Summary
Denne enkel molekyl fluorescens i situ hybridisering protokollen er optimalisert for å tallfeste antallet RNA molekyler i spirende gjær under vegetativ vekst og meiose.
Abstract
Ett molekyl fluorescens i situ hybridisering (smFISH) er en kraftfull teknikk å studere genuttrykk i enkeltceller på grunn av sin evne til å oppdage og telle RNA molekyler. Utfyllende til dyp sekvensering-baserte metoder, smFISH gir informasjon om celle-til-celle variasjonen i transkripsjon overflod og den subcellular lokaliseringen av en gitt. Nylig har vi brukt smFISH å studere uttrykket av genet NDC80 under meiose i spirende gjær, i hvilke to transkripsjon isoformene finnes og kort transkripsjon isoformen har hele sekvensen delt med den lange isoformen. Trygt Finn hver utskrift isoformen, vi optimalisert kjent smFISH protokoller og høy konsistens og kvaliteten på smFISH data for prøvene ervervet under spirende gjær meiose. Her beskriver vi denne optimalisert protokollen, kriteriene som brukes for å avgjøre om høy kvalitet smFISH data hentes, og noen tips for å implementere denne protokollen i andre gjær påkjenningen og vekst betingelser.
Introduction
Dynamisk regulering av genuttrykk kjører utviklingen av en organisme, samt sitt svar på miljøstress, infeksjon og endringer i metabolisme. Studier som fokuserer på transcriptional regulering avhengige teknologier som måler RNA overflod. En slik metode, kalt ett molekyl fluorescens i situ hybridisering (smFISH), brukes for påvisning av RNA molekyler i enkeltceller1,2. Denne metoden tillater måling av celle-til-celle variasjon i genuttrykk og fastsetting av intracellulær RNA lokalisering.
Det mest brukte smFISH teknikken krever oppdagelsen av en individuell RNA molekylet flere kort DNA sonder (ofte ~ 48 20-mer sonder) som er komplementære til målet RNA og er konjugert til samme fluorescerende farge. Binding av en enkelt fluorescerende sonde gir svakt signal, men signalet fra ensemblet i alle sonder er robust. Denne funksjonen forbedrer signal-til-støy-forhold fordi selv om en enkelt sonde kan vise off-målet bindende, slik signalet forventes å bli veldig svak sammenlignet med målet RNA molekylet3. I feil gjenkjenning, kan antall RNA molekyler telles og forhold i ulike vekst forhold og blant annet mutanter.
Siden sin første utvikling, har smFISH blitt tilpasset for å studere ulike aspekter av gene expression4, som transkripsjon forlengelse1,2, skjøting5,6, transcriptional sprengning7 , 8 , 9, intracellulær allel uttrykk10,11,12og RNA lokalisering13,14,15. Nylig vi har brukt denne metoden for å studere uttrykk for to transkripsjon isoformene på det samme genet, der kort transkripsjon isoformen (NDC80ORF) har hele sekvensen delt med den lange isoformen (NDC80luti )16. Identifiserer de to mRNA isoformene, vi brukte to sonde sett: ett gjelder unike sekvensen av NDC80luti, og andre settet, konjugert til en annen fluorescerende farge, binder til vanlige regionen de to isoformene. NDC80luti RNA identifiseres som en colocalized sted med både fluorescerende signaler, mens den NDC80ORF RNA er en som inneholder bare signalet fra det felles settet som sonde. Siden antallet av NDC80ORF utskrifter beregnes ved en "subtraksjon" metode, høy effektivitet av sonden hybridisering og høy signal-til-støy forholdet er trygt identifisere smFISH flekker og redusere feil overføring.
Dette dokumentet beskriver en optimalisert protokoll for å utføre smFISH i spirende gjær Saccharomyces cerevisiae. I denne protokollen, de celle nummer, fiksering, fordøyelsen tid, fordøyelsen buffer, sonde konsentrasjon, og hybridisering bufferen for smFISH eksperimentene var optimalisert for SK1 belastning bakgrunnen av S. cerevisiae gjennomgår vegetative vekst eller meiose. Men vi også merke i dette manuskriptet: (1) metode for å sjekke kvaliteten på dataene som smFISH etter bildeopptak, og (2) skritt i protokollen som krever ytterligere optimalisering for ulike belastning bakgrunner og vekst forhold.
Protocol
Merk: Alle bufferne og mediene som brukes i denne protokollen er oppført i tabell 1. Leverandørinformasjonen for reagenser er oppført i Tabellen for materiale.
Dag 1/dag 1-2:
Merk: For vegetative kultur, vokse cellene til en OD600 på 0,4 til 0,6 i et foretrukne medium. For meiotic kultur, indusere celler gjennomgå meiose med en foretrukket metode (vanligvis dyrking i et OD600 av 1,85).
1. sample fiksering og fordøyelse
- Fastsette totalt ~3.5 OD600 celleområde i 3% formaldehyd.
- For vegetative kultur, legge til 5.52 mL kultur 480 µL av 37% formaldehyd i 15-mL konisk rør.
- For meiotic kultur, Legg 1840 µL av kultur til 160 µL av 37% formaldehyd i 2-mL microcentrifuge rør. Invertere ~ 5 ganger å blande.
FORSIKTIG: Formaldehyd er giftig. Håndtere og kast etter institusjonelle forskrifter.
- Plasser rør på en rull trommelen ved romtemperatur for 20 min. For meiotic prøver, etter bestemmer ved romtemperatur for 20 min, fortsette å feste natten på 4 grader, roterende.
Merk: Overnatting fiksering øker reproduserbarhet og kvaliteten på smFISH dataene innhentet for meiotic prøver. Fiksering tid skal optimaliseres. - Mens prøvene er fikse, tine 200 mM Vanadyl Ribonucleoside komplekser (VRC) på 65 grader i minst 10 min.
- Klargjør fordøyelsen master blandingen i en 15-mL tube: 1 sample, blande 425 µL av Buffer B med 40 µL av 200 mM VRC (oppvarmet til 65 grader); 5 eksempler, blande 2125 µL av Buffer B med 200 µL av 200 mM VRC (oppvarmet til 65 grader). Vortex ~ 5 s å fullt resuspend VRC før du legger til master mix, som vises lys grønn etter VRC.
Merk: Tillegg av VRC under fordøyelsen forbedrer konsistensen av smFISH resultater, potensielt begrenser nuclease miljøgifter introdusert av zymolyase blandingen, som er renset fra rå ekstrakt. Mengden VRC kreves i dette trinnet skal optimaliseres. - For vegetative prøver, sentrifuge rør ~ 1057 x g i 3 minutter. For meiotic prøver (etter overnatting fiksering), sentrifuge 21000 x g i 1,5 min. Decant eller Sug opp nedbryting til formaldehyd avfall.
Merk: Alle sentrifugering trinnene utføres ved romtemperatur. - Resuspend celler i 1,5 mL kaldt Buffer B ved pipettering opp og ned eller invertere rør og flicking for å blande. Overføre vegetative prøver til 2-mL rør etter rørets.
- Sentrifuger 21000 x g i 1,5 min. fjerne mesteparten av væsken vakuum aspirasjon eller pipettering, etterlot ~ 100 µL.
- Resuspend cellene i 1,5 mL kaldt Buffer B.
- Sentrifuger 21000 x g i 1,5 min. fjerne mesteparten av væsken vakuum aspirasjon eller pipettering, etterlot ~ 100 µL.
- Resuspend celler i 1,5 mL kaldt Buffer B. sentrifuge 21000 x g for 1,5 min. leveringstanken væsken helt av vakuum eller pipettering.
- Resuspend celler i 425 µL av fordøyelsen master mix og kort vortex å resuspend. Legge til 5 µL av 100T 10 mg/mL zymolyase i hver retning.
Merk: Vortex zymolyase hver gang før du legger til rør. Legge til zymolyase til hver tube enkeltvis, i stedet for å legge til master mix. Begge trinnene hjelpe opprettholde fordøyelsen konsekvens mellom rør fordi zymolyase precipitates raskt. - Vortex 2-3 s å blande. Plassere rør på en rull trommel og fordøye på 30 grader i 15-30 min. Vegetative celler og tidlig meiotic fase, tar det vanligvis ~ 15 min, og meiotic prophase og meiotic divisjoner, det tar vanligvis ~ 30 min.
Merk: Kontroller på mikroskopet hver 5 min etter 15 min, og stoppe fordøyelsen når ~ 80% av celler vises ikke-transparente og ikke-refraktiv. Fra dette punktet, celler er svært skjøre. Håndtere celler forsiktig og unngå å bruke vakuum aspirasjon eller vortexing. - Sentrifuge rør ~ 376 x g for 3 min. Fjern væsken helt av pipettering.
- Forsiktig resuspend celler med 1 mL av Buffer B av pipettering opp og ned 1 - 2 ganger å blande.
- Sentrifuge rør ~ 376 x g for 3 min. fjerne Buffer B væske av pipettering. Forsiktig resuspend celler i 1 mL av 70% etanol (fortynnet med RNase-fritt vann).
- Inkuber ved romtemperatur i 3,5-4 timer.
2. hybridisering
- Ta formamide til romtemperatur (for 50-mL aliquot, det tar ~ 30 min i vannbad).
Merk: Ikke åpne formamide flasken til flasken når romtemperatur for å unngå oksidasjon av formamide.
FORSIKTIG: Formamide er giftige. Håndtere og kast etter institusjonelle forskrifter. - Forberede 10% formamide vaskebuffer i et 15-mL konisk rør.
- Sentrifuge rør ~ 376 x g for 3 min. fjerne 500 µL av 70% etanol av pipettering. Pipetter forsiktig opp og ned til resuspend de gjenværende cellene, og deretter overføre cellene til lav-vedheft rør.
Merk: Ved hjelp av lav-vedheft rør sterkt reduserer celle tap under senere. - Sentrifuge rør igjen på ~ 376 x g for 3 min. Fjern alle etanol av pipettering.
- Legge 1 mL av 10% formamide vaskebuffer og forsiktig Pipetter opp og ned 2 - 3 ganger til resuspend cellene.
- At cellene å sitte ved romtemperatur for ~ 20 min klargjøring hybridisering løsningen. 1 sample, blande 50 µL av hybridisering Buffer (rom temperament), 5 µL av 200 mM VRC (oppvarmet til 65 grader) og 1 µL av hver probe (200 nM endelig). 5 eksempler, blande 250 µL av hybridisering Buffer (rom temperament), 25 µL av 200 mM VRC (oppvarmet til 65 grader) og 5 µL av hver probe (200 nM endelig).
- Tine hybridisering Buffer (frossen på-20 grader) til romtemperatur før røret å hindre formamide oksidering.
- Etter tilføyer den 200 mM VRC, vortex for 5-10 s. før du legger ut sonder, er som designet og kjøpt kommersielt, og rekonstituert i henhold til produsentens instruksjoner.
- Hvis to sonder er co inkubert, legger 1 µL av 1:10 fortynning av sonden #1 stock samt 1 µL av 1:10 fortynning av sonden #2 aksjen, å gjøre en siste fortynning av ~ 1:500 for hver probe. Konsentrasjonen trengs for best signal-til-støy-forhold må være optimalisert (se diskusjon for detaljer).
- Sentrifuge prøvene ~ 376 x g for 3 min. Fjern nedbryting i farlig avfall av pipettering.
- Legge til minst 50 µL av hybridisering løsning i hver retning. Sveip rør for å blande.
- Ruge på 30 grader på en rull tromme minst 16 timer i mørket.
Dag 2/dag 3
3. vask og tenkelig
- Ta formamide til romtemperatur.
- Forberede 10% formamide vaskebuffer (FWB) i en 15-mL konisk rør.
- Fjern rørene fra Berg trommelen og plassere dem i en folie-dekket for å beskytte mot lyset.
- Sentrifuge prøvene ~ 376 x g for 3 min. Fjern nedbryting i farlig avfall av pipettering.
- Resuspend i 1 mL av 10% FWB av pipettering forsiktig opp og ned 2 - 3 ganger.
- Ruge på 30 grader i 30 min (ikke roterer) i boksen folie-dekket.
- Sentrifuge prøvene ~ 376 x g for 3 min. fjerner nedbryting til farlig avfall av pipettering, og la ~ 50 µL.
- I mellomtiden forbereder DAPI/FWB i et 15-mL konisk rør: 1 sample, blande 1000 µL av 10% formamide vaskebuffer med 1 µL av 5 mg/mL DAPI. For 10 prøver, bland 10 mL av 10% formamide vaskebuffer med 10 µL av 5 mg/mL DAPI. Resuspend i 1 mL av DAPI/FWB av pipettering forsiktig opp og ned 2 - 3 ganger.
- Ruge på 30 grader i 30 min (ikke roterer) i boksen folie-dekket.
- Tine anti-blekemiddel reagenser på is.
- Sentrifuge prøvene ~ 376 x g for 3 min. Fjern nedbryting helt av pipettering. Eventuelt sentrifuge igjen for å fjerne alle nedbryting.
- For prøver som ikke er avbildet umiddelbart, resuspend pellet i 50 µL av GLOX Buffer uten enzymer. Pipetter opp og ned 3 - 4 ganger å blande.
- Holde alle unimaged prøvene i boksen folie-dekket på 4 grader til du er klar til bildet. Når du er klar å image, sentrifuge prøvene ~ 376 x g i 2 minutter og fjerne nedbryting helt ved pipettering. Resuspend i GLOX med enzymer som nedenfor.
- Prøver å være fotografert umiddelbart legge 15-20 µL av GLOX buffer med enzymer. Pipetter forsiktig opp og ned for å blande.
Merk: Volumet lagt kan variere avhengig av det cellen pellet. Vi anbefaler resuspending av pellets i 15 µL av GLOX buffer med enzymer og finne celle tettheten på mikroskopet. Hvis cellene er for tette (celler clumping oppå hverandre), kan du legge til ekstra GLOX buffer med enzymer. Hvis cellene er for sparsom, sentrifuge utvalget og fjerner ~ 5 µL av bufferen. - Pipetter 5 µL mot dekkglassvæske (18 mm x 18 mm, nr. 1), og sette dekkglassvæske på et lysbilde.
- Sette en laboratorium tørke på lysbildet der dekkglassvæske er plassert. Trykk forsiktig på laboratoriet tørke sette lysbildet (burde se flytende kommer ut fra alle fire kanter på dekkglassvæske).
- Overføre lysbildet til mikroskopet rommet i en boks dekket av aluminiumsfolie.
- Bildet med et bredt felt fluorescens mikroskop med forstørring (60-100 X) og høy numeriske blenderåpning.
Merk: For å samle maksimal fotoner fra smFISH sonder, AC confocal mikroskop anbefales ikke, som de betydelig begrense mengden lys inn. Her dataene ble samlet på et mikroskop utstyrt med 100 X, 1,4 NA mål, bruke filtre CY5 (EX632/22, EM679/34) avbildet på 1.3 s, 100% T; TRITC (EX542/27, EM597/45), 1.3 s, 100% T; og DAPI (EX390/18, EM435/48), 0,05-0,1 s, 32% - 50% T. En referanseavbildning av lyse-feltet bør også være ervervet. Få 15-25 skiver trinn størrelse 0.1-0.2 µm, fra helt under fokus for synsfelt helt over, for å sikre at alle RNA flekker regnskapsføres.
4. bildeanalyser
- Analysere smFISH data publisert smFISH analyseverktøy som fisk-quant17 og StarSearch2eller skreddersydde programmer, avhengig av nøyaktig hva eksperimentet.
Merk: En god analyse rørledning bør tillater brukere å bestemme en terskel til å skille ekte RNA flekker fra bakgrunnen, og statistikk som X, Y og Z (valgfritt) koordinatene og intensiteten på hvert sted, hvor mange steder i hver celle , og muligens passende parametere som en måte å filtrere ut false oppdagelsen.
Representative Results
Evaluere hvor godt smFISH protokollen arbeidet (beskrevet i figur 1), vi utviklet et sett med 54 sonder som flis åpent lesing rammen av NDC80 genet (figur 2A, topp). Sonden ligger i de 5' enden kalles sonde 1; morgendagen ettall, undersøke 2; og den tredje, undersøke 3, etc. 27 sonder tildelt en odde tall (Probe 1, 3, 5...) er konjugert til CAL Fluor 590 (CF590) fluorescerende farge; og 27 sonder tilordnet et partall (Probe 2, 4, 6...), konjugert til Quasar 670 (Q670) fluorescerende farge. Derfor er disse vekslende sonde sett ofte referert til som "oddetall/partall" sonder. På hybridisering, bør settene sonde etiketten samme transkripsjon.
Etter sted brukte vi noen mål for å bedømme kvaliteten på smFISH datasettet. Den første var den grad og kvaliteten på colocalization for oddetall/partall sonder. I vårt tilfelle colocalized 88% av alle de smFISH stedene (figur 2A og 2B), med mer enn 95% av flekker sammen innen 2 piksler av hverandre (figur 2C, sammenkoblet), som er den forventede verdien gitt noen kromatisk og gjenkjenning avvik mellom de to fluorescerende kanalene. Til sammenligning mindre enn 10% av kortet hadde nærmeste nabo avstand på mindre enn 2 piksler, viser at sannsynligheten for nettverksinnstillingene noen spot er lav (figur 2C). De 12% av kortet var jevnt fordelt mellom de to kanalene (figur 2B, sammenlign CF590 bare med Q670-bare); og dermed vi konkluderte med at for denne 2,4 kb genet med en rekke uttrykk mellom null til 45 transkripsjoner per celle, ~ 94% av RNA molekyler ble funnet i hver fluorescerende kanal. Hvis smFISH protokollen var suboptimal, ville man observere (1) en større del av de smFISH stedene med bare en av to fluorescerende signaler (ikke colocalized) og/eller (2) celler med en svært lav signal-til-støy-forhold eller intet signal på alle.
Vi spurte deretter om oppdagelsen av smFISH signalet var forutinntatt forhold til totalt antall RNA molekyler per celle. I en befolkning ligger det totale antallet av en bestemt i hver celle i en distribusjon, med noen celler huse mer RNA molekyler enn andre. En god smFISH protokollen skal robust oppdage RNA uansett om en høyt eller lavt antall RNA molekyler er tilstede i hver celle. For å teste dette, for hver celle, beregnet vi brøkdel av de smFISH stedene med colocalized signaler og brøken med bare én av to fluorescerende signaler. Etter gruppering cellene som hadde samme antall totale kapasitet per celle, vi beregnet gjennomsnittlig brøkdel av colocalized (forbundet) eller ikke-colocalized (bare CF590 eller bare Q670) flekker i en gitt gruppe, og grafisk dette gjennomsnittet som en funksjon av antall kapasitet per celle (Figur 3). For hver kategori av var fraksjoner like over hele omfanget av antall flekker per celle. For eksempel, var sammenligne cellene med totalt 20 fluorescerende flekker per celle versus de med totalt 30 flekker, gjennomsnittlig fraksjoner av de colocalized stedene lik. Dette resultatet foreslo at våre protokollen finner et utvalg av RNA molekyler i en celle (til minst ~ 40 molekyler per celle). Hvis protokollen jobbet suboptimally, kan man observere en skjevhet. For eksempel kan brøkdel av stedene med bare én av to fluorescerende signalene øke som antall flekker per celle økt.
Bruker denne optimalisert protokollen, undersøkte vi uttrykket av NDC80 genet, som koder en kinetochore protein, i ulike vekst forhold. NDC80 genet uttrykker to mRNA isoformene: lenge undecoded transkripsjon isoformen, NDC80luti, har filtypen ~ 400 base parene i 5' slutten i forhold til korte NDC80ORF isoformen, men begge transkripsjoner dele regionen koding av NDC80 genet (se skjematisk i figur 4A). Vi utviklet to sett med sonder: The CF 590 sett binder seg til den unike 5' regionen NDC80luti; og Q 670 settet binder til vanlige regionen NDC80luti og NDC80ORF. NDC80luti transkripsjoner ble oppdaget som de smFISH stedene der signalene fra begge sonde sett colocalized, mens den NDC80ORF utskrifter var de med signalet fra Q 670. På grunn av størrelsen på den unike delen av NDC80luti, kan vi bare flis 20 oligonucleotide sonder langs denne regionen, som er lavere enn de anbefalte 30-48 sonder. Derfor bestemt vi først Hvis denne sonde sett finner robust RNA i våre optimalisert protokollen. For enten fluorescerende kanal, vi grafisk signal-til-støy-forhold (SNR, definert som variansen for bildepunktene rundt et sted i forhold til spot intensiteten) mot signalet oppdaget for hver smFISH spot, og genererte en scatterplot for alle flekker identifisert i hele synsfeltet (eksempel bilder i figur 4A ) og tomter i figur 4B. To forskjellige bestander var tydelig identifisert for både den Q 670 og CF 590 sonden setter (optimalisert, figur 4B), tyder på at den sanne smFISH flekker (inne det grå området) kan skilles fra bakgrunnen signalet. Merk at suboptimal tilstanden, slik separasjon var mindre opplagt (Suboptimal, figur 4B).
Vi brukte disse to sonde sett for å studere uttrykk for NDC80luti og NDC80ORFunder vegetativ vekst og meiose. I vegetative celler, robust signal fra Q 670 sonde settet ble oppdaget, men fra CF-590 sonde satt ikke (figur 5A, vegetativ), enige med observasjon av nordlige blotting som bare kort isoformen ble uttrykt i vegetativ vekst16 . Dette resultatet foreslo også at CF 590 sonde settet er spesifikt, gir lav bakgrunn i våre optimalisert smFISH protokollen. I kontrast, robust signal fra settene sonde ble oppdaget i meiotic prophase, og fleste av stedene hadde colocalized signal (figur 5A, meiotic prophase). Sammen med Nord blot analyse (figur 5B) bekreftet denne observasjonen at den lenge isoformen NDC80luti ble uttrykt i meiose. Disse to typer mRNAs ble oppdaget i cytoplasma (utenfor DAPI regionen), tyder på at begge ble eksportert fra kjernen, samsvar med ribosom profilering data18.
For å avgjøre hvis nok data ble samlet til nøyaktig konto for biologisk variasjon iboende til våre datasett, utført vi bootstrap analyse ved hjelp av statistikk for hver celle som inkluderte (1) brøkdel av de colocalized stedene per celle og (2) brøkdel av stedene med en av to fluorescerende signaler (CF 590 bare og Q 670 bare). I denne analysen var valgt et program tilfeldig en celle fra 437 kvantifisert celler for 500 gjentakelser. Deretter ble gjennomsnittet og variansen av respektive statistikk knyttet til disse 500 merkede celler beregnet. Denne prosessen ble deretter gjentatt for tilfeldig velge to celler fra alle cellene, uten utskifting; og så for tilfeldig velge tre celler, etc. før en halvparten av den totale datasett størrelsen ble nådd. Avviket i datasettet plateaued etter ~ 40 celler, antyder at etter dette punktet mesteparten av variasjonen i gjennomsnittet er iboende til dataene i stedet for en gjenstand av undersampling (figur 6, innfelt). Denne effekten ble mer tydelig når vi grafisk eksempel avviket delt utvalgsgjennomsnittet, som en funksjon av antall celler samplet i hver gjentakelse syklus (figur 6). Dataene vises, ble endringen i avviket diminishingly liten etter ~ 60 celler. Antall celler kvantifisert i et smFISH eksperiment bør overstige det minste antallet celler kreves for å oppnå en stabil middelverdi og et platå av varians. I vårt tilfelle kvantifisert vi over 95 celler per eksempel per replikere. Antall celler (> 400 celler) overskredet også antallet celler (~ 60 celler) kreves for å gjenspeile populasjonen.
Med en skreddersydd Matlab programmet16, vegetative celler ble funnet for å ha en median på 5 NDC80ORF utskrifter per celle, mens i meiotic prophase celler, medianen betydelig falt til 4 transkripsjoner per celle (tosidig Diversified Rank Sum test, p = 0.026) (figur 7). Median antall NDC80luti utskrifter per celle var 21 transkripsjoner, og 100% av cellene uttrykte NDC80luti utskrifter. Vi grafisk brøkdel av cellene med et gitt antall utskrifter som et step-wise, relative frekvensen histogram fordi mRNA molekyler er et diskret antall. Den største hyllen av hver histogrammet var normalisert til samme høyde.
Figur 1: Flow-chart for smFISH protokollen. Celler er løst med formaldehyd ved romtemperatur for 20 min eller 4 grader over natten, for vegetativ vekst prøver og meiotic prøver, henholdsvis. Etter vask i Buffer B tre ganger, er celler fordøyd av zymolyase til ~ 70% - 90% av cellene er fordøyd. Fordøyd prøvene er deretter vaskes en gang med Buffer B fjerne zymolyase, og senere permeabilized i 70% etanol (EtOH) ~3.5 timer. For å forberede hybridisering, er prøver først ruges i 10% formamide vaskebuffer (FWB) for ~ 20 min. Deretter er prøvene resuspended i ~ 50 µL av hybridisering løsning, som inneholder fluorescerende sonder, for overnatting inkubasjon i mørket på 30 grader. Etter hybridisering, er prøvene ruges i 10% FWB i 30 min å vaske bort overflødig sonder, og deretter ruges i 10% FWB med 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) stain DNA. For prøven fotografert umiddelbart etter den FWB/DAPI-inkubering, er prøven resuspended i GLOX bufferen med catalase, Trolox og glukose oxidase (GLOX + enz); mens andre prøvene er resuspended i GLOX bufferen uten enzymer, og lagret på 4 grader til ~ 3 timene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: vurdering av smFISH kvalitet med oddetall/partall sonder. (A) topp: Skjematisk for oddetall/partall sonde settene. Femti-fire oligonucleotide sonder flislegging NDC80 genet ble utformet. Oddetalls-sonder ble merket med en fluorophore (CF590, vises i magenta) og partalls-sonder, med en annen fluorophore (Q670, vises i grønt). Bunnen: Representant smFISH bilder av meiotic prophase celler anskaffes ved hjelp av oddetall/partall sonde settene. Prøvene ble tatt timer etter celler (UB8144) ble overført til sporulation medium, en tid når disse cellene ble arrestert i meiotic prophase. DNA var farget med DAPI (vist i blått). Bilder vises som de maksimale intensitet projeksjoner av z-stabler. Skala bar: 5 µm. (B) prosent av de sammenkoblede eller kortet smFISH stedene får oddetall/partall sonde settene. Totalt 428 meiotic prophase celler ble analysert, pooling fra to uavhengige eksperimenter. Dette tallet er endret fra figur 2-figur tillegg 4 på Chen et al. 16 (C) en kumulativ tetthet funksjonen (CDF) av avstanden mellom hvert par av sammenkoblede flekker og avstanden mellom nærmeste nabo av en kort spot. For hver oppdaget stedet i en fluorescerende kanal, "k nærmeste nabo" algoritmen ble brukt til å identifisere nærmeste oppdaget stedet – og avstanden til det stedet-i komplementære kanalen. Steder som var gjensidig nærmeste naboer ble ansett å være forbundet, og en ny liste ble generert innspillingen de sammenkoblede CF590-bare og bare Q670 oppdagelser. Hver kategori av oppdagelser, var en CDF-histogram av avstanden tegnet inn i Matlab, bekrefter at riktig tilkoblet flekker faktisk var mye nærmere i avstand enn de uten en tilsvarende i den andre kanalen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: fraksjoner av sammenkoblede og hender, som en funksjon av det totale antallet per celle. For å teste om gjenkjenning og sammenkobling av de smFISH stedene var forutinntatt på ulike uttrykk nivåer, var enkeltceller gruppert etter totale RNA uttrykket. Mener fraksjoner av sammenkoblede CF590-bare og bare Q670 detektiv ble beregnet for hver gruppe med celler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Kvalitetsvurdering smFISH data generert ved hjelp av sonder designet for NDC80luti og NDC80ORF mRNAs. Q 670 sonder (vist i grønt) hybridize til vanlige regionen mellom NDC80luti og NDC80ORF mRNAs, mens CF 590 sonder (vises i magenta) hybridize til unike 5' regionen NDC80luti . (A) representant smFISH bilder av NDC80luti og NDC80ORF i meiotic prophase, under optimalisert versus suboptimal forhold. Stammer UB8144 (optimalisert tilstand) og UB1337 (suboptimal tilstand) ble overtalt til å gjennomgå meiose og fast under meiotic prophase. Disse to stammer havn forskjellige synkronisering systemer for å indusere meiose, men bruk av enten systemet påvirker ikke smFISH kvalitet (data ikke vist). Suboptimal tilstanden, ble celler løst ved romtemperatur for 20 min (ingen overnatting fiksering), fordøyd med zymolyase uten VRC supplert, og hybridiserte i en lavere konsentrasjon av VRC. Bilder vises som de maksimale intensitet projeksjoner av z-stabler. DNA var farget med DAPI (vist i blått). Skala bar: 5 µm. (B) Scatterplots signal-til-støy-forhold (SNR) og signalet fra hver smFISH spot i synsfeltet presentert i figur 4A, for enten fluorescerende kanal og optimalisert eller suboptimal betingelsene. Optimalisert tilstanden var to bestander av de smFISH stedene tilstede. Den sanne smFISH flekker ble plassert innenfor det grå området, skille fra bakgrunnen signalet. Suboptimal tilstanden, personlige mRNAs var vanskelig å skille av øyet, og avstanden mellom ekte flekker og bakgrunn etter running den stedet programvaren var mindre opplagt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Uttrykk for NDC80luti og NDC80ORF utskrifter kontrolleres timelig. (A) representant smFISH bilder av NDC80luti og NDC80ORF under vegetativ vekst og meiose. Vegetative prøver ble tatt når celler (UB8144) vokste eksponentielt i nærings rik medium. Meiotic prophase prøver ble tatt timer etter celler (UB8144) ble overført til sporulation medium, en tid når disse cellene ble arrestert i meiotic prophase. Q 670 sonder (vist i grønt) hybridize til vanlige regionen mellom NDC80luti og NDC80ORF mRNAs, mens CF 590 sonder (vises i magenta) hybridize til unike 5' regionen NDC80luti . DNA var farget med DAPI (vist i blått). Hver celle var iscenesatt av dekningen Zip1-GFP, en markør for meiotic prophase. Våre smFISH protokollen beholder sterkt GFP signal uten videre endringer. Vegetativ vekst: Zip1-GFP negativ. Meiotic prophase: Zip1-GFP-positive. Bilder vises som de maksimale intensitet projeksjoner av z-stabler. Skala bar: 5 µm. Dette tallet er endret fra figur 2C av Chen et al. 16. (B) NDC80ORF, NDC80lutiog Ndc80 protein (Ndc80p) nivå under meiose (UB4074). NDC80luti og NDC80ORF nivåer ble fastsatt av nordlige blot og Ndc80p nivå ble bestemt av anti-V5 immunoblot på angitt tidspunkt. Hxk1p, laster inn kontroll for immunoblot. Så belastning UB8144, denne belastningen også havner i pGAL-NDT80 GAL4-ER synkronisering system19,20. Cellene ble overført til sporulation middels på 0 time og utgitt fra pachytene arrestasjonen av β-østradiol tillegg 6 timer senere. NDC80luti transkripsjon robust fant i S/meiotic prophase, mens den NDC80ORF utskrifter var hovedsakelig tilstede før meiotic oppføring (0 time) og under meiotic divisjonene (7-9 timer). Dette tallet er endret fra figur 6J av Chen et al. 16 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Bootstrap analyse utført for meiotic prophase prøvene vises i Figur 5 . Alle kvantifisert var samlet, og et gitt antall (n) celler ble tilfeldig valgt 500 ganger. Midlere og 95% konfidensintervall var beregnet for brøkdel av sammenkoblede og hender mRNA per celle. Disse dataene ble plottet for hvert valg av nummer n (innfelt). Platået i avviket var visualisert ved å plotte eksempel avviket delt på gjennomsnittet, som en funksjon av antall celler (n) samplet. Antall celler målt (437 celler) sterkt overstiger antallet som feilen platå (~ 60 celler), som indikerer at ytterligere data ikke ville forbedre tilliten i målinger. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: kvantifisering av smFISH dataene på Figur 5 , kurven fremstilt som relative hyppigheten histogrammer for cellene med et gitt antall NDC80luti og NDC80ORF utskrifter per celle, bruker data samlet fra tre uavhengige eksperimenter. Den stiplede linjen angir median antall NDC80luti og NDC80ORF utskrifter per celle. Hver histogrammet var normalisert slik at maksimal bin høyden var den samme på tvers av alle histogrammer. Totalt 637 celler ble analysert for vegetativ vekst og 437 for meiotic prophase. Tosidig Diversified rang Sum test ble utført for NDC80luti og NDC80ORFhenholdsvis sammenligne vegetative og meiotic prophase prøver. Dette tallet er endret fra figur 2D av Chen et al. 16 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Buffer B (1 L lager: 1,2 M sorbitol; 0.1 M kalium fosfatbuffer, pH 7.5) | 1 x |
| Nuclease-fritt vann | 500 mL |
| Sorbitol | 218.6 g |
| KH2PO4 | 2,18 g |
| K2HPO4 | 14.62 g |
| Nuclease-fritt vann | Ta 1 L siste volum |
| * Lagre på 4 grader i 50-mL dele etter filteret sterilisering | |
| Zymolyase 100T (10 mg/mL) | |
| * Lagre på-20 grader i dele | |
| Oppløse 10 mg zymolyase pulver i 1 mL MilliQ vann | |
| E. coli tRNA (10 mg/mL) | |
| * Lagre på-20 grader i dele | |
| Oppløse 10 mg tRNA pulver i 1 mL MilliQ vann | |
| 70% etanol (50 mL) | 1 x (mL) |
| Ren etanol | 35 |
| Nuclease-fritt vann | 15 |
| * Lagre ved romtemperatur | |
| Hybridisering Buffer (10 mL) | 1 x (mL) |
| 50% dekstran sulfate | 2 |
| E. coli tRNA (10 mg/mL) | 1 |
| 200 mM Vanadyl ribonucleoside kompleks (VRC) | 0,1 |
| BSA, 50 mg/mL | 0,04 |
| 20 x SSC | 1 |
| Formamide | 1 |
| Nuclease-fritt vann | 4.86 |
| * Lagre på-20 grader i 250-µL eller 500-µL dele | |
| 10% formamide vaskebuffer (10 mL) | 1 x (mL) |
| Formamide ved romtemperatur | 1 |
| 20 x SSC | 1 |
| Nuclease-fritt vann | 8 |
| * gjøre ferske vortex for 20-30 årene å blande | |
| 10% glukose løsning | |
| * Lagre på 4 grader i dele etter filteret sterilisering | |
| Oppløse 1 g av glukose i 10 mL nuclease uten vann | |
| Gluko | |
| * Lagre på-20 grader i dele | |
| Oppløse 3.7 mg gluko i 1 mL av 50 mM NaOAc, pH 5 | |
| Anti-blekemiddel (GLOX) Buffer, uten enzymer (1 mL) | 1 x (µL) |
| 10% glukose i nuclease-fritt vann | 40 |
| 1 M Tris, pH 8.0 | 10 |
| 20 x SSC | 100 |
| Nuclease-fritt vann | 850 |
| * gjør frisk, kan også lagre dele på 4 grader | |
| Anti-blekemiddel (GLOX) Buffer, med enzymer (50 µL) | 1 x (µL) |
| Catalase (vortex mildt, den utligner lett) | 0,5 |
| Gluko | 0,5 |
| 100 mM Trolox (oppløst i etanol) | 1 |
| GLOX buffer | 50 |
| * lage fersk hver gang, forberede på is, kan lagres på 4 grader i 2-3 timer |
Tabell 1. Buffere og media
Discussion
Protokollen presenteres her er avledet fra andre publiserte smFISH protokoller2,3,21,22,23, og er spesielt optimalisert for gjær belastning bakgrunnen SK1. Parameterne optimalisert inkludert celle nummer, fiksering varigheten, sentrifugering hastigheten og varighet, fordøyelsen varighet, fordøyelsen buffer, sonde konsentrasjon og hybridisering buffer. Andre parametere som hybridisering temperatur og varigheten var ikke optimalisert. I denne delen dele vi noen notater som kan tilpasse denne protokollen for eventuelle gjær belastning bakgrunn og vekst forholdene rundt.
Cellen vegg av spirende gjær er en stor utfordring mot å oppnå høy kvalitet smFISH bilder i spirende gjær fordi cellen vegg forhindrer sonde penetrasjon. Ufullstendig fordøyelsen av cellen vegg av zymolyase fører til ineffektiv hybridisering sonder og høye celle til celle variasjon i signal. Men kan over fordøyelsen gjøre celler for skjøre, fører til betydelig celle tap under vask trinnene og cellen sprengning under lysbildet forberedelse for bildebehandling. Dermed er optimalisere varigheten av fordøyelsen avgjørende. Vi anbefaler å gjennomføre en pilot smFISH eksperiment ved å fordøye samme utvalget for forskjellige mengder tid. I vårt tilfelle oppnådd vi best smFISH dataene hvis vi stoppet fordøyelsen når ~ 80% av celler ble ikke-refraktiv. Vanligvis for samme vekst betingelsen, kan ulike genetisk muterte stammer bli fordøyd med lignende timing. Varigheten av fordøyelsen er imidlertid sammenlignet blant annet vekst forhold og ulike stadier av meiose i spirende gjær. Når tidspunktet er bestemt, er kvaliteten på smFISH reproduserbare. Merk kan at for mutant stammer med defekt cellevegg syntese og/eller sammensetning, fordøyelsen kan gjennomføres på mindre enn 15 min. Bruk av ulike grupper av zymolyase også litt endre fordøyelsen timing.
Optimal sonde konsentrasjon er nødvendig for å oppnå en høy signal-til-støy-forhold. Vi designet og kjøpt våre smFISH sonder kommersielt. God sonder (ofte 20-mers) bør ha en prosentandel av GC spenner fra 35% til 45%, en avstand på 2 base parene mellom sonder, og lav kryss-reaktivitet minst. Vi brukte en webbasert sonde designer fra produsenten til å generere en liste over sonder, og hvis det var nok sonder å velge mellom, vil vi bruke BLAST algoritmen i Saccharomyces genomet databasen for å eliminere sonder med mer enn 17 base parene overlappet med andre genomisk. Vi valgte mer photostable fluorescerende farge (CAL Fluor 590) for sonden settet som anneals til den unike regionen NDC80luti (CF 590) fordi i dette settet, antall sonder som fornøyd alle de ovennevnte kriteriene (20 sonder) var lavere enn den minimum antall anbefalt av produsenten (~ 25 sonder). Etter gjenoppbygge sonde løsningen etter produsentens instruksjoner, gjorde vi en 1:10 fortynning av lager løsningen og lagret utvannet løsningen i 5-µL dele på-20 grader. Hver aliquot ble brukt bare en gang. For optimalisering, bør man gjøre føljetong fortynninger fra 1:10 utvannet løsning og test som konsentrasjon gir best signal-til-støy-forhold. Vi anbefaler å foreta en fortynning rekke 1:250, 1:500, 1:1000 og 1:2000 fra det opprinnelige lageret. I vårt tilfelle førte en fortynningsfaktoren for 1:500 beste signal-til-støy forholdet, for både CF 590 og Q 670 sonde sett.
Optimal fiksering tid er også avgjørende for vellykket smFISH i spirende gjær. Vi fant at natten fiksering på 4 grader, snarere enn fikse ved romtemperatur for 20 min, forbedret konsistens og kvaliteten på smFISH resultatene for meiotic prøver. Selv om vi ikke har testet hvordan natten fiksering kan påvirke vegetative prøver, fiksering ved romtemperatur fungerte bra for denne veksten tilstanden. Dermed for å optimalisere smFISH protokollen for nye stammer eller betingelser for vekst, anbefaler vi starter med kort fiksering tid ved romtemperatur og øke fiksering tid hvis det høye variasjon av signal.
Sammenlignet med andre publiserte protokoller3,22,23, bruker vår protokollen den RNase inhibitor VRC under fordøyelsen og en høyere konsentrasjon av VRC under hybridisering. Tillegg av VRC i disse to trinnene forbedret konsistensen av smFISH resultatene, muligens med bedre bevare RNA molekyler mot nuclease aktivitet, som kan være innført av zymolyase mix (enzymet er renset fra råolje ekstrakter og kan inneholde RNase forurensninger). Derfor anbefaler vi bruker mengde VRC som er oppført i protokollen eller enda høyere konsentrasjoner av VRC for optimalisering.
En betydelig del av cellene kan gå tapt under vask trinnene i både Buffer B og vaskebuffer formamide. For å redusere tap av cellen, kan en øke sentrifugering hastigheten. I vårt tilfelle vasker med høy hastighet (21000 x g) for å pellets våre prøver under Buffer B reduserte celle tap. Imidlertid blir celler svært skjøre etter zymolyase fordøyelsen, slik endring sentrifugering hastigheten ikke anbefales. I stedet foreslår vi bruke lav-vedheft rørene fra USA vitenskapelig, som hjelper pellets cellene under vasker i formamide vaske bufferen. Samlet kan våre protokollen konsekvent generere en monolayer av celler tett nok for effektiv bildebehandling. Vanligvis 7 synsfelt skal gi > 130 celler egnet for kvantifisering.
Endelig er det viktig å bestemme optimale parametere for og utganger behov fra bildeanalyser. For å finne smFISH steder, publiserte analyse programmer vanligvis filtrere raw-bilder bruke Gaussian kjernen til å fjerne bakgrunn signal, og be brukerne å bestemme signal-til-støy forholdet skal brukes for hvert sett med bilder2,17. Dessverre, det er ikke en enkelt standard som riktige parametere er bestemt, og så noen empirisk testing av disse forskjellige innstillinger er nødvendig. Hvis du vil angi parametere som kreves for hver av disse trinnene, må man iterativt inn ulike sett med parametere og sjekke hvor godt resultatene fra hvert kamper som fra manuell telling i noen representant celler. Når et sett med parametere er funnet, kan den brukes for det meste av bilder innhentet til tross for ulike vekst forhold og genetisk bakgrunn.
I tillegg kan en test Hvis maksimalt intensitet projeksjon av smFISH bildene kan utføres før kvantifisering22. Dette trinnet forenkler den spot algoritmen og reduserer tenkelig tid, men på bekostning av noen potensielt nyttig informasjon om enkeltsteder, som deres subcellular lokalisering. I vårt tilfelle var antall mRNA molekyler produsert av NDC80 genet lav nok til at de ble godt skilt etter denne behandling (ikke uvanlig for utskrifter i spirende gjær3,7). I tilfeller der colocalization analyse er kritisk må analyse rørledningen bestemme plasseringen av hver smFISH spot i hver enkelt kanal å vurdere colocalization. Avhengig av konkrete spørsmål blir spurt, annen informasjon som intensiteten av hver spot må også hentes fra pipeline for videre analyse. Optimalisere nøkkelen trinn i protokollen og rørledningen bildet analyse er avgjørende i å få høy kvalitet for smFISH å studere spørsmålet rundt.
Disclosures
Forfatterne har noen interessekonflikt avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Anne Dodson og Stephanie Heinrich for råd om hvordan å optimalisere smFISH protokollen, Xavier Darzacq for hjelp med analyse plattform, Haiyan Huang forslag på den statistiske analysen. Dette arbeidet ble støttet av midler fra mars Dimes (5-FY15-99), Pew veldedige stiftelser (00027344), Damon Runyon Cancer Research Foundation (35-15) og Glenn Foundation som EÜ og et NSF Graduate forskning Fellowship Grant. DGE-1106400 til JC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BSA, RNase-free (50 mg/mL) | Ambion | AM2616 | Store at -20 °C. |
| Catalase | Sigma | C3515 | Store at 4 °C for short-term. Vortex before use. |
| DAPI | Sigma | D9564 | Store at -20 °C after reconstitution in water. Protect from light. |
| 50% Dextran Sulfate | Milli Pore | S4030 | Store at room temperature. Very viscous liquid. Handle with patience. |
| E. coli tRNA | Sigma | R4251 | Store at -20 °C in aliquots after reconstitution in water. |
| Ethanol (100%, 200 proof) | various | Flammable. | |
| 37% Formaldehyde | Fisher | F79-500 | Store at room temperature. Toxic. Use and dispose with caution. |
| Formamide | Ambion | AM9342 | Store at 4 °C. Open after the temperature equilibrates to room temperature in order to prevent oxidation. Toxic. Use and dispose with caution. |
| Glucose | various | Store at 4 °C after dissolving in nuclease-free water. | |
| Glucose oxidase | Sigma | G2133 | Store at -20 °C in aliquots after reconstitution in 50 mM NaOAc, pH 5. |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9932 | Store at room temperature. |
| Potassium phosphate (monobasic and dibasic) | various | Store at room temperature. | |
| Probe library, diluted in TE, pH 8.0 | Biosearch Technologies | Store at -20 °C in aliquots (5 µL) after reconstitution in TE pH 8.0, following the instructions from the manufacturer. Protect from light. | |
| Sorbitol | various | Store at room temperature. | |
| 20X SSC | Ambion | AM9763 | Store at room temperature. |
| TE, pH 8.0 | Ambion | AM9849 | Store at room temperature. |
| 1 M Tris, pH 8.0 | Ambion | AM9856 | Store at room temperature. |
| Trolox | Sigma | 238813 | Store at -20 °C in aliquots. |
| 200 mM Vanadyl ribonucleoside complex (VRC) | NEB | S1402S | Store at -20 °C in aliquots after reconstitution, following the instructions from the manufacturer. |
| Zymolyase 100T | MP Biomedicals | 08320932 | Store at -20 °C in aliquots after reconstitution in water. |
| Low-adhesion tubes | USA Scientific | 1415-2600 | Store at room temperature. |
References
- Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280 (5363), 585-590 (1998).
- Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
- Rahman, S., Zenklusen, D. Single-molecule resolution fluorescent in situ hybridization (smFISH) in the yeast S. cerevisiae. Methods Mol Biol. 1042, 33-46 (2013).
- Gaspar, I., Ephrussi, A. Strength in numbers: quantitative single-molecule RNA detection assays. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 4 (2), 135-150 (2015).
- Vargas, D. Y., et al. Single-molecule imaging of transcriptionally coupled and uncoupled splicing. Cell. 147 (5), 1054-1065 (2011).
- Waks, Z., Klein, A. M., Silver, P. A. Cell-to-cell variability of alternative RNA splicing. Mol Syst Biol. 7, 506 (2011).
- Zenklusen, D., Larson, D. R., Singer, R. H. Single-RNA counting reveals alternative modes of gene expression in yeast. Nat Struct Mol Biol. 15 (12), 1263-1271 (2008).
- Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells. PLoS Biol. 4 (10), e309 (2006).
- Senecal, A., et al. Transcription factors modulate c-Fos transcriptional bursts. Cell Rep. 8 (1), 75-83 (2014).
- Levesque, M. J., Ginart, P., Wei, Y., Raj, A. Visualizing SNVs to quantify allele-specific expression in single cells. Nat Methods. 10 (9), 865-867 (2013).
- Hansen, C. H., van Oudenaarden, A. Allele-specific detection of single mRNA molecules in situ. Nat Methods. 10 (9), 869-871 (2013).
- Ginart, P., et al. Visualizing allele-specific expression in single cells reveals epigenetic mosaicism in an H19 loss-of-imprinting mutant. Genes Dev. 30 (5), 567-578 (2016).
- Long, R. M., et al. Mating type switching in yeast controlled by asymmetric localization of ASH1 mRNA. Science. 277 (5324), 383-387 (1997).
- Park, H. Y., Trcek, T., Wells, A. L., Chao, J. A., Singer, R. H. An unbiased analysis method to quantify mRNA localization reveals its correlation with cell motility. Cell Rep. 1 (2), 179-184 (2012).
- Jourdren, L., Delaveau, T., Marquenet, E., Jacq, C., Garcia, M. CORSEN, a new software dedicated to microscope-based 3D distance measurements: mRNA-mitochondria distance, from single-cell to population analyses. RNA. 16 (7), 1301-1307 (2010).
- Chen, J., et al. Kinetochore inactivation by expression of a repressive mRNA. eLife. 6, e27417 (2017).
- Mueller, F., et al. FISH-quant: automatic counting of transcripts in 3D FISH images. Nat Methods. 10 (4), 277-278 (2013).
- Brar, G. A., et al. High-resolution view of the yeast meiotic program revealed by ribosome profiling. Science. 335 (6068), 552-557 (2012).
- Carlile, T. M., Amon, A. Meiosis I is established through division-specific translational control of a cyclin. Cell. 133 (2), 280-291 (2008).
- Benjamin, K. R., Zhang, C., Shokat, K. M., Herskowitz, I. Control of landmark events in meiosis by the CDK Cdc28 and the meiosis-specific kinase Ime2. Genes Dev. 17 (12), 1524-1539 (2003).
- Dodson, A. E., Rine, J. Heritable capture of heterochromatin dynamics in Saccharomyces cerevisiae. eLife. 4, e05007 (2015).
- Trcek, T., et al. Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast. Nat Protoc. 7 (2), 408-419 (2012).
- Youk, H., Raj, A., van Oudenaarden, A. Imaging single mRNA molecules in yeast. Methods Enzymol. 470, 429-446 (2010).
