Summary
Denne undersøgelse anvender en dobbelt-sidet belysning lys-ark Fluorescens mikroskopi (LSFM) teknik kombineret med optisk clearing for at studere murine hjertet.
Abstract
Lys-ark Fluorescens mikroskopi har været meget anvendt til hurtig billede erhvervelse med en aksial højopløselige fra mikrometer til millimeter skala. Traditionelle lys-ark teknikker indebærer brug af en enkelt belysning stråle rettet vinkelret på vævsprøve. Billeder af store prøver, der er fremstillet ved hjælp af en enkelt belysning stråle indeholder striber eller artefakter og lider af en reduceret opløsning på grund af spredning og absorption af lys ved væv. Denne undersøgelse anvender en dobbelt-sidet belysning stråle og en forenklet klarhed optisk clearing teknik for murine hjertet. Disse teknikker giver mulighed for dybere billeddannelse ved at fjerne lipider fra hjertet og producere et stort felt af imaging, større end 10 x 10 x 10 mm3. Som et resultat, denne strategi gør det muligt at kvantificere de ventrikulære dimensioner, spore hjerte slægt og lokalisere den geografiske fordeling af hjertestop-specifikke proteiner og ion-kanaler fra den postnatale til voksen mus hjerter med tilstrækkelig kontrast og opløsning.
Introduction
Lys-ark Fluorescens mikroskopi var en teknik, først udviklet i 1903 og bruges i dag som en metode til at studere genekspression og også til at fremstille 3D- eller 4-D modeller af væv prøver1,2,3. Denne billedbehandling metode bruger en tynd plade af lys til at belyse et enkelt fly af en prøve, således at kun at flyet er fanget af detektoren. Prøven kan derefter flyttes i aksial retning at fange hvert lag, en sektion ad gangen, og gøre en 3D-model efter efterbehandling af erhvervede billeder4. Men på grund af absorption og spredning af fotoner, LSFM har været begrænset til prøver, der er enten et par mikron tyk eller optisk gennemsigtig1.
Begrænsninger i LSFM har ført til omfattende undersøgelser af organismer, der har væv, der er optisk gennemsigtige, såsom zebrafisk. Undersøgelser, hvor hjertets udvikling og differentiering er ofte udført på zebrafisk siden der er bevarede gener mellem mennesker og zebrafisk5,6. Selv om disse undersøgelser har ført til fremskridt i hjertets forskning relateret til cardiomyopatier6,7, er der stadig behov for at gennemføre lignende forskning på højere niveau organismer såsom pattedyr.
Hjerte pattedyrvæv præsenterer en udfordring på grund af tykkelsen og opacitet af væv, absorption på grund af hæmoglobin i røde blodlegemer, og den opdeling, der opstår på grund af et enkeltsidet belysning af prøven under traditionelle LSFM metoder1 , 8. for at kompensere for disse begrænsninger, vi har foreslået at bruge dobbelt-sidet belysning og en forenklet version af klarhed teknik9 kombineret med et brydningsindeks matchende løsning (fælge). Derfor, dette system giver mulighed for billeddannelse af en stikprøve, der er større end 10 x 10 x 10 mm3 mens opretholde en god kvalitet opløsning i den aksiale og laterale fly8.
Dette system blev først kalibreret ved hjælp af fluorescerende perler arrangeret i forskellige konfigurationer i glas slangen. Derefter, at systemet blev brugt til at billede efter fødslen og voksen murine hjerter. Først, den postnatale mus hjerte blev afbildet på 7 dage (P7) til at afsløre den ventrikulære hulrum, tykkelsen af den ventrikulære væg, ventil strukturer og tilstedeværelsen af trabeculation. For det andet blev en undersøgelse udført for at identificere celler, der vil differentiere i cardiomyocytes ved hjælp af et postnatal mus hjerte på 1 dag (P1) med Cre-mærket cardiomyocytes og gul fluorescerende proteiner (YFP). Endelig blev voksen mus på 7,5 måneder afbildet for at konstatere tilstedeværelsen af renal ydre medullær kalium (ROMK) kanaler efter gen terapi8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle de procedurer, der involverer brug af dyr er blevet godkendt af institutionelle anmeldelse udvalg (IACUC) på University of California, Los Angeles, Californien.
1. imaging System Setup
Bemærk: Se figur 1 og figur 2.
- Hente en kontinuerlig bølge (CW) laser med 3 bølgelængde: 405 nm, 473 nm og 532 nm. Sted 2 spejle (M1 og M2) 150 mm fra hinanden og bringe dem på linje med deres spejl fly på 45° med strålen.
Bemærk: Dette trin er udført for at omdirigere laser fra dobbelt-sidet belysning setup. Den resulterende stråle vil være i den samme retning som den første stråle. - Passere stråle gennem en 25 mm diameter irisblænden/pinhole (PH), 50-mm diameter neutralfiltre (NDF) med en optisk tæthed vifte af 0 - 4.0, en stråle expander (BE), en 30 mm slids (S) med bredden af ~ 0 - 6 mm, og et spejl (M3) , alle placeret 150 mm fra hinanden. Placere spejl med sin mirror plane't ved 45° nærlys.
- Passere stråle gennem en 50/50 stråledeler placeret 150 mm fra M3. Placere et spejl (M6) 150 mm fra beam splitter og justere det, så dets mirror plane't er på 45° med bjælken, der udsendes i fremadgående retning. Brug den reflekterede lysstråle til at danne en side af arket dual-belysning lys.
- Placere et spejl (M4) 150 mm fra beam splitter og justere det, så dets mirror plane't er på 45° med den stråle, der blev udledt i en 90° vinkel fra stråledeler. Placere et andet spejl (M5) 150 mm fra M4 og justere det, så dets mirror plane't er på 45° nærlys reflekteres fra M6. Brug bjælken udsendes fra M5 til at danne den anden side af arket dual-belysning lys.
- Dobbelt-sidet belysning systemet på en symmetrisk måde (Se fig. 1). Placer en cylindrisk linse (CL1) [diameter (d) = 1. brændvidde (f) = 50 mm] 150 mm i overensstemmelse med den stråle, udsendes fra M5 på den ene side og en anden identisk cylindrisk linse (CL2) 150 mm i overensstemmelse med den stråle, udsendes fra M6 på anden siden af dual-belysning setu s. sted 2 spejle (M7 og M8) hver linje med de cylindriske linser i en afstand af 50 mm at afspejle stråle på 90 °.
- Danne en akromatisk doublet fra et par af linser. Placer den første linse, L1 (d = 1 i; f = 100 mm), 100 mm fra M7, og den anden linse, L2 (d = 1 i; f = 60 mm), 160 mm fra L1. Gentag dette på anden siden af dual-belysning med identiske linser (L3, L4) placeres i samme afstand fra M8.
- Sted spejle, M9 og M10, 60 mm fra linser L2 og L4, henholdsvis, og i overensstemmelse med strålen. Placer belysning målsætninger, OL1 og OL2 (d = 2; f = 150 mm), 150 mm fra M9 og M10 og i overensstemmelse med strålen. Strålen udsendes fra mål, der danner arket lys for imaging prøverne.
- Bruge en 3D-printer til at udskrive prøveholderen fra acrylonitril butadien styren (ABS). Integrer et stykke cover glas [brydningsindeks (RI) = 1.4745] på hver side af salen, vinkelret på belysning beam, at minimere brydningsindeks misforholdet. Jævnt sted i salen i mellem bjælkerne udsendes fra målet linser.
- Installer et stereo mikroskop med 1 X forstørrelse mål og en videnskabelig komplementær metal oxide semiconductor (sCMOS) kamera vinkelret på belysningen fly (Se figur 2).
2. imaging System kalibrering
- Hente fluorescerende polystyren perler, der er 0,53 μm i diameter.
- Forberede fluorescerende perle prøven ved at fortynde den perle løsning i et brydningsindeks matchende løsning (fælge) med 1% lav-Smelt peger Agarosen til 1:150, 000. Skær et stykke af borsilikatglas rør med en indvendig diameter på 12 mm og en ydre diameter på 18 mm til en længde på 30 mm.
Bemærk: Borsilikatglas rør bruges til at matche brydningsindeks (1,47). - Fortyndet perle proeven blandes med 1% Agarosen og afpipetteres perle/Agarosen løsning i borosilicate slanger. Tillad Agarosen størkne ved stuetemperatur (23 ° C).
- Fyld ABS kammer (fra trin 1,7) med et 99,5% glycerol løsning. Placer borsilikatglas rør indeholdende perler inde i salen. Placer ABS kammer i imaging systemet, så det er i midten af de Gaussian beam lavet af dobbelt belysning systemet.
- Vedhæfte en 3D-motoriseret translationel fase til borsilikatglas rør til at kontrollere bevægelse og orientering af prøven inden for ABS-afdeling (Se supplerende fig. 1).
- Erhverve billeder ved hjælp af sCMOS kamera med en sats på 30 frames per sekund (fps). Bruger den motor controller, flytte prøve 1 mm i tværgående retning og erhverve billeder på hver 1-mm tilvækst ved hjælp af sCMOS kamera. Fortsætte indtil hele prøven har blevet afbildet.
- Stak de erhvervede billeder ved hjælp af en visualisering software (Se Tabel af materialer). Måle punkt spredt funktion (PSF) af systemet ved hjælp af disse perle billeder. Brug denne PSF til deconvolution under billedbehandling i senere trin.
3. Prøvetilberedning
- Dissekere hjerter fra en vildtype P1 mus og en dobbelt heterozygous sarcolipin-Cre knockin mus med Rosa26-YFP-genet (SlnCre / +; R26YFP reporter / +) på P7.
Bemærk: Eutanasi blev udført ved hjælp af pentobarbital og den teknik beskrevet af Robbins et al. 10. dissektion blev udført ifølge den teknik beskrevet af National Heart, Lung, og Blood Institute (NHLBI)10,11. - Udføre en kemisk clearing af murine hjerter som beskrevet af Kevin Sung et al. 12.
Bemærk: Følgende trin skal udføres i et stinkskab, da at blive anvendte kemikalier er giftige.- Skyl hjerterne i 1 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS) 3 x til 10 min. Efter skylning, placere hjerter i en 4% PARAFORMALDEHYD opløsning og inkuberes disse prøver ved 4 ° C natten over.
- Placer prøverne i en 4% acrylamid oploesning indeholdende 0,5% w/v i 2, 2'-Azobis dihydrochlorid. Tillad prøver at udruge ved 4 ° C natten over. Efter natten inkubation, fjerne prøverne og dem der inkuberes ved 37 ° C i 2-3 h.
- Skyl prøver med PBS og derefter placere dem i en opløsning af 8% w/v sodium dodecyl sulfat og 1,25% w/v borsyre. Inkuber prøver ved 37 ° C, indtil de er klar. Dette kan tage flere timer afhængigt af tykkelsen af prøven. Efter clearing, fjerne prøverne og placere dem i 1 x fosfatbufferet saltopløsning i 1 dag.
- Forberede et brydningsindeks matchende løsning med 40 g af nonionisk tæthed gradient medium (Se Tabel af materialer) i 30 mL 0,02 M fosfat buffer (PB), 0,1% Tween-20 og 0,01% natriumazid. Bringes opløsningen til en pH på 7,5 med natriumhydroxid.
- Placer ryddet prøven i fælge med et brydningsindeks på 1,46-1,48 og 1% agarosegelelektroforese. Indsæt eksemplet i borsilikatglas rør og tillade Agarosen størkne ved stuetemperatur (23 ° C).
- Vedhæfte en 3D-motoriseret translationel fase til borsilikatglas rør til at kontrollere bevægelsen og orientering af prøven inden for 3-D trykt ABS kammer (Se supplerende fig. 1).
4. voksen Heart Imaging
- Injicere 8,7 x 1012 virus af type adeno-associeret virus vektor 9 (AAV9) indeholdende en hjerte-specifikke troponin T promoter (cTnT) og grøn fluorescerende proteiner (NGL) i en 100-μL volumen i halen vene af en 2-måned vildtype (C57BL/6) mus.
Bemærk: AAV9 blev udviklet efter den teknik beskrevet af Yuan et al. 13. Dette medfører normal god landbrugspraksis bindes til den renale ydre medullære kalium kanal (ROMK) producerer AAV9-cTnT-ROMK-NGL (Se Tabel af materialer). - Dissekere voksen mus hjerter på 7,5 måneder efter den teknik beskrevet af NHLBI11. Forberede prøverne ved hjælp af trin 3.1-3.3.
- Tilslut den motor controller til den motor aktuator. Tillægger borsilikatglas rør til at kontrollere bevægelsen aktuatoren og orientering af prøven inden for 3-D trykt ABS kammer.
- Placér prøven, så det er i midten af de Gaussian beam lavet af dobbelt belysning systemet. Erhverve billeder ved hjælp af sCMOS kamera med en hastighed på 100 fps.
- Bruger den motor controller, gå prøve 1 mm i aksial retning og erhverve billeder på hver 1-mm tilvækst med sCMOS kamera. Fortsætte indtil hele prøven har blevet afbildet.
Bemærk: Systemet styres af en brugerdefineret-udviklet instrument-control software. - Stak de erhvervede billeder ved hjælp af en visualisering software (Se Tabel af materialer). Udvikle 3D-billeder ved hjælp af disse billedstakke og visualisering software14. Deconvolve polyesterfibre fra trin 2.6 med den erhvervede billedstak. Angiv en pixelværdi tærskel intensitet at observere konturerne af hjertet og tilføje pseudo farve til billeder baseret på denne grå-skala intensitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den teknik beskrevet brugt her en dobbelt-sidet belysning stråle kombineret med en optisk clearing af vævsprøver mus hjertet for at opnå en dybere imaging dybde og en større imaging volumen med tilstrækkelig imaging opløsning (figur 1). Hvis du vil kalibrere systemet, blev fluorescerende perler placeret inde glas slangen og inden for billedbehandling system. Perlerne blev derefter afbildet og visualiseret i x-y plane, y-z planet, og i x-z planet, for at få punktet spredes funktion (PSF) for systemet8. System kalibrering produceret en resolution i lateral retning af dlateral ≈ 2,8 µm og en resolution i aksial brugsvejledningen dXZ ≈ 17.4 µm og dYZ ≈ 17,9 µm når du bruger glycerol som den indlejring medium8.
Efter de fluorescerende perler blev brugt til kalibrering, blev imaging systemet brugt til at billede mus hjerter på 1 dag og 7 dage efter fødslen (figur 2)8. Ventrikulær hulrum dimensioner, hjerteklapper og ventrikulær trabeculation er tydeligt i disse billeder af musen hjertet. For at studere en cardiomyocyte differentiering inden for hjertet, var heterozygous knockin mus med Cre-mærket cardiomyocytes afbildet efter fødslen. Billederne af den Cre-mærket cardiomyocytes er returflyvninger flyet sammen med en 3D-gengivelse af hjertet8 (figur 3).
Ud over at studere postnatal mus, var imaging systemet også bruges til at undersøge voksen mus hjerte. I første omgang, blev genterapi brugt til at indføre normal god landbrugspraksis-markeret ROMK kanaler ind i musen hjertet. 7,5 måneder, mus hjertet var afbildet og disse ROMK kanaler blev visualiseret i ventrikel væg (figur 4). Dette trin i proceduren illustrerer evne til dette system image store prøver og skelne strukturer ikke set med histologiske farvning i hjertet. Figur 4 viser ROMK kanalerne fra hvert fly retning sammen med en 3D-gengivelse af hjertet8.
Figur 1 : Skematisk diagram af lys-ark Fluorescens mikroskopi system. Dette er en 3-dimensionelle gengivelse af lys ark Fluorescens mikroskopi system, herunder Afstandene mellem komponenterne og brændvidder af de komponenter, der bruges i systemet. Dette tal er blevet ændret fra Yichen Ding et al. 8. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Top view af lys ark mikroskopi system med registrering af. Dette er den øverste visning af dobbelt-sidet belysning mikroskopi system hvor regionen mørkelagt blå repræsenterer stråle på hvert sted i systemet. Inkluderet er en 2-dimensional udvidede afdeling, der viser en af regionerne bestående af akromatisk dubletter og belysning mål. Dette udvidede afsnit viser også princippet om lys ark dannelse og hvordan bjælker er kombineret til form en dobbelt-sidet belysning. Dette tal er blevet ændret fra Yichen Ding et al. 8. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : 3D-billeder af postnatal murine hjertet. (en) dette panel viser et billede af den postnatale mus hjerte på dag 7 viser ventrikel hulrum. (b) dette panel viser et billede af den postnatale mus hjerte på dag 7 viser ventrikel væggens tykkelse. (c) dette panel viser billedet af postnatal mus hjertet på dag 1 viser placeringen af ventil strukturer. (d) dette billede viser en udvidet afsnit fra den postnatale mus hjerte på dag 1 viser pectinate musklen placeret i atrium i hjertet. (e) dette billede viser trabeculation i ventrikel postnatal mus midt på dag 1. Skalalinjen: 1 mm. Rød-cirkel regionen inden for indsatsen viser to gennemskinnelige mus hjerter efter undergår klarhed teknik og bliver indsat i borsilikatglas rør. Dette tal er blevet ændret fra Yichen Ding et al. 8. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Billeder af den Cre-mærket cardiomyocytes i en postnatal mus hjerte fra hver planet. P1 mus hjerte var afbildet med Cre-mærket cardiomyocytes i hver tværsnits fly: (et) XY, (b) YZ, og (c) XZ. Disse tværsnitsdata billeder viser tilstedeværelsen af Cre-mærket cardiomyocytes i atrium og ventrikel P1 musen. (d) billederne blev også slået sammen for at skabe en 3D-gengivelse af hjertet. Rød-cirkel regionen inden for indsatsen viser to gennemskinnelige mus hjerter efter undergår klarhed teknik og bliver indsat i borsilikatglas rør. Skalalinjen: 1 mm. Dette tal er blevet ændret fra Yichen Ding et al. 8. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Billeder af voksen mus hjertet viser ROMK kanalerne fra hver planet. Musen hjertet var afbildet på 7,5 måneder at vise tilstedeværelsen og placeringen af ROMK kanaler. Hjertet var afbildet i hver tværsnits fly: (et) XY, (b) YZ, og (c) XZ. Grå skala værdien angiver den optiske intensitet i billedet, med de lysere områder svarende til flere lysintensitet og de mørkere områder svarende til mindre lysintensitet. (d) billederne blev også slået sammen for at skabe en 3D-gengivelse af hjertet, og de oprindelige grayscaled billeder var pseudo farvede, så ROMK kanalerne vises grøn. Rød-cirkel regionen inden for indsatsen viser en enkelt gennemskinnelige voksen mus hjerte efter at have klarhed teknik og bliver indsat i borsilikatglas rør. Skalalinjen: 1 mm. Dette tal er blevet ændret fra Yichen Ding et al. 8. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 1: billede af ABS kammer med borosilicate slangen i arket lys af den billedbehandlingssystem. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
LSFM system og teknik beskrevet her udnytter en dobbelt-sidet belysning stråle kombineret med en optisk clearing til billede mus hjertet på efter fødslen og voksen stadier af dets udvikling. En traditionel enkelt belysning stråle lider photon spredning og absorption gennem tykkere og større væv prøver1,3. De dobbelt-sidet bjælker giver en mere jævn belysning af den prøve, derved at minimere effekten af striping og andre artefakter, der ofte ses i billeder produceret af en ensidig belysning. Denne teknik også øger størrelsen af stikprøven, og som kan være afbildet ved at justere placeringen af dobbelt Gaussisk bjælker8. Den maksimale adskillelse af disse bjælker tillader imaging en vævsprøve flere millimeter i størrelse, som den voksne mus hjerte, mens en enkelt belysning begrænset størrelsen af prøven til mindre hjerter som hjerter zebrafisk og Drosophila .
Fluorescens imaging i væv, der ikke er optisk gennemsigtige er mere udfordrende da lysspredning ikke kan være ensartet i hele vævsprøve. Dette begrænser dybde til som et eksempel kan være afbildet og effektiviteten af fluorescens billeddannelse. Af denne grund er det almindeligt at bruge organismer såsom zebrafisk, som naturligt har optisk gennemsigtige væv5. Men for at udføre fluorescens billeddiagnostiske undersøgelser på organismer, der ikke naturligt har optisk gennemsigtig hud, der er forskellige optiske clearing teknikker, der er blevet udviklet for at fjerne farvning af vævet. En sådan optisk clearing teknik er klarhed, hvor vævet placeres i en hydrogel, derefter inkuberes i en lang periode og til sidst placeret i en clearing-løsning, der reducerer mængden af refleksion og refraktion mellem prøven og andre medier1 ,9. I denne undersøgelse, denne teknik er blevet ændret for at reducere mængden af clearing reagens, der anvendes og kræver ikke tilføjelse af vakuumpumper eller nitrogen gas8.
Selv om denne teknik giver en forbedret opløsning til tykkere uigennemsigtig prøver, er der begrænsninger for denne strategi, der kunne forbedres i fremtidige undersøgelser. Yderligere undersøgelser er blevet gennemført med Bessel-bjælker og en to-foton nonlinear excitation at give en bedre opløsning på tilstrækkelig imaging dybder15,16. Disse metoder er i øjeblikket brugt til at studere mindre hjerte modeller men kunne tilpasses for at studere de dynamiske processer i et embryo under udvikling. Også, ændringer i metoden klarhed for større vævsprøver kunne forbedre effektiviteten af fluorescerende billeddannelse ved at reducere antallet af fluorophores, der kan potentielt være tabt under clearing behandle8. For nylig har vi integreret dette LSFM system med virtuel virkelighed at belyse udviklingsmæssige hjerte mekanik17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne udtrykke taknemmelighed over for Thao Nguyen og Atsushi Nakano fra UCLA for at give eksemplet mus til billede. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud NIH HL118650 (til Tzung K. Hsiai), HL083015 (til Tzung K. Hsiai), HD069305 (til N. C. Chi og Tzung K. Hsiai.), HL111437 (til Tzung K. Hsiai og N. C. Chi), HL129727 (til Tzung K. Hsiai) og University of Texas System stjerner finansiering (til Juhyun Lee).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CW Laser | Laserglow Technologies | LMM-GBV1-PF3-00300-05 | Excitation of fluorophores |
| Neutral density filter | Thorlabs | NDC-50C-4M | Controls amount of light entering system |
| Achromatic beam expander | Thorlabs | GBE05-A | Expands the beam of light |
| Mechanical slit | Thorlabs | VA100C | Controls width of beam |
| Beam splitter | Thorlabs | BS013 | Forms dual-illumination beam |
| Stereo microscope with 1X objective lense | Olympus | MVX10 | Used for observation of sample |
| ORCA-Flash4.0 LT sCMOS camera | Hamamatsu Photonics | C11440-42U | Used to capture Images |
| Acrylonitrile butadiene styrene (ABS) | Stratasys | uPrint | Material used to 3-D print a sample holder |
| Fluorescent polystyrene beads | Spherotech Inc | PP-05-10 | Used for imaging system calibration |
| Borosilicate glass tubing | Corning | Pyrex 7740 | Tubing for sample embedding |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | Fill for sample chamber |
| Phosphate-buffered saline | Fisher Scientific | BP39920 | Rinse solution for mouse hearts |
| Paraformaldehyde | Electron microscopy sciences | RT-15700 | First incubation solution |
| Acrylamide | Wako Chemicals | AAL-107 | Mixed with 2,2'-Azobis dihydrochloride for second incubation solution for mouse hearts |
| 2,2'-Azobis dihydrochloride | Wako Chemicals | VA-044 | Mixed with Acrylamide for second incubation solution for mouse hearts |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | 71725 | Mixed with Boric acid for third incubtion solution for mouse hearts |
| Boric acid | Fischer Scientific | A74-1 | Mixed with Sodium dodecyl sulfate for third incubtion solution for mouse hearts |
| Sigma D2158 | Sigma Aldrich | D2158 | Mixed with PB, Tween-20, and Sodium azide as a refractive index matching solution |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | 11332465001 | Mixed with Sigma D2158, PB, and Sodium azide as a refractive index matching solution |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002 | Mixed with Sigma D2158, PB, and Tween-20 as a refractive index matching solution |
| Adeno-associated virus vector 9 with a cardiac-specific Troponin T promoter tagged with GFP | Vector Biolabs | VB2045 | Expresses GFP when bound to ROMK |
| DC Servo Motor Actuator | Thorlabs | Z825B | Used for movement of sample in axial direction within light sheet |
| K-Cube Brushed DC Servo Motor Controller | Thorlabs | KDC101 | Connects to motor actuator and controls movement of the actuator |
| Amira | FEI Software | N/A | Visualization software for producing 2-D and 3-D images |
References
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Lee, J., et al. 4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation. Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1679-1690 (2016).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Huisken, J., Stainier, D. Y. Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology. Development. 136 (12), 1963-1975 (2009).
- Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovascular Research. 91 (2), 279-288 (2011).
- High, F. A., Epstein, J. A. The multifaceted role of Notch in cardiac development and disease. Nature Reviews Genetics. 9 (1), 49-61 (2008).
- Sachinidis, A. Cardiac specific differentiation of mouse embryonic stem cells. Cardiovascular Research. 58 (2), 278-291 (2003).
- Ding, Y., et al. Light-sheet fluorescence imaging to localize cardiac lineage and protein distribution. Scientific Reports. 7, 42209 (2017).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Robbins, N., Thompson, A., Mann, A., Blomkalns, A. L. Isolation and excision of murine aorta; a versatile technique in the study of cardiovascular disease. Journal of Visualized Experiments. (93), e52172 (2014).
- National Heart, L., Blood Institute, Standard Operating Procedures (SOP's) for Duchenne Animal Models. , (2015).
- Sung, K., et al. Simplified three-dimensional tissue clearing and incorporation of colorimetric phenotyping. Scientific Reports. 6, 30736 (2016).
- Yuan, Z., Qiao, C., Hu, P., Li, J., Xiao, X. A versatile adeno-associated virus vector producer cell line method for scalable vector production of different serotypes. Human Gene Therapy. 22 (5), 613-624 (2011).
- FEI, Amira User's Guide. , Konrad-Zuse-Zentrum fur Informationstechnik. Berlin. 59-138 (2017).
- Gao, L., et al. Noninvasive imaging of 3D dynamics in thickly fluorescent specimens beyond the diffraction limit. Cell. 151 (6), 1370-1385 (2012).
- Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy. Nature Methods. 8 (9), 757-760 (2011).
- Ding, Y., et al. Integrating light-sheet imaging with virtual reality to recapitulate developmental cardiac mechanics. JCI Insight. 2 (22), (2017).
