखित करें ।
    नोट: यह कदम लेजर अनुप्रेषित करने के लिए किया जाता है दूर दोहरी पक्षीय प्रदीप्ति सेटअप से । परिणामस्वरूप किरण आरंभिक किरण के रूप में उसी दिशा में जाएगी ।
  2. एक 25 मिमी व्यास आईरिस डायाफ्राम/pinhole (पीएच) के माध्यम से बीम दर्रा, एक ५० मिमी व्यास तटस्थ घनत्व फिल्टर (NDF) 0 के एक ऑप्टिकल घनत्व रेंज-४.०, एक बीम विस्तारक (BE), एक 30 मिमी भट्ठा (ओं) की चौड़ाई के साथ ~ 0-6 मिमी, और एक दर्पण (एम 3) , सभी तैनात १५० मिमी एक दूसरे से । बीम करने के लिए ४५ डिग्री पर अपनी दर्पण विमान के साथ दर्पण प्लेस ।
  3. एक 50:50 किरण अलगानेवाला के माध्यम से बीम पास एम 3 से १५० mm रखा । बीम अलगानेवाला से एक दर्पण (M6) १५० mm प्लेस और यह इतना संरेखित करें कि इसकी दर्पण विमान ४५ डिग्री पर है कि आगे की दिशा में उत्सर्जित है बीम के लिए है । दोहरे रोशनी प्रकाश चादर के एक पक्ष के रूप में परिलक्षित बीम का प्रयोग करें ।
  4. बीम अलगानेवाला से एक दर्पण (M4) १५० mm प्लेस और यह संरेखित करें ताकि अपने दर्पण विमान ४५ डिग्री पर है बीम कि बीम अलगानेवाला से एक ९० डिग्री कोण पर उत्सर्जित किया गया था । एक दूसरे दर्पण प्लेस (M5) M4 से १५० mm और यह संरेखित करें ताकि अपने दर्पण विमान ४५ डिग्री पर है M6 से परिलक्षित बीम । M5 से उत्सर्जित बीम का प्रयोग दोहरा-दीप्ति लाइट शीट के दूसरी ओर फार्म करने के लिए करें ।
  5. एक सममित फैशन में दोहरी तरफा रोशनी प्रणाली की स्थापना की ( चित्रा 1देखें) । प्लेस एक बेलनाकार लेंस (CL1) [व्यास (डी) = 1 में; फोकल लंबाई (f) = ५० मिमी] १५० मिमी एक तरफ M5 से उत्सर्जित बीम के साथ लाइन में और एक अन्य समान बेलनाकार लेंस (CL2) १५० मिमी दोहरी-दीप्ति बेरुत के दूसरी तरफ M6 से उत्सर्जित बीम के साथ लाइन में पी प्लेस 2 (M7 और M8) दर्पण ५० mm की दूरी पर बेलनाकार लेंस के साथ लाइन में ९० डिग्री पर बीम प्रतिबिंबित ।
  6. लेंस की एक जोड़ी से एक achromatic नक़ल फार्म । पहले लेंस प्लेस, L1 (डी = 1 में; f = १०० मिमी), M7 से १०० मिमी, और दूसरा लेंस, L2 (डी = 1 में; f = ६० मिमी), L1 से १६० मिमी. दोहरा-समान लेंस (L3, L4) के साथ रोशनी के दूसरे पक्ष पर इस दोहराने M8 से एक ही दूरी रखा ।
  7. जगह दर्पण, M9 और M10, लेंस से ६० mm L2 और L4, क्रमशः, और बीम के साथ लाइन में । संदीप्ति उद्देश्यों, OL1 और OL2 (डी = 2 में; f = १५० mm), १५० mm से M9 और M10 और बीम के साथ लाइन में रखें । उद्देश्यों से उत्सर्जित बीम इमेजिंग नमूनों के लिए प्रकाश शीट रूपों ।
  8. नमूना धारक को acrylonitrile ब्यूटाडाइन styrene (ABS) से प्रिंट करने के लिए 3-डी प्रिंटर का उपयोग करें । कवर कांच का एक टुकड़ा [अपवर्तन सूचकांक (आरआई) = १.४७४५] कक्ष के प्रत्येक पक्ष पर, सीधा करने के लिए दीप्ति बीम, अपवर्तन सूचकांक बेमेल कम करने के लिए । समान रूप से उद्देश्य लेंस से उत्सर्जित मुस्कराते हुए के बीच में चैंबर जगह है ।
  9. एक 1x आवर्धन उद्देश्य और एक वैज्ञानिक पूरक धातु ऑक्साइड अर्धचालक (sCMOS) के साथ एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप स्थापित करने के लिए रोशनी विमान सीधा ( चित्र 2देखें) ।

2. इमेजिंग प्रणाली अंशांकन

  1. फ्लोरोसेंट polystyrene मोतियों कि व्यास में ०.५३ माइक्रोन हैं निकालते हैं ।
  2. 1% कम पिघल संकेतन agarose 1:150000 के साथ एक अपवर्तन सूचकांक मिलान समाधान (रिम्स) में मनका समाधान कमजोर द्वारा फ्लोरोसेंट मनका नमूना तैयार करें । 12 मिमी के एक भीतरी व्यास और 30 मिमी की लंबाई के लिए 18 मिमी के एक बाहरी व्यास के साथ borosilicate ग्लास टयूबिंग का एक टुकड़ा काट ।
    नोट: borosilicate ग्लास टयूबिंग अपवर्तन सूचकांक (१.४७) से मेल खाने के लिए प्रयोग किया जाता है ।
  3. 1% agarose के साथ पतला मनका नमूना मिश्रण और borosilicate टयूबिंग में मनका/agarose समाधान पिपेट । agarose को कमरे के तापमान (23 डिग्री सेल्सियस) पर जमना की अनुमति दें ।
  4. ABS चैंबर (१.७ कदम से) एक ९९.५% ग्लिसरॉल समाधान के साथ भरें । borosilicate ग्लास कक्ष के अंदर मोती युक्त टयूबिंग प्लेस । इमेजिंग सिस्टम में एबीएस चैंबर लगाएं ताकि यह डुअल प्रदीप्ति सिस्टम के द्वारा बनाई गई गाऊसी बीम के केंद्र में हो ।
  5. borosilicate ग्लास टयूबिंग के लिए एक 3 डी मोटर अनुवाद चरण संलग्न करने के लिए आंदोलन और ABS चैंबर के भीतर नमूने के उंमुखीकरण को नियंत्रित ( पूरक चित्रा 1देखें) ।
  6. दूसरे (एफपीएस) प्रति 30 तख्ते की दर से sCMOS कैमरे का उपयोग कर छवियों का अधिग्रहण । मोटर नियंत्रक का उपयोग करना, पार्श्व दिशा में नमूना 1 मिमी चाल और sCMOS कैमरे का उपयोग कर प्रत्येक 1 मिमी वृद्धि पर छवियों को प्राप्त. जारी रखें जब तक पूरा नमूना imaged किया गया है ।
  7. एक दृश्य सॉफ्टवेयर का उपयोग कर अधिग्रहीत छवियों ढेर ( सामग्री की तालिकादेखें). इन मनका छवियों का उपयोग कर प्रणाली के बिंदु प्रसार समारोह (पीएसएफ) उपाय । बाद में चरणों में छवि संसाधन के दौरान deconvolution के लिए इस पीएसएफ का उपयोग करें ।

3. नमूना तैयारी

  1. एक जंगली प्रकार P1 माउस से काटना दिल और एक डबल heterozygous sarcolipin-Cre knockin माउस से Rosa26-YFP जीन (SlnCre/ R26YFP reporter/+) at P7.
    नोट: इच्छामृत्यु pentobarbital और रॉबिंस एट अल द्वारा वर्णित तकनीक का उपयोग किया गया था । 10. विच्छेदन राष्ट्रीय हृदय, फेफड़े, और रक्त संस्थान (NHLBI)10,11द्वारा वर्णित तकनीक के अनुसार किया गया था ।
  2. केविन सुंग एट अल द्वारा वर्णित के रूप में murine दिलों की एक रासायनिक समाशोधन प्रदर्शन । 12.
    नोट: निंनलिखित कदम एक धुएं डाकू में किया जाना चाहिए के बाद से रसायनों का इस्तेमाल किया जा रहा विषाक्त कर रहे हैं ।
    1. 10 मिनट के लिए 1x फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) 3x में दिल कुल्ला । धोने के बाद, एक 4% paraformaldehyde समाधान में दिल जगह और 4 डिग्री सेल्सियस पर इन नमूनों रात भर में मशीन ।
    2. नमूनों को 4% acrylamide समाधान में रखें जिसमें ०.५% w/v 2, 2 '-Azobis dihydrochloride है । नमूनों की अनुमति दें 4 डिग्री सेल्सियस रात भर में गर्मी । रातोंरात मशीन के बाद, नमूनों को हटा दें और उन्हें ३७ ° c पर 2-3 h के लिए मशीन ।
    3. पंजाबियों के साथ नमूनों कुल्ला और फिर उंहें 8% w/v सोडियम dodecyl सल्फेट और १.२५% डब्ल्यू के समाधान में जगह/ वे स्पष्ट कर रहे हैं जब तक ३७ डिग्री सेल्सियस पर नमूनों की मशीन. इस नमूने की मोटाई के आधार पर कई घंटे लग सकते हैं । समाशोधन के बाद, नमूनों को हटाने और उन्हें 1x फास्फेट में जगह-1 दिन के लिए खारा बफर.
    4. (पंजाब) ०.०२ मीटर फॉस्फेट बफर (पीबी), ०.१% के बीच-20, और ०.०१% सोडियम azide के 30 मिलीलीटर में ( सामग्री की तालिकादेखें) के ४० g के साथ एक अपवर्तन सूचकांक मिलान समाधान तैयार करें । सोडियम हीड्राकसीड के साथ ७.५ के एक पीएच के लिए समाधान लाओ ।
  3. १.४६-१.४८ और 1% agarose के अपवर्तन सूचकांक के साथ रिम्स में खाली नमूना रखें । borosilicate ग्लास टयूबिंग में नमूना डालें और कमरे के तापमान (23 डिग्री सेल्सियस) पर agarose को जमना की अनुमति दें ।
  4. 3-डी मुद्रित ABS चैंबर ( पूरक चित्रा 1देखें) के भीतर आंदोलन और नमूने के उन्मुखीकरण को नियंत्रित करने के लिए borosilicate ग्लास टयूबिंग के लिए एक 3 घ मोटर अनुवाद चरण संलग्न करें ।

4. वयस्क हार्ट इमेजिंग

  1. ८.७ x 1012 प्रकार के वायरस adeno-जुड़े वायरस वेक्टर 9 (AAV9) एक कार्डियक-विशिष्ट ट्रोपोनिन टी प्रमोटर (cTnT) और हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) एक १००-μL मात्रा में एक 2 महीने के जंगली प्रकार की पूंछ नस में शामिल (C57BL/
    नोट: AAV9 युआन एट अल द्वारा वर्णित तकनीक के अनुसार विकसित किया गया था । 13. इस कारण GFP को गुर्दे के बाहरी दिमाग़ी पोटेशियम चैनल (ROMK) के उत्पादन AAV9-cTnT-ROMK-GFP ( सामग्री की तालिकादेखें) से बाँधना पड़ता है.
  2. काटना NHLBI11द्वारा वर्णित तकनीक के अनुसार उंर के ७.५ महीने में वयस्क माउस दिल । ३.१-३.३ चरणों का उपयोग कर नमूने तैयार करें ।
  3. मोटर नियंत्रक मोटर गति को जोड़ने के लिए । 3-डी मुद्रित ABS चैंबर के भीतर आंदोलन और नमूने के उन्मुखीकरण को नियंत्रित करने के लिए borosilicate ग्लास टयूबिंग के लिए प्रेरक संलग्न ।
  4. नमूना स्थिति इतना है कि यह गाऊसी दोहरी रोशनी प्रणाली के द्वारा बनाई गई बीम के केंद्र में है । १०० एफपीएस की दर से sCMOS कैमरा का उपयोग कर छवियों का अधिग्रहण ।
  5. मोटर नियंत्रक का उपयोग, अक्षीय दिशा में नमूना 1 मिमी चाल और sCMOS कैमरा के साथ प्रत्येक 1 मिमी वेतन वृद्धि पर छवियों को प्राप्त । जारी रखें जब तक पूरा नमूना imaged किया गया है ।
    नोट: प्रणाली एक कस्टम विकसित साधन नियंत्रण सॉफ्टवेयर के द्वारा नियंत्रित किया जाता है.
  6. एक दृश्य सॉफ्टवेयर का उपयोग कर अधिग्रहीत छवियों ढेर ( सामग्री की तालिकादेखें). इन छवि स्टैक और विज़ुअलाइज़ेशन सॉफ़्टवेयर14का उपयोग करके 3-डी छवियों का विकास करना. Deconvolve पीएसएफ चरण २.६ से प्राप्त किए गए छवि स्टैक के साथ । एक पिक्सेल थ्रेशोल्ड तीव्रता मान सेट करने के लिए दिल की आकृति का पालन करें और इस ग्रे पैमाने पर तीव्रता के आधार पर छवियों के लिए छद्म रंग जोड़ें ।

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Representative Results

तकनीक यहां वर्णित एक दोहरे तरफा रोशनी एक गहरी इमेजिंग गहराई और पर्याप्त इमेजिंग संकल्प (चित्रा 1) के साथ एक बड़ा इमेजिंग मात्रा को प्राप्त करने के लिए माउस दिल ऊतक नमूने के एक ऑप्टिकल समाशोधन के साथ संयुक्त बीम का इस्तेमाल किया । प्रणाली जांचना करने के लिए, फ्लोरोसेंट मोतियों कांच टयूबिंग के अंदर और इमेजिंग प्रणाली के भीतर रखा गया था । मोतियों तो छवि और x-y विमान, y-z विमान में visualized थे, और x-z विमान में,8प्रणाली के लिए बिंदु प्रसार समारोह (पीएसएफ) प्राप्त करने के लिए । सिस्टम अंशांकन dपार्श्व ≈ २.८ µm की पार्श्व दिशा में एक संकल्प का उत्पादन किया और dXZ ≈ १७.४ µm और डीYZ ≈ १७.९ µm के अक्षीय दिशाओं में एक संकल्प जब embedding माध्यम8के रूप में ग्लिसरॉल का उपयोग कर ।

फ्लोरोसेंट मोतियों के बाद अंशांकन के लिए इस्तेमाल किया गया, इमेजिंग प्रणाली छवि माउस दिल के लिए इस्तेमाल किया गया था 1 दिन और 7 दिनों में प्रसव के बाद (2 चित्रा)8। वेंट्रिकुलर गुहा आयाम, हृदय वाल्व, और वेंट्रिकुलर trabeculation माउस दिल की इन छवियों में स्पष्ट कर रहे हैं । दिल के भीतर एक cardiomyocyte भेदभाव का अध्ययन करने के लिए, Cre के साथ heterozygous knockin चूहों-लेबल cardiomyocytes प्रसव के बाद किया गया । Cre की छवियों-लेबल cardiomyocytes दिल8 (चित्रा 3) के एक 3-डी प्रतिपादन के साथ साथ प्रत्येक विमान दिशा में हैं ।

प्रसव पश्चात चूहों के अध्ययन के अलावा, इमेजिंग प्रणाली का भी वयस्क माउस हृदय से अध्ययन किया जाता था. शुरू में, जीन थेरेपी के लिए GFP परिचय-माउस दिल में ROMK चैनल टैग किया गया । ७.५ महीने में, माउस हार्ट छवि थी और इन ROMK चैनल वेंट्रिकुलर दीवार (चित्रा 4) में visualized थे । प्रक्रिया के भीतर यह कदम छवि बड़े नमूनों के लिए इस प्रणाली की क्षमता को दिखाता है और संरचना भेद दिल के भीतर ऊतकवैज्ञानिक धुंधला के साथ नहीं देखा । चित्रा 4 दिल8के एक 3-डी प्रतिपादन के साथ साथ प्रत्येक विमान दिशा से ROMK चैनलों से पता चलता है.

Figure 1
चित्रा 1 : प्रकाश शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी प्रणाली के योजनाबद्ध आरेख । यह एक 3-प्रकाश शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी प्रणाली के घटकों और सिस्टम में इस्तेमाल घटकों के फोकल लंबाई के बीच दूरी सहित, के आयामी प्रतिपादन है । यह आंकड़ा Yichen डिंग एट अल से संशोधित किया गया है । 8. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : पता लगाने के साथ प्रकाश शीट माइक्रोस्कोपी प्रणाली के शीर्ष दृश्य । इस दोहरी पक्षीय दीप्ति माइक्रोस्कोपी प्रणाली के शीर्ष दृश्य है, जहां अंधेरे नीले क्षेत्र प्रणाली के भीतर प्रत्येक स्थान पर बीम का प्रतिनिधित्व करता है । शामिल achromatic दोहरी और रोशनी उद्देश्य से मिलकर क्षेत्रों में से एक से पता चलता है कि एक 2 आयामी बढ़े अनुभाग है । यह बढ़े हुए खंड भी प्रकाश चादर गठन के सिद्धांत से पता चलता है और कैसे मुस्कराते हुए एक दोहरे पक्षीय रोशनी फार्म के लिए संयुक्त कर रहे हैं । यह आंकड़ा Yichen डिंग एट अल से संशोधित किया गया है । 8. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : प्रसव उपरांत murine हृदय की 3-डी छवियां । (क) इस पैनल 7 दिन में प्रसव के बाद माउस दिल की एक छवि को दर्शाता है निलय गुहा दिखा । (ख) इस पैनल के बाद 7 दिन में प्रसव माउस दिल की एक छवि निलय दीवार की मोटाई दिखा दिखाता है । (ग) यह पैनल 1 दिन में प्रसव के बाद माउस दिल की छवि को दिखाता है वाल्व संरचनाओं के स्थान दिखा । (घ) इस छवि के बाद प्रसव से एक बढ़े हुए अनुभाग से पता चलता है 1 दिन दिल के atrium में स्थित pectinate मांसपेशी दिखा । (ङ) इस छवि के बाद के भीतर निलय में trabeculation से पता चलता है प्रसव के बाद माउस दिल 1 दिन । स्केल बार: 1 मिमी । इनसेट के भीतर लाल वृत्त क्षेत्र स्पष्टता तकनीक के दौर से गुजर रहा है और borosilicate ग्लास टयूबिंग में डाला जा रहा है के बाद दो पारदर्शी माउस दिल से पता चलता है । यह आंकड़ा Yichen डिंग एट अल से संशोधित किया गया है । 8. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : Cre की छवियां-प्रत्येक विमान से एक के बाद प्रसव माउस दिल में cardiomyocytes लेबल । P1 माउस दिल प्रत्येक पार अनुभागीय विमान में Cre-लेबल cardiomyocytes के साथ imaged था: (क) XY, (ख) YZ, और (ग) XZ । इन पार अनुभागीय छवियां Cre की उपस्थिति-atrium में cardiomyocytes लेबल और P1 माउस के निलय दिखा । (घ) हृदय के ३-डी प्रतिपादन बनाने के लिए बिंब भी विलय किए गए. इनसेट के भीतर लाल वृत्त क्षेत्र स्पष्टता तकनीक के दौर से गुजर रहा है और borosilicate ग्लास टयूबिंग में डाला जा रहा है के बाद दो पारदर्शी माउस दिल से पता चलता है । स्केल बार: 1 मिमी । यह आंकड़ा Yichen डिंग एट अल से संशोधित किया गया है । 8. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5 : वयस्क माउस प्रत्येक विमान से ROMK चैनल दिखा दिल की छवियां । माउस दिल ROMK चैनलों की उपस्थिति और स्थान को दिखाने के लिए उम्र के ७.५ महीने में छवि थी । दिल प्रत्येक पार अनुभागीय विमान में छवि थी: (क) XY, (ख) YZ, और (ग) XZ । ग्रे स्केल मूल्य की छवि के भीतर ऑप्टिकल तीव्रता इंगित करता है, हल्का और अधिक प्रकाश तीव्रता और गहरा कम प्रकाश तीव्रता के लिए इसी क्षेत्रों के साथ इसी क्षेत्रों के साथ । (घ) छवियों को भी दिल का एक 3-डी प्रतिपादन बनाने के लिए विलय किया गया था, और मूल ग्रेस्केल छवियों छद्म रंग थे ताकि ROMK चैनल हरी दिखाई देते हैं । इनसेट के भीतर लाल वृत्त क्षेत्र स्पष्टता तकनीक के दौर से गुजर रहा है और borosilicate ग्लास टयूबिंग में डाला जा रहा है के बाद एक एकल पारदर्शी वयस्क माउस दिल से पता चलता है । स्केल बार: 1 मिमी । यह आंकड़ा Yichen डिंग एट अल से संशोधित किया गया है । 8. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

पूरक चित्रा 1: इमेजिंग प्रणाली के प्रकाश शीट के भीतर borosilicate टयूबिंग के साथ ABS चैंबर की छवि । कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

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Discussion

LSFM प्रणाली और तकनीक यहां वर्णित एक दोहरे तरफा रोशनी छवि को ऑप्टिकल समाशोधन के साथ संयुक्त बीम के बाद प्रसव और उसके विकास के वयस्क चरणों का इस्तेमाल करता है । एक पारंपरिक एकल रोशनी बीम मोटा और बड़ा ऊतक नमूने1,3के माध्यम से फोटॉन कैटरिंग और अवशोषण से ग्रस्त है । दोहरे पक्षीय मुस्कराते हुए नमूने का एक और भी रोशनी प्रदान करते हैं, जिससे पट्टी और अंय कलाकृतियों है कि अक्सर एक तरफा रोशनी से उत्पादित छवियों में देखा जाता है के प्रभाव को कम करने । इस तकनीक के नमूने के आकार को भी बढ़ाता है कि दोहरी गाऊसी मुस्कराते हुए8की स्थिति का समायोजन करके imaged किया जा सकता है । इन मुस्कराते हुए की अधिकतम जुदाई इमेजिंग के लिए अनुमति देता है एक ऊतक इस तरह के वयस्क माउस दिल के रूप में, आकार में कई मिलीमीटर नमूना, जबकि एक एकल रोशनी ऐसे zebrafish और Drosophila के दिलों के रूप में छोटे दिलों के लिए नमूने के आकार सीमित .

ऊतकों में प्रतिदीप्ति इमेजिंग कि ऑप्टिकली पारदर्शी नहीं है और अधिक चुनौतीपूर्ण है के बाद से प्रकाश बिखरने ऊतक नमूने भर में वर्दी नहीं हो सकता है । यह गहराई जो करने के लिए एक नमूना छवि और प्रतिदीप्ति इमेजिंग की प्रभावशीलता हो सकता है सीमित करता है । इस कारण से, यह zebrafish के रूप में जीवों का उपयोग करने के लिए आम है, जो स्वाभाविक रूप से ऑप्टिकली पारदर्शी ऊतक5है । हालांकि, जीवों पर प्रतिदीप्ति इमेजिंग अध्ययन करने के लिए कि स्वाभाविक रूप से ऑप्टिकली पारदर्शी त्वचा नहीं है, वहां अलग ऑप्टिकल समाशोधन तकनीक है कि ऊतक की रंगाई हटाने के लिए विकसित किया गया है रहे हैं । एक ऐसी ऑप्टिकल समाशोधन तकनीक स्पष्टता है, जहां ऊतक एक hydrogel में रखा गया है, तो समय की एक लंबी अवधि के लिए मशीन, और अंत में एक समाशोधन समाधान है कि प्रतिबिंब और नमूना और अंय मीडिया के बीच अपवर्तन की मात्रा कम कर देता है में रखा1 ,9. इस अध्ययन में, इस तकनीक का इस्तेमाल किया समाशोधन की राशि को कम करने के लिए संशोधित और वैक्यूम पंप या नाइट्रोजन गैस8के अलावा की आवश्यकता नहीं किया गया था ।

हालांकि इस तकनीक मोटा अपारदर्शी नमूनों के लिए एक बेहतर छवि संकल्प प्रदान करता है, वहां इस रणनीति है कि भविष्य के अध्ययन में सुधार किया जा सकता करने के लिए सीमाएं हैं । बिसेल बीम और एक दो-फोटॉन रेखीय उत्तेजना के साथ पर्याप्त इमेजिंग गहराई15,16पर एक बेहतर समाधान प्रदान करने के लिए अतिरिक्त अध्ययन आयोजित किया गया है । इन तरीकों वर्तमान में छोटे कार्डियक मॉडल का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, लेकिन एक विकासशील भ्रूण के भीतर गतिशील प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । इसके अलावा, बड़े ऊतक नमूनों के लिए स्पष्टता विधि में परिवर्तन fluorophores की संख्या को कम करने से फ्लोरोसेंट इमेजिंग की प्रभावशीलता में सुधार हो सकता है कि संभावित समाशोधन प्रक्रिया8के दौरान खो सकते हैं । हाल ही में, हम आभासी वास्तविकता के साथ इस LSFM प्रणाली स्पष्ट विकास कार्डियक यांत्रिकी17के लिए एकीकृत है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखकों छवि के लिए चूहों के नमूने प्रदान करने के लिए UCLA से थाओ गुयेन और अतसुशी Nakano के लिए आभार व्यक्त करना चाहते हैं । इस अध्ययन को पलाश NIH HL118650 (Tzung K. Hsiai) द्वारा समर्थित किया गया था, HL083015 (ते Tzung k. Hsiai), HD069305 (to N. C. ची आणि Tzung k. Hsiai.), HL111437 (to Tzung k. Hsiai और n. c. ची), HL129727 (to Tzung k. Hsiai), और टेक्सास प्रणाली के सितारे वित्त पोषण (को Juhyun ली).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CW Laser Laserglow Technologies LMM-GBV1-PF3-00300-05 Excitation of fluorophores
Neutral density filter Thorlabs NDC-50C-4M Controls amount of light entering system
Achromatic beam expander Thorlabs GBE05-A Expands the beam of light
Mechanical slit Thorlabs VA100C Controls width of beam
Beam splitter Thorlabs BS013 Forms dual-illumination beam
Stereo microscope with 1X objective lense Olympus MVX10 Used for observation of sample
ORCA-Flash4.0 LT sCMOS camera Hamamatsu Photonics C11440-42U Used to capture Images
Acrylonitrile butadiene styrene (ABS) Stratasys uPrint Material used to 3-D print a sample holder
Fluorescent polystyrene beads Spherotech Inc PP-05-10 Used for imaging system calibration
Borosilicate glass tubing Corning Pyrex 7740 Tubing for sample embedding
Glycerol Fisher Scientific BP229-4 Fill for sample chamber
Phosphate-buffered saline Fisher Scientific BP39920 Rinse solution for mouse hearts
Paraformaldehyde Electron microscopy sciences RT-15700 First incubation solution
Acrylamide Wako Chemicals AAL-107 Mixed with 2,2'-Azobis dihydrochloride for second incubation solution for mouse hearts
2,2'-Azobis dihydrochloride Wako Chemicals VA-044 Mixed with Acrylamide for second incubation solution for mouse hearts
Sodium dodecyl sulfate  Sigma Aldrich 71725 Mixed with Boric acid for third incubtion solution for mouse hearts
Boric acid Fischer Scientific A74-1 Mixed with Sodium dodecyl sulfate for third incubtion solution for mouse hearts
Sigma D2158 Sigma Aldrich D2158 Mixed with PB, Tween-20, and Sodium azide as a refractive index matching solution
Tween-20 Sigma Aldrich 11332465001 Mixed with Sigma D2158, PB, and Sodium azide as a refractive index matching solution
Sodium azide Sigma Aldrich S2002 Mixed with Sigma D2158, PB, and Tween-20 as a refractive index matching solution
Adeno-associated virus vector 9 with a cardiac-specific Troponin T promoter tagged with GFP Vector Biolabs VB2045 Expresses GFP when bound to ROMK
DC Servo Motor Actuator Thorlabs Z825B Used for movement of sample in axial direction within light sheet
K-Cube Brushed DC Servo Motor Controller Thorlabs KDC101 Connects to motor actuator and controls movement of the actuator
Amira FEI Software N/A Visualization software for producing 2-D and 3-D images

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References

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इंजीनियरिंग अंक १३९ प्रकाश शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी LSFM murine ऑप्टिकल समाशोधन cardiomyocytes निलय दिल दोहरी रोशनी स्पष्टता
Murine दिल के अध्ययन के लिए लाइट-शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी
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Ding, Y., Bailey, Z., Messerschmidt, V., Nie, J., Bryant, R., Rugonyi, S., Fei, P., Lee, J., Hsiai, T. K. Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart. J. Vis. Exp. (139), e57769, doi:10.3791/57769 (2018).

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