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Bioengineering

Licht-Blatt Fluoreszenzmikroskopie for the Study of Murine Herzen

Published: September 15, 2018 doi: 10.3791/57769

Summary

Diese Studie verwendet eine beidseitige Beleuchtung Licht-Blatt Fluoreszenz-Mikroskopie (LSFM) Technik kombiniert mit optischen Ausgleich der murine Herz zu studieren.

Abstract

Licht-Blatt Fluoreszenzmikroskopie hat seit schnelle Bildakquisition mit eine hohe axiale Auflösung von Mikrometer, Millimeter-Skala weit verbreitet. Traditionelle Licht-Blatt Techniken beinhalten die Verwendung von einem einzigen Beleuchtung Strahl orthogonal auf Probe Gewebe gerichtet. Bilder von großen Proben, die mit einem einzigen Beleuchtung Balken hergestellt werden Streifen oder Artefakte enthalten und leiden unter einer reduzierten Auflösung aufgrund der Streuung und Absorption von Licht durch das Gewebe. Diese Studie verwendet eine beidseitige Beleuchtung Strahl und eine vereinfachte Klarheit optische clearing-Technik für das murine Herz. Diese Techniken ermöglichen tiefere Bildgebung durch Lipide aus dem Herzen entfernen und produzieren einen großen Bereich der Bildgebung, größer als 10 x 10 x 10 mm3. Als ein Ergebnis dieser Strategie ermöglicht es uns, quantifizieren die ventrikulären Dimensionen, die kardiale Abstammung zu verfolgen und die räumliche Verteilung der Herz-Kreislauf-spezifische Proteine und Ionenkanäle aus der postnatalen zu Erwachsenen Mäuseherzen mit ausreichendem Kontrast zu lokalisieren und Auflösung.

Introduction

Licht-Blatt Fluoreszenzmikroskopie war eine Technik, die erstmals im Jahre 1903 entwickelt und dient heute als eine Methode, Genexpression zu studieren und auch 3-d- oder 4-D-Modelle von Gewebe Proben1,2,3zu produzieren. Dieses bildgebende Verfahren verwendet eine dünne Folie aus Licht um zu eine einzige Ebene einer Probe zu beleuchten, so dass nur das Flugzeug vom Detektor erfasst wird. Die Probe kann dann in axialer Richtung auf jeweils erfassen verschoben werden Schicht, einen Abschnitt in einer Zeit, und machen Sie ein 3-d-Modell nach der Nachbearbeitung der aufgenommenen Bilder4. Allerdings hat aufgrund der Absorption und Streuung von Photonen, LSFM Proben beschränkt, die entweder wenige Mikrometer dick sind oder optisch transparenten1.

Die Grenzen der LSFM führten zu umfangreichen Studien von Organismen, die Gewebe, die optisch transparent, wie dem Zebrafisch. Studien mit kardialen Entwicklung und Differenzierung werden häufig auf Zebrafisch durchgeführt, da gibt es konservierte Gene zwischen Mensch und Zebrafisch5,6. Obwohl diese Studien zu Fortschritten in der kardiologischen Forschung in Bezug auf Kardiomyopathien6,7geführt haben, muss es noch eine ähnliche forschen auf höherer Ebene Organismen wie Säugetiere.

Säugetier-Herzgewebe Herausforderung eine durch die Dicke und die Deckkraft des Gewebes, die Absorption durch Hämoglobin in den roten Blutkörperchen und das Striping, das durch einseitige Beleuchtung der Probe unter traditionellen LSFM Methoden1 auftritt , 8. um diese Einschränkungen zu kompensieren, haben wir vorgeschlagen, beidseitige Beleuchtung und eine vereinfachte Version der Klarheit Technik9 kombiniert mit einem Brechungsindex passende Lösung (Felgen) zu verwenden. Daher ermöglicht dieses System für die Darstellung einer Probe, die größer als 10 x 10 x 10 mm3 während Aufrechterhaltung eine gute Auflösung in den axialen und lateralen8Flugzeuge.

Dieses System wurde zunächst kalibriert mit fluoreszierenden Perlen in verschiedenen Konfigurationen innerhalb der Glasröhren angeordnet. Dann wurde das System verwendet, um nach der Geburt und Erwachsenen murinen Herzen Bild. Erstens war das postnatale Maus Herz 7 Tage (P7), offenbaren die ventrikuläre Hohlraum, die Dicke der Ventrikelwand, die Ventil-Strukturen und das Vorhandensein von Trabeculation abgebildet. Zweitens wurde eine Studie durchgeführt, um Zellen zu identifizieren, die in Kardiomyozyten differenzieren würde mithilfe einer postnatalen Maus Herz am 1 Tag (P1) mit Cre-Label Kardiomyozyten und gelb fluoreszierenden Proteins (YFP). Zu guter Letzt wurden Erwachsener Mäuse mit 7,5 Monaten abgebildet, um das Vorhandensein von renal äußeren medulläre Kalium (ROMK) Kanäle nach Gen Therapie8beobachten.

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Protocol

Alle Verfahren, die die Verwendung von Tieren wurden durch institutionelle Review Komitees (IACUC) an der University of California, Los Angeles, Kalifornien genehmigt.

(1) Imaging-System-Setup

Hinweis: Siehe Abbildung 1 und Abbildung 2.

  1. Einen kontinuierliche Welle (CW)-Laser mit 3 Wellenlängen abrufen: 405 nm, 473 nm und 532 nm. Platz 2 Spiegel (M1 und M2) 150 mm auseinander und richten Sie sie mit ihren Spiegelebenen um 45° zum Strahl.
    Hinweis: Dieser Schritt wird durchgeführt, um den Laser entfernt das beidseitige Beleuchtung Setup umleiten. Der resultierende Strahl wird in die gleiche Richtung wie der erste Strahl sein.
  2. Übergeben Sie den Strahl durch ein 25-mm-Durchmesser Irisblende/Lochkamera (PH), einen Durchmesser von 50 mm Graufilter (NDF) mit einer optischen Dichte-Bereich von 0 - 4.0, ein Strahl-Expander (BE), 30 mm Schlitz (S) mit der Breite von ~ 0 - 6 mm und einem Spiegel (M3) , alle 150 mm voneinander positioniert. Platzieren Sie den Spiegel mit der Spiegelebene auf 45° zum Balken.
  3. Übergeben Sie den Strahl durch ein 50: 50 Strahlteiler platziert 150 mm vom M3. Setzen Sie einen Spiegel (M6) 150 mm von der Strahlteiler und richten Sie es so dass die Spiegelebene auf 45° zum Balken, die in Vorwärtsrichtung ausgegeben wird. Verwenden Sie den reflektierten Strahl, um der Dual-Beleuchtung-Licht-Blatt zu bilden.
  4. Setzen Sie einen Spiegel (M4) 150 mm von der Strahlteiler und richten Sie es so dass die Spiegelebene auf 45° zum Balken, die in einem 90 °-Winkel von der Strahlteiler emittiert wurde. Setzen Sie einen zweiten Spiegel (M5) 150 mm von der M4 und richten Sie es so aus, dass die Spiegelebene auf 45° zu den Strahl von M6 reflektiert wird. Verwenden Sie den Strahl emittiert von M5 auf der zweiten Seite des Dual-Beleuchtung Licht Bogens bilden.
  5. Die beidseitige Beleuchtungssystem in einer symmetrischen Weise einrichten (siehe Abbildung 1). Legen Sie eine Zylinderlinse (CL1) [Durchmesser (d) = 1; Brennweite (f) = 50 mm] 150 mm im Einklang mit den Strahl emittiert von M5 einerseits mit einer anderen identisch Zylinderlinse (CL2) 150 mm im Einklang mit der Strahl von M6 auf der anderen Seite des Dual-Beleuchtung Setu emittiert p. Platz 2 Spiegel (M7 und M8) jeweils im Einklang mit der Zylinderlinsen im Abstand von 50 mm bis den Strahl im 90 °-Winkel zu reflektieren.
  6. Bilden Sie eine achromatische Wams aus einem Paar von Linsen. Legen Sie das erste Objektiv, L1 (d = 1; f = 100 mm), 100 mm von M7 und die zweite Linse L2 (d = 1; f = 60 mm), 160 mm von L1. Wiederholen Sie dies auf der anderen Seite der Dual-Beleuchtung mit identischen Linsen (L3, L4) den gleichen Abstand von M8 platziert.
  7. Statt Spiegel, M9 und M10, 60 mm von Linsen L2 und L4, bzw., und im Einklang mit den Strahl. Legen Sie die Beleuchtung Ziele, OL1 und OL2 (d = 2; f = 150 mm), 150 mm M9 und M10 und im Einklang mit den Strahl. Der Strahl emittiert von den Zielen bildet das leichte Blatt für die Proben-Bildgebung.
  8. Verwenden Sie einen 3-d-Drucker zum Drucken der Probenhalter aus Acrylnitril-Butadien-Styrol (ABS). Eine Stück Deckglas einbetten [Brechungsindex (RI) = 1.4745] auf jeder Seite der Kammer, senkrecht zur Beleuchtung Strahl, Brechungsindex Fehlanpassungen zu minimieren. Platzieren Sie gleichmäßig die Kammer zwischen die Balken von der Objektivlinsen emittiert.
  9. Installieren Sie ein Stereo-Mikroskop mit 1 X Vergrößerung Objektive und eine wissenschaftliche komplementäre Metalloxid-Halbleiter (sCMOS) Kamera senkrecht bis hin zur Beleuchtung Flugzeug (siehe Abbildung 2).

(2) Imaging System-Kalibrierung

  1. Abrufen von fluoreszierenden Polystyrol-Kügelchen, die 0,53 µm im Durchmesser sind.
  2. Bereiten Sie die fluoreszierende Bead Probe durch Verdünnung der Wulst-Lösung im Brechungsindex passende Lösung (Felgen vor) mit 1 % niedrig schmelzend zeigenden Agarose, 1: 150, 000. Schneiden Sie ein Stück von Borosilikatglas Schläuche mit einem Innendurchmesser von 12 mm und einem Außendurchmesser von 18 mm auf einer Länge von 30 mm.
    Hinweis: Borosilikat-Glasröhren wird verwendet, um den Brechungsindex (1,47) übereinstimmen.
  3. Mischen Sie die verdünnte Bead Probe mit 1 % Agarose und pipette die Perle/Agarose-Lösung in den Borosilikat-Schlauch. Lassen Sie die Agarose, bei Zimmertemperatur (23 ° C) zu festigen.
  4. Füllen Sie die ABS-Kammer (aus Schritt 1,7) mit einer 99,5 % Glycerin-Lösung. Legen Sie die Borosilikatglas-Schläuche mit den Kügelchen im Inneren der Kammer. Legen Sie der ABS-Kammer in dem abbildenden System, so dass es in der Mitte des Gaußschen Strahls durch die doppelte Beleuchtungssystem geschaffen.
  5. Befestigen Sie eine 3-d-motorisierte translationale Phase Borosilikat-Glasröhren zur Steuerung der Bewegung und Ausrichtung der Probe in der ABS-Kammer (siehe ergänzende Abbildung1).
  6. Bilder mit der Kamera sCMOS mit einer Rate von 30 Frames pro Sekunde (fps) zu erwerben. Mit der Motorsteuerung, die Probe 1 mm in seitlicher Richtung bewegen und Abrufen von Bildern bei jeweils 1 mm Inkrement sCMOS Kamera benutzen. Fortgesetzt, bis die gesamte Stichprobe abgebildet worden.
  7. Stapeln Sie die aufgenommenen Bilder mit einer Visualisierungs-Software (siehe Tabelle der Materialien). Messen Sie die Point-spread-Funktion (PSF) des Systems über diese Perle Bilder. Verwenden Sie diese PSF für Dekonvolution während der Bildverarbeitung in späteren Schritten.

3. die Probenvorbereitung

  1. Sezieren Herzen aus einem Wild-Typ P1-Maus und eine doppelte heterozygot Sarcolipin-Cre knockin Maus mit dem Rosa26-YFP-gen (SlnCre / +; R26YFP Reporter / +) auf P7.
    Hinweis: Euthanasie erfolgte mittels Pentobarbital und die Technik von Robbins Et Al. beschrieben 10. die Präparation erfolgte nach der Technik von der National Heart, Lung und Blood Institute (NHLBI)10,11beschrieben.
  2. Führen Sie eine chemische Reinigung der murinen Herzen wie von Kevin Sung Et Al. beschrieben 12.
    Hinweis: Die folgenden Schritte sollten in einem Abzug durchgeführt werden, da die verwendeten Chemikalien giftig sind.
    1. Spülen Sie die Herzen in 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) 3 X 10 min. lang. Nach dem Spülen, legen Sie die Herzen in einen 4 % Paraformaldehyd Lösung und inkubieren Sie diese Proben bei 4 ° C über Nacht.
    2. Legen Sie die Proben in einer 4 % Acrylamid-Lösung mit 0,5 % w/V von 2, 2'-Azobis Dihydrochloride. Lassen Sie die Proben über Nacht bei 4 ° C inkubieren. Entfernen Sie nach der Übernachtung Inkubation die Proben und inkubieren sie bei 37 ° C für ca. 2-3 h.
    3. Spülen Sie die Proben mit PBS und dann legen Sie sie in einer Lösung von 8 % w/V Sodium Dodecyl Sulfat und 1,25 % w/V Borsäure. Inkubieren Sie die Proben bei 37 ° C, bis sie klar sind. Dies kann je nach der Dicke der Probe mehrere Stunden dauern. Entfernen Sie nach der Reinigung die Proben zu und legen Sie sie in 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung für 1 Tag.
    4. Bereiten Sie einen passende Lösung mit 40 g nichtionische Dichte Gradienten Medium Brechungsindex (siehe Tabelle der Materialien) in 30 mL 0,02 M Phosphatpuffer (PB), 0,1 % Tween-20 und 0,01 % Natriumazid. Bringen Sie die Lösung einen pH-Wert von 7,5 mit Natriumhydroxid.
  3. Legen Sie die gelöschte Probe in Felgen mit einem Brechungsindex von 1,46-1,48 und 1 % Agarose. Legen Sie die Probe in Borosilikat-Glasröhren und ermöglichen Sie die Agarose, bei Zimmertemperatur (23 ° C) zu festigen.
  4. Befestigen Sie eine 3-d-motorisierte translationale Phase Borosilikat-Glasröhren zur Bewegungskontrolle und Ausrichtung der Probe innerhalb der 3-d gedruckt ABS Kammer (siehe ergänzende Abbildung1).

(4) Erwachsene Herz Imaging

  1. Injizieren Sie 8,7 x 1012 -Viren des Typs Adeno-assoziierten Virus Vektor 9 (AAV9) mit einem Promotor der Herz-Kreislauf-spezifische Troponin T (cTnT) und grün fluoreszierendes Protein (GFP) in einem 100 μL Volumen in die Rute Vene Mausklick 2-monatigen Wildtyp (C57BL/6).
    Hinweis: Die AAV9 wurde nach der Technik von Yuan Et Al. beschrieben entwickelt. 13. dadurch GFP binden an die renale äußeren medulläre Kaliumkanal (ROMK) AAV9-cTnT-ROMK-GFP Produktion (siehe Tabelle der Materialien).
  2. Sezieren Sie die Erwachsenen Mäuseherzen 7,5 Monate alt nach der Technik von NHLBI11beschrieben. Bereiten Sie die Proben mit Schritten 3.1-3.3 vor.
  3. Verbinden Sie den motor Controller mit dem motorischen Antrieb. Borosilikat-Glasröhren zur Bewegungskontrolle den Aktor beimessen und Ausrichtung der Probe innerhalb der 3-d gedruckt ABS Kammer.
  4. Positionieren Sie die Probe, so dass es in der Mitte des Gaußschen Strahls durch die doppelte Beleuchtungssystem geschaffen. Abrufen von Bildern mit der sCMOS Kamera mit einer Rate von 100 fps.
  5. Mit der Motorsteuerung, die Probe 1 mm in axialer Richtung bewegen und Bilder bei jedem Inkrement 1 mm mit sCMOS Kamera erwerben. Fortgesetzt, bis die gesamte Stichprobe abgebildet worden.
    Hinweis: Das System wird durch einen eigens entwickelten Instrument-Steuerungs-Software gesteuert.
  6. Stapeln Sie die aufgenommenen Bilder mit einer Visualisierungs-Software (siehe Tabelle der Materialien). 3-d-Bilder mit diesen Bild-Stacks und die Visualisierung Software14zu entwickeln. Deconvolve die PSF aus Schritt 2.6 mit den erworbenen Bildstapel. Legen Sie einen Pixel Intensität Schwellenwert zu beobachten die Konturen des Herzens und Pseudo-Farbe hinzufügen, um die Bilder anhand dieser Grauwert-Intensität.

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Representative Results

Die beschriebene Technik verwendet hier einen beidseitige Beleuchtung Strahl kombiniert mit einer optischen Ausgleich von Maus Herz Gewebeproben um zu einer tieferen bildgebenden Tiefe und ein größeres Volumen der Bildgebung mit ausreichender bildgebenden Auflösung (Abbildung 1) zu erreichen. Zur Kalibrierung des Systems wurden fluoreszierende Kügelchen im Inneren der Glasröhren und innerhalb des Systems der bildgebenden platziert. Die Perlen waren dann abgebildet und in der X-y-Ebene, y-Z-Ebene, visualisiert und in der X-Z-Ebene, um den Punkt zu erhalten verbreiten Funktion (PSF) für das System8. Die Kalibrierung des Systems produziert eine Auflösung in seitlicher Richtung dseitliche ≈ 2,8 µm und eine Auflösung in axialer Richtung dXZ ≈ 17,4 µm und dYZ ≈ 17,9 µm bei Verwendung von Glycerin als die einbettende mittlere8.

Nachdem die fluoreszierenden Perlen zur Kalibrierung verwendet wurden, diente das Abbildungssystem Mäuseherzen 1 Tag und 7 Tage nach der Geburt (Abbildung 2)8-Bild. Die ventrikuläre Hohlraum Dimensionen, Herzklappen und ventrikuläre Trabeculation liegen auf der Hand in diesen Bildern des Herzens Maus. Um eine Cardiomyocyte Differenzierung innerhalb des Herzens zu untersuchen, wurden heterozygot Profi Mäuse mit Cre-Label Kardiomyozyten postnatale abgebildet. Die Bilder von der Cre-Label Kardiomyozyten sind in jeder Richtung Ebene sowie eine 3-d-Darstellung des Herzens8 (Abbildung 3).

Neben dem Studium postnatale Mäuse, diente das abbildenden System auch Erwachsenen Maus Herzen zu studieren. Zunächst wurde Gentherapie zur Einführung von GLP-Tags ROMK Kanäle in das Maus-Herz. 7,5 Monate Maus Herzen abgebildet war und diese ROMK Kanäle wurden in der Ventrikelwand (Abbildung 4) visualisiert. Diesen Schritt innerhalb der Prozedur veranschaulicht die Fähigkeit dieses Systems zu Bild große Muster und Strukturen nicht mit histologischen Färbung innerhalb des Herzens zu unterscheiden. Abbildung 4 zeigt die ROMK Kanäle aus jeder Richtung Ebene sowie eine 3-d-Darstellung des Herzens8.

Figure 1
Abbildung 1 : Schematische Darstellung des Systems der Licht-Blatt Fluoreszenz-Mikroskopie. Dies ist eine 3-dimensionale Darstellung der leichte Blatt Fluoreszenz-Mikroskopie Systems, einschließlich die Abstände zwischen den Komponenten und die Brennweiten der Komponenten im System verwendet. Diese Zahl wurde von Yichen Ding Et Al. modifiziert 8. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : Draufsicht von leichten Bogen Mikroskopie System mit Erkennung. Dies ist die Draufsicht auf das beidseitige Mikroskopie Beleuchtungssystem, wo dunklen blauen Bereich den Strahl an jedem Standort innerhalb des Systems darstellt. Enthalten ist ein 2-dimensionale vergrösserter Ausschnitt, der eines der Gebiete, bestehend aus achromatischen Doublets und Beleuchtung Ziel zeigt. In diesem erweiterten Abschnitt zeigt auch das Prinzip der leichten Blattbildung und wie die Balken zu Form eine beidseitige Beleuchtung kombiniert werden. Diese Zahl wurde von Yichen Ding Et Al. modifiziert 8. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 : 3-d-Bilder vom postnatalen murinen Herzen. (ein) zeigt dieses Panel ein Bild des Herzens postnatale Maus am 7.Tag zeigt den Ventrikel Hohlraum. (b) dieses Panel zeigt ein Bild des Herzens postnatale Maus am 7.Tag zeigt die Ventrikel Wanddicke. (c) dieses Panel zeigt das Bild des Herzens postnatale Maus am Tag 1 zeigt den Standort der Ventil-Strukturen. (d) zeigt dieses Bild einen vergrösserter Ausschnitt aus postnatale Maus mitten am Tag 1 den pectinate Muskel befindet sich im Atrium des Herzens zeigen. (e) dieses Bild zeigt Trabeculation in der Herzkammer postnatale Maus mitten am Tag 1. Maßstab: 1 mm. Die rot Eingekreiste Region innerhalb der Inset zeigt zwei durchscheinende Mäuseherzen nach Durchlaufen der Klarheit-Technik und in der Borosilikat-Glasröhren eingefügt werden. Diese Zahl wurde von Yichen Ding Et Al. modifiziert 8. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4 : Bilder von der Cre-Label Herzzellen in eine postnatale Maus das Herz von jedem Flugzeug. Das P1 Maus Herz war mit Cre-Label Herzzellen in jeder Querschnittsebene abgebildet: (ein) XY, (b) YZ, und (c) XZ. Diese Schnittbilder zeigen die Anwesenheit von Cre-Label Herzzellen in das Atrium und die Herzkammer der P1-Maus. (d) die Bilder wurden auch zusammengeführt, um eine 3-d-Darstellung des Herzens zu schaffen. Die rot Eingekreiste Region innerhalb der Inset zeigt zwei durchscheinende Mäuseherzen nach Durchlaufen der Klarheit-Technik und in der Borosilikat-Glasröhren eingefügt werden. Maßstab: 1 mm. Diese Zahl wurde von Yichen Ding Et Al. modifiziert 8. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5 : Bilder des Erwachsenen Maus Herzens zeigen die ROMK Kanäle aus jedem Flugzeug. Die Maus-Herz war bei 7,5 Monate alt sein, um die Präsenz zu zeigen und den Speicherort der ROMK Kanäle abgebildet. Das Herz war in jedem Querschnittsebene abgebildet: (ein) XY, (b) YZ, und (c) XZ. Der Grauwert gibt die optische Intensität innerhalb des Bildes mit den helleren Regionen entsprechend mehr Lichtintensität und die dunkleren Regionen entsprechend weniger Lichtintensität. (d) die Bilder wurden auch zusammengeführt, um eine 3-d-Darstellung des Herzens zu erstellen, und die ursprünglichen Graustufen-Bilder waren Pseudo-farbigen, so dass die ROMK Kanäle grün erscheinen. Rot eingekreist Region innerhalb der Inset zeigt eine einzelne durchscheinende Erwachsener Mäuse Herz nach Durchlaufen der Klarheit-Technik und in der Borosilikat-Glasröhren eingefügt werden. Maßstab: 1 mm. Diese Zahl wurde von Yichen Ding Et Al. modifiziert 8. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Ergänzende Abbildung1: Bild der ABS-Kammer mit dem Borosilikat-Schlauch innerhalb des hellen Blatts das Abbildungssystem. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

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Discussion

Das LSFM System und die hier beschriebene Technik nutzt einen beidseitige Beleuchtung Strahl kombiniert mit einer optischen Ausgleich Bild Maus Herzen postnatale und Erwachsenen Stadium seiner Entwicklung. Ein traditionelle einheitliche Beleuchtung Strahl leidet Photon Streuung und Absorption durch dicker und größer Gewebe Proben1,3. Die beidseitige Träger bieten eine gleichmäßigere Ausleuchtung der Probe, so dass die Wirkung von Striping und andere Artefakte, die oft in Bildern erzeugt durch eine einseitige Beleuchtung zu sehen sind. Diese Technik erhöht auch die Größe der Stichprobe, die durch die Position des dual "glockenförmig" Balken8abgebildet werden kann. Die maximale Trennung dieser Träger ermöglicht für eine Gewebeprobe mehrere Millimeter groß, wie die Erwachsenen Maus Herz-Bildgebung während eine einzige Beleuchtung die Größe der Stichprobe zu kleineren Herzen wie die Herzen der Zebrafisch und Drosophila begrenzt .

Fluoreszenz-imaging in Geweben, die nicht optisch transparent ist schwieriger, da Lichtstreuung möglicherweise nicht einheitlich die Gewebeprobe. Dies begrenzt die Tiefe, die ein Beispiel abgebildet werden kann und die Wirksamkeit der Fluoreszenz-Bildgebung. Aus diesem Grund ist es üblich, Organismen wie dem Zebrafisch, die natürlich optisch transparente Gewebe5zu verwenden. Allerdings um Fluoreszenz Bildgebungsstudien auf Organismen, die nicht natürlich optisch transparente Haut durchzuführen, gibt es verschiedene optische Clearing-Techniken, die entwickelt wurden, um die Färbung des Gewebes zu entfernen. Eine solche optische Clearing-Technik ist Klarheit, wo das Gewebe platziert in einem Hydrogel, dann für einen langen Zeitraum hinweg inkubiert und schließlich in einem Clearing-Lösung, die Reduzierung der Menge an Reflexion und Lichtbrechung zwischen der Probe und anderen Medien1 platziert ,9. In dieser Studie diese Technik wurde modifiziert, um die Reduzierung der clearing-Reagenz verwendet und die Zugabe von Vakuumpumpen oder Stickstoff Gas8nicht erforderlich.

Obwohl diese Technik eine verbesserte Bildauflösung für dickere opake Proben bietet, gibt es Beschränkungen in Bezug auf diese Strategie, die in zukünftigen Studien verbessert werden könnte. Weitere Studien wurden mit Bessel Balken und eine zwei-Photon nichtlineare Anregung bieten eine bessere Auflösung bei ausreichender bildgebenden tiefen15,16durchgeführt. Diese Methoden derzeit wurden verwendet, um kleinere kardiale Modelle studieren aber können angepasst werden, um die dynamische Prozesse innerhalb einer sich entwickelnden Embryos zu studieren. Änderungen an der Klarheit-Methode für größere Gewebeproben die Wirksamkeit der Fluoreszenz-Bildgebung verbessern könnte, durch die Verringerung des Fluorophore, die potenziell können auch verloren bei der Räumung8zu verarbeiten. Vor kurzem haben wir dieses LSFM-System mit virtual Reality, Entwicklungsstörungen kardiale Mechanik17aufzuklären integriert.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Die Autoren möchten Thao Nguyen und Atsushi Nakano von der UCLA danken für die Bereitstellung der Mäuse Probe Bild. Diese Studie wurde unterstützt durch Zuschüsse NIH HL118650 (um Tzung K. Hsiai), HL083015 (zu Tzung K. Hsiai), HD069305 (zu N. C. Chi Tzung K. Hsiai.), HL111437 (zum Tzung K. Hsiai und N. C. Chi), HL129727 (zu Tzung K. Hsiai) und University of Texas System STARS Mittel (für Juhyun Lee).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CW Laser Laserglow Technologies LMM-GBV1-PF3-00300-05 Excitation of fluorophores
Neutral density filter Thorlabs NDC-50C-4M Controls amount of light entering system
Achromatic beam expander Thorlabs GBE05-A Expands the beam of light
Mechanical slit Thorlabs VA100C Controls width of beam
Beam splitter Thorlabs BS013 Forms dual-illumination beam
Stereo microscope with 1X objective lense Olympus MVX10 Used for observation of sample
ORCA-Flash4.0 LT sCMOS camera Hamamatsu Photonics C11440-42U Used to capture Images
Acrylonitrile butadiene styrene (ABS) Stratasys uPrint Material used to 3-D print a sample holder
Fluorescent polystyrene beads Spherotech Inc PP-05-10 Used for imaging system calibration
Borosilicate glass tubing Corning Pyrex 7740 Tubing for sample embedding
Glycerol Fisher Scientific BP229-4 Fill for sample chamber
Phosphate-buffered saline Fisher Scientific BP39920 Rinse solution for mouse hearts
Paraformaldehyde Electron microscopy sciences RT-15700 First incubation solution
Acrylamide Wako Chemicals AAL-107 Mixed with 2,2'-Azobis dihydrochloride for second incubation solution for mouse hearts
2,2'-Azobis dihydrochloride Wako Chemicals VA-044 Mixed with Acrylamide for second incubation solution for mouse hearts
Sodium dodecyl sulfate  Sigma Aldrich 71725 Mixed with Boric acid for third incubtion solution for mouse hearts
Boric acid Fischer Scientific A74-1 Mixed with Sodium dodecyl sulfate for third incubtion solution for mouse hearts
Sigma D2158 Sigma Aldrich D2158 Mixed with PB, Tween-20, and Sodium azide as a refractive index matching solution
Tween-20 Sigma Aldrich 11332465001 Mixed with Sigma D2158, PB, and Sodium azide as a refractive index matching solution
Sodium azide Sigma Aldrich S2002 Mixed with Sigma D2158, PB, and Tween-20 as a refractive index matching solution
Adeno-associated virus vector 9 with a cardiac-specific Troponin T promoter tagged with GFP Vector Biolabs VB2045 Expresses GFP when bound to ROMK
DC Servo Motor Actuator Thorlabs Z825B Used for movement of sample in axial direction within light sheet
K-Cube Brushed DC Servo Motor Controller Thorlabs KDC101 Connects to motor actuator and controls movement of the actuator
Amira FEI Software N/A Visualization software for producing 2-D and 3-D images

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References

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Ding, Y., Bailey, Z., Messerschmidt, More

Ding, Y., Bailey, Z., Messerschmidt, V., Nie, J., Bryant, R., Rugonyi, S., Fei, P., Lee, J., Hsiai, T. K. Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart. J. Vis. Exp. (139), e57769, doi:10.3791/57769 (2018).

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