Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

एकल अणु प्रतिदीप्ति में सीटू संकरण (smFISH) विश्लेषण में नवोदित खमीर वनस्पति विकास और अर्धसूत्रीविभाजन

Published: May 25, 2018 doi: 10.3791/57774
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Molecular and Cell Biology, Barker Hall, University of California, Berkeley, 2Department of Molecular and Cell Biology, Li Ka Shing Center, University of California, Berkeley

Summary

सीटू संकरण प्रोटोकॉल में यह एकल अणु प्रतिदीप्ति वनस्पति विकास और अर्धसूत्रीविभाजन के दौरान नवोदित खमीर में आरएनए अणुओं की संख्या को यों तो अनुकूलित है ।

Abstract

एकल अणु प्रतिदीप्ति में सीटू संकरण (smFISH) एक शक्तिशाली तकनीक का पता लगाने और व्यक्तिगत आरएनए अणुओं की गणना करने की क्षमता के कारण एकल कोशिकाओं में जीन अभिव्यक्ति का अध्ययन करने के लिए है. गहन अनुक्रमण आधारित तरीकों के पूरक, smFISH प्रतिलिपि में सेल-टू-सेल भिन्नता के बारे में जानकारी प्रदान करता है और एक दिया आरएनए के उपसेलुलर स्थानीयकरण. हाल ही में, हम smFISH का इस्तेमाल किया है नवोदित खमीर में अर्धसूत्रीविभाजन के दौरान जीन NDC80 की अभिव्यक्ति का अध्ययन, जिसमें दो प्रतिलिपि isoforms मौजूद है और कम प्रतिलिपि isoform अपने पूरे लंबे isoform के साथ साझा अनुक्रम है । के लिए आत्मविश्वास से प्रत्येक प्रतिलिपि isoform की पहचान, हम smFISH प्रोटोकॉल ज्ञात अनुकूलित और उच्च संगति और smFISH डेटा की गुणवत्ता के लिए उभरते खमीर अर्धसूत्रीविभाजन के दौरान अधिग्रहीत नमूनों के लिए प्राप्त की । यहां, हम इस अनुकूलित प्रोटोकॉल का वर्णन, मानदंड है कि हम smFISH डेटा की उच्च गुणवत्ता प्राप्त की है कि क्या यह निर्धारित करने का उपयोग करें, और अंय खमीर उपभेदों और विकास की स्थिति में इस प्रोटोकॉल को लागू करने के लिए कुछ सुझाव ।

Introduction

जीन अभिव्यक्ति के गतिशील विनियमन एक जीव के विकास ड्राइव, के रूप में अच्छी तरह से पर्यावरण तनाव, संक्रमण के लिए अपनी प्रतिक्रिया के रूप में, और चयापचय में परिवर्तन । transcriptional विनियमन पर ध्यान केंद्रित अध्ययनों कि आरएनए बहुतायत को मापने प्रौद्योगिकियों पर भरोसा करते हैं । ऐसा ही एक तरीका है, सीटू संकरण (smFISH) में एकल अणु प्रतिदीप्ति, एकल कोशिकाओं1,2में व्यक्तिगत आरएनए अणुओं का पता लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है । इस विधि से कोशिका के लिए कोशिका परिवर्तनशीलता जीन अभिव्यक्ति और intracellular आरएनए स्थानीयकरण के निर्धारण में माप की अनुमति देता है.

सबसे अधिक इस्तेमाल किया smFISH तकनीक में, एक व्यक्ति आरएनए अणु का पता लगाने के कई छोटे डीएनए जांच की आवश्यकता है (अक्सर ~ ४८ २०-मेर जांच) कि लक्ष्य आरएनए के पूरक हैं और एक ही फ्लोरोसेंट डाई करने के लिए संयुग्मित हैं. कमजोर संकेत में एक एकल फ्लोरोसेंट जांच के परिणाम के बंधन, लेकिन सभी जांच के पहनावा से संकेत मजबूत है । यह सुविधा बहुत सिग्नल से शोर अनुपात में सुधार क्योंकि भले ही एक जांच बंद लक्ष्य बंधन प्रदर्शन कर सकते हैं, ऐसे संकेत लक्ष्य आरएनए अणु की तुलना में बहुत कमजोर होने की उम्मीद है3. पता लगाने की त्रुटि के भीतर, आरएनए अणुओं की संख्या गिना जा सकता है और विभिंन विकास की स्थिति में और विभिंन म्यूटेंट के बीच की तुलना में ।

अपनी पहली विकास के बाद से, smFISH4, जैसे प्रतिलेखन बढ़ाव1,2, ब्याह5,6, transcriptional फट7 के रूप में जीन अभिव्यक्ति के विभिन्न पहलुओं का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया गया है , 8 , 9, intracellular allelic अभिव्यक्ति10,11,12, और आरएनए स्थानीयकरण13,14,15. हाल ही में, हम इस पद्धति का इस्तेमाल किया है एक ही जीन के दो प्रतिलिपि isoforms की अभिव्यक्ति का अध्ययन, जिसमें लघु प्रतिलिपि isoform (NDC80ओआरएफ) अपने पूरे लंबे isoform के साथ साझा अनुक्रम है (NDC80लुटि )16. अद्वितीय रूप से दो mRNA isoforms की पहचान करने के लिए, हम दो जांच सेट का इस्तेमाल किया: एक सेट NDC80लुटिके अद्वितीय अनुक्रम के लिए विशिष्ट है, और अन्य सेट, एक और फ्लोरोसेंट डाई करने के लिए संयुग्मित, दो isoforms के आम क्षेत्र के लिए बाइंड कर देता. NDC80लुटि आरएनए दोनों फ्लोरोसेंट संकेतों के साथ एक colocalized स्थान के रूप में पहचान की है, जबकि NDC80ओआरएफ आरएनए एक है कि आम जांच सेट से केवल संकेत होता है । के बाद से NDC80ओआरएफ टेप की संख्या एक "घटाव" विधि द्वारा गणना की है, जांच संकरण की उच्च दक्षता और एक उच्च संकेत करने वाली शोर अनुपात के लिए आत्मविश्वास से smFISH धब्बे की पहचान और त्रुटि को कम करने के लिए आवश्यक हैं प्रोपेगेशन.

यह कागज नवोदित खमीर Saccharomyces cerevisiaeमें smFISH प्रदर्शन के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल का वर्णन । इस प्रोटोकॉल में, कक्ष संख्या, निर्धारण समय, पाचन समय, पाचन बफर, जांच एकाग्रता, और smFISH प्रयोगों के लिए इस्तेमाल संकरण बफर एस cerevisiae के दौर से गुजर वनस्पति के SK1 तनाव पृष्ठभूमि के लिए अनुकूलित किया गया वृद्धि या अर्धसूत्रीविभाजन । हालांकि, हम भी इस पांडुलिपि में ध्यान दें: (1) विधि छवि अधिग्रहण के बाद smFISH डेटा की गुणवत्ता की जांच करने के लिए, और (2) प्रोटोकॉल है कि अलग तनाव पृष्ठभूमि और विकास की स्थिति के लिए अतिरिक्त अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती में कदम ।

Protocol

नोट: इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए गए सभी बफ़र्स और मीडिया तालिका 1में सूचीबद्ध हैं । रिएजेंट के लिए विक्रेता जानकारी सामग्री तालिकामें सूचीबद्ध है ।

दिन 1/1-2:

नोट: वनस्पति संस्कृति के लिए, एक पसंदीदा माध्यम में ०.६ के लिए ०.४ के एक आयुध डिपो६०० के लिए कोशिकाओं को विकसित । meiotic संस्कृति के लिए, अर्धसूत्रीविभाजन से गुजरना करने के लिए कोशिकाओं प्रेरित एक पसंदीदा विधि का उपयोग (आमतौर पर संवर्धन में एक आयुध डिपो६०० १.८५) ।

1. नमूना निर्धारण और पाचन

  1. 3% formaldehyde में कोशिकाओं के ~ ३.५ आयुध डिपो६०० की कुल फिक्स ।
    1. वनस्पति संस्कृति के लिए, 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूबों में ३७% formaldehyde के ४८० µ l के लिए ५.५२ मिलीलीटर संस्कृति जोड़ें ।
    2. meiotic संस्कृति के लिए, 2-एमएल microcentrifuge ट्यूबों में ३७% formaldehyde के १६० µ l को संस्कृति के १८४० µ l को जोड़ें । पलटना ~ 5 बार मिश्रण करने के लिए ।
      सावधानी: Formaldehyde विषाक्त है । संस्थागत नियमों के अनुसार संभालना और निपटाना.
  2. 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर एक रोलर ड्रम पर ट्यूबों प्लेस । meiotic नमूनों के लिए, 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर फिक्सिंग के बाद, 4 ˚ सी पर रात भर फिक्सिंग जारी है, घूर्णन ।
    नोट: रातोंरात निर्धारण meiotic नमूनों के लिए प्राप्त smFISH डेटा की reproducibility और गुणवत्ता को बढ़ाता है. निर्धारण समय अनुकूलित किया जाना चाहिए ।
  3. जबकि नमूनों फिक्सिंग कर रहे हैं, गल २०० mM Vanadyl Ribonucleoside परिसरों (VRC) पर ६५ ˚ C के लिए ंयूनतम 10 मिनट ।
  4. एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में पाचन मास्टर मिश्रण तैयार करें: 1 नमूना के लिए, बफर बी के ४२५ µ एल २०० mM VRC के ४० µ l के साथ मिश्रण (६५ ˚ C करने के लिए गर्म); 5 नमूनों के लिए, २०० mM VRC के २०० µ l के साथ बफर बी के २१२५ µ l को मिक्स करें (६५ ˚ सी तक) । भंवर ~ 5 VRC मास्टर मिश्रण है, जो VRC अतिरिक्त के बाद प्रकाश भूरा हरा दिखाई देगा करने के लिए जोड़ने से पहले पूरी तरह से स्थगित करने के लिए एस ।
    नोट: पाचन के दौरान VRC के अलावा smFISH परिणामों की निरंतरता में सुधार, संभावित zymolyase मिश्रण है, जो कच्चे तेल निकालने से शुद्ध है द्वारा शुरू की contaminant nuclease बाधा से । इस कदम पर आवश्यक VRC की मात्रा अनुकूलित किया जाना चाहिए ।
  5. वनस्पति नमूनों के लिए, 3 मिनट के लिए ~ १०५७ x g पर ट्यूबों केंद्रापसारक । meiotic नमूनों के लिए (रातोंरात निर्धारण के बाद), १.५ मिनट के लिए २१,००० x g पर केंद्रापसारक या formaldehyde अपशिष्ट को supernatant महाप्राण ।
    नोट: सभी केंद्रापसारक कदम कमरे के तापमान पर प्रदर्शन कर रहे हैं ।
  6. ठंड बफर बी के १.५ मिलीलीटर में कोशिकाओं reसस्पेंड ऊपर और नीचे pipetting द्वारा या ट्यूबों पलटने और मिश्रण करने के लिए फ़्लिक द्वारा । पुनर्निलंबन के बाद वनस्पति नमूनों को 2-एमएल ट्यूबों में स्थानांतरित करें ।
  7. १.५ मिनट के लिए २१,००० x g पर केंद्रापसारक । निर्वात आकांक्षा द्वारा तरल के थोक या pipetting द्वारा निकालें, पीछे छोड़ने ~ १०० µ l
  8. ठंड बफर बी के १.५ मिलीलीटर में कोशिकाओं reसस्पेंड
  9. १.५ मिनट के लिए २१,००० x g पर केंद्रापसारक । निर्वात आकांक्षा द्वारा तरल के थोक या pipetting द्वारा निकालें, पीछे छोड़ने ~ १०० µ l
  10. ठंड बफर के १.५ मिलीलीटर में कोशिकाओं को पुनर्निलंबित B. केंद्रापसारक के लिए २१,००० x g पर १.५ min. महाप्राण तरल पूरी तरह से निर्वात द्वारा या pipetting द्वारा ।
  11. reसस्पैंड कोशिकाओं पाचन मास्टर मिश्रण के ४२५ µ l में, और संक्षेप में reसस्पैंड करने के लिए भंवर । प्रत्येक ट्यूब के लिए 100T 10 मिलीग्राम/एमएल zymolyase के 5 µ एल जोड़ें ।
    नोट: भंवर ट्यूबों को जोड़ने से पहले हर बार zymolyase । प्रत्येक ट्यूब के लिए zymolyase जोड़ें व्यक्तिगत रूप से, बजाय मास्टर मिश्रण करने के लिए जोड़ने की । दोनों कदम ट्यूबों के बीच पाचन स्थिरता बनाए रखने में मदद क्योंकि zymolyase तेज़ी से होता है ।
  12. भंवर 2-3 एस मिश्रण करने के लिए । एक रोलर ड्रम पर ट्यूबों प्लेस, और 15-30 मिनट के लिए 30 ˚ सी में पचा । वनस्पति कोशिकाओं और जल्दी meiotic चरणों के लिए, यह आमतौर पर लेता है ~ 15 मिनट, और meiotic दौर और meiotic विभाजन के लिए, यह आमतौर पर लेता है ~ 30 मिनट ।
    नोट: 15 मिनट के बाद हर 5 मिनट माइक्रोस्कोप पर जांच करें, और जब ~ कोशिकाओं के ८०% गैर-अपवर्तन दिखाई देते हैं पाचन बंद करो । पर इस बिंदु से, कोशिकाओं को बहुत नाजुक हैं । धीरे कोशिकाओं को संभाल और निर्वात आकांक्षा या भंवर का उपयोग करने से बचें.
  13. केंद्रापसारक पर ट्यूबों ~ ३७६ एक्स जी के लिए 3 min. pipetting द्वारा पूरी तरह से तरल निकालें ।
  14. धीरे pipetting ऊपर और नीचे 1-2 बार मिश्रण करने के लिए बफर बी के 1 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को पुनर्निलंबित ।
  15. केंद्रापसारक पर ट्यूबों ~ ३७६ एक्स जी 3 मिनट के लिए pipetting द्वारा बफर बी तरल निकालें । धीरे ७०% इथेनॉल के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं को पुनः निलंबित (RNase के साथ पतला-मुक्त पानी) ।
  16. 3.5-4 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर मशीन ।

2. संकरण

  1. कमरे के तापमान (५०-एमएल aliquot के लिए formamide लाओ, यह जल स्नान में ~ 30 मिनट लेता है) ।
    नोट: बोतल formamide के ऑक्सीकरण से बचने के लिए कमरे के तापमान तक पहुंच जाता है जब तक formamide बोतल खुला नहीं है ।
    सावधानी: Formamide विषाक्त है । संस्थागत नियमों के अनुसार संभालना और निपटाना.
  2. 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में 10% formamide वॉश बफर तैयार करें ।
  3. केंद्रापसारक पर ट्यूबों ~ ३७६ एक्स जी के लिए 3 min. pipetting द्वारा ७०% इथेनॉल के ५०० µ एल निकालें । धीरे प्लास्टिक ऊपर और नीचे शेष कोशिकाओं reसस्पेंड करने के लिए, और फिर कम आसंजन ट्यूबों के लिए कोशिकाओं को हस्तांतरण ।
    नोट: कम आसंजन ट्यूब का उपयोग बहुत बाद में बहाकर के दौरान सेल नुकसान कम कर देता है ।
  4. केंद्रापसारक ट्यूबों फिर से पर ~ ३७६ एक्स जी 3 मिनट के लिए pipetting द्वारा सभी इथेनॉल निकालें ।
  5. 10% formamide वॉश बफ़र की 1 मिलीलीटर जोड़ें, और धीरे प्लास्टिक ऊपर और नीचे 2-3 बार कोशिकाओं को पुनर्स्थगित करने के लिए ।
  6. संकरण समाधान तैयार करते समय कोशिकाओं को ~ 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर बैठने की अनुमति दें । 1 नमूना के लिए, संकरण बफर के ५० µ एल मिश्रण (कमरे temp.), २०० मिमी VRC के 5 µ एल (६५ ˚ सी करने के लिए गर्म), और प्रत्येक जांच के 1 µ एल (२०० एनएम अंतिम). 5 नमूने के लिए, संकरण बफर के २५० µ एल मिश्रण (कक्ष temp.), 25 µ एल के २०० मिमी VRC (गर्म करने के लिए ६५ ˚ सी), और प्रत्येक जांच के 5 µ एल (२०० एनएम अंतिम).
    1. गल संकरण बफर (पर जमे हुए-20 ˚ सी) कमरे के तापमान के लिए ट्यूब खोलने से पहले formamide ऑक्सीकरण रोकने के लिए ।
    2. जांच को जोड़ने से पहले 5-10 एस के लिए २०० mM VRC, भंवर जोड़ने के बाद, जो डिजाइन और खरीदे गए है वाणिज्यिक, और निर्माता के निर्देशों के अनुसार पुनर्गठन ।
    3. यदि दो जांचें सह-तैयार की जाती हैं, तो जांच #1 के 1:10 कमजोर पड़ने के 1 µ l को जोड़ सकते हैं, साथ ही जांच #2 के 1:10 कमजोर पड़ने के 1 µ एल, या तो जांच के लिए ~ 1:500 के एक अंतिम कमजोर बनाने के लिए । सबसे अच्छा संकेत करने वाली शोर अनुपात के लिए आवश्यक एकाग्रता (विवरण के लिए चर्चा देखें) अनुकूलित करने की जरूरत है ।
  7. 3 मिनट के लिए ~ ३७६ x g पर नमूने के केंद्रापसारक । pipetting द्वारा खतरनाक कचरे में supernatant निकालें ।
  8. प्रत्येक ट्यूब के लिए संकरण समाधान के कम से ५० µ एल जोड़ें । मिश्रण करने के लिए ट्यूबों झटका ।
  9. 30 ˚ सी पर एक रोलर ड्रम पर गर्मी कम 16 अंधेरे में घंटे के लिए ।

day 2/

3. वॉशिंग और इमेजिंग

  1. कमरे के तापमान के लिए formamide लाओ ।
  2. 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में 10% formamide वॉश बफर (FWB) तैयार करें ।
  3. रोलर ड्रम से ट्यूबों निकालें और उन्हें प्रकाश से बचाने के लिए एक पन्नी-कवर बॉक्स में जगह है ।
  4. 3 मिनट के लिए ~ ३७६ x g पर नमूने के केंद्रापसारक । pipetting द्वारा खतरनाक कचरे में supernatant निकालें ।
  5. 10% FWB के 1 मिलीलीटर में धीरे से reसस्पैंड ऊपर और नीचे 2-3 बार pipetting ।
  6. 30 मिनट के लिए 30 ˚ सी में मशीन (घूर्णन नहीं) पन्नी में कवर बॉक्स ।
  7. पर नमूने के लिए ~ ३७६ x g 3 min. pipetting द्वारा खतरनाक अपशिष्ट को supernatant निकालें, और छोड़ ~ ५० µ l
  8. इस बीच, DAPI/FWB को 15 मिलीलीटर वाली शंकु ट्यूब में तैयार करें: 1 नमूना के लिए, १००० µ l को 10% formamide वाश बफ़र के साथ 1 µ l की 5 मिलीग्राम/एमएल DAPI के साथ मिलाएं । 10 नमूनों के लिए 10 मिलीलीटर 10% formamide वॉश बफर के साथ 10 µ एल के 5 मिलीग्राम/एमएल DAPI मिलाएं । DAPI/FWB के 1 मिलीलीटर में धीरे pipetting ऊपर और नीचे 2-3 बार reसस्पैंड ।
  9. 30 मिनट के लिए 30 ˚ सी में मशीन (घूर्णन नहीं) पन्नी में कवर बॉक्स ।
  10. बर्फ पर गल एंटी ब्लीच रिएजेंट ।
  11. पर नमूने केंद्रापसारक ~ ३७६ एक्स जी 3 मिनट के लिए supernatant पूरी तरह से pipetting द्वारा निकालें । यदि आवश्यक हो, फिर से supernatant के सभी हटाने के लिए केंद्रापसारक ।
  12. नमूने है कि तुरंत imaged नहीं कर रहे है के लिए, GLOX बफर के ५० µ एल में गोली reसस्पेंड एंजाइमों के बिना । प्लास्टिक ऊपर और नीचे 3-4 बार मिश्रण करने के लिए ।
    1. 4 ˚ सी पर पन्नी-कवर बॉक्स में सभी unimaged नमूनों रखें जब तक छवि के लिए तैयार है । जब छवि के लिए तैयार है, पर नमूने केंद्रापसारक ~ ३७६ एक्स जी 2 मिनट के लिए और pipetting द्वारा supernatant पूरी तरह से हटा दें । नीचे के रूप में एंजाइमों के साथ GLOX में reसस्पेंड ।
  13. नमूनों के लिए तुरंत imaged जा रहा है, एंजाइमों के साथ GLOX बफर के 15-20 µ एल जोड़ें । धीरे प्लास्टिक ऊपर और नीचे मिश्रण करने के लिए ।
    नोट: मात्रा जोड़ा सेल गोली के आकार के आधार पर अलग कर सकते हैं । हम एंजाइमों के साथ GLOX बफर के 15 µ एल में गोली reसस्पैंड और माइक्रोस्कोप पर सेल घनत्व की जांच की सलाह देते हैं । यदि कोशिकाओं को भी घने है (एक दूसरे के ऊपर का झुरमुट कोशिकाओं), एंजाइमों के साथ अतिरिक्त GLOX बफर जोड़ें । कोशिकाओं को भी विरल हैं, तो नमूना और निकालें ~ 5 µ l बफ़र की ।
  14. प्लास्टिक एक coverslip (18 मिमी x 18 मिमी, नंबर 1) पर 5 µ एल, और एक स्लाइड पर coverslip डाल दिया ।
  15. स्लाइड के शीर्ष पर एक प्रयोगशाला पोंछ रखें जहां coverslip रखा गया है । धीरे प्रयोगशाला पोंछ पर प्रेस स्लाइड सेट करने के लिए (तरल coverslip के सभी चार किनारों से बंद आ रहा है देखना चाहिए) ।
  16. एक एल्यूमीनियम पंनी द्वारा कवर बॉक्स में माइक्रोस्कोप कमरे में स्लाइड स्थानांतरण ।
  17. उच्च आवर्धन (60-100X) और उच्च संख्यात्मक एपर्चर के साथ एक व्यापक क्षेत्र प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग कर छवि ।
    नोट: smFISH जांच द्वारा उत्सर्जित फोटॉनों के अधिक से अधिक संख्या इकट्ठा करने के लिए, फोकल माइक्रोस्कोप की सिफारिश नहीं कर रहे हैं, के रूप में वे काफी प्रकाश की मात्रा को इकट्ठा किया जा करने के लिए सीमा. यहां, डेटा एक 100X, १.४ ना उद्देश्य से सुसज्जित एक खुर्दबीन पर एकत्र किया गया, फिल्टर CY5 (EX632/22, EM679/34) १.३ एस, १००% टी पर images का उपयोग कर; TRITC (EX542/27, EM597/45), १.३ s, १००% T; और DAPI (EX390/18, EM435/48), 0.05-0.1 s, 32%-५०% टी । एक उज्जवल क्षेत्र संदर्भ छवि भी प्राप्त किया जाना चाहिए । पूरी तरह से ऊपर की ओर देखने के क्षेत्र के ध्यान के नीचे से 0.1-0.2 µm के एक कदम आकार के साथ 15-25 स्लाइस प्राप्त, यह सुनिश्चित करने के लिए कि आरएनए के सभी स्थानों के लिए जवाबदेह हैं ।

4. छवि विश्लेषण

  1. smFISH डेटा को प्रकाशित smFISH विश्लेषण उपकरणों जैसे मछली-क्वांट17 और StarSearch2, या कस्टम द्वारा किए गए प्रोग्रांस के साथ, प्रयोग की सटीक आवश्यकताओं के आधार पर विश्लेषण करें ।
    नोट: एक अच्छा विश्लेषण पाइपलाइन उपयोगकर्ताओं को पृष्ठभूमि से सही आरएनए स्पॉट अलग करने के लिए एक सीमा निर्धारित करने की अनुमति चाहिए, और आउटपुट आँकड़े जैसे एक्स, वाई, और जेड (वैकल्पिक) निर्देशांक और प्रत्येक स्थान की तीव्रता, प्रत्येक कोशिका में धब्बों की संख्या , और संभवतः गलत पता लगाने के बाहर फिल्टर करने के लिए एक तरीका के रूप में फिटिंग मापदंडों ।

Representative Results

मूल्यांकन करने के लिए कितनी अच्छी तरह smFISH प्रोटोकॉल काम किया ( चित्रा 1में उल्लिखित), हम ५४ जांच का एक सेट है कि टाइल NDC80 जीन (चित्रा 2a, शीर्ष) के खुले पढ़ने के फ्रेम बनाया है । जांच सबसे 5 ' अंत में स्थित जांच 1 के रूप में जाना जाता है; अगले एक, जांच 2; और तीसरा एक, जांच 3, आदि। 27 जांच एक विषम संख्या सौंपा (जांच 1, 3, 5...) काल Fluor ५९० (CF590) फ्लोरोसेंट डाई करने के लिए सभी संयुग्मित हैं; और 27 जांच एक भी नंबर सौंपा (जांच 2, 4, 6...), कैसर ६७० (Q670) फ्लोरोसेंट डाई को संयुग्मित । इसलिए, इन अदल-बदल जांच सेट अक्सर "विषम/सम" जांच के रूप में संदर्भित किए जाते हैं । संकरण पर, दोनों जांच सेट एक ही प्रतिलिपि लेबल चाहिए ।

स्पॉट का पता लगाने के बाद, हम smFISH डेटा सेट की गुणवत्ता ंयायाधीश के लिए कुछ माप का इस्तेमाल किया । पहले एक डिग्री और colocalization की गुणवत्ता के लिए अजीब/भी जांच की थी । हमारे मामले में, सभी smFISH स्पॉट colocalized (चित्र2a और 2 बी) के ८८% से अधिक के साथ ९५% एक दूसरे (चित्रा 2c, युग्मित), जो किसी भी रंगीन और पता लगाने के लिए अपेक्षित मूल्य के भीतर है के भीतर बनती स्पॉट के साथ दो फ्लोरोसेंट चैनल के बीच वाकया । तुलना करके, ख़राब धब्बे के 10% से भी कम 2 पिक्सल की एक निकटतम पड़ोसी दूरी थी, दिखा रहा है कि एक स्पॉट जोड़ी की पहचान की संभावना कम है (चित्र 2c) । ख़राब धब्बे के 12% समान रूप से दो चैनलों के बीच विभाजित थे (चित्रा 2 बी, केवल Q670 के साथ CF590-केवल) की तुलना; और इस प्रकार, हम निष्कर्ष निकाला है कि इस २.४ केबी जीन के लिए शूंय से ४५ के बीच अभिव्यक्ति की एक सीमा के साथ प्रति सेल, ~ आरएनए अणुओं के ९४% सही प्रत्येक फ्लोरोसेंट चैनल में पाया गया । यदि smFISH प्रोटोकॉल इष्टतम थे, एक (1) दो फ्लोरोसेंट संकेतों (गैर colocalized) के केवल एक के साथ smFISH धब्बे का एक बड़ा अंश का पालन करेंगे, और/या (2) एक बहुत कम संकेत के साथ कोशिकाओं को शोर अनुपात या बिल्कुल भी कोई संकेत नहीं ।

हम अगले अगर smFISH संकेत का पता लगाने के प्रति सेल आरएनए अणुओं की कुल संख्या के संबंध में पक्षपाती था पूछा । एक जनसंख्या में, प्रत्येक कोशिका में एक विशेष आरएनए की कुल संख्या एक वितरण में निहित है, कुछ कोशिकाओं के साथ दूसरों की तुलना में अधिक आरएनए अणुओं बंदरगाह. एक अच्छा smFISH प्रोटोकॉल मजबूती से आरएनए का पता लगाने चाहिए चाहे एक उच्च संख्या या आरएनए अणुओं की कम संख्या प्रत्येक कोशिका में मौजूद है । इस परीक्षण के लिए, प्रत्येक कोशिका के लिए, हम colocalized संकेतों और दो फ्लोरोसेंट संकेतों में से केवल एक के साथ अंश के साथ smFISH धब्बे के अंश की गणना । कक्ष प्रति कुल स्पॉट की एक ही संख्या थी कि कोशिकाओं को समूहीकृत करने के बाद, हम एक दिए गए समूह में colocalized (युग्मित) या गैर colocalized (केवल CF590 या केवल Q670) स्थानों के औसत अंश की गणना, और की कुल संख्या के एक समारोह के रूप में इस औसत ग्राफी प्रति सेल स्पॉट (चित्र 3) । स्थानों की प्रत्येक श्रेणी के लिए, अंश प्रति कक्ष की कुल संख्या की संपूर्ण श्रेणी में समान थे । उदाहरण के लिए, सेल प्रति 20 फ्लोरोसेंट धब्बे की कुल के साथ उन बनाम की कुल के साथ कोशिकाओं की तुलना 30 स्थानों, colocalized स्पॉट के औसत अंश समान थे । इस परिणाम का सुझाव दिया है कि हमारे प्रोटोकॉल एक सेल में आरएनए अणुओं की एक श्रृंखला का पता लगाने सकता है (अप करने के लिए सेल प्रति कम से ~ ४० अणुओं). यदि प्रोटोकॉल बेहतर काम किया, एक एक पूर्वाग्रह का पालन हो सकता है । उदाहरण के लिए, दो फ्लोरोसेंट संकेतों में से केवल एक के साथ धब्बे के अंश बढ़ सकता है प्रति सेल धब्बों की कुल संख्या के रूप में वृद्धि हुई है ।

इस अनुकूलित प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हम NDC80 जीन है, जो एक kinetochore प्रोटीन encodes की अभिव्यक्ति की जांच की, विभिंन विकास की स्थिति में । NDC80 जीन दो mRNA isoforms व्यक्त: लंबी undecoded प्रतिलिपि isoform, NDC80लुटि, एक ~ ४०० आधार छोटे NDC80ओआरएफ isoform की तुलना में 5 ' अंत में बेस जोड़े विस्तार है, लेकिन दोनों टेप हिस्सा NDC80 जीन की कोडिंग क्षेत्र ( चित्र 4aमें योजनाबद्ध देखें) । हम जांच के दो सेट डिजाइन: CF ५९० सेट NDC80लुटिके अद्वितीय 5 क्षेत्र के लिए बाइंड कर देता है; और Q ६७० सेट NDC80लुटि और NDC80ओआरएफके सामांय क्षेत्र में बाइंड कर देता है । NDC80लुटि टेप smFISH स्थानों जहां दोनों जांच से संकेत colocalized सेट के रूप में पता लगाया गया है, जबकि NDC80ओआरएफ टेप केवल क्यू ६७० से संकेत के साथ उन थे । NDC80लुटिके अनूठे सेगमेंट के आकार के कारण, हम इस क्षेत्र के साथ 20 oligonucleotide जांचों को केवल टाइल कर सकते हैं, जो अनुशंसित 30 से ४८ जांचों से कम है । इस प्रकार, हम पहले निर्धारित अगर इस जांच सेट मजबूती से हमारे अनुकूलित प्रोटोकॉल में आरएनए का पता लगा सकता है । या तो फ्लोरोसेंट चैनल के लिए, हम संकेत के लिए शोर अनुपात (SNR, एक स्थान की तीव्रता के सापेक्ष एक स्थान के आसपास के पिक्सेल के विचरण के रूप में परिभाषित) संकेत के खिलाफ प्रत्येक smFISH स्थान के लिए पता लगाया, और सभी स्थानों के लिए एक scatterplot उत्पंन दृश्य के पूरे क्षेत्र में पहचान (चित्र 4Bमें चित्रा 4a और भूखंडों में उदाहरण छवियां) । दो अलग आबादी स्पष्ट रूप से दोनों के लिए पहचान की गई क्यू ६७० और CF ५९० जांच सेट (अनुकूलित, चित्रा 4B), सुझाव है कि सच smFISH स्पॉट (ग्रे क्षेत्र के अंदर) पृष्ठभूमि संकेत से अलग किया जा सकता है. ध्यान दें कि उपइष्टतम स्थिति में, ऐसी जुदाई कम स्पष्ट था (इष्टतम, चित्रा 4B) ।

हम इन दो जांच सेट का इस्तेमाल किया वनस्पति विकास और अर्धसूत्रीविभाजन के दौरान NDC80लुटि और NDC80ओआरएफकी अभिव्यक्ति का अध्ययन । वनस्पति कोशिकाओं में, Q ६७० जांच सेट से मजबूत संकेत पाया गया था, लेकिन CF ५९० जांच सेट से नहीं (चित्र 5, वनस्पति), उत्तरी सोख्ता द्वारा अवलोकन के साथ सहमत है कि केवल लघु isoform वनस्पति विकास के दौरान व्यक्त किया गया था16 . इस परिणाम भी सुझाव दिया कि CF ५९० जांच सेट विशिष्ट है, हमारे अनुकूलित smFISH प्रोटोकॉल में कम पृष्ठभूमि उपज । इसके विपरीत, दोनों जांच सेट से मजबूत संकेत meiotic दौर में पाया गया था, और स्पॉट के बहुमत colocalized संकेत था (चित्रा 5 ए, meiotic दौर) । उत्तरी दाग विश्लेषण के साथ साथ (चित्रा 5B), इस निरीक्षण की पुष्टि की है कि लंबे isoform NDC80लुटि विशेष रूप से अर्धसूत्रीविभाजन में व्यक्त किया गया था । mRNAs के इन दो प्रकार के कोशिका द्रव्य (DAPI क्षेत्र के बाहर) में पाया गया, सुझाव है कि दोनों नाभिक से निर्यात किया गया, ribosome profiling डेटा के अनुरूप 18 ।

यह निर्धारित करने के लिए कि पर्याप्त डेटा हमारे डेटा सेट करने के लिए आंतरिक जैविक भिन्नता के लिए सही खाते में एकत्र किया गया था, हम प्रत्येक कोशिका के आँकड़ों का उपयोग कर बूटस्ट्रैप विश्लेषण प्रदर्शन किया, जिसमें शामिल (1) सेल प्रति colocalized धब्बे के अंश और (2) दो फ्लोरोसेंट संकेतों में से एक के साथ धब्बे के अंश (CF ५९० केवल और क्यू ६७० केवल) । इस विश्लेषण में, प्रोग्राम रैंडम रूप से एक कक्ष ४३७ quantified कक्षों से ५०० पुनरावृत्तियों के लिए चयनित है । अगले, मतलब और इन ५०० चयनित कोशिकाओं के साथ जुड़े संबंधित आंकड़ों के विचरण की गणना की गई । यह प्रक्रिया तब रैंडम रूप से सभी कक्षों से, प्रतिस्थापन के बिना दो कक्षों का चयन करने के लिए दोहराया गया था; और फिर बेतरतीब ढंग से तीन कोशिकाओं का चयन करने के लिए, आदि कुल डेटा सेट आकार का एक आधा तक पहुंच गया था । डेटा सेट में विचरण ~ ४० कोशिकाओं के बाद पठारी, सुझाव है कि इस बिंदु के बाद मतलब में भिन्नता के सबसे डेटा के लिए आंतरिक है बजाय नमूने के एक विरूपण साक्ष्य (चित्रा 6, इनसेट). यह प्रभाव अधिक स्पष्ट हो गया जब हम नमूना नमूना मतलब द्वारा विभाजित विचरण ग्राफी, प्रत्येक पुनरावृत्ति चक्र में नमूना कोशिकाओं की संख्या के एक समारोह के रूप में (चित्रा 6) । आंकड़ों के साथ दिखाया गया है, विचरण में परिवर्तन ~ ६० कोशिकाओं के बाद कम छोटा हो गया । किसी smFISH प्रयोग में quantified कक्षों की संख्या स्थिर माध्य और प्रसरण के पठार को प्राप्त करने के लिए आवश्यक कक्षों की ंयूनतम संख्या से अधिक होनी चाहिए । हमारे मामले में, हम नमूने प्रति ९५ कोशिकाओं पर quantified, नकल प्रति । कक्षों की कुल संख्या (> ४०० कक्ष) अच्छी तरह से जनसंख्या माध्य को प्रतिबिंबित करने के लिए आवश्यक कक्षों की न्यूनतम संख्या (~ ६० कक्ष) से अधिक है ।

एक कस्टम के साथ Matlab कार्यक्रम16, वनस्पति कोशिकाओं के लिए सेल प्रति 5 NDC80ओआरएफ टेप के एक औसत पाया गया है, जबकि meiotic दौर कोशिकाओं में, औसत काफी सेल प्रति 4 टेप को गिरा दिया (दो पूंछ Wilcoxon रैंक योग परीक्षण, p = ०.०२६) (चित्र 7) । सेल प्रति NDC80लुटि टेप की औसत संख्या 21 टेप था, और कोशिकाओं के १००% NDC80लुटि टेप व्यक्त की । हम एक कदम के रूप में टेप की दी गई संख्या के साथ कोशिकाओं के अंश ग्राफी वार, रिश्तेदार आवृत्ति हिस्टोग्राम क्योंकि mRNA अणुओं की संख्या एक असतत मात्रा है । प्रत्येक हिस्टोग्राम का सबसे बड़ा बिन एक ही ऊंचाई के लिए सामान्यीकृत था ।

Figure 1
चित्र 1: smFISH प्रोटोकॉल के लिए प्रवाह-चार्ट. कोशिकाओं को कमरे के तापमान पर formaldehyde के साथ 20 मिनट के लिए या 4 ˚ सी में रातोंरात तय कर रहे हैं, वनस्पति विकास के नमूने और meiotic नमूनों के लिए क्रमशः । तीन बार बफर बी में धोने के बाद, कोशिकाओं zymolyase द्वारा पचा रहे हैं ~ ७०%-कोशिकाओं के ९०% पचा रहे हैं. पचा नमूने तो zymolyase हटाने के लिए बफर बी के साथ एक बार धोया जाता है, और बाद में ७०% इथेनॉल (ेतोः) में permeabilized ~ ३.५ घंटे के लिए । संकरण के लिए तैयार करने के लिए, नमूने पहले ~ 20 मिनट के लिए 10% formamide वॉश बफर (FWB) में मशीन हैं । अगले, नमूने ~ ५० µ एल में reसस्पैंड कर रहे है संकरण समाधान है, जो फ्लोरोसेंट जांच शामिल है, अंधेरे में 30 ˚ सी में रात भर की मशीन के लिए । संकरण के बाद, नमूनों 10% FWB में 30 मिनट के लिए दूर अतिरिक्त जांच धोने, और फिर 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) के साथ 10% FWB में मशीन के लिए डीएनए दाग है । नमूने के लिए FWB/DAPI की मशीन के बाद तुरंत imaged, नमूना catalase, Trolox, और ग्लूकोज oxidase (GLOX + enz) के साथ पूरक GLOX बफर में reसस्पैंड है; जबकि, अंय नमूनों एंजाइमों के बिना GLOX बफर में reसस्पैंड कर रहे हैं, और 4 ˚ सी पर संग्रहित ~ 3 घंटे तक । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: smFISH गुणवत्ता का आकलन अजीब/भी जांच का उपयोग कर । (क) शीर्ष: करीब के लिए योजनाबद्ध/ ५४ oligonucleotide जांचों के टाइलिंग NDC80 जीन डिजाइन किए गए थे. अजीब गिने जांच एक fluorophore (CF590, रानी में दिखाया गया है), और भी गिने जांच के साथ लेबल थे, एक और fluorophore (Q670, हरे रंग में दिखाया के साथ) । नीचे: प्रतिनिधि smFISH meiotic दौर कोशिकाओं की छवियां अजीब/भी जांच सेट का उपयोग कर प्राप्त की । नमूने लिए गए थे 6 घंटे बाद कोशिकाओं (UB8144) sporulation माध्यम को हस्तांतरित किया गया, एक समय था जब इन कोशिकाओं meiotic दौर में गिरफ्तार किया गया. डीएनए DAPI के साथ दाग (नीले रंग में दिखाया गया था) । छवियां z-स्टैक की अधिकतम तीव्रता अनुमानों के रूप में दिखाए जाते हैं । स्केल बार: 5 µm. (ख) युग्मित या अनजाना smFISH धब्बों का प्रतिशत अजीब/भी जांच सेट का उपयोग कर प्राप्त की । कुल ४२८ meiotic दौर कोशिकाओं का विश्लेषण किया गया, दो स्वतंत्र प्रयोगों से पूलिंग । यह आंकड़ा चेन एट अल के चित्रा 2-चित्रा अनुपूरक 4 से संशोधित किया गया है । 16 (ग) एक बिगड़ा हुआ स्पॉट के निकटतम पड़ोसी के बीच एक जोड़ी धब्बे और दूरी के प्रत्येक जोड़ी के बीच की दूरी के एक संचई घनत्व समारोह (CDF) । प्रत्येक एक फ्लोरोसेंट चैनल में पता लगाया स्थान के लिए, "कश्मीर निकटतम पड़ोसी" एल्गोरिथ्म के निकटतम पता लगाया स्थान की पहचान करने के लिए लागू किया गया था-और उस जगह की दूरी-पूरक चैनल में । वे स्थानीयकरण जो पारस्परिक निकटतम पड़ोसियों को युग्मित माना जाता था, और एक नई सूची में युग्मित, CF590, और केवल Q670 का पता लगाने वाली रिकॉर्डिंग जनरेट की गई थी । पता लगाने के प्रत्येक वर्ग के लिए, दूरी के एक CDF हिस्टोग्राम Matlab में प्लॉट किया गया था, पुष्टि है कि सही ढंग से बनती धब्बे वास्तव में अन्य चैनल में एक इसी मौके के बिना उन लोगों से दूरी में बहुत करीब थे. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: युग्मित और विकृत धब्बे के अंश, प्रति सेल कुल आरएनए संख्या के एक समारोह के रूप में. यदि पता लगाने और smFISH स्पॉट के बाँधना अलग अभिव्यक्ति के स्तर पर पक्षपाती था परीक्षण करने के लिए, व्यक्तिगत कोशिकाओं कुल आरएनए अभिव्यक्ति द्वारा समूहीकृत किया गया. युग्मित, CF590-केवल, और Q670-केवल डिटेक्शन का माध्य अंश कक्षों के प्रत्येक समूह के लिए परिकलित किए गए थे । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: NDC80लुटि और NDC80ओआरएफ mRNAs के लिए डिज़ाइन की गई जांचों का उपयोग करके जेनरेट किए गए smFISH डेटा का गुणवत्ता मूल्यांकन । Q ६७० जांच (हरे रंग में दिखाया गया है) आम क्षेत्र के लिए संकरण NDC80लुटि और NDC80ओआरएफ mRNAs के बीच साझा किया, जबकि CF ५९० जांच (रानी में दिखाया गया है) संकरण के अद्वितीय 5 ' क्षेत्र के लिए NDC80लुटि . (क) meiotic दौर में NDC80लुटि और NDC80ओआरएफ के प्रतिनिधि smFISH छवियों, अनुकूलित बनाम इष्टतम शर्तों के तहत प्राप्त की । उपभेदों UB8144 (अनुकूलित शर्त) और UB1337 (इष्टतम स्थिति) अर्धसूत्रीविभाजन से गुजरना और meiotic दौर के दौरान तय करने के लिए प्रेरित किया गया । इन दो उपभेदों अर्धसूत्रीविभाजन प्रेरित करने के लिए अलग तुल्यकालन प्रणालियों बंदरगाह, लेकिन या तो प्रणाली का उपयोग smFISH गुणवत्ता को प्रभावित नहीं करता है (डेटा नहीं दिखाया गया है) । इष्टतम हालत में, कोशिकाओं को 20 मिनट (कोई रातोंरात निर्धारण), VRC पूरक के बिना zymolyase के साथ पचा, और VRC के एक कम एकाग्रता में संकर के लिए कमरे के तापमान पर तय किया गया । छवियां z-स्टैक की अधिकतम तीव्रता अनुमानों के रूप में दिखाए जाते हैं । डीएनए DAPI के साथ दाग (नीले रंग में दिखाया गया था) । स्केल बार: 5 µm. (ख) सिग्नल को प्रदर्शित Scatterplots-शोर अनुपात (SNR) और प्रत्येक smFISH स्थान के संकेत को देखने के क्षेत्र में पाया आंकड़ा 4a, या तो फ्लोरोसेंट चैनल के लिए, के रूप में अच्छी तरह के रूप में अनुकूलित या इष्टतम शर्तों के लिए । अनुकूलित हालत में, smFISH स्थानों की दो आबादी मौजूद थे । सच smFISH स्पॉट ग्रे क्षेत्र के अंदर स्थित थे, पृष्ठभूमि संकेत से अलग. इष्टतम स्थिति में, व्यक्तिगत mRNAs आंख से भेद करने के लिए कठिन थे, और स्पॉट का पता लगाने सॉफ्टवेयर चलाने के बाद सही धब्बे और पृष्ठभूमि के बीच जुदाई कम स्पष्ट था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: NDC80लुटि और NDC80ओआरएफ टेप की अभिव्यक्ति अस्थाई नियंत्रित कर रहे हैं । (क) वनस्पति विकास और अर्धसूत्रीविभाजन के दौरान NDC80लुटि और NDC80ओआरएफ के प्रतिनिधि smFISH छवियां । वनस्पति नमूनों को तब लिया गया जब कोशिकाएँ (UB8144) पोषक समृद्ध माध्यमों में तेजी से बढ़ रही थीं. Meiotic दौर नमूने कोशिकाओं (UB8144) sporulation माध्यम, एक समय था जब इन कोशिकाओं Meiotic दौर में गिरफ्तार किया गया था स्थानांतरित करने के बाद 6 घंटे लग गए थे । Q ६७० जांच (हरे रंग में दिखाया गया है) आम क्षेत्र के लिए संकरण NDC80लुटि और NDC80ओआरएफ mRNAs के बीच साझा, जबकि CF ५९० जांच (रानी में दिखाया गया है) संकरण के अनूठे 5 ' क्षेत्र के लिए NDC80 लुटि . डीएनए DAPI के साथ दाग (नीले रंग में दिखाया गया था) । प्रत्येक कोशिका अपने Zip1-GFP संकेत, meiotic दौर के लिए एक मार्कर द्वारा मंचन किया गया था । हमारे smFISH प्रोटोकॉल आगे संशोधन के बिना मजबूत GFP संकेत को बरकरार रखता है । वनस्पति विकास: Zip1-GFP नकारात्मक । Meiotic टप्पा: Zip1-GFP सकारात्मक. छवियां z-स्टैक की अधिकतम तीव्रता अनुमानों के रूप में दिखाए जाते हैं । स्केल बार: 5 µm । यह आंकड़ा चेन एट अल के फिगर 2c से संशोधित किया गया है । 16. (B) NDC80ओआरएफ, NDC80लुटि, और NDC80 प्रोटीन (Ndc80p) स्तर के दौरान अर्धसूत्रीविभाजन (UB4074) । NDC80लुटि और NDC80ओआरएफ स्तर उत्तरी दाग द्वारा निर्धारित किया गया था, और Ndc80p स्तर विरोधी V5 immunoblot द्वारा संकेत दिया समय बिंदुओं पर निर्धारित किया गया था । Hxk1p, immunoblot के लिए नियंत्रण लोड हो रहा है । तनाव UB8144 के रूप में, यह तनाव भी pGAL-NDT80 GAL4-एर तुल्यकालन प्रणाली19,20बंदरगाह । कोशिकाओं को 0 घंटे में sporulation माध्यम से स्थानांतरित किया और β-एस्ट्राडियोल अलावा 6 घंटे बाद pachytene गिरफ्तारी से जारी किया गया । NDC80लुटि प्रतिलिपि मजबूती से एस/meiotic दौर में पाया गया था, जबकि NDC80ओआरएफ टेप मुख्य रूप से meiotic प्रविष्टि (0 घंटे) और meiotic डिवीजनों (7-9 घंटे) के दौरान पहले मौजूद था । यह आंकड़ा चेन एट अल के फिगर 6J से संशोधित किया गया है । 16 कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । 

Figure 6
चित्रा 6: बूटस्ट्रैप विश्लेषण meiotic दौर में दिखाया नमूनों के लिए प्रदर्शन किया चित्र 5 . सभी quantified कक्षों को परित किया गया, और किसी दिए गए संख्या (n) कक्षों की अनियमित ५०० बार नमूना लिया गया । माध्य और ९५% विश्वास अंतराल के अंश के लिए परिकलित किए गए और कक्ष के प्रति unpaired mRNA । नंबर एन (इनसेट) के प्रत्येक चुनाव के लिए ये आंकडे प्लॉट किए गए थे । प्रसरण में पठार नमूने द्वारा विभाजित नमूना प्रसरण प्लॉट करने के द्वारा विज़ुअलाइज़ किया गया था, जो कक्षों की संख्या (n) नमूना के रूप में एक फ़ंक्शन के रूप में । मापा कोशिकाओं की कुल संख्या (४३७ कोशिकाओं) बहुत संख्या है जिस पर त्रुटि पठारी (~ ६० कोशिकाओं) से अधिक है, यह दर्शाता है कि अतिरिक्त डेटा माप में विश्वास में सुधार नहीं होगा । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्र 7: smFISH में दर्शाए गए डेटा का ठहराव चित्र 5 , NDC80लुटि और सेल प्रति NDC80ओआरएफ टेप की दी गई संख्या के साथ कोशिकाओं के सापेक्ष आवृत्ति हिस्टोग्राम के रूप में ग्राफी, तीन स्वतंत्र प्रयोगों से परित डेटा का उपयोग कर । डैश्ड रेखा सेल प्रति NDC80लुटि और NDC80ओआरएफ टेप की औसत संख्या को इंगित करती है । प्रत्येक हिस्टोग्राम इतना सामान्यीकृत था कि अधिकतम बिन ऊँचाई हिस्टोग्राम के सभी भर में एक ही था. ६३७ कोशिकाओं की कुल संख्या वनस्पति विकास और meiotic के लिए ४३७ के लिए विश्लेषण किया गया । दो पूंछ Wilcoxon रैंक राशि परीक्षण NDC80लुटि और NDC80ओआरएफके लिए किया गया था क्रमशः, वनस्पति और meiotic दौर नमूनों की तुलना । यह आंकड़ा चेन एट अल के चित्रा 2d से संशोधित किया गया है । 16 कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । 

बफर बी (1 एल स्टॉक: १.२ एम सोर्बिटोल; ०.१ एम पोटेशियम फॉस्फेट बफर, पीएच ७.५) 1x
Nuclease-मुफ्त पानी ५०० एमएल
सोर्बिटोल २१८.६ छ
KH2पो4 २.१८ छ
K2HPO4 १४.६२ छ
Nuclease-मुफ्त पानी 1 L अंतिम वॉल्यूम पर लाएं
* ५० में 4 ˚ सी पर स्टोर-एमएल aliquots के बाद फिल्टर बंध्याकरण
Zymolyase 100T (10 मिलीग्राम/
* aliquots में स्टोर-20 ˚ सी
भंग 10 मिलीग्राम zymolyase पाउडर में 1 मिलीलीटर MilliQ पानी
ई. कोलाई tRNA (10 मिलीग्राम/
* aliquots में स्टोर-20 ˚ सी
भंग 10 मिलीग्राम tRNA पाउडर में 1 मिलीलीटर MilliQ पानी
७०% इथेनॉल (५० मिलीलीटर) 1x (mL)
शुद्ध इथेनॉल ३५
Nuclease-मुफ्त पानी 15
* कमरे के तापमान पर स्टोर
संकरण बफर (10 एमएल) 1x (mL)
५०% Dextran सल्फेट 2
ई. कोलाई tRNA (10 मिलीग्राम/ 1
२०० मिमी Vanadyl ribonucleoside परिसर (VRC) ०.१
BSA, ५० मिलीग्राम/ ०.०४
20x एसएससी 1
Formamide 1
Nuclease-मुफ्त पानी ४.८६
* स्टोर at-20 ˚ C in २५०-µ l या ५००-µ l aliquots
10% formamide वॉश बफर (10 एमएल) 1x (mL)
कमरे के तापमान पर Formamide 1
20x एसएससी 1
Nuclease-मुफ्त पानी 8
* 20 के लिए ताजा, भंवर बनाओ-30 मिश्रण करने के लिए
10% ग्लूकोज समाधान
* फ़िल्टर नसबंदी के बाद aliquots में 4 ˚ सी पर स्टोर
nuclease के 10 मिलीलीटर में ग्लूकोज की 1 जी भंग-नि: शुल्क पानी
ग्लूकोज oxidase
* aliquots में स्टोर-20 ˚ सी
भंग ३.७ मिलीग्राम ग्लूकोज oxidase में 1 मिलीलीटर की ५० मिमी NaOAc, पीएच 5
एंटी ब्लीच (GLOX) बफर, एंजाइमों के बिना (1 मिलीलीटर) 1x (µ l)
nuclease में 10% ग्लूकोज-फ्री पानी ४०
1 मीटर Tris, पीएच ८.० 10
20x एसएससी १००
Nuclease-मुफ्त पानी ८५०
* ताजा बनाओ, 4 ˚ ग पर भी aliquots स्टोर कर सकते है
एंटी ब्लीच (GLOX) बफर, एंजाइमों के साथ (५० µ l) 1x (µ l)
Catalase (भंवर हल्का, यह आसानी से बसा) ०.५
ग्लूकोज oxidase ०.५
१०० mM Trolox (इथेनॉल में भंग) 1
GLOX बफर ५०
* हर बार ताजा बनाओ, बर्फ पर तैयार, 2-3 घंटे के लिए 4 ˚ सी पर संग्रहीत किया जा सकता है

तालिका 1. बफ़र्स और मीडिया

Discussion

प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत अंय प्रकाशित smFISH प्रोटोकॉल से व्युत्पंन है2,3,21,22,23, और विशेष रूप से खमीर तनाव पृष्ठभूमि SK1 के लिए अनुकूलित है । अनुकूलित पैरामीटर कक्ष संख्या, निर्धारण की अवधि, केंद्रापसारक गति और अवधि, पाचन अवधि, पाचन बफर, जांच एकाग्रता, और संकरण बफर शामिल थे । ऐसे संकरण तापमान और अवधि के रूप में अंय मानकों को अनुकूलित नहीं थे । इस अनुभाग में, हम कुछ नोट है कि किसी भी खमीर तनाव पृष्ठभूमि और ब्याज की वृद्धि की स्थिति के लिए इस प्रोटोकॉल अनुकूलन में मदद मिलेगी साझा करें ।

उभरते खमीर के सेल दीवार एक बड़ी चुनौती है नवोदित खमीर में उच्च गुणवत्ता smFISH छवियों को प्राप्त करने के खिलाफ है क्योंकि सेल दीवार जांच प्रवेश रोकता है । zymolyase द्वारा सेल दीवार के अपूर्ण पाचन जांच और उच्च कोशिका के लिए संकेत में सेल परिवर्तनशीलता के अकुशल संकरण की ओर जाता है । हालांकि, अधिक पाचन कोशिकाओं को भी कमजोर कर सकते हैं, महत्वपूर्ण सेल नुकसान के लिए अग्रणी धोने के कदम और सेल इमेजिंग के लिए स्लाइड तैयार करने के दौरान फोड़ के दौरान । इस प्रकार, पाचन की अवधि का अनुकूलन महत्वपूर्ण है । हम समय की विभिंन मात्रा के लिए एक ही नमूना पचा द्वारा एक पायलट smFISH प्रयोग आयोजित करने की सलाह देते हैं । हमारे मामले में, हम सबसे अच्छा smFISH डेटा प्राप्त अगर हम पाचन बंद कर दिया जब ~ ८०% कोशिकाओं के गैर अपवर्तन बन गया । आमतौर पर, एक ही वृद्धि की स्थिति के लिए, अलग आनुवंशिक उत्परिवर्ती उपभेदों समान समय के साथ पचा जा सकता है । हालांकि, पाचन की अवधि अलग है जब विभिंन विकास की स्थिति और नवोदित खमीर में अर्धसूत्रीविभाजन के विभिंन चरणों के बीच तुलना में । एक बार समय निर्धारित किया जाता है, smFISH की गुणवत्ता reproducible है । नोट कि दोषपूर्ण कोशिका दीवार संश्लेषण और/या संरचना के साथ उत्परिवर्ती उपभेदों के लिए, पाचन से कम 15 मिनट में पूरा किया जा सकता है । zymolyase के विभिंन बैचों का उपयोग भी थोड़ा पाचन समय बदल सकता है ।

इष्टतम जांच एकाग्रता के लिए एक उच्च संकेत करने के लिए शोर अनुपात को प्राप्त करने की जरूरत है । हम डिजाइन और व्यावसायिक रूप से हमारे smFISH जांच खरीदा है । अच्छी जांच (अक्सर 20-mers) ३५% से ४५%, जांच के बीच 2 आधार जोड़े की एक ंयूनतम रिक्ति को लेकर GC का एक प्रतिशत होना चाहिए, और कम पार-जेट । हम जांच की एक सूची उत्पंन करने के लिए निर्माता से एक वेब आधारित जांच डिजाइनर का इस्तेमाल किया, और अगर वहां पर्याप्त जांच से चुनने के लिए, हम Saccharomyces जीनोम डाटाबेस में विस्फोट एल्गोरिथ्म का उपयोग करने के लिए 17 से अधिक आधार जोड़े के साथ जांच समाप्त होगा अंय जीनोमिक क्षेत्रों के साथ । हम जांच सेट के लिए अधिक photostable फ्लोरोसेंट डाई (काल Fluor ५९०) चुना है कि anneals के अद्वितीय क्षेत्र के लिए NDC80लुटि (CF ५९०) क्योंकि इस सेट में, जांच की संख्या है कि उपरोक्त मानदंडों के सभी संतुष्ट (20 जांच) से कम था निर्माता द्वारा अनुशंसित न्यूनतम संख्या (~ 25 जांच). निर्माता के निर्देशों के बाद जांच समाधान का पुनर्गठन करने के बाद, हम शेयर समाधान के एक 1:10 कमजोर पड़ने बनाया है और 5 में पतला समाधान-µ एल aliquots में संग्रहित-20 ˚ सी । प्रत्येक aliquot का उपयोग केवल एक बार किया गया । अनुकूलन के लिए, एक 1:10 पतला समाधान और परीक्षण जो एकाग्रता सबसे अच्छा संकेत करने वाली शोर अनुपात पैदावार से धारावाहिक कमजोर पड़ने बनाना चाहिए । हम मूल शेयर से 1:250, 1:500, 1:1000, और 1:2000 की एक कमजोर पड़ने श्रृंखला बनाने की सलाह देते हैं । हमारे मामले में, एक 1:500 कमजोर पड़ने का कारक सबसे अच्छा संकेत करने वाली शोर अनुपात के परिणामस्वरूप, दोनों CF ५९० और Q ६७० जांच सेट के लिए ।

इष्टतम निर्धारण समय नवोदित खमीर में सफल smFISH के लिए भी महत्वपूर्ण है । हमने पाया है कि 4 ˚ सी पर रात निर्धारण, बजाय 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर फिक्सिंग, काफी स्थिरता और meiotic नमूनों के लिए smFISH परिणामों की गुणवत्ता में सुधार । हालांकि हम परीक्षण नहीं किया है कैसे रातोंरात निर्धारण वनस्पति नमूनों प्रभाव हो सकता है, कमरे के तापमान पर निर्धारण इस वृद्धि की स्थिति के लिए अच्छी तरह से काम किया । इस प्रकार, नए उपभेदों या विकास की स्थिति के लिए smFISH प्रोटोकॉल का अनुकूलन करने के लिए, हम सुझाव है कि कमरे के तापमान पर कम निर्धारण समय के साथ शुरू करने और निर्धारण समय में वृद्धि अगर संकेत की उच्च परिवर्तनशीलता का सामना करना पड़ा है ।

अन्य प्रकाशित प्रोटोकॉल के साथ तुलना में3,22,23, हमारे प्रोटोकॉल पाचन के दौरान RNase अवरोधक VRC का उपयोग करता है और संकरण के दौरान VRC के एक उच्च एकाग्रता. इन दो चरणों में VRC के अलावा smFISH परिणामों की निरंतरता में सुधार, संभवतः बेहतर nuclease गतिविधि है, जो zymolyase मिश्रण द्वारा पेश किया जा सकता है के खिलाफ आरएनए अणुओं के संरक्षण द्वारा (एंजाइम कच्चे तेल के अर्क से शुद्ध है और शामिल हो सकते हैं RNase संदूषण) । इस प्रकार, हम VRC की राशि का उपयोग करने की सिफारिश के रूप में हमारे प्रोटोकॉल में सूचीबद्ध या अनुकूलन के लिए VRC के भी उच्च सांद्रता ।

दोनों बफ़र B और formamide वॉश बफ़र में वाशिंग चरणों के दौरान कक्षों का एक महत्वपूर्ण भाग खो सकते हैं । कोशिका हानि को कम करने के लिए, एक केंद्रापसारक गति बढ़ा सकता है । हमारे मामले में, एक उच्च गति का उपयोग (२१,००० x g) बफर बी के दौरान हमारे नमूनों गोली करने के लिए काफी कम सेल नुकसान बहाकर । हालांकि, कोशिकाओं zymolyase पाचन के बाद बहुत नाजुक हो, तो केंद्रापसारक गति बदलने की सिफारिश नहीं है । इसके बजाय, हम संयुक्त राज्य अमेरिका वैज्ञानिक, जो बहुत formamide धोने बफर में बहाकर दौरान कोशिकाओं गोली मदद से कम आसंजन ट्यूब का उपयोग सुझाव देते हैं । कुल मिलाकर, हमारे प्रोटोकॉल लगातार कुशल इमेजिंग के लिए पर्याप्त घने कोशिकाओं के एक monolayer उत्पंन कर सकते हैं । आमतौर पर, देखने के 7 क्षेत्रों > 130 ठहराव के लिए उपयुक्त कोशिकाओं उपज चाहिए ।

अंत में, यह करने के लिए इष्टतम मापदंडों और छवि विश्लेषण से आवश्यक outputs निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है । smFISH धब्बे का पता लगाने के लिए, प्रकाशित विश्लेषण कार्यक्रम आमतौर पर कच्चे छवियों गाऊसी कर्नेल का उपयोग करने के लिए पृष्ठभूमि संकेत को दूर फ़िल्टर, और उपयोगकर्ताओं को संकेत करने वाली शोर अनुपात का निर्धारण करने के लिए छवियों के प्रत्येक सेट के लिए उपयोग करने के लिए2,17। दुर्भाग्य से, वहाँ वर्तमान में एक मानक है जिसके द्वारा उचित मापदंडों निर्धारित कर रहे हैं नहीं है, और इसलिए इन विभिन्न सेटिंग्स के कुछ अनुभवजंय परीक्षण आवश्यक है. इन चरणों में से प्रत्येक के लिए आवश्यक पैरामीटर्स को सेट करने के लिए, एक इनपुट विभिन्न सेट को पैरामीटर्स की iteratively करने की आवश्यकता है और जांचें कि प्रत्येक सेट से प्राप्त परिणाम कितनी अच्छी तरह हैं, जो कुछ प्रतिनिधि कक्षों में मैन्युअल रूप से गणना करने से मिलता है. एक बार मापदंडों का एक सेट पाया जाता है, यह विभिन्न विकास की स्थिति और आनुवंशिक पृष्ठभूमि के बावजूद प्राप्त छवियों के अधिकांश के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

इसके अलावा, एक अगर smFISH छवियों की अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण ठहराव से पहले किया जा सकता है परीक्षण कर सकते है22। इस चरण स्थान का पता लगाने एल्गोरिथ्म को सरल और काफी इमेजिंग समय कम कर देता है, हालांकि व्यक्तिगत स्पॉट, जैसे उनके सेलुलर स्थानीयकरण के बारे में कुछ संभावित उपयोगी जानकारी की कीमत पर । हमारे मामले में, mRNA NDC80 जीन द्वारा उत्पादित अणुओं की संख्या काफी कम है कि धब्बे अच्छी तरह से इस प्रक्रिया के बाद अलग किया गया था (के लिए असामांय नहीं नवोदित खमीर3में टेप के लिए,7) । मामलों में जहां colocalization विश्लेषण महत्वपूर्ण है, विश्लेषण पाइपलाइन colocalization का आकलन करने के लिए प्रत्येक चैनल में प्रत्येक smFISH स्पॉट का स्थान निर्धारित करने के लिए की जरूरत है । पूछे जाने वाले विशिष्ट प्रश्नों पर निर्भर करते हुए, प्रत्येक स्थान की गहनता जैसी अन्य जानकारी भी आगे विश्लेषण के लिए पाइप लाइन से निकाले जाने की आवश्यकता हो सकती है. प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम और छवि विश्लेषण पाइपलाइन अनुकूलन smFISH डेटा के उच्च गुणवत्ता प्राप्त करने के लिए ब्याज के सवाल का अध्ययन करने में महत्वपूर्ण है ।

Disclosures

लेखकों के हित का खुलासा करने का कोई विरोध नहीं है.

Acknowledgments

हम कैसे smFISH प्रोटोकॉल का अनुकूलन करने के लिए पर सलाह के लिए ऐनी Dodson और स्टेफ़नी हेनरिक धंयवाद, जेवियर Darzacq विश्लेषण मंच, सांख्यिकीय विश्लेषण पर सुझावों के लिए हैयान हुआंग के साथ मदद के लिए । यह काम पैसा (5-FY15-99), बेंच चैरिटेबल ट्रस्ट (०००२७३४४), Damon Runyon कैंसर रिसर्च फाउंडेशन (35-15) और ग्लेन फाउंडेशन EÜ को मार्च से धन द्वारा समर्थित किया गया था, और एक NSF स्नातक अनुसंधान फैलोशिप अनुदान नहीं । डीजीई-११०६४०० को जे. के.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BSA, RNase-free (50 mg/mL) Ambion AM2616 Store at -20 °C.
Catalase Sigma C3515 Store at 4 °C for short-term. Vortex before use.
DAPI Sigma D9564 Store at -20 °C after reconstitution in water. Protect from light.
50% Dextran Sulfate Milli Pore S4030 Store at room temperature. Very viscous liquid. Handle with patience.
E. coli tRNA Sigma R4251 Store at -20 °C in aliquots after reconstitution in water.
Ethanol (100%, 200 proof) various Flammable.
37% Formaldehyde Fisher F79-500 Store at room temperature. Toxic. Use and dispose with caution.
Formamide Ambion AM9342 Store at 4 °C. Open after the temperature equilibrates to room temperature in order to prevent oxidation. Toxic. Use and dispose with caution. 
Glucose various Store at 4 °C after dissolving in nuclease-free water.
Glucose oxidase Sigma G2133 Store at -20 °C in aliquots after reconstitution in 50 mM NaOAc, pH 5.
Nuclease-free water Ambion AM9932 Store at room temperature.
Potassium phosphate (monobasic and dibasic) various Store at room temperature.
Probe library, diluted in TE, pH 8.0  Biosearch Technologies Store at -20 °C in aliquots (5 µL) after reconstitution in TE pH 8.0, following the instructions from the manufacturer. Protect from light. 
Sorbitol various Store at room temperature.
20X SSC Ambion AM9763 Store at room temperature.
TE, pH 8.0 Ambion AM9849 Store at room temperature.
1 M Tris, pH 8.0 Ambion AM9856 Store at room temperature.
Trolox Sigma 238813 Store at -20 °C in aliquots.
200 mM Vanadyl ribonucleoside complex (VRC) NEB S1402S Store at -20 °C in aliquots after reconstitution, following the instructions from the manufacturer.
Zymolyase 100T MP Biomedicals 08320932 Store at -20 °C in aliquots after reconstitution in water.
Low-adhesion tubes USA Scientific 1415-2600 Store at room temperature.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280 (5363), 585-590 (1998).
  2. Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
  3. Rahman, S., Zenklusen, D. Single-molecule resolution fluorescent in situ hybridization (smFISH) in the yeast S. cerevisiae. Methods Mol Biol. 1042, 33-46 (2013).
  4. Gaspar, I., Ephrussi, A. Strength in numbers: quantitative single-molecule RNA detection assays. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 4 (2), 135-150 (2015).
  5. Vargas, D. Y., et al. Single-molecule imaging of transcriptionally coupled and uncoupled splicing. Cell. 147 (5), 1054-1065 (2011).
  6. Waks, Z., Klein, A. M., Silver, P. A. Cell-to-cell variability of alternative RNA splicing. Mol Syst Biol. 7, 506 (2011).
  7. Zenklusen, D., Larson, D. R., Singer, R. H. Single-RNA counting reveals alternative modes of gene expression in yeast. Nat Struct Mol Biol. 15 (12), 1263-1271 (2008).
  8. Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells. PLoS Biol. 4 (10), e309 (2006).
  9. Senecal, A., et al. Transcription factors modulate c-Fos transcriptional bursts. Cell Rep. 8 (1), 75-83 (2014).
  10. Levesque, M. J., Ginart, P., Wei, Y., Raj, A. Visualizing SNVs to quantify allele-specific expression in single cells. Nat Methods. 10 (9), 865-867 (2013).
  11. Hansen, C. H., van Oudenaarden, A. Allele-specific detection of single mRNA molecules in situ. Nat Methods. 10 (9), 869-871 (2013).
  12. Ginart, P., et al. Visualizing allele-specific expression in single cells reveals epigenetic mosaicism in an H19 loss-of-imprinting mutant. Genes Dev. 30 (5), 567-578 (2016).
  13. Long, R. M., et al. Mating type switching in yeast controlled by asymmetric localization of ASH1 mRNA. Science. 277 (5324), 383-387 (1997).
  14. Park, H. Y., Trcek, T., Wells, A. L., Chao, J. A., Singer, R. H. An unbiased analysis method to quantify mRNA localization reveals its correlation with cell motility. Cell Rep. 1 (2), 179-184 (2012).
  15. Jourdren, L., Delaveau, T., Marquenet, E., Jacq, C., Garcia, M. CORSEN, a new software dedicated to microscope-based 3D distance measurements: mRNA-mitochondria distance, from single-cell to population analyses. RNA. 16 (7), 1301-1307 (2010).
  16. Chen, J., et al. Kinetochore inactivation by expression of a repressive mRNA. eLife. 6, e27417 (2017).
  17. Mueller, F., et al. FISH-quant: automatic counting of transcripts in 3D FISH images. Nat Methods. 10 (4), 277-278 (2013).
  18. Brar, G. A., et al. High-resolution view of the yeast meiotic program revealed by ribosome profiling. Science. 335 (6068), 552-557 (2012).
  19. Carlile, T. M., Amon, A. Meiosis I is established through division-specific translational control of a cyclin. Cell. 133 (2), 280-291 (2008).
  20. Benjamin, K. R., Zhang, C., Shokat, K. M., Herskowitz, I. Control of landmark events in meiosis by the CDK Cdc28 and the meiosis-specific kinase Ime2. Genes Dev. 17 (12), 1524-1539 (2003).
  21. Dodson, A. E., Rine, J. Heritable capture of heterochromatin dynamics in Saccharomyces cerevisiae. eLife. 4, e05007 (2015).
  22. Trcek, T., et al. Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast. Nat Protoc. 7 (2), 408-419 (2012).
  23. Youk, H., Raj, A., van Oudenaarden, A. Imaging single mRNA molecules in yeast. Methods Enzymol. 470, 429-446 (2010).

Tags

आनुवंशिकी अंक १३५, सीटू संकरण में एकल अणु प्रतिदीप्ति (smFISH) नवोदित खमीर बँटवारा अर्धसूत्रीविभाजन आरएनए एकल सेल विश्लेषण प्रतिलेखन लुटि
एकल अणु प्रतिदीप्ति <em>में सीटू</em> संकरण (smFISH) विश्लेषण में नवोदित खमीर वनस्पति विकास और अर्धसूत्रीविभाजन
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, J., McSwiggen, D., Ünal,… More

Chen, J., McSwiggen, D., Ünal, E. Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis. J. Vis. Exp. (135), e57774, doi:10.3791/57774 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter