Summary
이 연구 murine 마음 공부 광 청소와 함께 양면 조명 빛 시트 형광 현미경 검사 법 (LSFM) 기법을 사용 합니다.
Abstract
빛 시트 형광 현미경 검사 법은 축 고해상도 마이크로미터에서 밀리미터 규모와 빠른 이미지 수집을 위해 널리 사용 되었습니다. 전통적인 빛 시트 기술 샘플 조직에서 기가 감독 단일 조명 광속의 사용을 포함 한다. 단일 조명 광선을 사용 하 여 생성 되는 큰 샘플의 이미지 줄무늬 또는 아티팩트를 포함 하 고는 조직에 의해 빛의 흡수와 산란 감소 해상도에서 고통. 이 연구 양면 조명 광속 및 단순화 된 선명도 광학 기술 murine 마음에 대 한 삭제를 사용 합니다. 이러한 기술은 마음에서 지질을 제거 하 여 깊은 이미징에 대 한 허용 하 고 영상, 10 x 10 x 10 m m3보다 더 큰 분야를 생산. 결과적으로,이 전략을 수 있습니다 계량 실의 크기, 심장 계보를 추적 하 고 심장 특정 단백질 및 충분 한 대비와 성인 쥐 심 혼에는 출생에서 이온 채널의 공간 분포를 지역화 하 고 해상도입니다.
Introduction
빛-시트 형광 현미경 검사 법 1903 년에 처음 개발 하는 기술 이었고, 유전자 발현을 연구 하 고 조직 샘플1,2,3또는 4 차원 3 차원 모델을 생성 하는 방법으로 오늘 사용 된다. 이 이미징 방법만 그 비행기는 검출기에 의해 캡처 있도록 샘플의 단일 면을 밝히는 빛의 얇은 시트를 사용 합니다. 샘플 다음 이동할 수 있습니다 축 방향으로 각각 캡처 레이어, 한 번에 하나의 섹션 및 인수 이미지4의 후 처리 후 3 차원 모델을 렌더링. 그러나, 흡수 및 산란 광자의 LSFM 되었습니다 샘플 중 몇 미크론 두께 또는 광학 투명1을 제한.
LSFM의 한계는 제 브라 같은 광학 투명 한 조직 있는 생물의 광범위 한 연구를이 끌고있다. 심장 개발 및 차별화는 종종 연구 zebrafish에 있기 때문에 인간과 zebrafish5,6보존된 유전자. 이러한 연구는 cardiomyopathies6,7에 관련 된 심장 연구에 발전을 이끈, 비록 여전히 포유류와 같은 수준의 유기 체에 유사한 연구 수행 필요가 하다.
포유류 심장 조직의 두께와 불투명도 조직, 전통적인 LSFM 방법1 아래 샘플의 단면 조명으로 인해 발생 하는 스트라이핑에 붉은 혈액 세포, 헤모글로빈 때문 흡수의 과제를 안으십시오 , 8. 이러한 제한에 대 한 보상, 우리 양면 조명과 선명도 기법9 일치 하는 솔루션 (RIMS) 굴절 인덱스와 결합의 단순화 된 버전을 사용 하 여 제안. 따라서,이 시스템은8비행기 축과 측면에서 좋은 품질의 해상도 유지 하면서 10 m m3 x 10 x 10 보다 크면 시료의 이미징에 대 한 수 있습니다.
이 시스템은 먼저 유리 튜브 내에서 다른 구성에서 배열 하는 형광 구슬을 사용 하 여 보정 됩니다. 그런 다음, 시스템 출생 및 성인 murine 마음을 이미지를 사용 되었다. 첫째, 출생 후 마우스 마음은 7 일 (P7) 심 실 구멍, 심 실 벽, 밸브 구조 및 trabeculation의 존재의 두께 공개에 몇 군데. 둘째, 연구 cardiomyocytes Cre 표시와 노란 형광 성 단백질 (YFP) 1 일 (P1)에서 출생 마우스 마음을 사용 하 여 cardiomyocytes에 분화 것 셀을 식별 하기 위해 실시 됐다. 마지막으로, 7.5 개월에서 성인 쥐 유전자 치료8후 신장 외부 골 수 칼륨의 존재 (ROMK) 채널을 관찰 하는 몇 군데 했다.
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Protocol
동물의 사용을 포함 하는 모든 절차는 캘리포니아 대학, 로스 앤젤레스, 캘리포니아에서 기관 검토 위원회 (IACUC)에 의해 승인 되었습니다.
1. 영상 시스템 설치
주: 그림 1 과 그림 2를 참조 하십시오.
- 3 파장 연속파 (CW) 레이저 검색: 405 nm, 473 nm와 532 nm. 장소 2 거울 (M1 및 M2) 150 mm 떨어져와 45 ° 광속에 그들의 거울 비행기와 그들을 맞춥니다.
참고:이 단계는 양면 조명 설치에서 레이저를 수행 됩니다. 결과 빔 초기 광속과 같은 방향에 있을 것입니다. - 0-광학 밀도 범위는 25 m m 직경 홍 채 격 막/핀 홀 (PH), 직경 50 mm 중립 밀도 필터 (NDF)을 통해 서 광선 통과 4.0, 빔 익 스팬 더 (BE)의 폭 30 mm 슬릿 (S) ~ 0-6 m m, 그리고 거울 (M3) 모두 서로에서 150 m m 위치. 45 ° 광속의 거울 평면 거울을 놓습니다.
- 150 m m m 3에서 배치 하는 50: 50 빔 스플리터를 통해 광속을 전달 합니다. 거울 (M6) 빔 스플리터에서 150mm 놓고 그것의 대칭 면은 앞으로 방향에서 방출 되는 광속을 45 °에 정렬 합니다. 반사 광선을 사용 하 여 듀얼-조명 빛 시트의 1 개의 측을 형성.
- 거울 (M4) 빔 스플리터에서 150mm 놓고 그것의 대칭 면은 45 ° 빔 스플리터에서 90 ° 각도로 방출 되는 광속에 정렬 합니다. 두 번째 미러 (M5) 150 m m m 4에서 배치 하 고 그것의 대칭 면은 M6에서 반영 광속에 45 °에 맞춥니다. M5에서 방출 하는 광속을 사용 하 여 듀얼-조명 빛 시트의 두 번째 측면을 형성.
- 대칭 방식에서 양면 조명 시스템 설정 ( 그림 1참조). 한 원통형 렌즈 (CL1) 장소 [지름 (d) = 1; 초점 거리 (f) = 50mm] 한쪽과 다른 동일한 원통형 렌즈 (CL2) 듀얼-조명 setu의 반대편에 M6에서 방출 하는 빔 라인 150 m m M5에서 방출 하는 빔 라인 150 m m p. 90 ° 광선을 반영 하기 위해 50 m m의 거리에서 2 거울 (M7 및 M8) 각 원통형 렌즈 라인을 놓습니다.
- 렌즈의 쌍에서 무색 남자 용 상의 형성 합니다. 첫 번째 렌즈, L1 배치 (d = 1; f = 100 m m), M7, 그리고 두 번째 렌즈, L2에서 100 m m (d = 1; f = 60 m m), l 1에서 160 m m. 이 동일한 렌즈 (L3, L4) 듀얼-조명의 반대편에 m 8에서 동일한 거리 배치를 반복 합니다.
- 장소 거울, M9, M10, 60mm 렌즈 l 2와 L4, 각각, 그리고 빔 라인. 조명 목표, OL1 및 OL2 배치 (d = 2; f = 150 m m), M9, M10 및 빔 라인 150 m m. 목표에서 방출 하는 광선 빛 시트 샘플 이미지를 형성 한다.
- 3 차원 프린터를 사용 하 여 샘플 홀더 아크릴로 니트 릴 부 타 디 엔 스 티 렌 (ABS)에서 인쇄. 커버 유리의 조각을 포함 [굴절률 (RI) = 1.4745] 챔버, 수직 굴절률 일치를 최소화 하기 위해 조명 광속의 각 측에. 균등 하 게 대물 렌즈에서 방출 된 광선 사이 챔버 장소.
- 설치는 스테레오 현미경 확대 객관적이 고 과학적인 보완 금속 산화물 반도체 (sCMOS) 카메라 조명에 수직인 X 1 비행기 ( 그림 2참조).
2. 이미징 시스템 교정
- 형광 성 폴리스 티 렌 구슬 0.53 μ m 직경에 있는 검색 합니다.
- 1:150, 000에 1% 낮은 용융 포인팅 agarose와 굴절률 매칭 솔루션 (테두리)에 구슬 솔루션을 diluting 하 여 형광 구슬 샘플을 준비 합니다. 30 m m의 길이에 내경 12 m m와 18 mm의 외부 직경 붕 규 산 유리 배관의 조각을 잘라.
참고: 붕 규 산 유리 배관 굴절률 (1.47)에 맞게 사용 됩니다. - 1 %agarose 희석된 비드 샘플 혼합 하 고 구슬/agarose 솔루션 붕 튜브에 플라스틱. 실 온 (23 ° C)에서 공고히 agarose를 허용 합니다.
- 99.5% 글리세롤 솔루션 (1.7 단계)에서 ABS 챔버를 채우십시오. 챔버 내부에 구슬 포함 하는 붕 규 산 유리 튜브를 놓습니다. 이중 조명 시스템에 의해 만들어진 가우스 광속의 센터에 되도록 이미징 시스템에 ABS 챔버를 놓습니다.
- 3 차원 동력된 변환 단계 운동 및 ABS 챔버 내 샘플의 방향을 제어 하 붕 규 산 유리 튜브를 연결 ( 추가 그림 1참조).
- (Fps) 초당 30 프레임의 속도로 sCMOS 카메라를 사용 하 여 이미지를 취득 합니다. 모터 컨트롤러를 사용 하 여 샘플 1 m m 옆 방향으로 이동 하 고 sCMOS 카메라를 사용 하 여 각 1 m m 증가에서 이미지. 전체 샘플 이미지가 포함 된 때까지 계속 합니다.
- 시각화 소프트웨어를 사용 하 여 인수 이미지 스택 ( 재료의 표참조). 이 구슬 이미지를 사용 하 여 시스템의 확산 기능 (PSF)를 측정 합니다. 이 PSF deconvolution 이미지 나중 단계에서 처리 하는 동안 사용 합니다.
3. 샘플 준비
- 마음 야생 유형 P1 마우스와 Rosa26 YFP 유전자 이중 heterozygous sarcolipin-Cre knockin 마우스 해 부 (SlnCre / +; R26YFP 기자 / +) P7에.
참고: 안락사 pentobarbital로 빈스 외. 에 의해 설명 하는 기법을 사용 하 여 수행 10. 해 부 국가 심 혼, 폐, 혈액 연구소 (NHLBI)10,11에서 설명 하는 기술에 따라 수행 되었다. - 케빈 성 외 에 설명 된 대로 murine 마음의 청소 화학 수행 12.
참고: 다음 단계 이후 사용 되 고 화학 물질 독성 증기 두건에서 수행 되어야 합니다.- 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 3 x 1에 마음 씻어 10 분 x. Rinsing 후, 4 %paraformaldehyde 솔루션에 마음을 놓고 하룻밤 4 ° C에서이 샘플을 품 어.
- 0.5 %w / v 2, 2'-Azobis dihydrochloride의를 포함 하는 4% 아크릴 솔루션에는 샘플을 놓습니다. 샘플 하룻밤 4 ° C에서 알을 품을 수 있습니다. 밤새 부 화 후 샘플을 제거 하 고 2-3 h 37 ° C에서 그들을 품 어.
- PBS와 샘플을 헹 구 고 8 %w / v 나트륨 라우릴 황산 염 및 1.25 %w / v 붕 소의 산 성 솔루션에 그들을 배치. 그들은 분명 때까지 37 ° C에서 샘플을 품 어. 이 샘플의 두께 따라 몇 시간이 걸릴 수 있습니다. 개간, 후 샘플을 제거 하 고 1 일 인산 염 버퍼 염 분 x 1에 배치 합니다.
- 일치 하는 비 밀도 그라데이션 중간의 40 g 솔루션 굴절률 준비 ( 재료의 표참조) 0.02 M 인산 버퍼 (PB), 0.1% 트윈-20, 그리고 0.01% 나트륨 아 지 드의 30 ml에서. 수산화 나트륨으로 7.5의 pH에 솔루션을가지고.
- 1.46 1.48 및 1 %agarose 굴절률을 가진 바퀴에 지운된 샘플을 놓습니다. 붕 규 산 유리 배관으로 샘플을 삽입 하 고 실 온 (23 ° C)에서 공고히 agarose를 허용.
- 움직임을 제어 하는 붕 규 산 유리 튜브를 3 차원 동력된 변환 단계를 연결 하 고 3 차원 내에서 샘플의 방향 인쇄 ABS 챔버 ( 보충 그림 1참조).
4. 성인 심장 이미징
- 2 개월 야생 타입 (C57BL/6) 마우스의 꼬리 정 맥으로 심장 관련 분 T 발기인 (cTnT) 및 녹색 형광 단백질 (GFP)를 포함 하는 1012 의 바이러스 유형 adeno 관련 바이러스 벡터 9 (AAV9) x 8.7 100 μ 볼륨에 주사.
참고:는 AAV9 위안 외 에 의해 설명 하는 기술에 따라 개발 되었다 13. 그러면 신장 외부 골 수 칼륨 채널 (ROMK) AAV9-cTnT-ROMK-GFP 생산에 바인딩할 GFP ( 재료의 표참조). - NHLBI11에서 설명 하는 기술에 따라 7.5 개월에서 성인 쥐 심 혼을 해 부. 단계 3.1-3.3을 사용 하 여 샘플을 준비 합니다.
- 모터 액추에이터를 모터 컨트롤러를 연결 합니다. 움직임을 제어 하는 붕 규 산 유리 튜브에 액추에이터를 연결 하 고 3 차원 내에서 샘플의 방향 인쇄 ABS 챔버.
- 그것은 이중 조명 시스템에 의해 만들어진 가우스 광속의 센터에 되도록 샘플을 놓습니다. 100 fps의 속도로 sCMOS 카메라를 사용 하 여 이미지를 취득 합니다.
- 모터 컨트롤러를 사용 하 여 샘플 1 m m 축 방향에서 이동한 sCMOS 카메라와 함께 각 1 m m 증가에서 이미지를 수집 합니다. 전체 샘플 이미지가 포함 된 때까지 계속 합니다.
참고: 시스템 사용자 정의 개발 장비 제어 소프트웨어에 의해 제어 됩니다. - 시각화 소프트웨어를 사용 하 여 인수 이미지 스택 ( 재료의 표참조). 이러한 이미지 스택 및 시각화 소프트웨어14를 사용 하 여 3 차원 이미지를 개발 합니다. 획득된 한 이미지 스택에 단계 2.6에서에서 PSF deconvolve 심장의 윤곽을 관찰 하 고 의사 색이 회색조 강도에 따라 이미지를 추가 하려면 픽셀 임계값 강도 값을 설정 합니다.
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Representative Results
설명 하는 기술은 여기 깊은 이미징 깊이 및 충분 한 이미지 해상도 (그림 1) 더 큰 이미징 볼륨 마우스 심장 조직 샘플의 광학 청소와 함께 양면 조명 광선을 사용. 시스템 보정, 형광 구슬 유리 튜브 내부와 이미징 시스템 내에서 배치 했다. 구슬에 몇 군데 했다 그리고 x y 평면, y z 평면, 시각 그리고 포인트를 x-z 평면에서 시스템8기능 (PSF)를 확산. 시스템 보정 d측면 ≈의 측면 방향에서 해결 생산 2.8 µ m 및 dXZ ≈ 17.4 µ m 및 dYZ ≈ 17.9 µ m 포함 중간8로 글리세롤을 사용 하는 경우의 축 방향에서 해결.
형광 구슬 캘리브레이션에 사용 되었다, 후 1 일, 7 일 출생 (그림 2)8에 마우스 마음에 이미지를 이미징 시스템 사용 되었다. 심 실 구멍 크기, 심장 밸브 및 심 실 trabeculation 마우스 심장의 이러한 이미지에 분명 하다. 공부 하 고 심 혼 내의 cardiomyocyte 차별화, Cre 표시 cardiomyocytes와 heterozygous 쫓 고 쥐 출생 후 몇 군데 있었다. Cre 표시 cardiomyocytes의 이미지는 마음8 (그림 3)의 3 차원 렌더링 함께 각 평면 방향에 있습니다.
출생 후 마우스, 공부 외에 이미징 시스템 성인 마우스 마음 공부에 사용 되었다. 처음에, 유전자 치료는 마우스 마음에 GFP 태그 ROMK 채널을 소개 하 사용 되었다. 7.5 개월, 마우스 심 혼은 몇 군데 하 고 심 실 벽 (그림 4)에이 ROMK 채널 시각화 했다. 이 단계는 프로시저 내에서 큰 샘플 이미지 및 심 혼 내의 조직학 얼룩과 볼 수 없습니다 구조를 구별이 시스템의 기능을 보여 줍니다. 그림 4 는 ROMK 채널8심장 3 차원 렌더링 함께 각 평면 방향에서.
그림 1 : 빛 시트 형광 현미경 시스템의 회로도. 이것은 구성 요소와 시스템에서 사용 되는 부품의 초점 길이 사이 거리를 포함 하 여 빛 시트 형광 현미경 시스템의 3 차원 렌더링 이다. 이 그림에서 Yichen 딩 외. 수정 되었습니다. 8. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 검출 빛 시트 현미경 시스템의 탑. 이것은 양면 조명 현미경 시스템의 상위 뷰 어두운된 파란색 영역 시스템 내의 각 위치에서 광속을 나타냅니다. 포함 된 색 남자 및 조명 목적으로 구성 된 지역 중 하나를 보여 주는 2 차원 확대 섹션이입니다. 이 확대 섹션은 또한 가벼운 시트 형성의 원리와 형태는 양면 조명에 광선은 결합 하는 방법을 보여 줍니다. 이 그림에서 Yichen 딩 외. 수정 되었습니다. 8. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 출생 murine 심장의 3 차원 이미지. (한)이이 패널 출생 마우스 심장의 이미지에서 보여준다 심 실 구멍을 보여주는 7 일. (b)이이 패널 7 심 실 벽의 두께 보여주는 일에 출생 마우스 심장의 이미지를 보여줍니다. (c)이이 패널 위치 밸브 구조를 보여주는 1 일에 출생 마우스 심장의 이미지를 보여줍니다. (d)이이 이미지 보여주는 pectinate 근육 심장의 안마당에 있는 1 일에 출생 마우스 마음에서 확대 섹션을 보여 줍니다. (e)이이 이미지를 보여줍니다 trabeculation 출생 마우스 심장 내 우 심 실에서 1 일에. 눈금 막대: 1 m m. 삽입 된 내에 있는 빨간 동그라미 영역 선명도 기법 및 붕 규 산 유리 튜브에 삽입 되 고 후 두 반투명 마우스 마음을 보여줍니다. 이 그림에서 Yichen 딩 외. 수정 되었습니다. 8. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 출생 마우스에서 Cre 표시 cardiomyocytes의 이미지 각 평면에서 심장. P1 마우스 마음은 각 단면 평면에 Cre 표시 cardiomyocytes와 몇 군데: (한) XY, (b) YZ, 및 (c) XZ. 이러한 단면 이미지 안마당에 P1 마우스의 심 실 Cre 표시 cardiomyocytes의 존재를 표시합니다. (d) 이미지도 심장의 3 차원 렌더링을 병합 했다. 삽입 된 내에 있는 빨간 동그라미 영역 선명도 기법 및 붕 규 산 유리 튜브에 삽입 되 고 후 두 반투명 마우스 마음을 보여줍니다. 눈금 막대: 1 m m. 이 그림에서 Yichen 딩 외. 수정 되었습니다. 8. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : 각 평면에서 ROMK 채널을 보여주는 성인 마우스 심장의 이미지. 마우스 마음은 존재를 보여 7.5 개월과 ROMK 채널의 위치에 몇 군데 있습니다. 마음은 각 단면 평면에 몇 군데: (한) XY, (b) YZ, 및 (c) XZ. 그레이 스케일 값 밝은 영역을 더 많은 빛의 강도 및 적은 빛의 강도에 해당 하는 어두운 영역에 해당 하는 이미지 내의 광 강도 나타냅니다. (d) 이미지도는 심장의 3 차원 렌더링을 병합 했다 그리고 원래 grayscaled 이미지 ROMK 채널 표시 녹색 의사 색 했다. 삽입 된 내에 있는 빨간 동그라미 영역 선명도 기술과 붕 규 산 유리 튜브에 삽입 되 고 받은 후 단일 반투명 성인 마우스 마음을 보여줍니다. 눈금 막대: 1 m m. 이 그림에서 Yichen 딩 외. 수정 되었습니다. 8. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 그림 1: 이미징 시스템의 빛 시트 내에서 붕 규 산 튜브와 ABS 챔버의 이미지. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
LSFM 시스템 및 여기에 설명 된 기술 개발의 출생 및 성인 단계에서 이미지 마우스 마음에 광 청소와 함께 양면 조명 광속을 이용 한다. 전통적인 단일 조명 광선은 광자 산란 및 흡수 두꺼운 및 더 큰 조직 샘플1,3에서 겪고 있다. 양면 보 샘플, 스트라이핑 및 종종 한 면 조명에 의해 생산 하는 이미지에 표시 되는 다른 아티팩트 효과 최소화의 더 심지어 조명을 제공 합니다. 이 기술은 또한 듀얼 가우스 빔8의 위치를 조정 하 여 몇 군데 수 샘플의 크기를 증가 시킵니다. 단일 조명 제 브라와 초파리 의 마음 같은 작은 마음에 샘플의 크기를 제한 하는 반면이 광선의 최대 분리 조직 샘플 성인 마우스 마음 처럼 크기가 몇 밀리미터 이미징에 대 한 허용 .
형광 이미징 광학 투명 하지 않은 조직에 더 도전 산란 조직 샘플에 걸쳐 균일 하지 않을 수 있습니다 때문입니다. 이 제한에 깊이 샘플 몇 군데 수와 형광 이미징의 효과. 이 자연스럽 게 광학 투명 한 조직5zebrafish, 같은 유기 체를 사용 하 여 일반적입니다. 그러나, 형광 이미징 자연스럽 게 없는 광학 투명 한 피부는 유기 체에 대 한 연구를 수행 하는 직물의 착 색을 제거 하도록 개발 되었습니다 다른 광학 개간 기술 있다. 같은 1 개의 광학 개간 기술은 이다 선명도, 어디 조직은 하이드로 겔에 다음 시간의 긴 기간 동안 incubated 고 마지막으로에 반사와 샘플 및 기타 미디어1 사이 굴절의 양을 감소 하는 개간 솔루션 ,9. 이 연구에서이 기술을 지우고 사용 시 약의 양을 줄이기 위해 수정 된 고 진공 펌프 또는 질소 가스8의 추가 요구 하지 않았다.
이 기술은 두꺼운 불투명 샘플에 대 한 향상 된 이미지 해상도 제공, 하지만 미래 연구에서 향상 시킬 수 있는이 전략에 한계가 있다. 베셀 광속 및 2 광자 비선형 여기 충분 한 이미징 깊이15,16더 나은 해상도 제공 하기 위해 추가적인 연구가 실시 되었습니다. 이 방법은 현재 작은 심장 모델을 연구 하는 데 사용 되었습니다 하지만 발전 태아 내의 동적 과정 공부에 적응 수 있습니다. 또한, 선명도 메서드 변경 큰 조직 샘플 잠재적으로 수 fluorophores의 수를 줄여 형광 이미징의 효율성을 향상 시킬 수에 대 한 손실 될 비운 동안 처리8. 최근에, 우리는 가상 현실 개발 심장 역학17명료 하이 LSFM 시스템을 통합 했습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자는 마우스 샘플 이미지를 제공 하기 위한 UCLA에서 타오 구 엔과 아츠 시 나카노에 게 감사를 표현 하 고 싶습니다. 이 연구는 NIH (Tzung K. Hsiai)에 HL118650, HL083015 (Tzung K. Hsiai)를, (N. C. 치 및 Tzung K. Hsiai)에 HD069305, HL111437 (Tzung K. Hsiai N. C. 치)를, (에 Tzung K. Hsiai), HL129727 및 텍사스 대학교 시스템 교부 받음 (지주에 자금에 의해 지원 되었다 리)입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CW Laser | Laserglow Technologies | LMM-GBV1-PF3-00300-05 | Excitation of fluorophores |
| Neutral density filter | Thorlabs | NDC-50C-4M | Controls amount of light entering system |
| Achromatic beam expander | Thorlabs | GBE05-A | Expands the beam of light |
| Mechanical slit | Thorlabs | VA100C | Controls width of beam |
| Beam splitter | Thorlabs | BS013 | Forms dual-illumination beam |
| Stereo microscope with 1X objective lense | Olympus | MVX10 | Used for observation of sample |
| ORCA-Flash4.0 LT sCMOS camera | Hamamatsu Photonics | C11440-42U | Used to capture Images |
| Acrylonitrile butadiene styrene (ABS) | Stratasys | uPrint | Material used to 3-D print a sample holder |
| Fluorescent polystyrene beads | Spherotech Inc | PP-05-10 | Used for imaging system calibration |
| Borosilicate glass tubing | Corning | Pyrex 7740 | Tubing for sample embedding |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | Fill for sample chamber |
| Phosphate-buffered saline | Fisher Scientific | BP39920 | Rinse solution for mouse hearts |
| Paraformaldehyde | Electron microscopy sciences | RT-15700 | First incubation solution |
| Acrylamide | Wako Chemicals | AAL-107 | Mixed with 2,2'-Azobis dihydrochloride for second incubation solution for mouse hearts |
| 2,2'-Azobis dihydrochloride | Wako Chemicals | VA-044 | Mixed with Acrylamide for second incubation solution for mouse hearts |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | 71725 | Mixed with Boric acid for third incubtion solution for mouse hearts |
| Boric acid | Fischer Scientific | A74-1 | Mixed with Sodium dodecyl sulfate for third incubtion solution for mouse hearts |
| Sigma D2158 | Sigma Aldrich | D2158 | Mixed with PB, Tween-20, and Sodium azide as a refractive index matching solution |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | 11332465001 | Mixed with Sigma D2158, PB, and Sodium azide as a refractive index matching solution |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002 | Mixed with Sigma D2158, PB, and Tween-20 as a refractive index matching solution |
| Adeno-associated virus vector 9 with a cardiac-specific Troponin T promoter tagged with GFP | Vector Biolabs | VB2045 | Expresses GFP when bound to ROMK |
| DC Servo Motor Actuator | Thorlabs | Z825B | Used for movement of sample in axial direction within light sheet |
| K-Cube Brushed DC Servo Motor Controller | Thorlabs | KDC101 | Connects to motor actuator and controls movement of the actuator |
| Amira | FEI Software | N/A | Visualization software for producing 2-D and 3-D images |
References
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