Enda molekyl fluorescens In Situ hybridisering (smFISH) analys i spirande jäst vegetativ tillväxt och meios

Summary

Detta enda molekyl fluorescens i situ hybridisering protokoll är optimerad för att kvantifiera antalet RNA-molekyler i spirande jäst under vegetativ tillväxt och meios.

Abstract

Enda molekyl fluorescens i situ hybridisering (smFISH) är en kraftfull teknik för att studera genuttryck i enstaka celler på grund av dess förmåga att upptäcka och räkna enskilda RNA-molekyler. Komplement till djupa sekvensering-baserade metoder, smFISH ger information om cell till cell variationen i avskrift överflöd och subcellulär lokalisering av en given RNA. Nyligen har vi använt smFISH att studera uttrycket av genen NDC80 vid meios i spirande jäst, i vilken två avskrift isoformer finns och den korta avskrift isoformen har dess hela sekvensen som delas med den långa isoformen. För att säkert identifiera varje avskrift isoform, vi optimerade kända smFISH protokoll och erhålls hög konsekvens och kvalitet av smFISH data för de prover som förvärvats under spirande jäst meios. Här beskriver vi detta optimerade protokoll, de kriterier som vi använder för att avgöra om hög kvalitet av smFISH uppgifter har erhållits, och några tips för att genomföra detta protokoll i andra jäststammar och tillväxt villkorar.

Introduction

Dynamisk reglering av genuttryck driver utvecklingen av en organism, liksom dess svar på miljömässig stress, infektion och förändringar i ämnesomsättningen. Studier som fokuserar på Transkriptionsreglering förlita dig på teknik som mäter RNA överflöd. En sådan metod, kallas enda molekyl fluorescens i situ hybridisering (smFISH), används för identifiering av enskilda RNA-molekyler i enstaka celler^1,2. Denna metod tillåter mätning av cell-till-cell variabiliteten i genuttryck och bestämning av intracellulära RNA lokalisering.

I den vanligaste smFISH tekniken kräver upptäckt av en enskild RNA-molekyl flera korta DNA sonder (ofta ~ 48 20-mer sonder) som kompletterar målet RNA och konjugeras till den samma fluorescerande färgen. Bindningen av en enda fluorescerande sond resulterar i svag signal, men signalen från ensemblen av alla sonderna är robust. Denna funktion förbättrar avsevärt det signal-brus-förhållandet eftersom även om en enda sond kan uppvisar off-target bindande, sådan signal är väntat till vara mycket svag jämfört med målet RNA molekylen³. Inom fel upptäckt, kan antalet RNA molekyler räknas och jämfört över olika odlingsbetingelser och bland olika mutanter.

Sedan dess första utveckling, har smFISH anpassats för att studera olika aspekter av gene expression⁴, såsom transkription töjning^1,2, skarvning^5,6, transkriptionell spricker^{7 , 8 , 9}, intracellulära alleliska uttryck^10,11,12och RNA lokalisering^13,14,15. Nyligen, vi har använt denna metod för att studera uttrycket av två avskrift isoformer av samma gen, där den korta avskrift isoformen (NDC80^ORF) har dess hela sekvensen som delas med den långa isoformen (NDC80^luti )¹⁶. För att unikt identifiera de två mRNA-isoformerna, vi använde två sonden uppsättningar: en uppsättning är specifika för den unika sekvensen av NDC80^luti, och den andra uppsättningen, konjugerat till en annan fluorescerande färgämne, binder till regionen gemensamma i de två isoformerna. Den NDC80^luti RNA identifieras som en colocalized plats med båda fluorescerande signaler, medan de NDC80^ORF RNA är en som innehåller bara signalen från den gemensamma probsats. Eftersom antalet den NDC80^ORF avskrifter beräknas genom en ”subtraktion” metod, hög effektivitet av sonden hybridisering och en hög signal-brus-förhållande är nödvändiga för att säkert identifiera smFISH ställen och minska fel förökning.

Detta dokument beskriver en optimerad protokollet för att utföra smFISH i spirande jästen Saccharomyces cerevisiae. I detta protokoll, mobilnummer, fixering tid, koktiden, matsmältningen buffert, sond koncentration och hybridisering buffert som används för smFISH experiment var optimerad för SK1 stam bakgrund av S. cerevisiae som genomgår vegetativt tillväxt eller meios. Men vi noterar också i detta manuskript: (1) metod för att kontrollera kvaliteten på smFISH data efter bild förvärv och (2) stegen i det protokoll som kan kräva ytterligare optimering för annan stam bakgrunder och tillväxt villkorar.

Protocol

Obs: Alla buffertar och media som används i detta protokoll listas i tabell 1. Leverantörsinformationen för reagenserna är listade i Tabell för material.

Dag 1/dag 1-2:

Obs: För vegetativt kultur, odla cellerna till en OD₆₀₀ av 0,4 – 0,6 i en rekommenderad medium. För meiotiska kultur, framkalla celler genomgår meios med en rekommenderad metod (vanligtvis odling i en OD₆₀₀ av 1,85).

1. prova fixering och matsmältning

1. Fixa en totalt ~3.5 OD₆₀₀ av celler i 3% formaldehyd.
   1. För vegetativt kultur, tillsätt 5,52 mL kultur till 480 µL av 37% formaldehyd i 15 mL koniska rör.
   2. För meiotiska kultur, tillsätt 1840 µL av kultur till 160 µL av 37% formaldehyd i 2 mL mikrocentrifugrör. Invertera ~ 5 gånger att blanda.
      Varning: Formaldehyd är giftiga. Hanteras och kasseras enligt institutionella föreskrifter.
2. Placera rören på en rulle trumma i rumstemperatur i 20 min. För meiotiska prover, efter fastställande i rumstemperatur i 20 min, fortsätta fastställande över natten vid 4 ˚C, roterande.
   Obs: Övernattning fixering ökar reproducerbarhet och kvaliteten på smFISH data som erhållits för meiotiska prover. Fixering tid bör optimeras.
3. Även om proverna fastställande, Tina 200 mM Vanadyl Ribonucleoside komplex (VRC) på 65 ° c i minst 10 min.
4. Förbereda matsmältningen master mix i en 15 mL tub: för 1 prov, blanda 425 µL buffert B med 40 µL av 200 mM VRC (värmas till 65 ° c); för 5 prover, blanda 2125 µL buffert B med 200 µL 200 mM VRC (värmas till 65 ° c). Vortex ~ 5 s att fullt resuspendera VRC innan du lägger till huvudmixen, som kommer att visas ljus brunaktig grön efter VRC tillägg.
   Obs: Tillägg av VRC under matsmältningen förbättrar konsistensen av smFISH resultat, eventuellt genom att hämma det främmande ämnet nuclease som infördes genom den zymolyase blandningen, som renas från råa extrakt. Mängden VRC krävs vid detta steg bör optimeras.
5. För vegetativt prover, Centrifugera rören vid ~ 1057 x g i 3 min. För meiotiska prover (efter övernattning fixering), Centrifugera 21 000 x g för 1,5 min. Dekantera eller Aspirera supernatanten till formaldehyd avfall.
   Obs: Alla centrifugering steg utförs i rumstemperatur.
6. Att resuspendera cellerna i 1,5 mL kall buffert B genom pipettering upp och ner eller invertera rören och snärta för att blanda. Överföra vegetativt prover till 2 mL rör efter resuspension.
7. Centrifugera vid 21 000 x g för 1,5 min. bort huvuddelen av vätskan genom vakuum aspiration eller pipettering, lämnar bakom ~ 100 µL.
8. Att resuspendera cellerna i 1,5 mL kall buffert B.
9. Centrifugera vid 21 000 x g för 1,5 min. bort huvuddelen av vätskan genom vakuum aspiration eller pipettering, lämnar bakom ~ 100 µL.
10. Återsuspendera cellerna i 1,5 mL kall buffert B. Centrifugera vid 21 000 x g för 1,5 min. Aspirera vätska helt genom vakuum eller genom pipettering.
11. Att resuspendera cellerna i 425 µL av matsmältningen huvudmixen och kort vortex att resuspendera. Tillsätt 5 µL 100T 10 mg/mL zymolyase i varje rör.
    Obs: Vortex zymolyase varje gång innan du lägger till rören. Lägga till zymolyase i varje rör individuellt, istället för att lägga till huvudmixen. Båda stegen att upprätthålla matsmältning enhetlighet bland rör eftersom zymolyase fällningar snabbt.
12. Vortex 2-3 s att blanda. Placera rören på en rulle trumma och smälta vid 30 ˚C för 15-30 min. Det tar oftast ~ 15 min för vegetativa celler och tidiga meiotiska stadierna, och för meiotiska profas och meiotiska divisioner, det tar oftast ~ 30 min.
    Obs: Kontrollera på mikroskopet varje 5 min efter 15 min och stoppa matsmältningen när ~ 80% av cellerna visas icke-transparenta och icke-brytningsfel. Från denna punkt på, celler är mycket bräcklig. Hantera celler försiktigt och Undvik att använda vakuum aspiration eller vortexa.
13. Centrifugera rören vid ~ 376 x g i 3 min. ta bort vätskan helt genom pipettering.
14. Försiktigt Omsuspendera cellerna med 1 mL buffert B genom pipettering upp och ner 1 - 2 gånger att blanda.
15. Centrifugera rören vid ~ 376 x g i 3 min. ta bort buffert B vätska genom pipettering. Försiktigt resuspendera cellerna i 1 mL 70% etanol (utspädd med RNase-fritt vatten).
16. Inkubera 3,5-4 timmar i rumstemperatur.

2. hybridisering

1. Låt formamid rumstemperatur (för 50 mL alikvot, det tar ~ 30 min i vattenbad).
   Obs: Öppna inte formamid flaskan tills flaskan når rumstemperatur för att undvika oxidation av formamid.
   Varning: Formamid är giftiga. Hanteras och kasseras enligt institutionella föreskrifter.
2. Förbereda 10% formamid tvättbuffert i en 15 mL koniska rör.
3. Centrifugera rören vid ~ 376 x g i 3 min. ta bort 500 µL av 70% etanol av pipettering. Pipettera försiktigt upp och ner för att resuspendera återstående cellerna, och sedan överföra cellerna till låg friktion rör.
   Obs: Använda låg friktion rör kraftigt minskar cellförlust under efterföljande tvättar.
4. Centrifugera rören igen vid ~ 376 x g i 3 min. ta bort alla etanol av pipettering.
5. Tillsätt 1 mL 10% formamid tvättbuffert och försiktigt Pipettera upp och ner 2 - 3 gånger till Omsuspendera cellerna.
6. Att cellerna att sitta vid rumstemperatur för ~ 20 min medan du förbereder hybridisering lösningen. För 1 prov, blanda 50 µL av hybridisering buffert (rum temp.), 5 µL av 200 mM VRC (värmas till 65 ° c) och 1 µL av varje sond (200 nM slutlig). För 5 prover, blanda 250 µL av hybridisering buffert (rum temp.), 25 µL av 200 mM VRC (värmas till 65 ° c) och 5 µL av varje sond (200 nM slutlig).
   1. Tina hybridisering buffert (fryst vid-20 ° c) till rumstemperatur innan du öppnar tuben för att förhindra formamid oxidation.
   2. Efter tillägger den 200 mM VRC, virvel för 5-10 s innan du lägger sonderna, som är utformad för köpt kommersiellt och rekonstitueras enligt tillverkarens anvisningar.
   3. Om två sonder är samtidig ruvade, tillsätt 1 µL av 1:10 utspädning av sonden #1 beståndet, liksom 1 µL av 1:10 utspädning av sonden #2 beståndet, att göra en slutspädning av ~ 1: 500 för antingen sonden. Den koncentration som behövs för bästa signal-brus-förhållande behöver vara optimerad (se diskussion för detaljer).
7. Centrifugera proverna vid ~ 376 x g i 3 min. ta bort supernatanten i farligt avfall genom pipettering.
8. Tillsätt minst 50 µL av hybridisering lösning till varje rör. Snärta rören för att blanda.
9. Inkubera vid 30 ° c på en trumma som rullen i minst 16 timmar i mörker.

Dag 2/dag 3

3. tvätt och imaging

1. Ta formamid till rumstemperatur.
2. Förbereda 10% formamid tvättbuffert (FWB) i en 15 mL koniska rör.
3. Ta bort rören från rullen trumman och placera dem i en folie-täckt låda ljuskänsligt.
4. Centrifugera proverna vid ~ 376 x g i 3 min. ta bort supernatanten i farligt avfall genom pipettering.
5. Återsuspendera i 1 mL 10% FWB genom att försiktigt upp och ner med 2 - 3 gånger.
6. Inkubera vid 30 ° c i 30 min (inte roterar) i rutan folie-täckt.
7. Centrifugera proverna vid ~ 376 x g för 3 min. ta bort supernatanten farligt avfall genom pipettering och lämna ~ 50 µL.
8. Under tiden förbereder DAPI/FWB i en 15 mL koniska rör: för 1 prov, blanda 1000 µL 10% formamid tvättbuffert med 1 µL 5 mg/mL DAPI. För 10 prover, blanda 10 mL 10% formamid tvättbuffert med 10 µL av 5 mg/mL DAPI. Återsuspendera i 1 mL av DAPI/FWB genom att försiktigt upp och ner med 2 - 3 gånger.
9. Inkubera vid 30 ° c i 30 min (inte roterar) i rutan folie-täckt.
10. Tina anti blekmedel reagens på is.
11. Centrifugera proverna vid ~ 376 x g i 3 min. ta bort supernatanten helt genom pipettering. Om det behövs, Centrifugera igen för att ta bort alla av supernatanten.
12. För prover som inte är avbildade omedelbart, återsuspendera pelleten i 50 µL av GLOX buffert utan enzymer. Pipettera upp och ner 3 - 4 gånger att blanda.
    1. Hålla alla unimaged prover i rutan folie-omfattas vid 4 ° c tills det att bilden. När redo att bild, Centrifugera proverna vid ~ 376 x g i 2 min och ta bort supernatanten helt pipettering. Återsuspendera i GLOX med enzymer som nedan.
13. För prover som avbildas omedelbart, tillsätt 15-20 µL av GLOX buffert med enzymer. Pipettera försiktigt upp och ner för att blanda.
    Obs: Volymen lagt till kan variera beroende på storleken på cellpelleten. Vi rekommenderar omblandning pelleten i 15 µL GLOX buffert med enzymer och kontrollera cell densiteten på Mikroskop. Om cellerna är alltför tät (cellerna klumpar ovanpå varandra), lägga till extra GLOX buffert med enzymer. Om cellerna är alltför gles, Centrifugera provet och ta bort ~ 5 µL buffert.
14. Pipettera 5 µL på ett täckglas (18 mm x 18 mm, nr 1), och sätta täckglaset på en bild.
15. Sätta en laboratorium torka ovanpå bilden där täckglaset placeras. Tryck försiktigt på det laboratorium torka att ställa in bilden (bör se flytande kommer bort från alla fyra kanter på täckglaset).
16. Överför bilden till Mikroskop rummet i en låda som täcks av aluminiumfolie.
17. Bild med wide-fältet fluorescens Mikroskop med hög förstoring (60-100 X) och hög numerisk bländare.
    Obs: För att samla in det maximala antalet fotoner som avges av de smFISH sonderna, confocal Mikroskop rekommenderas inte, eftersom de avsevärt begränsa mängden ljus som samlas in. Här uppgifterna samlades på ett mikroskop som är utrustat med en 100 X, 1,4 NA mål, använda filter CY5 (EX632/22, EM679/34) avbildas på 1.3 s, 100% T; TRITC (EX542/27, EM597/45), 1.3 s, 100% T; och DAPI (EX390/18, EM435/48), 0,05-0,1 s, 32-50% T. En ljus-fältet referensavbildning bör också förvärvas. Förvärva 15-25 skivor med ett stegstorlek av 0,1-0,2 µm, från helt nedanför fokus i synfältet helt ovan, för att säkerställa att alla RNA fläckarna redovisas.

4. bildanalys

1. Analysera smFISH data med publicerade smFISH analysverktyg såsom fisk-quant¹⁷ och StarSearch²eller med skräddarsydda program, beroende på de exakta kraven för experimentet.
   Obs: En bra analys pipeline bör tillåta användarna att fastställa en tröskel för att skilja de sanna RNA-platserna från bakgrunden och matar ut statistik som (valfritt) koordinaterna X, Y och Z och intensiteten i varje plats, antalet ställen i varje cell , och eventuellt passande parametrar som ett sätt att filtrera bort falska detektioner.

Representative Results

Att utvärdera hur väl smFISH protokollet arbetade (beskrivs i figur 1), utformade vi en uppsättning 54 sonder som kakel ramen öppen behandlingen av NDC80 -genen (figur 2A, överst). Sonden ligger mest 5' slutet benämns Probe 1; Nästa gång, sond 2; och den tredje, Probe 3, etc. 27 sonderna tilldelas en udda nummer (Probe 1, 3, 5...) är alla konjugerat till den CAL Fluor 590 (CF590) fluorescerande färgämnen; och 27 sonderna tilldelas ett jämnt antal (sond 2, 4, 6...), konjugerat till den Quasar 670 (Q670) fluorescerande färgen. Därför benämns dessa alternerande probe set ofta som ”udda/jämnt” sonder. Vid hybridisering, bör båda probe set märka samma avskriften.

Efter spot detection använde vi några mätningar för att bedöma kvaliteten på smFISH datauppsättningen. Den första var grad och kvalitet av colocalization för udda/jämnt sonderna. I vårt fall, 88% av alla smFISH fläckar colocalized (figur 2A och 2B), med mer än 95% av ställen parat inom 2 pixlar av varandra (figur 2 c, ihopkopplade), som ligger inom det förväntade värdet ges någon kromatisk och upptäckt avvikelse mellan de två fluorescerande kanalerna. I jämförelse, färre än 10% av oparade ställen hade ett närmaste-granne avstånd på mindre än 2 pixlar, visar att sannolikheten för att felaktigt tolkas en spot par är låg (figur 2 c). På 12% av oparade ställen var jämnt fördelade mellan de två kanalerna (figur 2B, jämför CF590 endast med Q670-bara); och, vi kom fram till att för denna 2,4 kb gen med en rad uttryck mellan noll till 45 utskrifter per cell, upptäcktes korrekt ~ 94% av RNA-molekyler i varje fluorescerande kanal. Om protokollet smFISH var suboptimal, skulle man observera (1) en större bråkdel av de smFISH platserna med endast en av de två fluorescerande signalerna (icke-colocalized), eller (2) celler med en mycket låg signal-brus-förhållande eller ingen signal alls.

Nästa bad vi om detektion av smFISH signalen var partisk när det gäller det totala antalet RNA-molekyler per cell. I en befolkning ligger det totala antalet en viss RNA i varje cell i en fördelning, med vissa celler som härbärgerat mer RNA-molekyler än andra. Ett bra smFISH protokoll bör kraftfullt upptäcka RNA oavsett om ett högt eller lågt antal RNA-molekyler är närvarande i varje cell. För att testa detta, för varje cell, beräknade vi bråkdel av de smFISH platserna med colocalized signaler och andelen med endast en av de två fluorescerande signalerna. Efter gruppering de celler som hade samma antal totala ställen per cell, beräknade vi den genomsnittliga andelen av colocalized (Parade) eller icke-colocalized (endast CF590- eller Q670-bara) ställen i en viss grupp, och ett diagram detta genomsnitt som en funktion av det totala antalet ställen per cell (figur 3). För varje kategori av fläckar liknade fraktioner över hela skalan av det totala antalet ställen per cell. Till exempel var jämföra cellerna med sammanlagt 20 fluorescerande ställen per cell jämfört med dem med sammanlagt 30 ställen, de genomsnittliga bråkdelar av de colocalized platserna liknande. Detta resultat föreslog att vår protokollet kunde upptäcka ett utbud av RNA-molekyler i en cell (upp till minst ~ 40 molekyler per cell). Om protokollet arbetat suboptimally, kan man observera en bias. Fraktionen av fläckarna med bara en av de två fluorescerande signalerna kan till exempel öka som det totala antalet ställen per cell ökade.

Använder detta optimerade protokoll, undersökte vi uttrycket av genen NDC80 , som kodar en Kinetochor protein, i olika odlingsbetingelser. Den NDC80 genen uttrycker två mRNA isoformer: den långa undecoded avskrift isoformen, NDC80^luti, har filnamnstillägget ~ 400 baspar i slutet 5' i jämförelse med kort NDC80^ORF isoform, men båda avskrifter dela kodande regionen av NDC80 -genen (se schematiskt i figur 4A). Vi har utformat två uppsättningar av sonder: The CF 590 uppsättning binder till regionen unik 5' i NDC80^luti; och Q 670 uppsättningen binder till den gemensamma regionen NDC80^luti och NDC80^ORF. NDC80^luti avskrifter identifierades som de smFISH ställen där signalerna från både probe set colocalized, medan de NDC80^ORF avskrifter var de med signalen endast från Q 670. På grund av det unika segmentet av NDC80^luti, kunde vi bara kakel 20 oligonukleotiden sonder längs denna region, som är färre än de rekommendera 30 till 48-sonderna. Således bestäms vi först om detta probsats kraftfullt kunde upptäcka RNA i vårt optimerade protokoll. För antingen fluorescerande kanal, vi ett diagram av signal-brus-förhållande (SNR, definieras som variansen för de pixlar som omger en plats i förhållande till spot intensiteten) mot signalen identifieras för varje smFISH plats, och genererade ett spridningsdiagram för alla fläckar identifierats i hela synfältet (exempel bilder i figur 4A ) och tomter i figur 4B. Två distinkta populationer var tydligt för båda de Q-670 och CF 590 sonden uppsättningar (optimerad, figur 4B), vilket tyder på att de sanna smFISH ställen (inuti gråzonen) kunde avskiljas från den bakgrund signalen. Observera att sådan åtskillnad i suboptimala villkoret var mindre uppenbara (Suboptimal, figur 4B).

Vi använde dessa två probe set för att studera uttrycket av NDC80^luti och NDC80^ORFunder vegetativ tillväxt och meios. I vegetativa celler, robust signal från Q 670 probe set upptäcktes, men inte från den CF 590 sonden (figur 5A, vegetativt), överens med observationen av northern blotting som bara den korta isoformen uttrycktes under vegetativ tillväxt¹⁶ . Detta resultat har också föreslagit att CF 590 sonden är specifika, vilket ger låg bakgrund i vårt optimerade smFISH protokoll. Däremot robust signal från båda probe set upptäcktes i meiotiska profas, och majoriteten av ställen hade colocalized signal (figur 5A, meiotiska profas). Tillsammans med norra blot analys (figur 5B) bekräftade denna iakttagelse att de långa isoformen NDC80^luti uttrycktes specifikt i meios. Dessa två typer av mRNA påvisades i cytoplasman (utanför regionen DAPI), vilket tyder på att både exporterades från kärnan, konsekvent med Ribosomen profilering data¹⁸.

För att avgöra om tillräckliga data samlades in på korrekt konto för den biologiska variationen inneboende till vår datauppsättning, utfört vi bootstrap analys med hjälp av statistiken för varje cell, som ingår (1) andelen av de colocalized platserna per cell och (2) fraktionen hos fläckarna med en av de två fluorescerande signalerna (CF 590 endast och Q 670 endast). I denna analys ut ett program slumpmässigt en cell från 437 kvantifierade cellerna för 500 iterationer. Därefter beräknades medelvärdet och variansen för respektive statistik är associerad med dessa 500 markerade celler. Denna process upprepades sedan för att slumpmässigt välja två celler från alla celler, utan ersättning; och då för att slumpmässigt välja tre celler, etc. tills en hälften av den totala datauppsättning storleken nåddes. Variansen i datauppsättningen nått sitt tak efter ~ 40 celler, tyder på att efter detta pekar de flesta av variationen i medelvärdet är inneboende till data i stället för en artefakt av undersampling (figur 6, infälld). Denna effekt blev mer uppenbara när vi ett diagram prov varians dividerat med medelvärdet, som en funktion av antalet celler som provtagits i varje iteration cykel (figur 6). Med de data som visas, blev förändringen i varians försvagande små efter ~ 60 celler. Antalet celler kvantifierades i ett smFISH experiment bör överstiga det minsta antalet celler som krävs för att uppnå en stabil medelvärde och en platå av variansen. I vårt fall kvantifierad vi över 95 celler per prov, per replikat. Det totala antalet (> 400 celler) överskred väl det minsta antalet (~ 60 celler) som krävs för att återspegla populationsmedelvärdet.

Med en skräddarsydd Matlab programmet¹⁶, vegetativa celler befanns ha en median av 5 NDC80^ORF avskrifter per cell, medan i meiotiska profas celler, medianen betydligt minskade till 4 utskrifter per cell (tvåsidiga Wilcoxon Rank Sum test, p = 0,026) (figur 7). Medianvärdet av NDC80^luti avskrifter per cell var 21 avskrifter, och 100% av cellerna uttryckt NDC80^luti avskrifter. Vi i diagram fraktionen av cellerna med ett givet antal avskrifter som en stegvis, relativ frekvens histogram eftersom antalet mRNA-molekyler är en diskret kvantitet. Den största bin varje histogram var normaliserade till samma höjd.

Figur 1: Flödesdiagram för protokollet smFISH. Cellerna fixeras med formaldehyd i rumstemperatur i 20 min eller vid 4 ° c över natten, för vegetativ tillväxt prover och meiotiska prover, respektive. Efter tvättning i buffert B tre gånger, rötas celler av zymolyase tills ~ 70% - 90% av cellerna rötas. Smält proverna sedan tvättas en gång med buffert B att ta bort zymolyase och därefter permeabilized i 70% etanol (EtOH) ~3.5 timmar. För att förbereda för hybridisering, inkuberas först prover i 10% formamid tvättbuffert (FWB) för ~ 20 min. Sedan är proverna resuspended i ~ 50 µL av hybridisering lösning, som innehåller de fluorescerande sonderna, för natten inkubation i mörker vid 30 ˚C. Efter hybridisering, proverna inkuberas i 10% FWB för 30 min att tvätta bort de överflödiga sonderna, och sedan inkuberas i 10% FWB med 4', 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI) att färga DNA. För provet avbildas omedelbart efter FWB/DAPI ruvning, är provet resuspended i GLOX bufferten kompletteras med katalas, Trolox och glukos oxidasnegativ (GLOX + enz); medan, de andra proverna resuspended i GLOX bufferten utan enzymer och lagras vid 4 ° c upp till ~ 3 timmar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2: bedömning av smFISH kvalitet med udda/jämnt sonder. (A) överst: Principschema för den udda/jämn probe set. Femtiofyra oligonukleotiden sonder plattsättning genen NDC80 utformades. De udda sonderna var märkt med en fluorophore (CF590, visas i magenta), och de jämna sonderna, med en annan fluorophore (Q670, visas i grönt). Botten: Representant smFISH bilder av meiotiska profas celler förvärvade med udda/jämnt sonden uppsättningar. 6 timmar efter celler (UB8144) överfördes till sporulering medium, en tid när dessa celler greps i meiotiska profas togs prover. DNA var fläckade av DAPI (visas i blått). Bilder visas som maximal intensitet projektionerna av z-stackar. Skalstapeln: 5 µm. (B) andelen Parade eller oparade smFISH fläckarna erhålls med den udda/jämn probe set. Sammanlagt 428 meiotiska profas celler analyserades, poolning från två oberoende experiment. Denna siffra är modifierad från figur 2-figur tillägg 4 av Chen et al. ¹⁶ (C) en kumulativ densitet funktion (CDF) av avståndet mellan varje par av Parade fläckar och avståndet mellan närmaste grannen en oparade spot. För varje upptäckta plats i en fluorescerande kanal, den ”k närmaste granne” algoritmen användes för att identifiera närmaste upptäckta plats — och avståndet till den platsen — i den kompletterande kanalen. Lokaliseringar som var ömsesidigt närmaste grannar ansågs vara ihopkopplade, och en ny lista genererades inspelning Parade, endast CF590- och Q670-bara upptäckterna. För varje kategori av upptäckter, var CDF histogram av distanserar ritade i Matlab, bekräftar att korrekt Parade ställen faktiskt var mycket närmare avstånd än de utan en motsvarande plats i den andra kanalen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3: fraktioner av Parade och oparade ställen, som en funktion av den total-RNA nummer per cell. För att testa om upptäckt och ihopkoppling av de smFISH platserna var partisk på olika nivåer, grupperades enskilda celler av total RNA uttryck. De genomsnittliga fraktionerna av Parade, endast CF590- och Q670-bara upptäckter beräknades för varje grupp av celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4: Kvalitetsbedömning av smFISH data genereras med hjälp av designade prober för NDC80^luti och NDC80^ORF mRNA. De Q 670 sonder (visas i grönt) hybridisera till gemensamma regionen delas mellan NDC80^luti och NDC80^ORF mRNA, medan CF 590 sonderna (visas i magenta) hybridisera till regionen unik 5' i NDC80^luti . (A) representant smFISH bilder av NDC80^luti och NDC80^ORF meiotiska profas, förvärvade under optimerad kontra suboptimala förhållanden. Stammar UB8144 (optimerad skick) och UB1337 (suboptimala tillstånd) var inducerad genomgår meios och fast under meiotiska profas. Dessa två stammar harbor synkronisering av olika system för att inducera meios, men antingen systemet påverkar inte smFISH kvalitet (inga data anges). I suboptimala tillstånd fastställdes celler i rumstemperatur i 20 min (ingen övernattning fixering), smält med zymolyase utan VRC kompletteras och hybridiseras i en lägre koncentration av VRC. Bilder visas som maximal intensitet projektionerna av z-stackar. DNA var fläckade av DAPI (visas i blått). Skalstapeln: 5 µm. (B) Scatterplots visar det signal-brus-förhållandet (SNR) och signalen av varje smFISH plats upptäcks i synfältet presenteras i figur 4A, för antingen fluorescerande kanal, liksom för optimerad eller suboptimala förhållanden. I optimerad skick var två populationer av de smFISH platserna närvarande. Sanna smFISH fläckarna fanns inuti gråzonen, separera från bakgrunden signalen. I suboptimala villkoret enskilda mRNA var svårt att skilja av ögat, och separationen mellan den sanna ställen och bakgrunden efter kör programvaran spot detection var mindre uppenbara. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5: Uttryck för NDC80^luti och NDC80^ORF avskrifter styrs temporally. (A) representant smFISH bilder av NDC80^luti och NDC80^ORF under vegetativ tillväxt och meios. Vegetativt prover togs när celler (UB8144) växer exponentiellt i rika näringsmedium. 6 timmar efter celler (UB8144) överfördes till sporulering medium, en tid när dessa celler greps i meiotiska profas togs meiotiska profas prover. De Q 670 sonder (visas i grönt) hybridisera till gemensamma regionen delas mellan NDC80^luti och NDC80^ORF mRNA, medan CF 590 sonderna (visas i magenta) hybridisera till unika 5' regionen NDC80^luti . DNA var fläckade av DAPI (visas i blått). Varje cell var iscensatt av sin Zip1-GFP signal, en markör för meiotiska profas. Vårt smFISH protokoll bevarar stark GFP signal utan ytterligare ändringar. Vegetativ tillväxt: Zip1-GFP negativ. Meiotiska profas: Zip1-GFP positivt. Bilder visas som maximal intensitet projektionerna av z-stackar. Skalstapeln: 5 µm. Denna siffra är modifierad från figur 2 c av Chen et al. ¹⁶. (B) NDC80^ORF, NDC80^lutioch Ndc80 protein (Ndc80p) nivå under meios (UB4074). NDC80^luti och NDC80^ORF nivåer bestämdes av nordliga plumpen och Ndc80p fastställdes av anti-V5 immunoblot vid angivna punkter. Hxk1p, laddar kontroll för immunoblot. Som stam UB8144, denna stam också hamnar den lenaaltin-NDT80 GAL4-ER synkronisering system^19,20. Cellerna var överförs till sporulering medium vid 0 timme och befrias från pachytene gripandet av β-estradiol tillägg 6 timmar senare. NDC80^luti avskriften upptäcktes kraftfullt i S/meiotiska profas, medan de NDC80^ORF avskrifter fanns huvudsakligen före meiotiska inträde (0 timmar) och under de meiotiska divisionerna (7-9 timmar). Denna siffra är modifierad från figur 6J av Chen et al. ¹⁶ Klicka här för att se en större version av denna siffra. 

Figur 6: Bootstrap analys för meiotiska profas prover visat i Figur 5 . Alla kvantifierade celler var poolade, och ett givet antal (n) celler var slumpmässigt provtas 500 gånger. Medelvärde och 95% konfidensintervall beräknades för fraktionen av Parade och oparade mRNA per cell. Dessa uppgifter var plottas för varje val av nummer n (infälld). Platån i varians var visualiserat genom att plotta prov varians dividerat med medelvärdet, som en funktion av antalet celler (n) provtas. Det totala antalet celler mätt (437 celler) kraftigt överskred antalet där felet nått sitt tak (~ 60 celler), vilket indikerar att ytterligare data inte skulle förbättra förtroende i mätningarna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 7: kvantifiering av smFISH data visas i Figur 5 , grafiskt som relativ frekvens histogram av cellerna med ett givet antal NDC80^luti och NDC80^ORF avskrifter per cell, med hjälp av data poolade från tre oberoende experiment. Den streckade linjen visar medianantalet NDC80^luti och NDC80^ORF avskrifter per cell. Varje histogram var normaliserade så att maximal bin höjd var samma över alla histogram. Det totala antalet 637 celler analyserades för vegetativ tillväxt och 437 för meiotiska profas. Tvåsidiga Wilcoxon Rank Sum test som utfördes för NDC80^luti och NDC80^ORFrespektive jämföra vegetativt och meiotiska profas prover. Denna siffra är modifierad från figur 2D av Chen et al. ¹⁶ Klicka här för att se en större version av denna siffra. 

Buffert B (1 L lager: 1,2 M sorbitol; 0.1 M kalium fosfatbuffert, pH 7.5)	1 x
Nuclease-gratis vatten	500 mL
Sorbitol	218.6 g
KH2PO4	2,18 g
K2HPO4	14.62 g
Nuclease-gratis vatten	Ta till 1 L slutlig volym
* Förvaras vid 4 ° c i 50 mL alikvoter efter filtret sterilisering
Zymolyase 100T (10 mg/mL)
* Förvaras vid-20 ˚C i alikvoter
Lös 10 mg zymolyase pulver i 1 mL MilliQ vatten
E. coli tRNA (10 mg/mL)
* Förvaras vid-20 ˚C i alikvoter
Lös 10 mg tRNA pulver i 1 mL MilliQ vatten
70% etanol (50 mL)	1 x (mL)
Ren etanol	35
Nuclease-gratis vatten	15
* Förvara i rumstemperatur
Hybridisering buffert (10 mL)	1 x (mL)
50% dextran sulfat	2
E. coli tRNA (10 mg/mL)	1
200 mM Vanadyl ribonucleoside komplex (VRC)	0,1
BSA, 50 mg/mL	0,04
20 x SSC	1
Formamid	1
Nuclease-gratis vatten	4,86
* Förvaras vid-20 ˚C i 250-µL eller 500-µL portioner
10% formamid tvättbuffert (10 mL)	1 x (mL)
Formamid vid rumstemperatur	1
20 x SSC	1
Nuclease-gratis vatten	8
* göra färska, virvel för 20-30s att blanda
10% glukoslösning
* Förvaras vid 4 ° c i alikvoter efter filtret sterilisering
Lös 1 g glukos i 10 mL nuclease-gratis vatten
Glukosoxidas
* Förvaras vid-20 ˚C i alikvoter
Lös upp 3,7 mg glukosoxidas i 1 mL 50 mM NaOAc, pH 5
Anti blekmedel (GLOX) buffert, utan enzymer (1 mL)	1 x (µL)
10% glukos i nuclease-gratis vatten	40
1 M Tris, pH 8,0	10
20 x SSC	100
Nuclease-gratis vatten	850
* gör färska, kan också lagra alikvoter vid 4 ˚C
Anti blekmedel (GLOX) buffert, med enzymer (50 µL)	1 x (µL)
Katalas (vortex milt, det lägger sig lätt)	0,5
Glukosoxidas	0,5
100 mM Trolox (löst i etanol)	1
GLOX buffert	50
* göra färska varje gång, förbereda på is, kan lagras vid 4 ° c i 2-3 timmar

Tabell 1. Buffertar och media

Discussion

Det protokoll som presenteras här härstammar från andra publicerade smFISH protokoll^2,3,21,22,23, och är särskilt optimerat för jäst stam bakgrunden SK1. Parametrarna för optimerad ingår antalet celler, fixering varaktighet, centrifugeringsvarvtal och varaktighet, matsmältningen varaktighet, matsmältningen buffert, sond koncentration och hybridisering buffert. Andra parametrar såsom hybridiseringstemperatur och varaktighet var inte optimerad. I detta avsnitt delar vi några anteckningar som skulle hjälpa till att anpassa detta protokoll till någon jäst stam bakgrund och tillväxten villkorar av intresse.

Cellväggen av spirande jäst är en stor utmaning mot att få hög kvalitet smFISH bilder i spirande jäst eftersom cellväggen hindrar sonden penetration. Ofullständig nedbrytning av cellväggen av zymolyase leder till ineffektiva hybridisering av sonder och hög cell till cell variation i signalen. Dock kan alltför matsmältningen göra celler alltför bräcklig, leder till betydande cell förlust under tvätt stegen och cell spricker under bild förberedelse för imaging. Således är det avgörande att optimera matsmältningen varaktighet. Vi rekommenderar att genomföra ett pilotprojekt smFISH experiment genom att smälta samma prov för olika mängder av tid. I vårt fall fick vi bästa smFISH data om vi slutade matsmältningen när ~ 80% av cellerna blev icke-brytningsfel. Vanligtvis för samma tillväxt tillstånd, kan olika genetiska mutant stammar smältas med liknande timing. Varaktigheten av matsmältningen skiljer sig dock jämfört bland olika odlingsbetingelser och olika stadier i meios i spirande jäst. När tidpunkten bestäms, är kvaliteten på smFISH reproducerbara. Observera kan att för mutant stammar med defekta cellväggsyntes och sammansättningen, matsmältning får fyllas i på mindre än 15 min. användning av olika partier av zymolyase också något ändra matsmältningen timing.

Optimal sonden koncentration som behövs för att uppnå en hög signal-brus-förhållande. Vi designade och köpt vår smFISH sonder kommersiellt. Bra sonder (ofta 20-mers) bör ha en procentandel av GC, från 35% till 45%, ett minsta avstånd av 2 baspar mellan sonder och låg korsreaktivitet. Vi använde en webbaserad sonden designer från tillverkaren för att generera en lista av sonder, och om det fanns tillräckligt sonder att välja mellan, vi skulle använda BLAST algoritmen i databasen Saccharomyces genomet för att eliminera sonderna med mer än 17 baspar överlappas med andra genomisk regioner. Vi valde den mer fotostabilt fluorescerande färgämnen (CAL Fluor 590) för sonden som anneals till den unika regionen NDC80^luti (CF 590) eftersom i denna uppsättning, antalet sonder som uppfyllt alla ovanstående kriterier (20 sonder) var lägre än den minimiantal som rekommenderas av tillverkaren (~ 25 sonder). Efter beredning av sonden lösningen efter tillverkarens instruktioner, gjorde vi en 1:10 utspädning av en stamlösning och lagras den utspädda lösningen i 5-µL alikvoter vid-20 ˚C. Varje alikvot användes bara en gång. För optimering, bör man göra seriella utspädningar från 1:10 utspädd lösning och test vilken koncentration ger det bästa signal-brus-förhållandet. Vi rekommenderar att göra en utspädning serie 1: 250, 1: 500, 1: 1000 och 1: 2000 från det ursprungliga beståndet. I vårt fall resulterade en 1: 500 utspädningsfaktorn i bästa signal-brus-förhållandet, för både CF 590 och Q 670 probe set.

Optimal fixering tid är också avgörande för framgångsrika smFISH i spirande jäst. Vi hittade den övernattning fixeringen vid 4 ˚C, snarare än fastställande i rumstemperatur i 20 min, betydligt bättre konsekvens och kvalitet av smFISH resultat för meiotiska prover. Även om vi inte har testat hur natten fixering kan påverka vegetativt prover, fixering vid rumstemperatur fungerat bra för detta tillväxt villkor. Således, för att optimera smFISH protokollet för nya stammar eller tillväxt villkorar, rekommenderar vi börjar med kort fixering tid vid rumstemperatur och ökar fixering tiden om hög variabilitet av signal påträffas.

Jämfört med andra publicerade protokoll^3,22,23, använder vår protokollet den RNase inhibitor VRC under matsmältningen och en högre koncentration av VRC under hybridisering. Tillägg av VRC i dessa två steg förbättrats konsekvensen av smFISH resultat, eventuellt genom att bättre bevara RNA-molekyler mot nuclease verksamhet, som kan införas genom zymolyase mixen (enzymet renas från rå extrakt och kan innehålla RNase föroreningar). Således rekommenderar vi använder mängden VRC enligt förteckningen i våra protokoll eller ännu högre koncentrationer av VRC för optimering.

En betydande del av cellerna kan förloras under tvätt stegen i både buffert B och formamid tvättbuffert. För att minska cellförlust, kunde man öka hastigheten med centrifugering. I vårt fall tvättar med en hög hastighet (21 000 x g) till pellet våra prover under buffert B betydligt reducerad cellförlust. Dock bli celler mycket bräcklig efter zymolyase matsmältningen, så du inte bör ändra centrifugeringsvarvtal. I stället föreslår vi att använda låg friktion rören från vetenskaplig USA, som kraftigt bidra till att pressa samman cellerna under tvättarna i formamid tvättbuffert. Våra protokoll kan sammantaget konsekvent generera en enskiktslager av celler tät nog för effektiv bildbehandling. Normalt 7 synfält bör ge > 130 celler lämplig för kvantifiering.

Avslutningsvis är det viktigt att fastställa de optimala parametrarna för och de utgångar som krävs från bildanalys. För att upptäcka smFISH ställen, publicerade analysprogram vanligen filtrera raw-bilder med Gaussisk kärna ta bort bakgrund signal och be användarna att fastställa signal-brus-förhållandet att använda för varje uppsättning bilder^2,17. Tyvärr finns det inte för närvarande en enda standard genom vilken rätt parametrar bestäms, och så några empiriska tester av dessa olika inställningar krävs. Om du vill ange parametrar som behövs för varje av dessa steg, behöver man iterativt ingång olika uppsättningar av parametrar och kolla hur väl de resultat som erhålls från varje uppsättning matchar från manuell räknar i några representativa celler. När en uppsättning parametrar finns, kan det användas för de flesta av bilderna erhålls trots olika odlingsbetingelser och genetiska bakgrunder.

Dessutom kan man testa om maximal intensitet projektionen av smFISH bilder kan utföras före kvantifiering²². Detta steg förenklar plats upptäckt algoritm och avsevärt minskar tänkbar tid, men på bekostnad av vissa potentiellt användbar information om enskilda ställen, såsom deras subcellulär lokalisering. I vårt fall var antalet mRNA-molekyler som produceras av den NDC80 genen tillräckligt låg för att fläckarna var väl separerade efter denna behandling (inte ovanligt för avskrifter i spirande jäst^3,7). I fall där colocalization analys är kritiska, behöver rörledningen analys bestämma placeringen av varje smFISH plats i varje kanal att bedöma colocalization. Beroende på de specifika frågorna uppmanas, annan information såsom intensiteten av varje plats kan också behöva extraheras från rörledningen för vidare analys. Optimera nyckeln steg i protokollet och rörledningen bild analys är avgörande att få hög kvalitet av smFISH data för att studera frågan av intresse.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BSA, RNase-free (50 mg/mL)	Ambion	AM2616	Store at -20 °C.
Catalase	Sigma	C3515	Store at 4 °C for short-term. Vortex before use.
DAPI	Sigma	D9564	Store at -20 °C after reconstitution in water. Protect from light.
50% Dextran Sulfate	Milli Pore	S4030	Store at room temperature. Very viscous liquid. Handle with patience.
E. coli tRNA	Sigma	R4251	Store at -20 °C in aliquots after reconstitution in water.
Ethanol (100%, 200 proof)	various		Flammable.
37% Formaldehyde	Fisher	F79-500	Store at room temperature. Toxic. Use and dispose with caution.
Formamide	Ambion	AM9342	Store at 4 °C. Open after the temperature equilibrates to room temperature in order to prevent oxidation. Toxic. Use and dispose with caution.
Glucose	various		Store at 4 °C after dissolving in nuclease-free water.
Glucose oxidase	Sigma	G2133	Store at -20 °C in aliquots after reconstitution in 50 mM NaOAc, pH 5.
Nuclease-free water	Ambion	AM9932	Store at room temperature.
Potassium phosphate (monobasic and dibasic)	various		Store at room temperature.
Probe library, diluted in TE, pH 8.0	Biosearch Technologies		Store at -20 °C in aliquots (5 µL) after reconstitution in TE pH 8.0, following the instructions from the manufacturer. Protect from light.
Sorbitol	various		Store at room temperature.
20X SSC	Ambion	AM9763	Store at room temperature.
TE, pH 8.0	Ambion	AM9849	Store at room temperature.
1 M Tris, pH 8.0	Ambion	AM9856	Store at room temperature.
Trolox	Sigma	238813	Store at -20 °C in aliquots.
200 mM Vanadyl ribonucleoside complex (VRC)	NEB	S1402S	Store at -20 °C in aliquots after reconstitution, following the instructions from the manufacturer.
Zymolyase 100T	MP Biomedicals	08320932	Store at -20 °C in aliquots after reconstitution in water.
Low-adhesion tubes	USA Scientific	1415-2600	Store at room temperature.