Summary
Esta sola molécula fluorescencia en situ hibridación protocolo está optimizado para cuantificar el número de moléculas de ARN en levadura de florecimiento durante la meiosis y crecimiento vegetativo.
Abstract
Sola molécula en situ hibridación de la fluorescencia (smFISH) es una técnica poderosa para el estudio de expresión génica en las células debido a su capacidad para detectar y contar las moléculas de ARN individuales. Complementaria a métodos basados en la secuenciación profunda, smFISH proporciona información sobre la variación de célula a célula en abundancia de la transcripción y la localización subcelular de un determinado RNA. Recientemente, hemos utilizado smFISH para estudiar la expresión del gene de NDC80 durante meiosis en levadura de florecimiento, en que dos transcripción existen isoformas y la isoforma corta transcripción tiene su secuencia todo comparte con la isoforma larga. Para identificar con confianza cada isoforma de transcripción, conocido smFISH protocolos optimizados y obtuvo alta consistencia y calidad de los datos smFISH para las muestras que se adquirieron durante el florecimiento levadura meiosis. Aquí, describimos este protocolo optimizado, los criterios que utilizamos para determinar si se obtiene alta calidad de los datos de smFISH y algunos consejos para la aplicación de este protocolo en otras cepas de levadura y las condiciones de crecimiento.
Introduction
Regulación dinámica de la expresión génica impulsa el desarrollo de un organismo, así como su respuesta al estrés ambiental, infección y cambios en el metabolismo. Estudios que se centran en la regulación transcripcional se basan en tecnologías que miden la abundancia de RNA. Un tal método, denominado sola molécula en situ hibridación de la fluorescencia (smFISH), se utiliza para la detección individuales de moléculas de ARN en las células1,2. Este método permite la medición de la variabilidad de célula a célula en la expresión génica y la determinación de la localización intracelular de RNA.
En la técnica de smFISH más utilizados, la detección de una molécula de RNA individual requiere múltiples cortas sondas de ADN (a menudo ~ 48 20-mer sondas) que son complementarios en el destino del RNA y se conjugan en el mismo tinte fluorescente. Fijación de una sola sonda fluorescente resulta en una señal débil, pero la señal desde el conjunto de todas las sondas es robusta. Esta característica mejora considerablemente la relación señal a ruido porque a pesar de una sola punta de prueba puede exhibir objetivo vinculante, tal señal se espera que sea muy débil en comparación con el objetivo de la molécula de RNA3. Dentro de error de detección, el número de moléculas de ARN puede ser contado y comparado en diferentes condiciones de crecimiento y entre mutantes diferentes.
Desde su primer desarrollo, smFISH ha sido adaptado para estudiar diversos aspectos de la gene expresión4, tales como transcripción elongación1,2,5,6, transcripcional estallar7 de empalme , 8 , 9la expresión alélica intracelular10,11,12y RNA localización13,14,15. Recientemente, hemos utilizado este método para estudiar la expresión de ambas isoformas de la transcripción del mismo gen, en la que la isoforma corta transcripción (NDC80ORF) tiene su secuencia de todo comparte con la isoforma larga (NDC80luti )16. Para identificar de forma única las dos isoformas mRNA, utilizamos dos tipos de sonda: un sistema es específico de la secuencia única de NDC80luti, y el otro conjunto, conjugado a otro colorante fluorescente, se une a la región común de las dos isoformas. NDC80luti RNA es identificado como un lugar colocalized con ambas señales fluorescentes, mientras que el NDC80ORF RNA es la que contiene sólo la señal desde el conjunto de sonda común. Dado que el número de la NDC80ORF transcripciones se calcula por un método de "resta", alta eficiencia de la hibridación de la sonda y un alto cociente signal-to-noise son necesarios para identificar puntos de smFISH con confianza y reducir el error propagación.
Este papel describe un protocolo optimizado para realizar smFISH en la levadura de florecimiento Saccharomyces cerevisiae. En este protocolo, numero de celular, tiempo de fijación, tiempo de digestión, tampón de digestión, concentración de la sonda e hibridación buffer utilizado para los experimentos de smFISH fueron optimizados para el SK1 cepa fondo de S. cerevisiae que vegetativo crecimiento o la meiosis. Sin embargo, también observamos en este manuscrito: (1) el método para comprobar la calidad de los datos de smFISH después de la adquisición de la imagen y (2) los pasos en el protocolo que requieran optimización adicional de tensión diferentes orígenes y condiciones de crecimiento.
Protocol
Nota: Todos los buffers y los medios utilizados en el presente Protocolo se enumeran en la tabla 1. La información de proveedores para los reactivos se enumera en la Tabla de materiales.
Día 1/día 1-2:
Nota: Para el cultivo vegetal, cultivar células a un OD600 de 0.4 a 0.6 en un medio preferido. Para la cultura meiótica, inducir las células experimentan meiosis utilizando un método preferido (normalmente el cultivo en un OD600 de 1,85).
1. la fijación y la digestión de la muestra
- Arreglar un total de ~3.5 OD600 de células en formaldehído al 3%.
- Para el cultivo vegetativo, añadir mL 5,52 de cultura a 480 μl de formaldehído al 37% en tubos cónicos de 15 mL.
- Para la cultura meiótica, añadir 1840 μl del cultivo a 160 μl de formaldehído al 37% en tubos de microcentrífuga de 2 mL. Invertir aproximadamente 5 veces para mezclar.
PRECAUCIÓN: El formaldehído es tóxico. Manipúlelo y deséchelo según las normas institucionales.
- Coloque los tubos en un tambor de rodillo a temperatura ambiente durante 20 minutos. Para muestras meióticas, después de fijar a temperatura ambiente durante 20 minutos, continúan la fijación durante la noche a 4 ° c, rotación.
Nota: La fijación durante la noche aumenta la reproducibilidad y la calidad de los datos smFISH obtenidos para las muestras meióticas. Tiempo de fijación debe ser optimizado. - Mientras que la fijación de las muestras, descongelar 200 mM Vanadyl ribonucleósido complejos (VRC) a 65 ° c durante al menos 10 minutos.
- Preparar la mezcla principal de digestión en un tubo de 15 mL: para la 1 muestra, mezclar 425 μl de tampón B con 40 μl de 200 mM VRC (calentado a 65 ° c); para las 5 muestras, mezclar 2125 μl de tampón B con 200 μL de 200 mM VRC (calentado a 65 ° c). Vórtice ~ 5 s para suspender de nuevo el VRC completamente antes de agregar a la mezcla principal, que aparecerá en verde marrón claro después de la adición de VRC.
Nota: Además de VRC durante la digestión mejora la consistencia de los resultados de la smFISH, potencialmente inhibiendo el contaminante de nucleasa introducido por la mezcla de zymolyase, que es purificada del extracto crudo. La cantidad de VRC en este paso debe ser optimizada. - Para las muestras vegetativas, centrifugar los tubos a ~ 1057 x g durante 3 minutos. Para muestras meióticas (después de la fijación durante la noche), centrifugar a 21.000 x g durante 1,5 minutos decantar o aspirar el sobrenadante de residuos de formaldehído.
Nota: Todos los pasos de centrifugación se realizan a temperatura ambiente. - Resuspender las células en 1,5 mL de tampón frío mediante pipeteo arriba y abajo o invertir los tubos y agitando para mezclar. Transferencia de muestras vegetativas a los tubos 2 mL después resuspension.
- Centrífuga a 21.000 x g durante 1,5 minutos quitar la mayor parte del líquido por aspiración o mediante pipeteo, dejando atrás ~ 100 μl.
- Resuspender las células en 1,5 mL de tampón frío B.
- Centrífuga a 21.000 x g durante 1,5 minutos quitar la mayor parte del líquido por aspiración o mediante pipeteo, dejando atrás ~ 100 μl.
- Resuspender las células en 1,5 mL de frío tampón B. centrífuga a 21.000 x g durante 1,5 minutos aspirado el líquido completamente por vacío o por pipeteo.
- Resuspender las células en 425 μl de la mezcla principal de la digestión y brevemente vortex para suspender de nuevo. Añadir 5 μl de 100T zymolyase de 10 mg/mL a cada tubo.
Nota: Vortex zymolyase cada vez antes de agregarlo a los tubos. Añadir zymolyase a cada tubo individualmente, en lugar de agregar a la mezcla principal. Ambos pasos ayudará a mantener consistencia entre tubos de digestión porque zymolyase se precipita rápidamente. - Vórtice 2-3 s para mezclar. Colocar los tubos en un tambor de rodillo y digerir a 30 ° c durante 15-30 minutos. Células vegetativas y primeras etapas meióticas, generalmente tarda ~ 15 min, y profase meiótica y divisiones meióticas, tarda generalmente 30 min.
Nota: Comprobar en el microscopio cada 5 min después de 15 min y parada la digestión cuando ~ 80% de las células aparecen no transparente y no refractiva. Partir de este punto, las células son muy frágiles. Manejar suavemente las células y evitar el uso de extracción con bomba aspirativa o vórtex. - Centrifugar los tubos a ~ 376 x g durante 3 minutos Retire el líquido completamente mediante pipeteo.
- Resuspender suavemente las células con 1 mL de tampón B mediante pipeteo arriba y abajo 1 - 2 veces a la mezcla.
- Centrifugar los tubos a ~ 376 x g durante 3 min líquido eliminar tampón B mediante pipeteo. Resuspender suavemente las células en 1 mL de etanol al 70% (diluida con agua libre de ARNasa).
- Incubar a temperatura ambiente por 3.5-4 horas.
2. hibridación
- Llevar formamida a temperatura ambiente (por alícuota de 50 mL, se tarda 30 min en baño de agua).
Nota: No abra la botella de formamida hasta que la botella llegue a temperatura ambiente para evitar la oxidación de formamida.
PRECAUCIÓN: La formamida es tóxico. Manipúlelo y deséchelo según las normas institucionales. - Preparar el tampón de lavado 10% formamida en un tubo cónico de 15 mL.
- Centrifugar los tubos a ~ 376 x g durante 3 minutos Retire 500 μl de etanol al 70% mediante pipeteo. Pipetee suavemente arriba y abajo para resuspender las células restantes y luego se transfieren las células a los tubos de baja adherencia.
Nota: Usando tubos de adherencia baja grandemente reduce pérdida de la célula durante lavados posteriores. - Centrifugar los tubos a ~ 376 x g durante 3 minutos Retire el etanol mediante pipeteo.
- Añadir 1 mL de tampón de lavado 10% formamida y suavemente la pipeta hacia arriba y hacia abajo 2 - 3 veces para resuspender las células.
- Permitir a las células a reposar a temperatura ambiente unos 20 minutos mientras se prepara la solución de hibridación. Para la 1 muestra, mezcle 50 μl de tampón de hibridación (Temp. ambiente), 5 μl de 200 mM VRC (calentado a 65 ° c) y 1 μl de cada sondeo (final de 200 nM). Para las 5 muestras, mezclar 250 μl de tampón de hibridación (Temp. ambiente), 25 μl de 200 mM VRC (calentado a 65 ° c) y 5 μl de cada sondeo (final de 200 nM).
- Descongelar el tampón de hibridación (congelado a-20 ° c) a temperatura ambiente antes de abrir el tubo para evitar la oxidación de formamida.
- Después de agregar el 200 mM VRC, vortex por 5-10 s antes de añadir las puntas de prueba, que se diseñado y adquirido comercialmente y reconstituido según las instrucciones del fabricante.
- Si dos sondas Co incubadas, añadir 1 μl de la 1:10 dilución de la población de punta de prueba #1, y 1 μl de la 1:10 dilución de la población de punta de prueba #2, para hacer una dilución final de ~ 1: 500 para cada sonda. La concentración necesaria para que la mejor relación de señal a ruido deben ser optimizado (ver la discusión para más detalles).
- Centrifugar las muestras a ~ 376 x g durante 3 minutos Retire el sobrenadante en residuos peligrosos por pipeteo.
- Añadir 50 μl de solución de hibridación a cada tubo. Película los tubos para mezclar.
- Incubar a 30 ° c en un tambor de rodillo durante al menos 16 horas en la oscuridad.
Día 2/día 3
3. lavado y proyección de imagen
- Llevar formamida a temperatura ambiente.
- Preparar el tampón de lavado 10% formamida (FWB) en un tubo cónico de 15 mL.
- Retirar los tubos del tambor de rodillo y colocar en una caja cubierta de papel de aluminio para proteger de la luz.
- Centrifugar las muestras a ~ 376 x g durante 3 minutos Retire el sobrenadante en residuos peligrosos por pipeteo.
- Resuspender en 1 mL de 10% FWB transfiriendo suavemente arriba y abajo 2 - 3 veces.
- Incubar a 30 ° c por 30 min (no gira) en la caja cubierta de papel de aluminio.
- Centrifugar las muestras a ~ 376 x g para 3 minutos Retire el sobrenadante de residuos peligrosos mediante pipeteo y dejar ~ 50 μl.
- Mientras tanto, preparar el DAPI/FWB en un tubo cónico de 15 mL: para la 1 muestra, mezclar 1000 μl de tampón de lavado 10% formamida con 1 μl de DAPI de 5 mg/mL. De 10 muestras, mezclar 10 mL de tampón de lavado 10% formamida con 10 μl de DAPI de 5 mg/mL. Resuspender en 1 mL de DAPI/FWB transfiriendo suavemente arriba y abajo 2 - 3 veces.
- Incubar a 30 ° c por 30 min (no gira) en la caja cubierta de papel de aluminio.
- Descongelar los reactivos anti-bleach en el hielo.
- Centrifugar las muestras a ~ 376 x g durante 3 minutos Retire el sobrenadante totalmente mediante pipeteo. Si es necesario, Centrifugue nuevamente para eliminar todo el sobrenadante.
- Para las muestras que no son imágenes inmediatamente, Resuspender el precipitado en 50 μl de tampón de GLOX sin enzimas. Pipeta de arriba y abajo 3 - 4 veces para mezclar.
- Mantener todas las muestras unimaged en la caja cubierta de papel de aluminio a 4 ° c hasta que esté listo a la imagen. Cuando esté listo para la imagen, centrifugar las muestras a ~ 376 x g durante 2 min y retire completamente el sobrenadante mediante pipeteo. Resuspender en GLOX con enzimas como abajo.
- Para las muestras que se va a examinar inmediatamente, agregar 15-20 μl de tampón GLOX con enzimas. Suavemente la pipeta hacia arriba y hacia abajo para mezclar.
Nota: El volumen añadido puede variar dependiendo del tamaño de la pelotilla de la célula. Recomendamos Resuspender el pellet en 15 μl de tampón de GLOX con enzimas y comprobar la densidad de células en el microscopio. Si las células son demasiado densas (células agrupar uno encima del otro), añade tampón GLOX extra con las enzimas. Si las células son demasiado escasas, Centrifugue la muestra y eliminar ~ 5 μl de tampón. - Pipeta de 5 μl sobre un cubreobjetos (18 mm x 18 mm, no. 1) y poner el cubreobjetos sobre un portaobjetos.
- Poner un trapo de laboratorio sobre el portaobjetos donde se coloca el cubreobjetos. Presione suavemente en el paño de laboratorio para establecer la diapositiva (debe ver salir líquido de los cuatro bordes del cubreobjetos).
- Transfiera el porta a la sala de microscopio en una caja cubierta por papel de aluminio.
- Imagen utilizando un microscopio de fluorescencia de campo amplio con gran aumento (60-100 X) y alta apertura numérica.
Nota: Para recoger el máximo número de fotones emitidos por las sondas smFISH, microscopios confocales no se recomiendan, como limitan significativamente la cantidad de luz a recoger. Aquí, los datos se recolectaron en un microscopio equipado con 100 X, objetivo 1.4 en NA, usando filtros de CY5 (EX632/22, EM679/34) reflejado en 1.3 s, 100% T; TRITC (EX542/27, EM597/45), 1.3 s, 100% T; y DAPI (EX390/18, EM435/48), 0.05-0.1 s, T. 32-50% También se debe adquirir una imagen de referencia de campo brillante. Adquirir cortes de 15-25 con un tamaño de paso de 0.1-0.2 μm, de enteramente bajo el enfoque del campo de visión totalmente arriba, para asegurarse de que todos los puntos de RNA se contabilizan.
4. Análisis de la imagen
- Analizar los datos de smFISH con smFISH publicado las herramientas de análisis como el pescado-quant17 y StarSearch2, o con programas a medida, dependiendo de las necesidades exactas del experimento.
Nota: Una tubería de buen análisis debe permitir a los usuarios determinar un umbral para separar los verdaderos puntos de RNA de los antecedentes y estadísticas, como las coordenadas X, Y y Z (opcionales) y la intensidad de cada punto, el número de puntos en cada celda de salida y posiblemente los parámetros como una manera de filtrar las falsas detecciones.
Representative Results
Para evaluar qué tan bien el protocolo de smFISH trabajado (se describe en figura 1), hemos diseñado un conjunto de 54 sondas que el marco de lectura abierta del gen NDC80 del azulejo (figura 2A, parte superior). La sonda situada en el más extremo 5' se conoce como punta de prueba 1; el otro, Probe 2; y la tercera, sondeo 3, etcetera. Las 27 sondas asignan un impar número (sonda 1, 3, 5...) se conjugan para el tinte fluorescente CAL Fluor 590 (CF590); y las 27 sondas asignan un número par (sondeo 2, 4, 6...), conjugado con el tinte fluorescente Quasar 670 (Q670). Por lo tanto, estos conjuntos de prueba alterna se refieren a menudo como sondas "impar". Sobre hibridación, ambos conjuntos de sonda deben etiquetar la transcripción del mismo.
Después de la detección del punto, utilizamos algunas medidas para juzgar la calidad de los datos smFISH. El primero fue el grado y la calidad de la colocalización de los sondeos/impar. En nuestro caso, el 88% de todos los puntos de smFISH colocalized (figura 2A y 2B), con más del 95% de los puntos emparejados dentro de 2 pixeles entre sí (figura 2, emparejados), que está dentro del valor esperado dado cualquier cromático y detección aberración entre los dos canales fluorescentes. En comparación, menos del 10% de puntos impares tenía una distancia más cercano vecino de menos de 2 píxeles, mostrando que la probabilidad de misidentifying un par de puntos es baja (figura 2). El 12% de los puntos fueron dividido uniformemente entre los dos canales (figura 2B, compare CF590 sólo con sólo Q670); y así, llegamos a la conclusión que para este gen de 2,4 kb con una gama de expresión entre cero a 45 transcripciones por la célula, ~ 94% de las moléculas de ARN fueron detectado con exactitud en cada canal fluorescente. Si el protocolo de smFISH era subóptimo, una observaría (1) una fracción mayor de los smFISH puntos con una sola de las dos señales fluorescentes (no colocalized), o (2) células con una relación señal / ruido muy baja o ninguna señal en absoluto.
A continuación nos pide si la detección de la señal de smFISH era parcial con respecto al número total de moléculas de ARN por la célula. En una población, el número total de un determinado RNA en cada célula se encuentra en una distribución, con algunas células que más moléculas de ARN que otros. Un protocolo de smFISH buena contundencia debería detectar el RNA independientemente si un número alto o bajo número de moléculas de ARN está presente en cada célula. Para probar esto, para cada celda, se calculó la fracción de los puntos de smFISH con señales colocalized y la fracción con una sola de las dos señales fluorescentes. Después de agrupar las células que tenían el mismo número de puntos totales por celda, se calculó la fracción promedio de colocalized (emparejados) o puntos (sólo para CF590 o solo Q670) no colocalized en un grupo dado y graficó este promedio en función del número total de puntos por la célula (figura 3). Para cada categoría de puntos, las fracciones fueron similares en toda la gama del número total de puntos por la célula. Por ejemplo, comparando las células con un total de 20 puntos fluorescentes por celular versus aquellos con un total de 30 puntos, el promedio fracciones de puntos colocalized fueron similares. Este resultado sugiere que nuestro protocolo podría detectar las moléculas de una gama de ARN en una célula (hasta por lo menos 40 moléculas por célula). Si el protocolo de trabajo subóptimo, se puede observar un sesgo. Por ejemplo, puede aumentar la fracción de los puntos con una sola de las dos señales fluorescentes como el número total de puntos por la célula mayor.
Usando este protocolo optimizado, examinamos la expresión del gene de NDC80 , que codifica una proteína del cinetocoro, en diferentes condiciones de crecimiento. El gen de NDC80 expresa dos isoformas mRNA: la isoforma larga dececonocida transcripción, NDC80luti, tiene una extensión de ~ 400 pares de bases en el extremo 5' en comparación con el corto NDC80ORF isoforma, pero ambas transcripciones compartan la región codificante del gen NDC80 (véase esquema en Figura 4A). Hemos diseñado dos tipos de sondas: 590 CF el conjunto se une a la única 5' región de NDC80luti; y el conjunto de 670 Q se une a la región común de NDC80luti y NDC80ORF. Las transcripciones de NDC80luti fueron detectadas como los lugares smFISH donde las señales de ambos probe juegos colocalized, mientras que el NDC80ORF transcripciones fueron aquellos con la señal de Q 670. Debido al tamaño del segmento único de NDC80luti, sólo podríamos azulejo 20 sondas de oligonucleótidos a lo largo de esta región, que es menor que la recomendada puntas de prueba de 30 a 48. Así, determinamos primero si este conjunto de sonda robusta podría detectar RNA en nuestro protocolo optimizado. Para cualquier canal fluorescente, graficar la relación señal a ruido (SNR, definido como la variación de los píxeles que rodean un punto en relación con la intensidad de la mancha) contra la señal detectada por cada punto de smFISH y genera un diagrama de dispersión para todas las manchas identificado en el campo de visión entero (imágenes de ejemplo en la Figura 4A ) y de la parcelas en la Figura 4B. Claramente se identificaron dos poblaciones distintas para ambos el 670 de Q y la sonda CF 590 establece (optimizado, Figura 4B), lo que sugiere que los puntos de verdadera smFISH (dentro de la zona gris) se podrían separar de la señal de fondo. Tenga en cuenta que en la condición subóptima, dicha separación fue menos evidente (Suboptimal, Figura 4B).
Utilizamos estos sistemas dos sonda para estudiar la expresión de NDC80luti y NDC80ORFdurante el crecimiento vegetativo y la meiosis. En células vegetativas, se detectó señal robusta desde el 670 Q probe, pero no de la CF 590 sonda establecido (figura 5A, vegetativo), de acuerdo con la observación por borrar norteño que sólo la isoforma corta fue expresada durante el crecimiento vegetativo16 . Este resultado también sugiere que el conjunto de sonda CF 590 es específico, rendimiento bajo fondo en nuestro protocolo optimizado de la smFISH. Por el contrario, sólida señal de ambos conjuntos de sonda fue detectado en profase meiótica y la mayoría de los lugares había colocalized señal (figura 5A, profase meiótica). Análisis de la mancha blanca /negra norteña (figura 5B), esta observación confirmó que la isoforma larga NDC80luti fue expresada específicamente en la meiosis. Estos dos tipos de mRNAs se detectaron en el citoplasma (fuera de la región DAPI), sugiriendo que ambos fueron exportados desde el núcleo, consistente con el ribosome profiling datos18.
Para determinar si obtuvieron los datos suficientes para tener en cuenta con exactitud la variación biológica intrínseca a nuestro conjunto de datos, realizamos el análisis bootstrap utilizando las estadísticas de cada célula, que incluye (1) la fracción de los lugares colocalized por célula y (2) la fracción de los lugares con una de las dos señales fluorescentes (CF 590 solamente y Q 670 solamente). En este análisis, un programa seleccionadas al azar a una célula de las células cuantificadas 437 500 iteraciones. A continuación, se calculan la media y la varianza de las estadísticas respectivas asociadas a estas 500 celdas seleccionadas. Este proceso entonces fue repetido por seleccionar al azar dos células de todas las células, sin reemplazo; y luego para la selección al azar de tres células, etcetera. hasta que se llegó a la mitad del tamaño del conjunto total de datos. La varianza del conjunto de datos plateaued después de ~ 40 células, lo que sugiere que después de este punto la mayoría de la variación en la media es intrínseca a los datos en lugar de un artefacto de undersampling (figura 6, de la inserción). Este efecto se hizo más evidente cuando graficó la variación de la muestra dividida por la media muestral, en función del número de células en cada ciclo de iteración (figura 6). Con los datos mostrados, el cambio en la varianza se convirtió cada pequeño después de ~ 60 células. El número de células en un experimento de smFISH debe superar el número mínimo de células necesarias para lograr un medio estable y una meseta de la varianza. En nuestro caso, hemos cuantificado más de 95 células por muestra, por repetición. El número total de células (> 400) bien superado el número mínimo de células (~ 60) necesario para reflejar la media de la población.
Con un por encargo Matlab programa16, células vegetativas fueron encontradas para tener una mediana de 5 NDC80ORF transcritos por la célula, mientras que en las células de la profase meiótica, la mediana se redujo significativamente a 4 transcripciones por la célula (Wilcoxon de dos colas Rank Sum test, p = 0.026) (figura 7). La mediana del número de transcripciones de NDC80luti por célula fue 21 transcripciones, y 100% de las células expresan las transcripciones de NDC80luti . Graficó la fracción de las células con un número determinado de expedientes como un histograma de frecuencia relativa, paso a paso porque el número de moléculas de mRNA es una cantidad discreta. La papelera más grande de cada histograma fue normalizada a la misma altura.
Figura 1: Organigrama para el protocolo de smFISH. Las células se fijan con formol a temperatura ambiente durante 20 minutos o a 4 ° c durante la noche, para muestras de crecimiento vegetativo y meiótica, respectivamente. Después del lavado en el búfer B tres veces, las células son digeridas por zymolyase hasta ~ 70-90% de las células son digerido. Las muestras digeridas se lavará una vez con Buffer B para quitar el zymolyase y permeabilized posteriormente en 70% de etanol (EtOH) ~3.5 horas. Para prepararse para la hibridación, las muestras se incuban primero en tampón de lavado 10% formamida (FWB) durante 20 minutos. A continuación, las muestras se resuspendió en 50 μl de solución de hibridación, que contiene las sondas fluorescentes, para la incubación durante la noche en la oscuridad a 30 ° c. Después de la hibridación, las muestras se incuban en FWB 10% durante 30 minutos para limpiar las sondas de exceso y luego se incubaron en 10% FWB con 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) para teñir el ADN. Para la muestra reflejada inmediatamente después de la incubación de FWB/DAPI, la muestra se resuspendió en el búfer GLOX complementado con oxidasa de glucosa, catalasa y Trolox (GLOX + enz); mientras que las otras muestras se resuspendió en el búfer GLOX sin las enzimas y almacenadas a 4 ° c hasta ~ 3 horas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: evaluación de la calidad de smFISH usando puntas de prueba/impar. (A) arriba: Esquema de los sistemas de sondeo/impar. Cincuenta y cuatro sondas de oligonucleótidos embaldosar el gene de NDC80 fueron diseñadas. Las sondas impares fueron etiquetadas con un fluoróforo (CF590, mostrado en magenta) y las sondas de pares, con otro fluoróforo (Q670, mostrado en verde). Abajo: Representante smFISH imágenes de las células de la profase meiótica adquirieron haciendo uso de la sonda/impar. Se tomaron muestras 6 horas después de las células (UB8144) fueron transferidas al medio de esporulación, un tiempo cuando estas células fueron detenidas en la profase meiótica. ADN fue teñido con DAPI (mostrado en azul). Imágenes se muestran como las proyecciones de máxima intensidad de pilas de z. Barra de escala: 5 μm. (B) porcentaje de los puntos de smFISH pares o impares obtenidas haciendo uso de la sonda/impar. Se analizaron un total de 428 células profase meiótica, puesta en común de dos experimentos independientes. Se modifica esta figura figura 2-figura suplemento 4 de Chen et al. 16 (C) un acumulado densidad función (CDF) de la distancia entre cada par de puntos pares y la distancia entre el vecino más cercano de un lugar impar. Para cada punto detectado en un canal de fluorescente, se aplicó el algoritmo "k más cercano vecino" para identificar el lugar más cercano detectado y la distancia a ese lugar, en el canal complementario. Localizaciones que fueron mutuos vecinos más cercanos eran considerados para ser asociado, y se generó una nueva lista de grabación las detecciones apareadas, CF590-y Q670. Para cada categoría de detecciones, un histograma de la CDF de las distancias fue trazado en Matlab, confirmando que puntos correctamente emparejados de hecho estaban más cercanos en distancia que aquellos sin una correspondiente en el otro canal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: número de fracciones de puntos apareados y no apareados, como una función del RNA total por celular. Para comprobar si la detección y vinculación de los puntos de smFISH era parcial a nivel de expresión diferente, las células individuales se agruparon por expresión de RNA total. Las fracciones medias de pares, sólo CF590 y sólo Q670 detecciones se calcularon para cada grupo de células. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Evaluación de la calidad de los datos de smFISH generados utilizando las sondas diseñadas para NDC80luti y NDC80ORF mRNAs. Hibridan las sondas Q 670 (mostradas en verde) a la región común compartida entre NDC80luti y NDC80ORF mRNAs, mientras que las sondas de CF 590 (mostradas en magenta) hibridan a la única 5' región de NDC80luti . (A) imágenes de smFISH representante de NDC80luti y NDC80ORF en profase meiótica, adquirió bajo optimizado frente a condiciones subóptimas. Cepas UB8144 (condición optimizado) y UB1337 (condición óptima) fueron inducidos a experimentar meiosis y fija durante la profase meiótica. Estas dos cepas albergan sistemas de sincronización diferente para inducir la meiosis, pero el uso de cualquier sistema no afecta la calidad de smFISH (datos no mostrados). En la condición óptima, las células se fijaron a temperatura ambiente durante 20 minutos (sin fijación durante la noche), digerida con zymolyase sin VRC suplido y cruzado por hibridación en una menor concentración de VRC. Imágenes se muestran como las proyecciones de máxima intensidad de pilas de z. ADN fue teñido con DAPI (mostrado en azul). Barra de escala: 5 μm. (B) diagramas de dispersión muestran la relación señal a ruido (SNR) y la señal de cada punto de la smFISH detectada en el campo de visión presentaron en la Figura 4A, ningún canal fluorescente, así como las condiciones optimizadas o subóptimas. En la condición optimizada, dos poblaciones de los lugares de smFISH estaban presentes. Los puntos de verdadera smFISH fueron situados dentro de la zona gris, separa la señal de fondo. En la condición subóptima, mRNAs individuales eran difíciles de distinguir por el ojo, y la separación entre los puntos de verdad y el fondo después de ejecutar el software de detección de punto era menos evidente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Expresión de NDC80luti y NDC80ORF transcripciones son controladas temporal. (A) imágenes de smFISH representante de NDC80luti y NDC80ORF durante el crecimiento vegetativo y la meiosis. Se tomaron muestras vegetativas cuando las células (UB8144) fueron creciendo exponencialmente en medio ricos nutrientes. 6 horas después de las células (UB8144) fueron transferidas al medio de esporulación, un tiempo cuando estas células fueron detenidas en la profase meiótica se tomaron muestras de la profase meiótica. Hibridan las sondas Q 670 (mostradas en verde) a la región común compartida entre NDC80luti y NDC80ORF mRNAs, mientras que las sondas de CF 590 (mostradas en magenta) hibridan a la única 5' región de NDC80luti . ADN fue teñido con DAPI (mostrado en azul). Cada celda fue representada por su señal Zip1-GFP, un marcador de la profase meiótica. Nuestro protocolo de smFISH conserva fuerte señal GFP sin mayor modificación. Crecimiento vegetativo: Zip1-GFP negativo. Profase meiótica: Zip1-GFP positivas. Imágenes se muestran como las proyecciones de máxima intensidad de pilas de z. Barra de escala: 5 μm. Se modifica esta figura 2 Figura de Chen et al. 16. (B) NDC80ORF, NDC80lutiy nivel de proteína (Ndc80p) de Ndc80 durante la meiosis (UB4074). NDC80luti y NDC80ORF niveles fueron determinados por la mancha blanca /negra norteña y Ndc80p nivel se determinó por el immunoblot anti-V5 en los puntos de tiempo indicado. Hxk1p, control de immunoblot de carga. Como UB8144 la tensión, esta tensión también alberga el pGAL NDT80 GAL4-ER sincronización sistema19,20. Células se transfirieron a medio de esporulación en 0 horas y liberadas de detención de paquiteno por la adición de β-estradiol 6 horas más tarde. La transcripción de NDC80luti robusta fue detectada en profase meiótica/S, mientras que el NDC80ORF transcripciones fue predominante presente antes de la entrada meiótica (0 horas) y durante las divisiones meióticas (7-9 horas). Esta cifra se modifica 6J figura de Chen et al. 16 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: iniciar el análisis realizado para las muestras de la profase meiótica se muestra en la Figura 5 . Todas las células cuantificadas se combinaron, y un número dado (n) de las células se muestrearon al azar 500 veces. Se calcularon la media y el intervalo de confianza del 95% para la fracción de mRNA apareados y no apareados por la célula. Estos datos fueron graficados para cada opción del número n (recuadro). La meseta de varianza fue visualizada mediante el trazado de la varianza de la muestra dividida por el medio, en función del número de células (n) muestreados. El número total de células medido (437) excedido grandemente el número en el cual el error plateaued (~ 60 células), que indica que datos adicionales no mejoraría la confianza en las mediciones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: cuantificación de los datos smFISH en Figura 5 , grafican como los histogramas de la frecuencia relativa de las células con un número determinado de NDC80luti y NDC80ORF transcritos por la célula, utilizando los datos de tres experimentos independientes. La línea discontinua indica la mediana del número de NDC80luti y NDC80ORF transcritos por la célula. Cada histograma se normalizó para que la altura máxima bin fue el mismo en todos los histogramas. Un número total de 637 células fueron analizado para el crecimiento vegetativo y 437 de la profase meiótica. Dos colas prueba de Wilcoxon Rank Sum se realizó de NDC80luti y NDC80ORF, respectivamente, comparando muestras de la profase meiótica y vegetativo. Esta cifra se modifica de 2D de la figura de Chen et al. 16 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Tampón B (1 L de caldo de: 1,2 M sorbitol; tampón de fosfato de potasio de 0.1 M, pH 7.5) | 1 x |
| Agua libre de nucleasas | 500 mL |
| Sorbitol | 218,6 g |
| KH2PO4 | 2,18 g |
| K2HPO4 | g 14,62 |
| Agua libre de nucleasas | Llevar a volumen final de 1 L |
| * Almacenar a 4 ° c en alícuotas de 50 mL después de filtro de esterilización | |
| Zymolyase 100T (10 mg/mL) | |
| * Almacenar a-20 ° c en alícuotas | |
| Disolver el polvo de zymolyase de 10 mg en 1 mL de agua MilliQ | |
| E. coli tRNA (10 mg/mL) | |
| * Almacenar a-20 ° c en alícuotas | |
| Disolver el polvo de tRNA de 10 mg en 1 mL de agua MilliQ | |
| etanol al 70% (50 mL) | 1 x (mL) |
| Etanol puro | 35 |
| Agua libre de nucleasas | 15 |
| * Almacenar a temperatura ambiente | |
| Tampón de hibridación (10 mL) | 1 x (mL) |
| 50% sulfato de dextrán | 2 |
| TRNA de e. coli (10 mg/mL) | 1 |
| Ribonucleósido de Vanadyl 200 mM complejo (VRC) | 0.1 |
| BSA, 50 mg/mL | 0.04 |
| 20 x SSC | 1 |
| Formamida | 1 |
| Agua libre de nucleasas | 4.86 |
| * Almacenar a-20 ° c en alícuotas de 250 μl o 500 μl | |
| tampón de lavado 10% formamida (10 mL) | 1 x (mL) |
| Formamida a temperatura ambiente | 1 |
| 20 x SSC | 1 |
| Agua libre de nucleasas | 8 |
| * hacer fresco, vortex durante 20-30 s para mezclar | |
| solución de glucosa 10% | |
| * Almacenar a 4 ° c en alícuotas después de filtro de esterilización | |
| Disolver 1 g de glucosa en 10 mL de agua libre de nucleasas | |
| Glucosa oxidasa | |
| * Almacenar a-20 ° c en alícuotas | |
| Disolver la glucosa oxidasa de 3,7 mg en 1 mL de 50 mM NaOAc, pH 5 | |
| Anti-Bleach (GLOX) Buffer, sin enzimas (1 mL) | 1 x (μL) |
| glucosa 10% en agua libre de nucleasas | 40 |
| 1 M Tris, pH 8.0 | 10 |
| 20 x SSC | 100 |
| Agua libre de nucleasas | 850 |
| * hacer fresco, también puede almacenar alícuotas a 4 ° c | |
| Anti-Bleach (GLOX) Buffer, con las enzimas (50 μL) | 1 x (μL) |
| Catalasa (vortex suavemente, se instala fácilmente) | 0.5 |
| Glucosa oxidasa | 0.5 |
| 100 mM Trolox (disuelto en etanol) | 1 |
| Buffer GLOX | 50 |
| * hacer fresca cada vez, preparar el hielo, pueden almacenarse a 4 ° c durante 2-3 horas |
Tabla 1. Buffers y medios de comunicación
Discussion
El protocolo que presentamos se deriva de otros protocolos de smFISH publicadas de3,2,21,22,23y está específicamente optimizado para el fondo de la cepa de levadura SK1. Los parámetros optimizados incluyen el numero de celular, duración de la fijación, velocidad de centrifugación y duración, duración de digestión, tampón de digestión, concentración de sonda y tampón de hibridación. Otros parámetros como la temperatura de hibridación y duración no fueron optimizados. En esta sección, compartimos algunas notas que ayude a adaptar el presente Protocolo a cualquier fondo de la cepa de levadura y las condiciones de crecimiento de interés.
La pared celular de levadura de florecimiento es un gran reto contra la obtención de imágenes de alta calidad smFISH en levadura de florecimiento porque la pared celular previene la penetración de la sonda. Digestión incompleta de la pared celular por zymolyase conduce a ineficiente hibridación de las sondas y la alta variabilidad de célula a célula en la señal. Sin embargo, digestión excesiva puede hacer las células demasiado frágil, significativa pérdida de la célula durante los pasos de lavado y estallar durante la preparación de los portaobjetos para la proyección de imagen de la célula. Por lo tanto, es fundamental optimizar la duración de la digestión. Se recomienda llevar a cabo un experimento piloto smFISH por extracción de la misma muestra para diferentes cantidades de tiempo. En nuestro caso, obtuvimos los mejores datos de smFISH si nos detiene la digestión cuando no refractiva ~ 80% de las células. Por lo general, para la misma condición de crecimiento, diferentes cepas mutantes genéticas pueden ser digeridas con tiempos similares. Sin embargo, la duración de la digestión es diferente cuando se compara entre diferentes condiciones de crecimiento y diferentes etapas de la meiosis en levadura de florecimiento. Una vez que se determina el momento, la calidad de smFISH es reproducible. Nota que para cepas mutantes con pared celular defectuosa síntesis o composición, digestión puede completarse en menos de 15 minutos de uso de lotes diferentes de zymolyase puede cambiar también un poco el tiempo de digestión.
Concentración óptima de la sonda es necesario para lograr un alto cociente signal-to-noise. Hemos diseñado y había adquirido nuestras sondas smFISH comercialmente. Buenas sondas (a menudo 20-mers) deben tener un porcentaje de GC desde 35% hasta 45%, un espacio mínimo de 2 pares de bases entre las puntas de prueba y baja reactividad cruzada. Utilizamos un diseño de sonda basada en web del fabricante para generar una lista de las puntas de prueba, y si hay suficientes sondas a elegir, utilizamos el algoritmo BLAST en la base de datos del genoma de Saccharomyces para eliminar las puntas de prueba con más de 17 pares de bases superpuestas con otras regiones genómicas. Elegimos más Fotoestables colorante fluorescente (CAL Fluor 590) para el conjunto de sonda que recuece a la única región de NDC80luti (CF 590) porque en este sistema, el número de puntas de prueba que satisfacen todos los criterios anteriores (20 sondas) fue menor que la número mínimo recomendado por el fabricante (~ 25 sondas). Después de la reconstitución la solución de la sonda siguiendo las instrucciones del fabricante, hemos hecho un 1:10 dilución de la solución y la solución diluida en alícuotas de 5 μl a-20 ° c. Cada alícuota se utilizó solamente una vez. Para la optimización, uno debe hacer serie diluciones desde la 1:10 diluyeron solución y prueba de que la concentración produce la mejor relación señal a ruido. Le recomendamos una serie de diluciones de 1: 250, 1: 500, 1: 1000 y 1: 2000 de la población original. En nuestro caso, un factor de dilución 1: 500 dio lugar a la mejor relación señal a ruido, para el CF 590 y Q 670 sistemas de sonda.
Tiempo óptimo de fijación también es crítico para el éxito smFISH en levadura de florecimiento. Encontró que la fijación durante la noche a 4 ° c, en lugar de fijación a temperatura ambiente durante 20 minutos, mejoraron significativamente la consistencia y calidad de los resultados smFISH para muestras meióticas. Aunque no hemos probado cómo la noche fijación pueda impactar las muestras vegetativas, fijación a temperatura ambiente trabajó bien para esta condición de crecimiento. Por lo tanto, para optimizar el protocolo de smFISH de nuevas cepas o condiciones de crecimiento, se recomiendan a partir de tiempo de fijación corto a temperatura ambiente y aumentar el tiempo de fijación si se encuentra la alta variabilidad de la señal.
En comparación con otros protocolos publicados3,22,23, nuestro protocolo utiliza el inhibidor de Rnasa VRC durante la digestión y una mayor concentración de VRC durante la hibridación. Además de VRC en estos dos pasos mejoraron la consistencia de los resultados de la smFISH, posiblemente mejor preservar las moléculas de ARN contra actividad nucleasa, que se pueden introducir por la mezcla de zymolyase (la enzima purificada de extractos crudos y puede contener Rnasa contaminantes). Así, se recomienda utilizar la cantidad de VRC que figuran en nuestro protocolo o incluso altas concentraciones de VRC para optimización.
Se puede perder una porción significativa de las células durante los pasos de lavado en tampón B y el tampón de lavado de formamida. Para reducir la pérdida de la célula, uno podría aumentar la velocidad de centrifugación. En nuestro caso, utilizando una velocidad alta (21.000 x g) a nuestras muestras de pellets durante el búfer B lava pérdida significativamente reducida de la célula. Sin embargo, las células se convierten en muy frágiles después de la digestión zymolyase, por lo que no se recomienda el cambio de velocidad de centrifugación. Por el contrario, se sugiere utilizar los tubos de baja adherencia de científicos de Estados Unidos, que sedimenten las células durante los lavados en el tampón de lavado formamida de gran ayudan. En general, nuestro protocolo puede generar constantemente una monocapa de células lo suficientemente densas para la proyección de imagen eficiente. Por lo general, deben producir los 7 campos de vista > 130 células adecuadas para la cuantificación.
Por último, es importante determinar los parámetros óptimos para el y los resultados de análisis de imagen. Para detectar manchas de smFISH, programas de análisis publicado comúnmente las imágenes raws usando kernel gaussiano para quitar la señal de fondo del filtro y preguntar a los usuarios a determinar la relación de señal a ruido para cada conjunto de imágenes2,17. Por desgracia, actualmente no existe una norma por la que se determinan los parámetros apropiados, y así algunas pruebas empíricas de estos ambientes son necesario. Para establecer los parámetros necesarios para cada uno de estos pasos, uno necesita iterativamente diferentes conjuntos de parámetros de entrada y compruebe qué tan bien los resultados obtenidos en cada juego del recuento manual en algunas células representativas. Una vez que se encuentra un conjunto de parámetros, puede ser utilizado para la mayoría de las imágenes obtenidas a pesar de diferentes condiciones de crecimiento y antecedentes genéticos.
Además, uno puede probar si proyección de máxima intensidad de las imágenes de smFISH puede llevarse a cabo antes de la cuantificación22. Este paso simplifica el algoritmo de detección de punto y significativamente reduce el tiempo de proyección de imagen, aunque a costa de información potencialmente útil sobre manchas individuales, tales como su localización subcelular. En nuestro caso, el número de moléculas de ARNm producidas por el gene de NDC80 fue lo suficientemente bajo como para que los puntos estaban bien separados después de este proceso (no es infrecuente para las transcripciones en florecimiento levadura3,7). En casos donde está crítico el análisis de colocalización, la tubería del análisis debe determinar la ubicación de cada punto de smFISH en cada canal para evaluar colocalización. Dependiendo de las preguntas específicas se pide, otros datos como la intensidad de cada punto también pueden necesitar ser extraído de la tubería para su posterior análisis. Optimización de la clave de los pasos en el protocolo y la tubería de análisis de imagen es crucial en la obtención de alta calidad de los datos smFISH para estudiar la cuestión de interés.
Disclosures
Los autores no tienen ningún conflicto de interés que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Anne Dodson y Stephanie Heinrich para consejos sobre cómo optimizar el protocolo de smFISH, Xavier Darzacq para ayudar con la plataforma de análisis, Haiyan Huang para sugerencias sobre el análisis estadístico. Este trabajo fue apoyado por fondos de March of Dimes (FY15-5-99), Pew Charitable Trusts (00027344), Damon Runyon Cancer Research Foundation (35-15) y Glenn Foundation a ésta y a NSF Graduate investigación beca Grant no. DGE-1106400 a JC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BSA, RNase-free (50 mg/mL) | Ambion | AM2616 | Store at -20 °C. |
| Catalase | Sigma | C3515 | Store at 4 °C for short-term. Vortex before use. |
| DAPI | Sigma | D9564 | Store at -20 °C after reconstitution in water. Protect from light. |
| 50% Dextran Sulfate | Milli Pore | S4030 | Store at room temperature. Very viscous liquid. Handle with patience. |
| E. coli tRNA | Sigma | R4251 | Store at -20 °C in aliquots after reconstitution in water. |
| Ethanol (100%, 200 proof) | various | Flammable. | |
| 37% Formaldehyde | Fisher | F79-500 | Store at room temperature. Toxic. Use and dispose with caution. |
| Formamide | Ambion | AM9342 | Store at 4 °C. Open after the temperature equilibrates to room temperature in order to prevent oxidation. Toxic. Use and dispose with caution. |
| Glucose | various | Store at 4 °C after dissolving in nuclease-free water. | |
| Glucose oxidase | Sigma | G2133 | Store at -20 °C in aliquots after reconstitution in 50 mM NaOAc, pH 5. |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9932 | Store at room temperature. |
| Potassium phosphate (monobasic and dibasic) | various | Store at room temperature. | |
| Probe library, diluted in TE, pH 8.0 | Biosearch Technologies | Store at -20 °C in aliquots (5 µL) after reconstitution in TE pH 8.0, following the instructions from the manufacturer. Protect from light. | |
| Sorbitol | various | Store at room temperature. | |
| 20X SSC | Ambion | AM9763 | Store at room temperature. |
| TE, pH 8.0 | Ambion | AM9849 | Store at room temperature. |
| 1 M Tris, pH 8.0 | Ambion | AM9856 | Store at room temperature. |
| Trolox | Sigma | 238813 | Store at -20 °C in aliquots. |
| 200 mM Vanadyl ribonucleoside complex (VRC) | NEB | S1402S | Store at -20 °C in aliquots after reconstitution, following the instructions from the manufacturer. |
| Zymolyase 100T | MP Biomedicals | 08320932 | Store at -20 °C in aliquots after reconstitution in water. |
| Low-adhesion tubes | USA Scientific | 1415-2600 | Store at room temperature. |
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