Summary
Cette étude utilise une technique de microscopie (LSFM) de fluorescence lumière-feuille recto-verso illumination combinée avec compensation optique pour étudier le coeur murin.
Abstract
La microscopie en fluorescence lumière-feuille a été utilisée pour l’acquisition rapide des images à haute résolution axiale de micromètre à échelle millimétrique. Les techniques traditionnelles de lumière-feuille impliquent l’utilisation d’un faisceau d’éclairage unique réalisé perpendiculairement au tissu de l’échantillon. Images de grands échantillons qui sont produites à l’aide d’un faisceau d’éclairage unique contiennent des rayures ou des artefacts et souffrent d’une résolution réduite en raison de la diffusion et d’absorption de la lumière par le tissu. Cette étude utilise un faisceau d’éclairage recto-verso et une clarté simplifiée optique technique pour coeur murin de compensation. Ces techniques permettent d’imagerie profonde en enlevant des lipides du coeur et produisent un grand domaine de l’imagerie, supérieur à 10 x 10 x 10 mm3. Par conséquent, cette stratégie permet de quantifier les dimensions ventriculaires, suivre la lignée cardiaque et localiser la distribution spatiale des protéines cardiaques spécifiques et des canaux ioniques de la post natal aux coeurs de souris adulte avec un contraste suffisant et résolution.
Introduction
La microscopie en fluorescence lumière-feuille est une technique développée tout d’abord en 1903 et est aujourd'hui utilisée comme une méthode pour étudier l’expression des gènes et aussi de produire des modèles 3D ou 4D, des échantillons de tissus pour1,2,3. Cette méthode d’imagerie utilise une mince feuille de lumière pour illuminer un seul plan d’un échantillon afin que seulement ce plan est capté par le détecteur. L’échantillon peut alors être déplacé dans la direction axiale pour capturer chaque couche, une section à la fois et le rendu d’un modèle 3D après le post-traitement des images acquises4. Toutefois, en raison de l’absorption et la dispersion des photons, LSFM a été limitée à des échantillons qui sont soit une épaisseur de quelques microns ou optiquement transparent1.
Les limitations de LSFM ont conduit à des études approfondies des organismes disposant de tissus qui sont optiquement transparents, tels que le poisson-zèbre. Études portant sur la différenciation et le développement cardiaque sont souvent menées sur le poisson-zèbre, puisqu’il y a des gènes conservés entre l’homme et le poisson-zèbre5,6. Bien que ces études ont conduit à des avancées dans la recherche cardiaque liée aux cardiomyopathies6,7, il y a toujours une nécessité d’effectuer des recherches similaires sur les organismes de niveau supérieures tels que les mammifères.
Chez les mammifères tissu cardiaque présente un défi en raison de l’épaisseur et l’opacité des tissus, l’absorption due à l’hémoglobine dans les globules rouges et les rayures qui se produit en raison de l’éclairage unilatéral de l’échantillon dans le cadre de méthodes traditionnelles LSFM1 , 8. pour compenser ces limitations, nous avons proposé d’utiliser illumination recto-verso et une version simplifiée de la technique de clarté9 combiné avec un indice de réfraction correspondant solution (jantes). Par conséquent, ce système permet l’imagerie d’un échantillon qui est supérieur à 10 x 10 x 10 mm3 , tout en conservant une bonne qualité de résolution axiale et latérale des avions8.
Ce système a été tout d’abord calibré à l’aide de perles fluorescentes disposés dans différentes configurations dans le tube de verre. Puis, le système a été utilisé afin d’imager les cœurs murines postnatals et adultes. Tout d’abord, le coeur de souris après l’accouchement a été imagé à 7 jours (P7) pour révéler la cavité ventriculaire, l’épaisseur de la paroi ventriculaire, les structures de la vanne et la présence de trabeculation. Deuxièmement, une étude a été menée pour identifier les cellules qui seraient différencient en cardiomyocytes en utilisant un coeur postnatal de souris au jour 1 (P1) avec marqué Cre cardiomyocytes et protéine fluorescente jaune (YFP). Enfin, des souris adultes à 7,5 mois ont été projetés pour observer la présence de potassium médullaire externe rénale canaux (ROMK) après la thérapie de gène8.
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Protocol
Toutes les procédures impliquant l’utilisation d’animaux ont été approuvés par les comités examen institutionnel (IACUC) à l’Université de Californie, Los Angeles, en Californie.
1. Configuration du système d’imagerie
Remarque : Voir la Figure 1 et Figure 2.
- Récupérer un laser à onde continue (CW) avec 3 longueurs d’onde : 405 nm, 473 nm et 532 nm. Place 2 miroirs (M1 et M2) de 150 mm et en conformité avec leurs avions de miroir à 45° à la poutre.
Remarque : Cette étape est effectuée afin de rediriger le laser de l’installation d’éclairage recto-verso. Le faisceau résultant sera dans la même direction que le faisceau initial. - Passer le faisceau à travers un diamètre de 25 mm diaphragme iris/sténopé (PH), un filtre à densité neutre (NDF) 50 mm de diamètre avec une plage de densité optique de 0 - 4.0, une extension de faisceau (BE), une fente de 30 mm (S) avec la largeur de ~ 0 - 6 mm et un miroir (M3) , tous positionnés 150 mm les uns des autres. Placez le miroir avec son plan de symétrie entre 45° et le faisceau.
- Passer le faisceau à travers un séparateur de faisceau de 50/50 placé à 150 mm de M3. Placez un miroir (M6) 150 mm de la séparateur de faisceau et alignez-la afin que son plan de symétrie est à 45° de la poutre qui est émise vers l’avant. Utilisez le faisceau réfléchi pour former un côté de la nappe de lumière double-illumination.
- Placez un miroir (M4) 150 mm de la séparateur de faisceau et alignez-la afin que son plan de symétrie est à 45° de la poutre qui a été émise à un angle de 90° de la séparateur de faisceau. Placez un deuxième miroir (M5) 150 mm du M4 et alignez-la afin que son plan de symétrie est à 45° vers le faisceau réfléchi sur M6. Utilisez le faisceau émis par M5 pour former le second côté de la nappe de lumière double-illumination.
- Mettre en place le système d’éclairage recto-verso de façon symétrique (voir Figure 1). Placer une lentille cylindrique (CL1) [diamètre (d) = 1 ; longueur focale (f) = 50 mm] 150 mm en ligne avec le faisceau émis par M5 sur un côté et une autre lentille cylindrique identique (CL2) 150 mm en ligne avec le faisceau émis par M6 sur l’autre côté de la double-illumination setu p. Placer 2 miroirs (M7 et M8) chaque en ligne avec des lentilles cylindriques, à une distance de 50 mm afin de refléter le faisceau à 90 °.
- Former un doublet achromatique d’une paire de lentilles. Placez la première lentille, L1 (d = 1 ; f = 100 mm), 100 mm de M7 et la seconde lentille, L2 (d = 1 ; f = 60 mm), 160 mm de L1. Répéter que cela de l’autre côté de la double-illumination avec des objectifs identiques (L3, L4) placés à la même distance du M8.
- Place miroirs, M9 et M10, 60 mm de lentilles L2 et L4, respectivement et conformément à la poutre. Placer les objectifs de l’illumination, OL1 et OL2 (d = 2 ; f = 150 mm), 150 mm de M9 et M10 et conforme à la poutre. Le faisceau émis par les objectifs constitue la nappe de lumière pour les échantillons d’imagerie.
- Une imprimante 3D permet d’imprimer le porte-échantillon d’acrylonitrile butadiène styrène (ABS). Incorporer un morceau de verre de couverture [indice de réfraction (RI) = 1.4745] de chaque côté de la chambre, perpendiculaire au faisceau éclairage, afin de minimiser la désadaptation de l’indice de réfraction. Placer la chambre entre les faisceaux émis par les lentilles de l’objectif.
- Installer un microscope stéréo avec un 1 X objectif de grossissement et une caméra à semi-conducteurs (sCMOS) oxyde de métal complémentaire scientifique perpendiculaire à l’illumination d’avion (voir Figure 2).
2. imagerie système de calibrage
- Récupérer les billes de polystyrène fluorescents qui 0.53 μm de diamètre.
- Préparation des échantillons de billes fluorescentes en diluant la solution de perle dans une solution correspondant d’indice de réfraction (jantes) avec agarose pointage bas point de fusion de 1 % à 1 : 150, 000. Couper un bout de tube en verre borosilicate avec un diamètre intérieur de 12 mm et un diamètre extérieur de 18 mm sur une longueur de 30 mm.
Remarque : Le tube de verre de borosilicate est utilisé pour correspondre à l’indice de réfraction (1,47). - Mélanger l’échantillon dilué perle avec 1 % d’agarose et Pipeter la solution perle / d’agarose dans la tubulure de borosilicate. Permettre l’agarose à se solidifier à température ambiante (23 ° C).
- Remplir la chambre de l’ABS (de l’étape 1.7) avec une solution de glycérol à 99,5 %. Déposer le tube de verre de borosilicate contenant les billes à l’intérieur de la chambre. Placer la chambre de l’ABS dans le système d’imagerie afin qu’il soit au centre du faisceau gaussien créé par le système de double éclairage.
- Fixer une platine translationnelle motorisée 3-d sur le tube de verre de borosilicate pour contrôler le mouvement et l’orientation de l’échantillon dans la chambre de l’ABS (voir la Figure 1).
- Acquisition d’images à l’aide de la caméra sCMOS à raison de 30 images par seconde (fps). En utilisant le contrôleur de moteur, déplacer l’échantillon de 1 mm dans le sens latéral et acquérir des images à chaque incrément de 1 mm à l’aide de la caméra sCMOS. Continuez jusqu'à ce que la totalité de l’échantillon a été photographié.
- Empiler les images acquises à l’aide d’un logiciel de visualisation (voir Table des matières). Mesurer la fonction de point propagation (PSF) du système à l’aide de ces images de perle. Utilisez cette PSF de déconvolution pendant le traitement dans les étapes ultérieures de l’image.
3. préparation des échantillons
- Disséquer les cœurs d’une souris de type sauvage P1 et par un double sarcolipin-Cre hétérozygotes knockin de souris avec le gène Rosa26-YFP (SlnCre / +; R26journaliste YFP / +) à P7.
Remarque : L’euthanasie a été effectuée à l’aide de pentobarbital et la technique décrite par Robbins et al. 10. la dissection a été réalisée selon la technique décrite par le National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI)10,11. - Effectuer un produit chimique de compensation des cœurs murines, comme décrit par Kevin Sung et al. 12.
Remarque : Les étapes suivantes devraient être effectuées sous une hotte étant donné que les produits chimiques utilisés sont toxiques.- Rincer les coeurs en 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 3 x pendant 10 min. Après le rinçage, placez les coeurs dans une solution de paraformaldéhyde de 4 % et incuber les échantillons à 4 ° C jusqu’au lendemain.
- Placer les échantillons dans une solution de 4 % d’acrylamide contenant 0,5 % p/v de 2, 2'-Azobis dichlorhydrate. Laisser les échantillons incubés à 4 ° C durant la nuit. Après l’incubation d’une nuit ou plus, retirer les échantillons et les incuber à 37 ° C pendant 2-3 h.
- Rincez les échantillons avec du PBS et ensuite les placer dans une solution de dodécylsulfate de sodium 8 % p/v et 1,25 % p/v d’acide borique. Incuber les échantillons à 37 ° C jusqu'à ce qu’elles sont claires. Cela peut prendre plusieurs heures selon l’épaisseur de l’échantillon. Après compensation, supprimer les échantillons et les placer dans 1 x tampon phosphate salin pendant 1 nuit.
- Préparer un indice de réfraction correspondant solution avec 40 g de milieu gradient de densité non ioniques (voir Table des matières) dans 30 mL de tampon phosphate de 0,02 M (PB), 0,1 % Tween-20 et 0,01 % d’azide de sodium. Porter la solution à un pH de 7,5 à l’hydroxyde de sodium.
- Placer l’échantillon déboisée dans jantes avec un indice de réfraction de 1,46-1,48 et 1 % d’agarose. Insérer l’échantillon dans le tube en verre borosilicate et permettre l’agarose à se solidifier à température ambiante (23 ° C).
- Fixer une platine translationnelle motorisée 3-d sur le tube de verre de borosilicate pour contrôler le mouvement et l’orientation de l’échantillon dans la 3-d imprimé chambre ABS (voir la Figure 1).
4. imagerie cardiaque adultes
- Injecter 8,7 x 1012 virus du vecteur de virus adeno-associé de type 9 (AAV9) contenant un promoteur spécifique cardiaque troponine T (cTnT) et la protéine fluorescente verte (GFP) dans un volume de 100 μL dans la veine de la queue d’une souris de type sauvage de 2 mois (C57BL/6).
Remarque : Le AAV9 a été développé selon la technique décrite par Yuan et al. 13. cela provoque GFP lier au canal potassium médullaire externe rénale (ROMK) produisant AAV9-cTnT-ROMK-GFP (voir Table des matières). - Disséquer le coeur de souris adultes à 7,5 mois selon la technique décrite par le NHLBI11. Préparer les échantillons à l’aide de mesures 3.1 à 3.3.
- Connectez le contrôleur de moteur à l’actuateur moteur. Fixer le vérin sur le tube de verre de borosilicate pour contrôler le mouvement et l’orientation de l’échantillon dans la 3-d imprimé chambre ABS.
- Positionner l’échantillon pour qu’il soit au centre du faisceau gaussien créé par le système de double éclairage. Acquisition d’images à l’aide de la caméra sCMOS à un taux de 100 fps.
- En utilisant le contrôleur de moteur, déplacer l’échantillon de 1 mm dans le sens axial et acquérir des images à chaque incrément de 1 mm avec la caméra sCMOS. Continuez jusqu'à ce que la totalité de l’échantillon a été photographié.
Remarque : Le système est contrôlé par un logiciel de contrôle d’instruments développés sur mesure. - Empiler les images acquises à l’aide d’un logiciel de visualisation (voir Table des matières). Développer des images 3D à l’aide de ces piles de l’image et le logiciel de visualisation14. Donne les fibres discontinues de polyesters de l’étape 2.6 avec la pile de l’image acquise. Définir une valeur d’intensité de seuil pixel pour observer les contours du cœur et de Pseudo-colorisation des images basées sur cette intensité de gris.
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Representative Results
La technique décrite ici utilise un faisceau d’éclairage double face combiné avec une compensation optique souris coeur d’échantillons de tissus pour atteindre une profondeur d’imagerie plus profonde et un plus grand volume d’imagerie avec une résolution suffisante d’imagerie (Figure 1). Pour calibrer le système, les perles fluorescentes ont été placés à l’intérieur du tube de verre et au sein du système d’imagerie. Les perles ont été imagées et visualisés dans le plan x-y, plan y-z, et dans le plan x-z, afin d’obtenir le point spread function (PSF) pour le système8. Le système de calibrage a produit une résolution dans le sens latéral dulatéral d ≈ 2,8 µm et une résolution dans les directions axiales de dXZ ≈ 17,4 µm et le µm 17,9 d ≈YZ lors de l’utilisation de glycérol comme l’incorporation moyenne8.
Après que les perles fluorescentes ont été utilisés pour l’étalonnage, le système d’imagerie servait à coeurs souris l’image à 1 jour et 7 jours après l’accouchement (Figure 2)8. Les dimensions de la cavité ventriculaire, valvules cardiaques et trabeculation ventriculaire sont évidents dans ces images de la coeur de souris. Afin d’étudier une différenciation cardiomyocyte dans le coeur, souris hétérozygotes knockin cardiomyocytes marqués au Cre ont été imagées après l’accouchement. Les images des cardiomyocytes marqués au Cre sont dans chaque direction de l’avion avec un rendu 3D du coeur8 (Figure 3).
En plus d’étudier de souris après l’accouchement, le système d’imagerie servait aussi à étudier le coeur de souris adulte. Initialement, la thérapie génique a été utilisée pour introduire des canaux ROMK GFP-étiquetée dans le coeur de souris. À 7,5 mois, le coeur de souris a été imagé et ces canaux ROMK ont été visualisées dans la paroi ventriculaire (Figure 4). Cette étape dans la procédure illustre la capacité de ce système de grands échantillons d’images et de distinguer les structures ne pas vus avec coloration histologique dans le coeur. La figure 4 montre les canaux ROMK venant de chaque plan ainsi qu’un rendu 3D du cœur8.
Figure 1 : Schéma de principe du système de microscopie fluorescence lumière feuilles. Il s’agit d’un rendu 3D de la système de microscopie de fluorescence nappe de lumière, y compris les distances entre les composants et les focales des composants utilisés dans le système. Ce chiffre a été modifié par Yichen Ding et al. 8. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Top vue du système de microscopie de nappe de lumière avec détection de. C’est la vue de dessus du système de microscopie recto-verso illumination où la région sombre bleue représente le faisceau à chaque emplacement au sein du système. Comprend une section élargie 2-dimensionnel qui montre l’une des régions comprenant l’objectif de l’illumination et les doublets achromatiques. Cette section élargie montre également le principe de la formation de la nappe de lumière et comment les poutres sont combinés à l’illumination forme un recto-verso. Ce chiffre a été modifié par Yichen Ding et al. 8. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Images 3D d’après la naissance coeur murine. (a) ce panneau montre une image du cœur postnatal de souris au jour 7 affichage de la cavité du ventricule. (b) ce panneau montre une image du cœur postnatal de souris au jour 7 montrant l’épaisseur de la paroi du ventricule. (c) ce panneau montre l’image du cœur postnatal de souris au jour 1, montrant l’emplacement des structures de vanne. (d) cette image montre une section élargie du cœur postnatal de souris au jour 1 montrant le muscle pectiné situé dans l’atrium du coeur. (e) cette image montre trabeculation dans le ventricule dans le coeur de souris après l’accouchement au jour 1. Echelle : 1 mm. La région de bloqué dans l’encart montre deux coeurs de souris translucide après avoir subi la technique de la clarté et insérée dans le tube en verre borosilicate. Ce chiffre a été modifié par Yichen Ding et al. 8. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Images des cardiomyocytes marqués au Cre chez une souris après l’accouchement du coeur de chaque plan. Le coeur de souris P1 a été imagé avec cardiomyocytes Cre-étiquetés dans chaque plan transversal : (a) XY, (b), YZ et (c) XZ. Ces images en coupe transversale montrent la présence de cardiomyocytes Cre marqués dans l’oreillette et le ventricule de la souris de P1. (d) les images ont également fusionnés pour créer un rendu 3D du cœur. La région de bloqué dans l’encart montre deux coeurs de souris translucide après avoir subi la technique de la clarté et insérée dans le tube en verre borosilicate. Echelle : 1 mm. Ce chiffre a été modifié par Yichen Ding et al. 8. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Images du cœur des souris adultes montrant les canaux ROMK entre chaque plan. Le coeur de souris a été photographié à 7,5 mois pour montrer la présence et l’emplacement de canaux ROMK. Le cœur a été photographié sur chaque plan transversal : (a) XY, (b), YZ et (c) XZ. La valeur d’échelle de gris indique l’intensité optique dans l’image, avec les régions plus légers correspondant à une intensité lumineuse plus et dans les régions plus sombres correspondant à moindre intensité de lumière. (d) les images ont également fusionnés pour créer un rendu 3D du coeur, et les niveaux de gris des images originales étaient Pseudo-aléatoire couleurs afin que les canaux ROMK apparaissent en verts. La région de bloqué dans l’encart montre un cœur simple de souris adultes translucide après avoir subi la technique de la clarté et insérée dans le tube en verre borosilicate. Echelle : 1 mm. Ce chiffre a été modifié par Yichen Ding et al. 8. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Supplémentaire Figure 1 : Image de la chambre d’ABS avec les tubes borosilicate dans la nappe de lumière du système d’imagerie. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Le système LSFM et la technique décrite ici utilise un faisceau d’éclairage double face combiné avec une compensation optique d’image au coeur de souris post-natale à adulte stades de son développement. Un faisceau d’éclairage unique traditionnel souffre de diffusion du photon et l’absorption par les tissus plus épais et plus grands échantillons1,3. Les poutres recto-verso fournissent un éclairage plus homogène de l’échantillon, réduisant ainsi au minimum l’effet des rayures et autres artefacts qui sont souvent visibles sur les images produites par un éclairage unilatéral. Cette technique augmente aussi la taille de l’échantillon qui peut être photographiée en ajustant la position des faisceaux gaussiens dual8. La séparation maximale de ces poutres permet d’imagerie d’un échantillon de tissu plusieurs millimètres dans la taille, tels que le coeur de souris adulte, alors qu’un éclairage unique limitait la taille de l’échantillon aux coeurs plus petits tels que le cœur du poisson-zèbre et Drosophila .
Fluorescence imaging dans les tissus qui ne sont pas optiquement transparents est plus difficile puisque la diffusion de la lumière ne peut pas être uniforme dans l’ensemble de l’échantillon de tissu. Cela limite la profondeur à laquelle un échantillon peut être photographié et l’efficacité de l’imagerie de fluorescence. Pour cette raison, il est courant d’utiliser des organismes tels que le poisson-zèbre, qui ont naturellement les tissus optiquement transparent5. Cependant, pour effectuer des études sur les organismes qui n’ont pas naturellement la peau optiquement transparente d’imagerie de fluorescence, il y a compensation optique différentes techniques qui ont été développés pour supprimer la coloration du tissu. Une telle technique de compensation optique est clarté, où le tissu est placé dans un hydrogel, puis incubé pendant une longue période de temps et enfin placé dans une solution de compensation qui réduit la quantité de réflexion et de réfraction entre l’échantillon et autres supports1 ,,9. Dans cette étude, cette technique a été modifiée afin de réduire le montant de la compensation de réactif utilisé et ne nécessitait pas l’ajout de pompes à vide ou azote gaz8.
Bien que cette technique offre une résolution d’image améliorée pour les échantillons plus épais opaques, il y a des limites à cette stratégie qui pourrait être amélioré dans de futures études. D’autres études ont été menées avec des poutres de Bessel et une excitation non linéaire à deux photons pour fournir une meilleure résolution à suffisamment d’imagerie profondeur15,16. Ces méthodes actuellement ont été utilisés pour étudier les plus petits modèles cardiaques mais pourraient être adaptées afin d’étudier les processus dynamiques au sein d’un embryon en développement. Changements à la méthode de clarté pour les grands échantillons de tissus pourraient améliorer l’efficacité de l’imagerie de fluorescence en réduisant le nombre des fluorophores qui peut potentiellement également perdue lors du franchissement du processus8. Récemment, nous avons intégré ce système LSFM avec réalité virtuelle pour élucider le développement mécanique cardiaque17.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier Thao Nguyen et Atsushi Nakano d’UCLA de fournir l’échantillon de souris à l’image. Cette étude a été financée par les STARS de subventions HL118650 NIH (à Tzung K. Hsiai), HL083015 (à Tzung K. Hsiai), HD069305 (pour N. C. Chi et Tzung K. Hsiai.), HL111437 (à Tzung K. Hsiai et N. C. Chi), HL129727 (à Tzung K. Hsiai) et système de l’Université du Texas (à Nancy Lee).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CW Laser | Laserglow Technologies | LMM-GBV1-PF3-00300-05 | Excitation of fluorophores |
| Neutral density filter | Thorlabs | NDC-50C-4M | Controls amount of light entering system |
| Achromatic beam expander | Thorlabs | GBE05-A | Expands the beam of light |
| Mechanical slit | Thorlabs | VA100C | Controls width of beam |
| Beam splitter | Thorlabs | BS013 | Forms dual-illumination beam |
| Stereo microscope with 1X objective lense | Olympus | MVX10 | Used for observation of sample |
| ORCA-Flash4.0 LT sCMOS camera | Hamamatsu Photonics | C11440-42U | Used to capture Images |
| Acrylonitrile butadiene styrene (ABS) | Stratasys | uPrint | Material used to 3-D print a sample holder |
| Fluorescent polystyrene beads | Spherotech Inc | PP-05-10 | Used for imaging system calibration |
| Borosilicate glass tubing | Corning | Pyrex 7740 | Tubing for sample embedding |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | Fill for sample chamber |
| Phosphate-buffered saline | Fisher Scientific | BP39920 | Rinse solution for mouse hearts |
| Paraformaldehyde | Electron microscopy sciences | RT-15700 | First incubation solution |
| Acrylamide | Wako Chemicals | AAL-107 | Mixed with 2,2'-Azobis dihydrochloride for second incubation solution for mouse hearts |
| 2,2'-Azobis dihydrochloride | Wako Chemicals | VA-044 | Mixed with Acrylamide for second incubation solution for mouse hearts |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | 71725 | Mixed with Boric acid for third incubtion solution for mouse hearts |
| Boric acid | Fischer Scientific | A74-1 | Mixed with Sodium dodecyl sulfate for third incubtion solution for mouse hearts |
| Sigma D2158 | Sigma Aldrich | D2158 | Mixed with PB, Tween-20, and Sodium azide as a refractive index matching solution |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | 11332465001 | Mixed with Sigma D2158, PB, and Sodium azide as a refractive index matching solution |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002 | Mixed with Sigma D2158, PB, and Tween-20 as a refractive index matching solution |
| Adeno-associated virus vector 9 with a cardiac-specific Troponin T promoter tagged with GFP | Vector Biolabs | VB2045 | Expresses GFP when bound to ROMK |
| DC Servo Motor Actuator | Thorlabs | Z825B | Used for movement of sample in axial direction within light sheet |
| K-Cube Brushed DC Servo Motor Controller | Thorlabs | KDC101 | Connects to motor actuator and controls movement of the actuator |
| Amira | FEI Software | N/A | Visualization software for producing 2-D and 3-D images |
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