Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Одной молекулы флуоресценции In Situ гибридизация (smFISH) анализ многообещающий вегетативного роста дрожжей и мейоз

Published: May 25, 2018 doi: 10.3791/57774
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Molecular and Cell Biology, Barker Hall, University of California, Berkeley, 2Department of Molecular and Cell Biology, Li Ka Shing Center, University of California, Berkeley

Summary

Этот одной молекулы флуоресценции в situ гибридизация протокол оптимизирован для подсчитать количество молекул РНК в многообещающий дрожжей во время вегетативного роста и мейоз.

Abstract

Одной молекулы флуоресценции в situ гибридизация (smFISH) – это мощный метод для изучения экспрессии генов в одиночных клетках из-за его способность обнаруживать и рассчитывать отдельные молекулы РНК. В дополнение к глубокие методы, основанные на последовательности, smFISH предоставляет сведения о вариации для ячеек в изобилии Стенограмма и внутриклеточных локализации данного РНК. Недавно мы использовали smFISH для изучения экспрессии гена NDC80 во время мейоза в многообещающий дрожжи, в котором два Стенограмма изоформ существуют и краткое стенограммы изоформы имеет свою всю последовательность, совместно с длиной изоформы. Чтобы уверенно идентифицировать каждый Стенограмма изоформы, мы оптимизирована известных smFISH протоколы и получили высокой согласованности и качества данных smFISH для образцов, приобретенных во время бутонизации дрожжей мейоз. Здесь мы опишем это оптимизированный протокол, критерии, которые мы используем для определения ли получено высокое качество данных smFISH и некоторые советы по реализации этого протокола в других штаммов дрожжей и условий роста.

Introduction

Динамический регуляцию экспрессии генов диски развития организма, а также его ответ на экологического стресса, инфекции и изменения в метаболизме. Исследования, которые сосредоточены на регуляцию полагаются на технологии, которые измеряют РНК изобилия. Один из таких методов, называемых одной молекулы флуоресценции в situ гибридизация (smFISH), используется для обнаружения отдельных молекул РНК в одиночных клетках1,2. Этот метод позволяет измерение к ячейке изменчивости в экспрессии генов и определение внутриклеточной локализации РНК.

В наиболее часто используемых smFISH технике обнаружения индивидуальных молекулы РНК требует несколько коротких ДНК зонды (часто ~ 48 20-mer зонды), которые дополняют цели РНК и сопряженных с же Люминесцентную краску. Связывание одного флуоресцентного зонда приводит слабый сигнал, но сигнал от ансамбля всех датчиков является надежной. Эта функция значительно улучшает отношение сигнал шум, потому что даже несмотря на то, что один зонд может exhibit-цели привязки, такой сигнал ожидается быть очень слабыми по сравнению с целевой молекулы РНК3. В ошибка обнаружения количество молекул РНК могут учитываться и сравнить между различными роста условиях и среди разных мутантов.

С момента своего первого развития smFISH была адаптирована для изучения различных аспектов генной выражение4, например транскрипции удлинение1,2, сплайсинга5,6, транскрипционный анализ разрыва7 , 8 , 9, внутриклеточный аллельные выражение10,11,12и РНК локализации13,14,15. Недавно, мы использовали этот метод для изучения экспрессии двух изоформ Стенограмма такого же гена, в котором изоформы краткое стенограммы (NDC80ORF) имеет свою всю последовательность, совместно с длиной изоформы (NDC80luti )16. Для уникальной идентификации две изоформы мРНК, мы использовали два датчика: один набор для уникальных последовательности NDC80luti, и другой набор, конъюгированных с другой Люминесцентную краску, привязывает к области общих двух изоформ. NDC80luti РНК определяется как colocalized пятно с обеих флуоресцентные сигналы, тогда как NDC80ORF РНК является тот, который содержит только сигнал от общего набора зонд. Так как количество NDC80ORF стенограммы вычисляется методом «вычитание», уверенно выявлять smFISH пятен и уменьшить ошибки необходимы высокая эффективность зонд гибридизации и высокое соотношение сигнал шум распространение.

Этот документ описывает оптимизированный протокол для выполнения smFISH в многообещающий дрожжей Saccharomyces cerevisiae. В этот протокол, мобильный номер, фиксации времени, время пищеварения, пищеварение буфер, зонд концентрации и гибридизации буфер, используемый для smFISH экспериментов были оптимизированы для SK1 штамм фон S. cerevisiae проходит вегетативной рост или мейоза. Однако мы также отмечаем в этой рукописи: (1) метод для проверки качества данных, smFISH после захвата изображений и (2 шаги в протоколе, которая может потребоваться дополнительная оптимизация для различных штамма стола и условий роста.

Protocol

Примечание: Все буферы и средствами массовой информации, используемые в настоящем Протоколе, перечислены в таблице 1. Вендора для реагентов, перечисленных в Таблице материалов.

День 1/день 1-2:

Примечание: Растительные культуры, растут клетки ОД600 от 0,4 до 0,6 в предпочтительным средством. Для meiotic культуры заставить клетки пройти мейоз, предпочтительным методом (обычно культивирования в ОД600 1,85).

1. образец фиксации и пищеварение

  1. Исправьте в общей сложности ~3.5 ОД600 клеток в 3% формальдегида.
    1. Для растительные культуры добавьте 5.52 мл культуры 480 мкл 37% формальдегида в 15 мл конические трубы.
    2. Для meiotic культуры мкл 1840 культуры до 160 мкл 37% формальдегида в 2-мл microcentrifuge трубы. Инвертировать ~ 5 раз, чтобы перемешать.
      Предупреждение: Формальдегид токсичных. Обрабатывать и распоряжаться согласно нормативных положений.
  2. Место труб на роликовых барабан при комнатной температуре за 20 мин. Для meiotic образцы, после фиксации при комнатной температуре в течение 20 мин, по-прежнему фиксации на ночь при 4 ° c, вращающиеся.
    Примечание: Ночь фиксации увеличивает воспроизводимость и качество полученных meiotic образцов данных smFISH. Время фиксации должны быть оптимизированы.
  3. В то время как фиксации образцов, оттепель 200 мм ванадила Ribonucleoside комплексов (ВРЦ) на 65 градусов по крайней мере 10 минут.
  4. Подготовка мастер смесь пищеварение в 15 мл: 1 образец, смешать 425 мкл буфера B с 40 мкл 200 мм VRC (прогреты до 65 ° c); для 5 образцов смесь 2125 мкл буфера B с 200 мкл 200 мм VRC (прогреты до 65 ° c). Вихревой ~ 5 s полностью Ресуспензируйте VRC перед добавлением в Мастер микс, который появится после сложения VRC света коричнево-зелёного.
    Примечание: Добавление VRC во время пищеварения улучшает консистенцию smFISH результатов, потенциально, подавляя нуклеиназы загрязнителем, представленный в zymolyase смесь, которая очищается от сырой экстракт. Количество VRC, необходимых на данном этапе должны быть оптимизированы.
  5. Для вегетативного образцов центрифуга трубы на x ~ 1057 г за 3 мин. Изучали образцы (после ночи фиксации) центрифуги на 21 000 x g 1,5 мин Decant или аспирационная супернатант формальдегида отходы.
    Примечание: Все центрифугирования шаги выполняются при комнатной температуре.
  6. Ресуспензируйте клетки в 1,5 мл холодного буфера B закупорить вверх и вниз или инвертирование трубы и стряхивая смешивать. Передача вегетативных проб в 2-мл пробирки после взмучивания.
  7. Центрифуг в 21000 g x 1,5 мин удалить основную часть жидкости путем вакуумной аспирации или закупорить, оставив позади ~ 100 мкл.
  8. Ресуспензируйте клетки в 1,5 мл холодного буфера б.
  9. Центрифуг в 21000 g x 1,5 мин удалить основную часть жидкости путем вакуумной аспирации или закупорить, оставив позади ~ 100 мкл.
  10. Ресуспензируйте клетки в 1,5 мл холодного буфера B. центрифуги на 21 000 x g 1,5 мин аспирата жидкость полностью вакуума или закупорить.
  11. Ресуспензируйте клетки в 425 мкл мастер смеси пищеварение, и кратко вихревой Ресуспензируйте. 5 мкл zymolyase 100т 10 мг/мл, к каждой трубе.
    Примечание: Вихрь zymolyase каждый раз, когда перед добавлением к трубкам. Добавьте zymolyase в каждую пробирку индивидуально, вместо добавления мастер смесь. Оба шага помогают поддерживать пищеварение согласованность трубы потому что zymolyase осаждает быстро.
  12. Вихрь 2-3 s смешивать. Место труб на барабане ролика и дайджест на 30 градусов для 15-30 мин. Для растительных клеток и ранних стадиях meiotic обычно это занимает ~ 15 мин, и для meiotic профаза и meiotic подразделений, обычно это занимает ~ 30 мин.
    Примечание: Проверка на микроскопе каждые 5 минут через 15 мин и остановить пищеварения когда ~ 80% клеток появляются нетранспарентные и не рефракции. От этой точки зрения, клетки являются очень хрупкими. Аккуратно обработать клетки и избегать использования вакуумной аспирации или vortexing.
  13. Центрифуга трубы на ~ 376 x g на 3 мин удалить жидкость полностью, закупорить.
  14. Нежно ресуспензируйте клеток в 1 мл буфера B, закупорить вверх и вниз на 1 - 2 раза в смесь.
  15. Центрифуга трубы на ~ 376 x g на 3 мин удалить B буферной жидкости, закупорить. Нежно ресуспензируйте клеток в 1 мл 70% этанола (разбавленный водой, RNase бесплатно).
  16. Инкубируйте 3,5-4 часа при комнатной температуре.

2. Гибридизация

  1. Довести до комнатной температуры формамид (для 50 мл Алиготе, она занимает ~ 30 мин на водяной бане).
    Примечание: Не открывайте формамид бутылку до тех пор, пока бутылка достигнет комнатной температуры во избежание окисления формамида.
    Предупреждение: Формамид является токсичным. Обрабатывать и распоряжаться согласно нормативных положений.
  2. Подготовка 10% формамида мыть буфер в 15 мл Конические трубки.
  3. Центрифуга трубы на ~ 376 x g для 3 мин удалить 500 мкл 70% этанола, закупорить. Аккуратно накапайте вверх и вниз для Ресуспензируйте оставшиеся ячейки, а затем перенесите клетки с низким сцеплением трубок.
    Примечание: Использование низким сцеплением трубы значительно уменьшает потери клеток во время последующих моек.
  4. Центрифуга трубы снова на ~ 376 x g на 3 мин удалить все этанола, закупорить.
  5. Добавить 1 мл 10% формамида мыть буфер, и аккуратно накапайте вверх и вниз 2 - 3 раза Ресуспензируйте клетки.
  6. Позволяют клеткам сидеть при комнатной температуре ~ 20 мин при подготовке решения гибридизации. 1 образец Смешайте 50 мкл буфера гибридизации (номер temp.), 5 мкл 200 мм VRC (разогрет до 65 градусов) и 1 мкл каждого зонда (финал 200 Нм). Для 5 образцов смесь 250 мкл буфера гибридизации (номер temp.), 25 мкл 200 мм VRC (разогрет до 65 градусов) и 5 мкл каждого зонда (финал 200 Нм).
    1. Оттепель гибридизации буфера (заморожен на уровне-20 ° c) до комнатной температуры перед открытием трубки для предотвращения окисления формамида.
    2. После добавления 200 мм VRC, вихревые для 5-10 s перед добавлением зонды, которые разработаны и приобрели коммерчески и восстановлена в соответствии с инструкциями производителя.
    3. Если два зонда совместно коммерсантам, 1 мкл 1:10 разрежения зонд #1 акции, а также 1 мкл в 1:10 разрежения зонд #2 акций, чтобы сделать окончательный разбавление ~ 1: 500 для либо зонд. Концентрации, необходимые для лучший сигнал шум коэффициент должен быть оптимизирован (см. обсуждение для подробной информации).
  7. Центрифугуйте образцы на ~ 376 x g на 3 мин удалить супернатант в опасных отходов, закупорить.
  8. По крайней мере 50 мкл раствора гибридизации к каждой трубе. Флик трубы смешивать.
  9. Инкубируйте на 30 градусов на барабане ролик для по крайней мере 16 часов в темноте.

День 2/день 3

3. Мойка и обработка изображений

  1. Формамид довести до комнатной температуры.
  2. Подготовка 10% формамида мыть буфера (FWB) в 15 мл Конические трубки.
  3. Удаление трубы из ролика барабана и поместите их в окно фольги покрыты для защиты от света.
  4. Центрифугуйте образцы на ~ 376 x g на 3 мин удалить супернатант в опасных отходов, закупорить.
  5. Ресуспензируйте в 1 мл 10% FWB, нежно закупорить вверх и вниз 2 - 3 раза.
  6. Инкубируйте на 30 градусов за 30 мин (не вращается) в поле покрытый фольгой.
  7. Центрифугуйте образцы на ~ 376 x g для 3 мин удалить супернатант для опасных отходов, дозирование и оставить ~ 50 мкл.
  8. Тем временем подготовить DAPI/FWB в 15 мл Конические трубки: 1 образец, смешать с 1 мкл 5 мг/мл DAPI 1000 мкл 10% формамида мыть буфера. Для 10 образцов Смешайте 10 мл 10% формамида мыть буфера с 10 мкл 5 мг/мл DAPI. Ресуспензируйте в 1 мл DAPI/FWB, нежно закупорить вверх и вниз 2 - 3 раза.
  9. Инкубируйте на 30 градусов за 30 мин (не вращается) в поле покрытый фольгой.
  10. Оттепель анти отбеливатель реагентов на льду.
  11. Центрифугуйте образцы на ~ 376 x g на 3 мин удалить супернатант полностью, закупорить. При необходимости, центрифуга снова, чтобы удалить все супернатант.
  12. Для образцов, которые отражаются не сразу Ресуспензируйте гранулы в 50 мкл буфера GLOX без ферментов. Накапайте вверх и вниз 3 - 4 раза для смешивания.
    1. Держите все unimaged образцы в поле фольги, покрытой на 4 ° c до готовности к изображению. Когда все готово к изображению, Центрифугуйте образцы на ~ 376 x g на 2 мин и полностью удалить супернатант, закупорить. Ресуспензируйте в GLOX с ферментами, как показано ниже.
  13. Для образцов изображаемого немедленно, добавить 15-20 мкл буфера GLOX с ферментами. Аккуратно накапайте вверх и вниз, чтобы смешать.
    Примечание: Объем добавил может варьироваться в зависимости от размера ячейки Пелле. Мы рекомендуем resuspending гранулы в 15 мкл буфера GLOX с энзимами и проверьте плотность ячеек на микроскопе. Если клетки являются слишком плотной (клетки слипания друг на друга), добавьте дополнительный буфер GLOX с ферментами. Если клетки слишком разреженный, центрифуга образца и удалить ~ 5 мкл буфера.
  14. Накапайте 5 мкл на coverslip (18 x 18 мм, № 1) и положить coverslip на слайде.
  15. Положите Лаборатория очистки поверх слайда, где находится coverslip. Аккуратно нажмите на стирание лаборатории для установки слайд (должны увидеть жидкость, отрываясь от всех четырех краев coverslip).
  16. Передача слайд в Микроскоп комнату в коробке, охватываемых алюминиевой фольги.
  17. Изображение с помощью микроскопа-поля флуоресценции с высоким увеличением (60-100 X) и высокая числовая апертура.
    Примечание: Собрать максимальное количество фотонов, испускаемых smFISH зонды, конфокальные микроскопы не рекомендуется, так как они значительно ограничивают количество света должны быть собраны. Здесь, данные были собраны на микроскоп оснащен 100 X, 1.4 NA цели, используя фильтры CY5 (EX632/22, EM679/34) образы на 1.3 s, 100% T; TRITC (EX542/27, EM597/45), 1.3 s, 100% T; и DAPI (EX390/18, EM435/48), 0,05-0,1 s, 32% - 50% т. Должно быть также приобретено ярко поле эталонный образ. Приобрести 15-25 фрагменты с шагом размером 0,1-0,2 мкм, от полностью ниже в центре поля зрения полностью выше, с целью обеспечить, чтобы все пятна РНК приходится.

4. анализ

  1. Проанализируйте данные smFISH с инструменты анализа опубликованных smFISH таких как рыбы Квант17 и StarSearch2, или индивидуальных программ, в зависимости от конкретных требований эксперимента.
    Примечание: Хороший анализ трубопровода следует позволить пользователям определить порог отделить истинное РНК пятна от фона, и вывода статистики, например координаты X, Y и Z (опционально) и интенсивности каждого пятна, количество точек в каждой ячейке и возможно установка параметров как способ фильтрации ложных срабатываний.

Representative Results

Чтобы оценить, насколько хорошо smFISH протокол работал (изложенные в Рисунок 1), мы разработали набор 54 зонды которые плитка открытой чтении кадр гена NDC80 (рис. 2A, сверху). Зонд расположен в наиболее 5' конце именуется как зонд 1; Следующий 1, зонд 2; и третье, зонд 3, и т.д. 27 зонды назначен нечетное число (датчик 1, 3, 5...) сопряжены для Люминесцентную краску CAL Fluor 590 (CF590); и 27 зонды четное число (зонд 2, 4, 6...), конъюгированных Люминесцентную краску Квазар 670 (Q670). Следовательно эти чередующиеся наборы зонд часто называются «чет/нечет» зондов. После гибридизации оба набора зонд должен ярлык же стенограмма.

После обнаружения место мы использовали несколько измерений судить о качестве smFISH набора данных. Первый из них был степень и качество colocalization для чет/нечет зондов. В нашем случае 88% всех пятен smFISH colocalized (рисунок 2A и 2B), с более чем 95% паре в пределах 2 пикселов друг от друга (рис. 2 c, парных), пятна, которые в пределах ожидаемое значение любой хроматические и обнаружения отклонение между двумя каналами флуоресцентные. Для сравнения, менее 10% непарных пятна имел ближайшего соседа расстояние менее 2 пикселов, показывают, что вероятность неправильного представления пятно пара низкого (рис. 2 c). 12% непарных пятна были поровну между двумя каналами (Рисунок 2Б, Сравните CF590-только с Q670-только); и таким образом, мы пришли к выводу, что для этого гена 2,4 КБ с диапазоном выражения между нуля до 45 стенограммы в клетку, ~ 94% молекул РНК точно были обнаружены в каждом канале, флуоресцентные. Если протокол smFISH субоптимальные, одно будет наблюдать (1) большую часть пятна smFISH только с одним из двух сигналов флуоресцентные (не colocalized), и/или (2) клетки с очень низкое соотношение сигнал шум или сигнал не на всех.

Далее, мы попросили, если обнаружение сигнала smFISH был пристрастен в отношении общего числа молекул РНК в клетку. В популяции общее количество конкретного РНК в каждой ячейке лежит в распределении, некоторые клетки укрывательство больше молекул РНК, чем другие. Хороший smFISH протокол должен энергично обнаружить РНК независимо ли высокой или низкой число молекул РНК присутствует в каждой клетке. Чтобы проверить это, для каждой ячейки, мы рассчитали фракция smFISH пятна с colocalized сигналов и дроби с только одним из двух люминесцентных сигналов. После группировки клетки, которые имели одинаковое количество общего числа в ячейке, мы рассчитывается средняя фракция colocalized (парные) или не colocalized (только для CF590 или Q670-только) пятна в данной группе и графике это среднее значение в зависимости от общего числа пятна на ячейку (рис. 3). Для каждой категории пятен фракции были похожи через весь спектр общее количество точек в клетку. Например сравнивая клетки с в общей сложности 20 флуоресцентные пятна на ячейку сравнению с в общей сложности 30 точек, средняя фракции colocalized пятна были похожи. Этот результат предложил, что наш протокол мог обнаружить молекул РНК диапазон в клетке (до по крайней мере 40 ~ молекул в клетку). Если протокол работал suboptimally, одно может наблюдать уклоном. Например часть пятна с только один из двух люминесцентных сигналов может увеличиться как общее количество пятен на ячейку увеличилось.

Используя этот оптимизированный протокол, мы изучили выражение NDC80 ген, который кодирует белок Кинетохор, в различных условиях. Джин NDC80 выражает две изоформы мРНК: долго undecoded Стенограмма изоформы, NDC80luti, имеет расширение ~ 400 пар в конце 5' по сравнению с краткосрочной NDC80ORF изоформы, но оба стенограммы поделиться кодирвоания гена NDC80 (см. схема в Рисунок 4A). Мы разработали два набора зондов: CF 590 набор связывается с уникальным 5' регион NDC80luti; и набор Q 670 связывается с общей области NDC80luti и NDC80ORF. NDC80luti стенограммы были обнаружены пятна smFISH, где сигналы от оба датчика Наборы colocalized, тогда как NDC80ORF стенограммы были те сигнала только от Q 670. Из-за размера сегмента уникальный NDC80lutiмы могли бы только плитка 20 зонды олигонуклеотида вдоль этого региона, который меньше, чем рекомендуемый зонды 30-48. Таким образом мы сначала определяется, если этот набор зонд надежно может обнаружить РНК в нашем оптимизирован протокол. Для либо флуоресцентные канала мы графике отношение сигнал шум (SNR, определяется как дисперсию значений пикселов, окружающих место по отношению к пятно интенсивности) против сигнал обнаружения для каждого smFISH месте и формируются рассеяния для всех пятен выявленные в всего поля зрения (пример изображения в Рисунок 4A ) и участки в рисунке 4В. Двух различных популяций были четко определены для Q 670 и CF 590 зонд наборы (оптимизировано, рис. 4B), предполагая, что истинный smFISH пятна (внутри области серого) могут быть отделены от фонового сигнала. Отметить, что в условиях неоптимальных такое разделение был менее очевидным (Suboptimal, Рисунок 4B).

Мы использовали эти наборы два зонда для изучения выражение NDC80luti и NDC80ORFво время вегетативного роста и мейоз. В растительных клетках надежный сигнал из Q 670 зонд набора был обнаружен, но не от CF 590 зонда набор (Рисунок 5A, вегетативной), соглашаясь с замечанием, Северный blotting, только короткие изоформы было выражено во время вегетативного роста16 . Этот результат также предложил, что CF 590 зонда набор конкретных, приносит низкий фон в нашем оптимизирован smFISH протокол. В противоположность этому надежный сигнал от обоих зонд был обнаружен в meiotic профаза, и большинство пятна colocalized сигнала (Рисунок 5A, meiotic профаза). Наряду с анализом Северная помарка (Рисунок 5B) это наблюдение подтвердил, что длинные изоформы NDC80luti была выражена конкретно в мейоз. Эти два типа mRNAs были обнаружены в цитоплазме (за пределами региона DAPI), предполагая, что оба были экспортированы из ядра, в соответствии с рибосомы, Профилирование данных18.

Чтобы определить, если достаточные данные были собраны для точного счета для биологической вариации, присущих нашей набор данных, мы провели загрузчик анализ с использованием статистических данных каждой ячейки, которая включала (1) часть colocalized пятна на клетки и (2) Доля мест с одним из двух люминесцентных сигналов (CF 590 только и Q 670 только). В этом анализе программа случайно выбранных одну ячейку из 437 количественных клеток для 500 итераций. Далее среднее и дисперсия соответствующих статистических данных, связанных с этими 500 ячеек были рассчитаны. Этот процесс был затем повторяется для случайным выбором две клетки от всех клеток, без замены; а потом случайно выбора три клетки и др. пока одна половина размера общего набора данных было достигнуто. Вариативность в наборе данных перестала расти после ~ 40 клеток, о том, что после этого момента большинство различий в средней неотъемлемым элементом данных, вместо того, чтобы артефакт undersampling (рис. 6, вставка). Этот эффект становится более очевидным, когда мы графике выборочную дисперсию, разделенных выборочное среднее, как функция количество клеток, отобранных в каждой итерации цикла (рис. 6). С данными показано изменения в дисперсии стал diminishingly небольшой после ~ 60 ячеек. Количество клеток, количественно в smFISH эксперименте должен превышать минимальное количество клеток, необходимых для достижения стабильного среднего и плато дисперсии. В нашем случае мы количественно более 95 клетки на сэмпл, за репликацию. Общее количество клеток (> 400 клетки) также превышает минимальное количество (~ 60 клетки), необходимое для отражения среднего.

Заказные программы Matlab16растительной клетки были обнаружены в среднем 5 NDC80ORF стенограммы в клетку, тогда как в клетках meiotic профаза, медиана значительно упала до 4 стенограммы в клетку (2 tailed Вилкоксон Ранг сумма тест, p = 0,026) (Рисунок 7). Среднее количество NDC80luti стенограммы на ячейку был 21 стенограммы, и 100% ячеек выражена NDC80luti стенограммы. Мы графике часть клетки с заданным числом стенограммы как поэтапный, относительной частоты гистограммы, потому что количество молекул мРНК дискретной величины. Крупнейший бин каждой гистограммы нормализуется на одинаковой высоте.

Figure 1
Рисунок 1: диаграмму для протокола smFISH. Клетки фиксируются с формальдегидом при комнатной температуре в течение 20 минут или на 4 ° c на ночь, для вегетативного роста проб и мейотическую, соответственно. После мытья в буфер В три раза, клетки усваиваются с zymolyase до ~ 70% - 90% клеток перевариваются. Усваивается образцы затем промывают один раз с буфера B для удаления zymolyase и впоследствии permeabilized в 70% этанола (EtOH) для ~3.5 часов. Чтобы подготовиться к гибридизации, Образцы инкубируют в 10% формамида мыть буфера (FWB) ~ 20 мин. Далее образцы являются высокомобильна в ~ 50 мкл раствора гибридизации, который содержит флуоресцентных зондов для ночи инкубации в темноте на 30 градусов. После гибридизации образцы инкубировали в FWB 10% для 30 минут смыть излишки зондов, а затем инкубируют в 10% FWB с 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) пятно ДНК. Для примера, отображаемого сразу же после инкубации FWB/DAPI образец высокомобильна в буфере GLOX, дополнена каталазы, Trolox и глюкоза оксидаза (GLOX + enz); в то время как другие образцы высокомобильна в буфере GLOX без ферментов и хранить при 4 ° c до ~ 3 часа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: Оценка качества smFISH, с использованием зондов, чет/нечет. (A) top: Схема для наборов чет/нечет зонд. Пятьдесят четыре олигонуклеотидных зондов черепица NDC80 гена были разработаны. Нечетные зонды были помечены с одним Флюорофор (CF590, показан пурпурным) и четные зонды, с другой Флюорофор (Q670, показано зеленым). Внизу: Представитель smFISH изображения meiotic профаза клеток, полученные с помощью зонда, чет/нечет наборов. 6 часов после того, как клетки (UB8144) были переданы заспорение среднего, то время, когда эти клетки были арестованы в профазе meiotic были взяты образцы. ДНК был запятнан DAPI (показаны синим цветом). Изображения отображаются в виде проекций максимальной интенсивности z стеки. Линейки: 5 мкм. (Б) процент в паре или непарные smFISH пятна полученные с помощью зонда, чет/нечет наборов. В общей сложности 428 meiotic профаза клетки были проанализированы, объединение двух независимых экспериментов. Этот показатель изменяется от Рисунок 2-рис Дополнение 4 Чэнь и др. 16 (C) совокупный плотность функция (СГО) расстояния между каждой парой парные пятна и расстояние между ближайшего соседа непарных пятно. Для каждого обнаруженного пятно в одном канале флуоресцентные, алгоритм «k ближайших соседей» был применен для определения ближайших обнаруженных месте — и расстояние до этого места — в дополнительных канала. Локализации, которые были взаимные ближайших соседей были рассмотрены в паре, и новый список был создан запись парных, CF590 и только Q670 обнаружений. Для каждой категории обнаружений СГО гистограммы расстояния было изобразить в Matlab, подтверждающий, что правильно парные пятна действительно были гораздо ближе в расстоянии чем те, без соответствующего места в другой канал. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: число фракций парные и непарные пятна, как функция общего РНК в клетку. Чтобы проверить, если обнаружение и сопряжения smFISH пятен предвзято на уровнях различные выражения, отдельные клетки были сгруппированы по общее выражение РНК. Средняя фракции парных, CF590 и только Q670 обнаружений были рассчитаны для каждой группы клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: Оценка качества smFISH данных, получаемых с помощью зондов для NDC80luti и NDC80ORF мРНК. Q 670 зонды (показано зеленым) гибридизировать к общей региона совместно NDC80luti и NDC80ORF мРНК, тогда как CF 590 зонды (показан пурпурным) гибридизировать в регионе уникальные 5' NDC80luti . (A) представитель smFISH образы NDC80luti и NDC80ORF в meiotic профаза, приобретенные под оптимизирован по сравнению с оптимальным условиям. Штаммы UB8144 (оптимизированный условие) и UB1337 (субоптимальные условие) были вынуждены пройти мейоз и фиксированной во время meiotic профаза. Эти два штаммов гавани систем синхронизации побудить мейоз, но использование любой системы не влияет на качество smFISH (данные не показаны). В условиях неоптимальных клетки были исправлены при комнатной температуре 20 мин (не ночь фиксации), переваривается с zymolyase без VRC дополнен и гибридизированных в низкой концентрации VRC. Изображения отображаются в виде проекций максимальной интенсивности z стеки. ДНК был запятнан DAPI (показаны синим цветом). Линейки: 5 мкм. Scatterplots (B) отображение отношение сигнал шум (SNR) и сигнал каждого smFISH месте обнаружен в поле зрения представлены в Рисунок 4A, либо флуоресцентные канала, а также для оптимизированного или неоптимальных условиях. В оптимизированные условия присутствовали две популяции smFISH пятен. Истинный smFISH пятна были расположены внутри области серый, отделяя от фонового сигнала. В условиях неоптимальных индивидуальных mRNAs были трудно отличить на глаз, и разделение между истинной пятна и фон после запуска месте обнаружения программного обеспечения был менее очевидным. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5: Выражение NDC80luti и NDC80ORF височно контролируются стенограммы. (A) представитель smFISH образы NDC80luti и NDC80ORF во время вегетативного роста и мейоз. Вегетативные пробы были взяты когда клетки (UB8144) растет в геометрической прогрессии в богатой питательной среде. 6 часов после того, как клетки (UB8144) были переданы заспорение среднего, то время, когда эти клетки были арестованы в профазе meiotic были взяты пробы meiotic профаза. Q 670 зонды (показано зеленым) гибридизировать к общей региона совместно NDC80luti и NDC80ORF мРНК, тогда как CF 590 зонды (показан пурпурным) гибридизировать в уникальный 5' регион NDC80luti . ДНК был запятнан DAPI (показаны синим цветом). Каждая ячейка была поставлена его сигнал Zip1-GFP, маркер для meiotic профаза. Наши smFISH протокол сохраняет сильный сигнал GFP без дальнейших изменений. Вегетативного роста: Zip1-GFP отрицательной. Meiotic профаза: Zip1-GFP положительный. Изображения отображаются в виде проекций максимальной интенсивности z стеки. Линейки: 5 мкм. Этот показатель изменяется от Рисунок 2 c Чэнь и др. 16. (B) NDC80ORF, NDC80lutiи уровень протеина (Ndc80p) Ndc80 во время мейоза (UB4074). NDC80luti и NDC80ORF уровни были определены при Северная помарка, и Ndc80p уровень определяется immunoblot анти V5 в назначенное время точках. Hxk1p, контроля для immunoblot загрузки. Как штамм UB8144, этот штамм также затаивает pGAL-NDT80 GAL4-ER синхронизации системы19,20. Клетки были переданы заспорение среднего в 0 час и освобождается от ареста pachytene β-эстрадиола добавлением 6 часов спустя. NDC80luti Стенограмма энергично был обнаружен в S/meiotic профаза, тогда как NDC80ORF стенограммы преимущественно присутствовал до meiotic запись (0 часов) и во время meiotic дивизий (7-9 часов). Этот показатель изменяется от Рисунок 6J Chen et al. 16 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. 

Figure 6
Рисунок 6: загрузочный анализ образцов meiotic профаза, показано в Рисунок 5 . Все количественные клетки были объединены, и заданное количество клеток (n) случайно были взяты пробы в 500 раз. Среднее значение и 95% доверительный интервал были рассчитаны для фракция парные и непарные мРНК в клетку. Эти данные были построены для каждого выбора число n (вставка). Плато в дисперсии был визуализирован путем построения выборочную дисперсию, разделенных означает, как функция количество клеток (n) пробы. Общее количество клеток измеряется (437) значительно превышает число на котором ошибка перестала расти (~ 60 клетки), указав, что дополнительные данные не повысит доверие в измерениях. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 7
Рисунок 7: количественная оценка smFISH данные, отображаемые в Рисунок 5 , графическом качестве относительной частоты гистограммы клеток с заданным числом NDC80luti и NDC80ORF стенограммы в клетку, с использованием данных пула от трех независимых экспериментов. Пунктирная линия показывает среднее количество NDC80luti и NDC80ORF стенограммы в клетку. Каждой гистограммы нормализуется так что бин максимальная высота была одинаковой во всех гистограммы. Общее количество 637 клетки были проанализированы для вегетативного роста и 437 для meiotic профаза. Двустороннее Вилкоксон ранг сумма тест был проведен для NDC80luti и NDC80ORF, соответственно, сравнивая растительные и meiotic профаза образцы. Этот показатель изменяется от 2D фигура Чэнь и др. 16 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. 

Буфера B (1 Л складе: 1,2 М сорбитол; 0,1 М калия фосфат буфера, pH 7.5) 1 x
Нуклеаза свободной воды 500 мл
Сорбит 218.6 g
KH2PO4 2.18 g
K2HPO4 14.62 g
Нуклеаза свободной воды Довести до окончательного объемом 1 Л
* Хранить при 4 ° c в 50-мл аликвоты после стерилизации фильтр
Zymolyase-100T (10 мг/мл)
* Хранить на уровне-20 ° c в аликвоты
Растворите порошок zymolyase 10 мг в 1 мл MilliQ воды
E. coli tRNA (10 мг/мл)
* Хранить на уровне-20 ° c в аликвоты
Растворите порошок tRNA 10 мг в 1 мл MilliQ воды
70% этанола (50 мл) 1 x (мл)
Чистого этанола 35
Нуклеаза свободной воды 15
* Хранить при комнатной температуре
Гибридизация буфера (10 мл) 1 x (мл)
50% декстран сульфат 2
E. coli tRNA (10 мг/мл) 1
200 мм ванадила ribonucleoside комплекс (ВРЦ) 0.1
BSA, 50 мг/мл 0,04
20 x SSC 1
Формамид 1
Нуклеаза свободной воды 4.86
* Хранить на уровне-20 ° c в 250 мкл или 500 мкл аликвоты
10% формамида мыть буфера (10 мл) 1 x (мл)
Формамид при комнатной температуре 1
20 x SSC 1
Нуклеаза свободной воды 8
* сделать свежие, вихревые для 20-30 лет смешивать
10% раствор глюкозы
* Хранить при 4 ° c в аликвоты после стерилизации фильтр
Растворить 1 г глюкозы в 10 мл воды, свободной от нуклеиназы
Глюкозооксидаза
* Хранить на уровне-20 ° c в аликвоты
Распустить глюкозооксидаза 3,7 мг в 1 мл 50 мм NaOAc, рН 5
Борьбе с отбеливателем (GLOX) буфер, без ферментов (1 мл) 1 x (мкл)
10% раствор глюкозы в свободной от нуклеиназы воды 40
1 М трис, рН 8,0 10
20 x SSC 100
Нуклеаза свободной воды 850
* сделать свежие, можно также хранить аликвоты на 4 ° c
Борьбе с отбеливателем (GLOX) буфера, с энзимами (50 мкл) 1 x (мкл)
Каталазы (вихревой мягко, он оседает легко) 0.5
Глюкозооксидаза 0.5
100 мм (растворимые в этиловом спирте) Trolox 1
GLOX буфер 50
* сделать свежий каждый раз, готовить на льду, можно хранить при 4 ° c на 2-3 часа

Таблица 1. Буферы и средства массовой информации

Discussion

Протокол, представленные здесь является производным от других22,21,2,3,23с опубликованной smFISH протоколы и специально оптимизирован для фона штамм дрожжей SK1. Оптимизированные параметры включали номер ячейки, длительность фиксации, скорость центрифугирования и продолжительность, продолжительность переваривания, пищеварение буфер, зонд концентрации и гибридизации буфера. Другие параметры, такие как гибридизации температуры и продолжительность не оптимизированы. В этом разделе мы разделяем несколько нот, которые помогли бы адаптировать этот протокол к любой фон штамм дрожжей и условий роста интереса.

Клеточной стенки многообещающий дрожжей является одной из основных задач против получения изображения высокого качества smFISH в многообещающий дрожжей, потому что клеточной стенки предотвращает проникновение зонда. Неполное переваривание клеточной стенки, zymolyase приводит к неэффективной Гибридизация зондов и высокой изменчивости к ячейке в сигнал. Однако, чрезмерной пищеварение может сделать слишком хрупкие клетки, приводит к значительным ячейка потерь во время стирки шаги и ячеек лопаются во время подготовки слайд для воображения. Таким образом крайне важно оптимизировать продолжительность переваривания. Мы рекомендуем проведение экспериментального smFISH эксперимент, переваривание того же образца для различное количество времени. В нашем случае мы получили лучшее smFISH данных если мы остановились пищеварение, став не преломления ~ 80% клеток. Как правило для же условия роста, различных генетических мутантных штаммов можно переваривается с аналогичные сроки. Однако продолжительность переваривания отличается в сравнении между различными роста условиях и разных стадиях мейоза в многообещающий дрожжей. После того, как определяется время, качество smFISH воспроизводимость. Обратите внимание что мутантных штаммов с синтезу дефектных клеточной стенки и/или состава, пищеварение может быть завершена в менее чем 15 минут использование различных партий zymolyase может также слегка изменить сроки пищеварение.

Оптимальное зонд концентрация необходима для достижения высокое соотношение сигнал шум. Мы разработан и приобрели наши smFISH зонды коммерчески. Хороший зонды (часто 20-РВК) должны иметь процент от 35% до 45%, минимальное расстояние между 2 пар нуклеотидов, между зонды и низкой перекрестной реактивности GC. Мы использовали зонд, веб-дизайнер от производителя для создания списка зондов, и если там было достаточно зонды, чтобы выбрать из, мы будет использовать алгоритм взрыва в базе данных генома Saccharomyces для ликвидации зонды с более чем 17 пар перекрываются с другими геномной регионами. Мы выбрали более фотостабилен Люминесцентную краску (CAL Fluor 590) для набора зонд, который anneals в уникальный регион NDC80luti (CF 590), потому что в этом наборе, количество датчиков, которые удовлетворены все из вышеупомянутых критериев (20 зонды) был ниже, чем Минимальное количество, рекомендованного изготовителем (~ 25 зондов). После воссоздания зонд решения следуя инструкциям производителя, мы сделали 1:10 разрежения Стоковый раствор и хранятся разбавленный раствор в 5 мкл аликвоты на уровне-20 ° c. Каждый Алиготе был использован только один раз. Для оптимизации, надо сделать последовательный разведениях от 1:10 разбавленный раствор и тест какой концентрации дает лучшее соотношение сигнал шум. Мы рекомендуем сделать серию разбавления 1: 250, 1: 500, 1: 1000 и 1: 2000 из исходного сырья. В нашем случае коэффициент разбавления 1: 500 привела к лучшее соотношение сигнал шум в CF 590 и Q 670 зонд наборов.

Оптимальную фиксацию времени также имеет решающее значение для успешного smFISH в многообещающий дрожжей. Мы нашли что ночь фиксации на 4 ° c, а не фиксации при комнатной температуре в течение 20 мин, значительно улучшить последовательность и качество результатов smFISH meiotic образцов. Хотя мы не испытали, как ночь фиксации может повлиять вегетативных проб, фиксация при комнатной температуре работал хорошо для этого условия роста. Таким образом чтобы оптимизировать smFISH протокол для новых штаммов или условий роста, мы рекомендуем, начиная с короткой фиксации времени при комнатной температуре и увеличивая время фиксации, если обнаружена высокая изменчивость сигнала.

По сравнению с другими опубликованных протоколов по3,22,23, наш протокол использует АБС битор РНКазы VRC во время пищеварения и более высокую концентрацию VRC во время гибридизации. Добавление VRC в этих двух шагов улучшить согласованность результатов smFISH, возможно, лучше сохранение молекулы РНК против нуклеиназы активности, который может быть представлен zymolyase смеси (фермент очищается от сырой экстрактов и может содержать РНКазы загрязнители). Таким образом мы рекомендуем использовать количество VRC, как указано в нашем протокола или даже более высокие концентрации VRC для оптимизации.

Значительная часть клетки могут быть потеряны во время стирки шаги в буфер B и формамид мыть буфера. Чтобы уменьшить потери клеток, одно может увеличить скорость центрифугирования. В нашем случае с помощью высокой скорости (21000 х g) гранул наши образцы во время буфера B моет значительно сокращена ячейка потерь. Однако клетки становятся очень хрупкие после zymolyase пищеварение, поэтому не рекомендуется изменять скорость центрифугирования. Вместо этого мы предлагаем использовать трубы низким сцеплением от научных США, которые значительно помочь Пелле клетки во время мойки в буфере мыть формамид. В целом наш протокол последовательно можно создать монослоя клеток достаточно плотная для эффективной визуализации. Как правило, должна принести 7 полей зрения > 130 клеток для количественной оценки.

И наконец важно определить оптимальные параметры для и мероприятий, от анализа изображений. Для обнаружения smFISH пятна, опубликованного анализа программы обычно фильтр изображений raw с использованием гауссовой ядра для удаления фонового сигнала и попросить пользователей, чтобы определить отношение сигнал шум, используемое для каждого набора изображений2,17. К сожалению в настоящее время не существует единого стандарта, в котором определяются соответствующие параметры, и поэтому некоторые эмпирические тестирование этих различных параметров является необходимым. Чтобы задать параметры, необходимые для каждого из этих шагов, необходимо итеративно ввода задать различные наборы параметров и проверить, насколько хорошо результаты, полученные от каждого набора совпадает с ручной подсчет в несколько представительных клеток. Как только один набор параметров найден, он может использоваться для большинства изображений, полученных несмотря на условия различных роста и генетических особенностей.

Кроме того можно проверить, если проекция максимальной интенсивности smFISH изображения может быть выполнена до количественная оценка22. Этот шаг упрощает месте обнаружения алгоритма и значительно сокращает время обработки изображений, хотя за счет некоторые потенциально полезную информацию об отдельных пятен, таких как их субцеллюлярные локализации. В нашем случае количество молекул мРНК, производимые NDC80 ген был достаточно низким, что пятна были хорошо разделенных после этой обработки (не редкость для стенограммы в многообещающий дрожжей3,7). В тех случаях, когда colocalization анализ критических анализ трубопровода необходимо определить местоположение каждого smFISH место в каждом канале, чтобы оценить colocalization. В зависимости от конкретных вопросов спрашивает, другие сведения, например интенсивности каждого пятна могут также должны быть извлечены из конвейера для дальнейшего анализа. Оптимизация ключевых шагов в протоколе и конвейер анализа изображения имеет решающее значение в получении высокое качество данных smFISH изучить вопрос о заинтересованности.

Disclosures

Авторы имеют никакого конфликта интересов раскрыть.

Acknowledgments

Мы благодарим Anne Додсон и Стефани Генрих за советом о том, как оптимизировать smFISH протокол, Ксавье Darzacq для помочь с платформой анализа, Хуан Хайянь для предложения о статистическом анализе. Эта работа была поддержана средств от марта Dimes (5-FY15-99), благотворительные фонды Пью (00027344), Фонд исследований рака Дэймон Раньон (35-15) и Гленн фонд EÜ и NSF выпускник исследовательских стипендий Грант № DGE-1106400 для JC.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BSA, RNase-free (50 mg/mL) Ambion AM2616 Store at -20 °C.
Catalase Sigma C3515 Store at 4 °C for short-term. Vortex before use.
DAPI Sigma D9564 Store at -20 °C after reconstitution in water. Protect from light.
50% Dextran Sulfate Milli Pore S4030 Store at room temperature. Very viscous liquid. Handle with patience.
E. coli tRNA Sigma R4251 Store at -20 °C in aliquots after reconstitution in water.
Ethanol (100%, 200 proof) various Flammable.
37% Formaldehyde Fisher F79-500 Store at room temperature. Toxic. Use and dispose with caution.
Formamide Ambion AM9342 Store at 4 °C. Open after the temperature equilibrates to room temperature in order to prevent oxidation. Toxic. Use and dispose with caution. 
Glucose various Store at 4 °C after dissolving in nuclease-free water.
Glucose oxidase Sigma G2133 Store at -20 °C in aliquots after reconstitution in 50 mM NaOAc, pH 5.
Nuclease-free water Ambion AM9932 Store at room temperature.
Potassium phosphate (monobasic and dibasic) various Store at room temperature.
Probe library, diluted in TE, pH 8.0  Biosearch Technologies Store at -20 °C in aliquots (5 µL) after reconstitution in TE pH 8.0, following the instructions from the manufacturer. Protect from light. 
Sorbitol various Store at room temperature.
20X SSC Ambion AM9763 Store at room temperature.
TE, pH 8.0 Ambion AM9849 Store at room temperature.
1 M Tris, pH 8.0 Ambion AM9856 Store at room temperature.
Trolox Sigma 238813 Store at -20 °C in aliquots.
200 mM Vanadyl ribonucleoside complex (VRC) NEB S1402S Store at -20 °C in aliquots after reconstitution, following the instructions from the manufacturer.
Zymolyase 100T MP Biomedicals 08320932 Store at -20 °C in aliquots after reconstitution in water.
Low-adhesion tubes USA Scientific 1415-2600 Store at room temperature.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280 (5363), 585-590 (1998).
  2. Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
  3. Rahman, S., Zenklusen, D. Single-molecule resolution fluorescent in situ hybridization (smFISH) in the yeast S. cerevisiae. Methods Mol Biol. 1042, 33-46 (2013).
  4. Gaspar, I., Ephrussi, A. Strength in numbers: quantitative single-molecule RNA detection assays. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 4 (2), 135-150 (2015).
  5. Vargas, D. Y., et al. Single-molecule imaging of transcriptionally coupled and uncoupled splicing. Cell. 147 (5), 1054-1065 (2011).
  6. Waks, Z., Klein, A. M., Silver, P. A. Cell-to-cell variability of alternative RNA splicing. Mol Syst Biol. 7, 506 (2011).
  7. Zenklusen, D., Larson, D. R., Singer, R. H. Single-RNA counting reveals alternative modes of gene expression in yeast. Nat Struct Mol Biol. 15 (12), 1263-1271 (2008).
  8. Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells. PLoS Biol. 4 (10), e309 (2006).
  9. Senecal, A., et al. Transcription factors modulate c-Fos transcriptional bursts. Cell Rep. 8 (1), 75-83 (2014).
  10. Levesque, M. J., Ginart, P., Wei, Y., Raj, A. Visualizing SNVs to quantify allele-specific expression in single cells. Nat Methods. 10 (9), 865-867 (2013).
  11. Hansen, C. H., van Oudenaarden, A. Allele-specific detection of single mRNA molecules in situ. Nat Methods. 10 (9), 869-871 (2013).
  12. Ginart, P., et al. Visualizing allele-specific expression in single cells reveals epigenetic mosaicism in an H19 loss-of-imprinting mutant. Genes Dev. 30 (5), 567-578 (2016).
  13. Long, R. M., et al. Mating type switching in yeast controlled by asymmetric localization of ASH1 mRNA. Science. 277 (5324), 383-387 (1997).
  14. Park, H. Y., Trcek, T., Wells, A. L., Chao, J. A., Singer, R. H. An unbiased analysis method to quantify mRNA localization reveals its correlation with cell motility. Cell Rep. 1 (2), 179-184 (2012).
  15. Jourdren, L., Delaveau, T., Marquenet, E., Jacq, C., Garcia, M. CORSEN, a new software dedicated to microscope-based 3D distance measurements: mRNA-mitochondria distance, from single-cell to population analyses. RNA. 16 (7), 1301-1307 (2010).
  16. Chen, J., et al. Kinetochore inactivation by expression of a repressive mRNA. eLife. 6, e27417 (2017).
  17. Mueller, F., et al. FISH-quant: automatic counting of transcripts in 3D FISH images. Nat Methods. 10 (4), 277-278 (2013).
  18. Brar, G. A., et al. High-resolution view of the yeast meiotic program revealed by ribosome profiling. Science. 335 (6068), 552-557 (2012).
  19. Carlile, T. M., Amon, A. Meiosis I is established through division-specific translational control of a cyclin. Cell. 133 (2), 280-291 (2008).
  20. Benjamin, K. R., Zhang, C., Shokat, K. M., Herskowitz, I. Control of landmark events in meiosis by the CDK Cdc28 and the meiosis-specific kinase Ime2. Genes Dev. 17 (12), 1524-1539 (2003).
  21. Dodson, A. E., Rine, J. Heritable capture of heterochromatin dynamics in Saccharomyces cerevisiae. eLife. 4, e05007 (2015).
  22. Trcek, T., et al. Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast. Nat Protoc. 7 (2), 408-419 (2012).
  23. Youk, H., Raj, A., van Oudenaarden, A. Imaging single mRNA molecules in yeast. Methods Enzymol. 470, 429-446 (2010).

Tags

Генетика выпуск 135 одной молекулы флуоресценции в situ гибридизация (smFISH) многообещающий дрожжи митоз мейоз РНК анализ одной ячейки транскрипция LUTI
Одной молекулы флуоресценции <em>In Situ</em> гибридизация (smFISH) анализ многообещающий вегетативного роста дрожжей и мейоз
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, J., McSwiggen, D., Ünal,… More

Chen, J., McSwiggen, D., Ünal, E. Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis. J. Vis. Exp. (135), e57774, doi:10.3791/57774 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter