Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

التهجين في الموقع Fluorescence جزيء واحد (سمفيش) التحليل في مهدها الخميرة النمو الخضري والانقسام الاختزالي

Published: May 25, 2018 doi: 10.3791/57774

Summary

هذه الأسفار جزيء واحد في الموقع بروتوكول التهجين هو الأمثل لتقدير عدد جزيئات الحمض النووي الريبي في مهدها الخميرة أثناء النمو الخضري والانقسام الاختزالي.

Abstract

جزيء واحد الأسفار في الموقع التهجين (سمفيش) تقنية قوية لدراسة التعبير الجيني في الخلايا المفردة بسبب قدرتها على كشف والعد الفردي من جزيئات الحمض النووي الريبي. مكملة لأساليب العميق القائم على التسلسل، سمفيش يوفر معلومات حول خلية إلى الاختلاف في وفرة نسخة وإضفاء الطابع المحلي على سوبسيلولار الحمض النووي الريبي معين. في الآونة الأخيرة، استخدمنا سمفيش لدراسة التعبير عن الجين NDC80 أثناء الانقسام الاختزالي في مهدها الخميرة وفي أي محضر اثنين isoforms موجودة و isoform نسخة قصيرة له التسلسل بأكمله مشتركة مع إيسوفورم طويلة. تحديد isoform محضر كل ثقة، الأمثل البروتوكولات المعروفة سمفيش وحصل على اتساق عالية ونوعية البيانات سمفيش للعينات التي اكتسبت خلال مهدها الخميرة الانقسام الاختزالي. هنا، يمكننا وصف هذا البروتوكول الأمثل، المعايير التي نستخدمها لتحديد ما إذا كان يتم الحصول على الجودة العالية للبيانات سمفيش، وبعض النصائح لتنفيذ هذا البروتوكول في سلالات الخميرة وظروف النمو الأخرى.

Introduction

التنظيم الديناميكي للتعبير الجيني محركات تنمية الكائن حي، فضلا عن استجابتها للإجهاد البيئي، والعدوى، والتغيرات في التمثيل الغذائي. الدراسات التي تركز على تنظيم النسخي تعتمد على التكنولوجيات التي تقيس وفرة الجيش الملكي النيبالي. يتم استخدام أحد هذه الأساليب، ووصف الأسفار جزيء واحد في الموقع التهجين (سمفيش)، للكشف عن كل جزيئات الحمض النووي الريبي في الخلايا المفردة1،2. هذا الأسلوب يتيح قياس التغير خلية إلى خلية في التعبير الجيني وتصميم تعريب الجيش الملكي النيبالي داخل الخلايا.

في الأسلوب سمفيش الأكثر استخداماً، يتطلب الكشف جزيء الحمض النووي الريبي الفردية المسابير الحمض النووي قصيرة متعددة (غالباً ~ 48 20-مير المسابير) التي تعتبر مكملة لهدف الجيش الملكي النيبالي وهي مترافق بصبغة الفلورسنت نفس. نتائج ملزمة للتحقيق الفلورسنت واحدة في إشارة ضعيفة، ولكن الإشارة من فرقة تحقيقات جميع قوية. هذه الميزة بتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء إلى حد كبير لأنه على الرغم من أن تحقيق واحد يمكن أن يحمل ملزم خارج الهدف، مثل هذه الإشارات من المتوقع أن تكون ضعيفة للغاية مقارنة بالهدف جزيء الحمض النووي الريبي3. ضمن خطأ الكشف، يمكن عد عدد جزيئات الحمض النووي الريبي والمقارنة عبر مختلف ظروف النمو وبين طفرات مختلفة.

منذ تطورها الأولى، تم تكييف سمفيش لدراسة الجوانب المختلفة للجينات التعبير4، مثل النسخ استطالة1،2،5،6، النسخي انفجار7 الربط , 8 , 9والتعبير الجينية داخل الخلايا10،،من1112، والجيش الملكي النيبالي التعريب13،،من1415. في الآونة الأخيرة، وقد استخدمنا هذا الأسلوب لدراسة التعبير عن isoforms نسخة اثنين من الجينات نفسها، التي isoform محاضر جلسات قصيرة (NDC80ORF) قد التسلسل بأكمله مشتركة مع إيسوفورم طويلة (NDC80لوتي )16. بشكل فريد isoforms مرناً اثنين، استخدمنا مسبار مجموعتين: مجموعة واحدة محددة لتسلسل فريد NDC80لوتي، ومجموعة أخرى، مترافق بصبغة الفلورسنت آخر، يربط منطقة مشتركة من isoforms اثنين. NDC80لوتي الجيش الملكي النيبالي هو تحديد كبقعة كولوكاليزيد مع كلا إشارات مضيئة، بينما NDC80ORF الجيش الملكي النيبالي هو الذي يحتوي على إشارة فقط من مجموعة التحقيق المشتركة. نظراً لأن عدد من NDC80ORF النصوص ويحسب باستخدام أسلوب "طرح"، كفاءة عالية من التهجين المسبار ونسبة الإشارة إلى الضوضاء عالية ضرورية لتحديد البقع سمفيش ثقة وتقليل الخطأ نشر.

وتصف هذه الورقة على بروتوكول أمثل لأداء سمفيش في مهدها الخميرة Saccharomyces cerevisiae. في هذا البروتوكول وعدد الخلايا، ووقت التثبيت، وقت الهضم، والهضم المخزن المؤقت، وتركيز التحقيق والتهجين المخزن المؤقت المستخدم للتجارب سمفيش كانت الأمثل ل SK1 سلالة خلفية S. cerevisiae تمر الخضري النمو أو الانقسام. ومع ذلك، نلاحظ أيضا في هذه المخطوطة: (1) الطريقة التحقق من جودة البيانات سمفيش بعد الحصول على الصور، والخطوات (2) الواردة في البروتوكول التي قد تتطلب التحسين الإضافي للخلفيات سلالة مختلفة وظروف نمو.

Protocol

ملاحظة: يتم سرد كافة المخازن المؤقتة والوسائط المستخدمة في هذا البروتوكول في الجدول 1. يتم سرد معلومات المورد الكواشف في الجدول للمواد.

يوم 1/1-2 يوم:

ملاحظة: للثقافة الخضري، تنمو خلايا ل التطوير التنظيمي600 من 0.4 إلى 0.6 في متوسط مفضل. للثقافة، وهو يحفز الخلايا على الخضوع للانقسام باستخدام أسلوب مفضل (استزراع عادة في التطوير التنظيمي600 من 1.85).

1-عينة من التثبيت والهضم

  1. إصلاح ما مجموعة ~3.5 OD600 من الخلايا في 3% فورمالدهايد.
    1. لثقافة الخضري، إضافة مل 5.52 الثقافة إلى 480 ميليلتر من 37% فورمالدهيد في أنابيب مخروطية الشكل 15 مل.
    2. للثقافة، وهو إضافة 1840 ميليلتر للثقافة إلى 160 ميليلتر من 37% فورمالدهيد في أنابيب ميكروسينتريفوجي 2 مل. عكس 5 مرات ~ إلى المزيج.
      تنبيه: فورمالدهايد السامة. التعامل معها والتصرف فيها وفقا للوائح المؤسسية.
  2. وضع أنابيب على طبل اسطوانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. للعينات هو، بعد تحديد في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة، مواصلة إصلاح بين عشية وضحاها في 4 ˚C، بالتناوب.
    ملاحظة: التثبيت بين عشية وضحاها يزيد من إمكانية تكرار نتائج ونوعية البيانات سمفيش التي تم الحصول عليها للعينات هو. وينبغي أن يكون الأمثل وقت التثبيت.
  3. بينما يتم تحديد العينات، ذوبان الجليد 200 ملم فاناديل ريبونوكليوسيدي المجمعات (فكتوريا) في 65 ˚C لمدة 10 دقيقة على الأقل.
  4. إعداد مزيج الهضم الرئيسي في أنبوب 15 مل: للعينة 1، مزيج ميليلتر 425 من "المخزن المؤقت ب" مع ميليلتر 40 مم 200 فكتوريا (استعد 65 ˚C)؛ لعينات 5، يخلط 2125 ميليلتر من "المخزن المؤقت ب" 200 ميليلتر من 200 ملم فكتوريا (استعد 65 ˚C). دوامة ~ 5 s ريسوسبيند في فكتوريا تماما قبل إضافة إلى مزيج الرئيسي، الذي سوف يظهر الضوء الأخضر البنى بعد إضافة فكتوريا.
    ملاحظة: يحسن إضافة فكتوريا خلال الهضم اتساق النتائج سمفيش، ويحتمل أن تكون عن طريق تثبيط الملوث نوكلاس عرضته الخليط زيمولياسي، الذي هو تنقيته من استخراج النفط الخام. ينبغي أن يكون الأمثل مقدار فكتوريا المطلوب في هذه الخطوة.
  5. لعينات الخضري، الطرد المركزي هذه الأنابيب في x ~ 1057 ز لمدة 3 دقائق. للحصول على عينات هو (بعد التثبيت بين عشية وضحاها)، الطرد المركزي في 21,000 ز x 1.5 دقيقة صب أو نضح المادة طافية للنفايات فورمالدهايد.
    ملاحظة: يتم تنفيذ جميع الخطوات الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة.
  6. ريسوسبيند الخلايا في 1.5 مل من البرد "المخزن المؤقت ب" بيبيتينج صعودا وهبوطاً أو عكس الأنابيب والتحريك إلى المزيج. نقل عينات الخضري لأنابيب 2 مل بعد استثارة.
  7. أجهزة الطرد المركزي في 21,000 س ز للحد الأدنى 1.5 إزالة الجزء الأكبر السائل بالشفط بالتخلية أو بيبيتينج، تاركة وراءها ~ 100 ميليلتر.
  8. ريسوسبيند الخلايا في 1.5 مل من البرد "المخزن المؤقت ب"
  9. أجهزة الطرد المركزي في 21,000 س ز للحد الأدنى 1.5 إزالة الجزء الأكبر السائل بالشفط بالتخلية أو بيبيتينج، تاركة وراءها ~ 100 ميليلتر.
  10. ريسوسبيند الخلايا في 1.5 مل من البرد "المخزن المؤقت ب أجهزة الطرد المركزي" في 21,000 س ز لمقدار 1.5 Aspirate السائل تماما بفراغ أو بواسطة بيبيتينج.
  11. ريسوسبيند الخلايا في 425 ميليلتر من مزيج الرئيسي الهضم، وإيجاز دوامة ريسوسبيند. إضافة 5 ميليلتر من 100T 10 ملغ/مل زيمولياسي لكل أنبوبة.
    ملاحظة: دوامة زيمولياسي في كل مرة من قبل إضافة إلى الأنابيب. إضافة زيمولياسي إلى كل أنبوب على حدة، بدلاً من إضافة إلى مزيج الرئيسي. كل الخطوات المساعدة في الحفاظ على اتساق الهضم بين أنابيب لأن رواسب زيمولياسي بسرعة.
  12. دوامة 2-3 s المزيج. وضع الأنابيب على طبل اسطوانة، وهضم في ˚C 30 لمدة 15-30 دقيقة. للخلايا النباتية والمراحل المبكرة هو، عادة ما يستغرق ~ 15 دقيقة، وهو الطور الأول وهو الشعب، وعادة ما يستغرق ~ 30 دقيقة.
    ملاحظة: التحقق في المجهر كل 5 دقائق بعد 15 دقيقة، ووقف عملية الهضم عندما تظهر ~ 80% خلايا غير الشفافة وغير الانكسار. من هذه النقطة، خلايا هشة جداً. التعامل مع الخلايا بلطف وتجنب استخدام الشفط بالتخلية أو فورتيكسينج-
  13. الطرد المركزي هذه الأنابيب في ~ 376 س ز للحد الأدنى 3 إزالة السائل تماما من بيبيتينج.
  14. ريسوسبيند الخلايا مع 1 مل من "المخزن المؤقت ب" بلطف من بيبيتينج 1-2 مرات صعودا ونزولاً إلى المزيج.
  15. الطرد المركزي هذه الأنابيب في ز x ~ 376 للحد الأدنى 3 سائل "إزالة المخزن المؤقت ب" من بيبيتينج. بلطف ريسوسبيند الخلايا في 1 مل إيثانول 70% (المخفف بالماء رناسي خالية).
  16. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 3.5-4 ساعات.

2-التهجين

  1. جلب ميثلامين إلى درجة حرارة الغرفة (قاسمة 50 مل، فإنه يأخذ ~ 30 دقيقة في حوض ماء).
    ملاحظة: لا تفتح زجاجة ميثلامين حتى الزجاجة يصل إلى درجة حرارة الغرفة لتجنب أكسدة ميثلامين.
    تنبيه: ميثلامين السامة. التعامل معها والتصرف فيها وفقا للوائح المؤسسية.
  2. إعداد 10% ميثلامين أغسل المخزن المؤقت في أنبوب مخروطي 15 مل.
  3. الطرد المركزي هذه الأنابيب في ~ 376 س ز للحد الأدنى 3 إزالة 500 ميليلتر من الإيثانول 70% من بيبيتينج. بلطف بيبيت صعودا ونزولاً ريسوسبيند الخلايا المتبقية، ومن ثم نقل الخلايا إلى أنابيب التصاق منخفضة.
    ملاحظة: استخدام أنابيب التصاق منخفضة إلى حد كبير يقلل من فقدان الخلية أثناء يغسل اللاحقة.
  4. الطرد المركزي الأنابيب مرة أخرى في ز x ~ 376 للحد الأدنى 3 إزالة جميع الإيثانول واسطة بيبيتينج.
  5. أضف 1 مل 10% ميثلامين أغسل المخزن المؤقت، ولطف بيبيت صعودا وهبوطاً 2-3 مرات على ريسوسبيند الخلايا.
  6. السماح للخلايا للجلوس في درجة حرارة الغرفة ل ~ 20 دقيقة أثناء إعداد "الحل التهجين". لنموذج 1، مزيج 50 ميليلتر من "التهجين المخزن المؤقت" (غرفة temp.) و 5 ميليلتر من 200 ملم فكتوريا (استعد 65 ˚C) 1 ميليلتر من كل مسبار (200 شمال البحر الأبيض المتوسط النهائي). لعينات 5، مزيج 250 ميليلتر من "التهجين المخزن المؤقت" (غرفة temp.) و 25 ميليلتر من 200 ملم فكتوريا (استعد 65 ˚C) 5 ميليلتر من كل مسبار (200 شمال البحر الأبيض المتوسط النهائي).
    1. ذوبان الجليد "التهجين المخزن المؤقت" (المجمدة في ˚C-20) إلى درجة حرارة الغرفة قبل فتح أنبوب لمنع أكسدة ميثلامين.
    2. بعد إضافة 200 ملم من فكتوريا، دوامة ل 5-10 s قبل إضافة التحقيقات، التي صممت وشراؤها تجارياً، وأعيد تشكيلها وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
    3. إذا اشتركت المحتضنة المسابير اثنين، أضف 1 ميليلتر من 01:10 إضعاف المخزون مسبار #1، فضلا عن 1 ميليلتر من 01:10 إضعاف المخزون مسبار #2، جعل إضعاف نهائي ~ 1: 500 للتحقيق أما. التركيز اللازم لاحتياجات أفضل الإشارات إلى الضجيج نسبة لتكون الأمثل (انظر مناقشة للحصول على التفاصيل).
  7. الطرد المركزي العينات في ~ 376 س ز للحد الأدنى 3 إزالة المادة طافية في النفايات الخطرة التي بيبيتينج.
  8. إضافة على الأقل 50 ميليلتر من "التهجين الحل" لكل أنبوبة. نفض الغبار الأنابيب المزيج.
  9. تبني في 30 ˚C على طبل اسطوانة لمدة 16 ساعة على الأقل في الظلام.

يوم 2/يوم 3

3-الغسيل والتصوير

  1. جلب ميثلامين إلى درجة حرارة الغرفة.
  2. إعداد 10% ميثلامين غسل العازلة (FWB) في أنبوب مخروطي 15 مل.
  3. إزالة الأنابيب من طبل الاسطوانة ووضعها في مربع المغطاة بإحباط لحماية من الضوء.
  4. الطرد المركزي العينات في ~ 376 س ز للحد الأدنى 3 إزالة المادة طافية في النفايات الخطرة التي بيبيتينج.
  5. ريسوسبيند في 1 مل 10% FWB بلطف بيبيتينج صعودا وهبوطاً 2-3 مرات.
  6. تبني في 30 ˚C مدة 30 دقيقة (غير الدورية) في المربع المغطاة بإحباط.
  7. الطرد المركزي هذه العينات في ز x ~ 376 لإزالة الحد الأدنى 3 المادة طافية للنفايات الخطرة عن طريق بيبيتينج واترك ~ 50 ميليلتر.
  8. ومن ناحية أخرى، تعد DAPI/FWB في أنبوب مخروطي 15 مل: للعينة 1، مزيج 1000 ميليلتر من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي ميثلامين 10% مع 1 ميليلتر من 5 ملغ/مل DAPI. 10 عينات، مزيج من 10 مل من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي ميثلامين 10% مع 10 ميليلتر من 5 ملغ/مل DAPI. ريسوسبيند في 1 مل من DAPI/FWB بلطف بيبيتينج صعودا وهبوطاً 2-3 مرات.
  9. تبني في 30 ˚C مدة 30 دقيقة (غير الدورية) في المربع المغطاة بإحباط.
  10. ذوبان الجليد الكواشف مكافحة التبييض على الجليد.
  11. الطرد المركزي العينات في ~ 376 س ز للحد الأدنى 3 إزالة المادة طافية تماما من بيبيتينج. إذا لزم الأمر، الطرد المركزي مرة أخرى لإزالة كل من المادة طافية.
  12. للعينات التي لم يتم تصويرها فورا، ريسوسبيند بيليه في 50 ميليلتر من "المخزن المؤقت جلو" دون الإنزيمات. بيبيت صعودا وهبوطاً 3-4 مرات لخلط.
    1. إبقاء جميع العينات أونيماجيد في المربع المغطاة بإحباط في 4 ˚C حتى جاهزة للصورة. عندما تكون جاهزاً الصورة، الطرد المركزي العينات في ~ 376 س ز لمدة 2 دقيقة وإزالة المادة طافية تماما من بيبيتينج. ريسوسبيند في جلو مع الإنزيمات على النحو المبين أدناه.
  13. لعينات يجري تصويرها على الفور، إضافة 15-20 ميليلتر من المخزن المؤقت جلو مع الإنزيمات. بلطف بيبيت صعودا ونزولاً المزيج.
    ملاحظة: يمكن أن تختلف حجم تضاف تبعاً لحجم الخلية بيليه. نوصي ريسوسبيندينج بيليه في 15 ميليلتر جلوكس المخزن المؤقت مع الإنزيمات والتحقق من كثافة الخلية في المجهر. إذا كانت الخلايا كثيفة جداً (الخلايا التثاقل فوق بعضها البعض)، إضافة المخزن المؤقت جلو إضافي مع الإنزيمات. إذا كانت الخلايا ضئيلة جداً، الطرد المركزي العينة وإزالة ~ 5 ميليلتر من المخزن المؤقت.
  14. بيبيت 5 ميليلتر على ساترة (18 ملم × 18 مم، رقم 1)، ووضعت ساترة على شريحة.
  15. وضع مسح مختبر على رأس الشريحة حيث يوضع ساترة. اضغط برفق على مسح مختبر لمجموعة الشرائح (يجب أن تشاهد السائل نزوله من كافة الحواف الأربع ساترة).
  16. نقل الشريحة إلى غرفة المجهر في مربع تغطيها رقائق الألومنيوم.
  17. صورة باستخدام مجهر الأسفار واسع المجال مع تضخم عالية (60-100 س) وفتحه رقمية عالية.
    ملاحظة: لجمع أقصى عدد الفوتونات المنبعثة من المسابر سمفيش، مجاهر [كنفوكل] لا ينصح، كما أنها تحد بشكل كبير من كمية الضوء التي سيتم جمعها. هنا، تم جمع البيانات على مجهر مجهزة 100 X، 1.4 نا الهدف، باستخدام مرشحات CY5 (EX632/22، EM679/34) تصويرها في 1.3 ق، 100% T؛ تريتك (EX542/27، EM597/45)، 1.3 ثانية، 100% T؛ و DAPI (EX390/18، EM435/48)، 0.05-0.1 s، ت 32-50%. وينبغي أيضا الحصول على صورة مشرقة حقل مرجع. الحصول على شرائح 15-25 مع حجم خطوة من 0.1-0.2 ميكرومتر، من تماما دون التركيز في مجال الرؤية لما سبق تماما، للتأكد من أن جميع البقع الحمض النووي الريبي تحتسب.

4. تحليل الصورة

  1. تحليل البيانات سمفيش مع أدوات التحليل سمفيش المنشورة مثل السمك-كوانت17 وستارسيارتش2، أو مع برامج مصنوعة خصيصا، تبعاً للاحتياجات الدقيقة للتجربة.
    ملاحظة: خط أنابيب تحليل جيد وينبغي السماح للمستخدمين بتحديد عتبة لفصل بقع الحمض النووي الريبي الحقيقية من الخلفية، وإخراج إحصائيات مثل إحداثيات X و Y و Z (اختياري) وكثافة كل نقطة، عدد النقاط في كل خلية ، وربما من المناسب معلمات كوسيلة لتصفية المكتشفة كاذبة.

Representative Results

تقييم جيدا كيف سمفيش البروتوكول عملت (المبين في الشكل 1)، قمنا بتصميم مجموعة من 54 المسابير التي تجانب الإطار القراءة المفتوحة للجينات NDC80 (الشكل 2A، أعلى). التحقيق يقع في أقصى نهاية 5 ' يشار مسبار 1؛ واحد القادم، 2 التحقيق؛ والثلث، 3 التحقيق، إلخ. المسابر 27 المعينة الغريب عدد (التحقيق 1، 3، 5...) جميع مترافق بصبغة الفلورسنت CAL فلور 590 (CF590)؛ والمسابير 27 تعيين عدد زوجي (Probe 2، 4، 6...)، مترافق بصبغة الفلورسنت كوازار 670 (Q670). ومن ثم فهذه المجموعات مسبار التناوب غالباً ما يشار إلى تحقيقات "الفردية/حتى". عند التهجين، مجموعتي التحقيق ينبغي تسمية النسخة نفسها.

بعد الكشف الموضعي، قمنا باستخدام قياسات قليلة للحكم على جودة مجموعة البيانات سمفيش. وكانت الأولى درجة ونوعية كولوكاليزيشن لتحقيقات الفردية/حتى. وفي حالتنا، كولوكاليزيد 88% من جميع المواقع سمفيش (الشكل 2 ألف و 2 باء)، بأكثر من 95% من البقع إقران 2 بيكسل من بعضها البعض (الشكل 2، إقران)، الذي ضمن القيمة المتوقعة نظراً لأي لوني والكشف عن انحراف بين قناتين الفلورسنت. وبالمقارنة، كانت أقل من 10% بقع مزاوج على مسافة أقرب جاره من أقل من 2 بكسل، تبين أن احتمال ديانة زوج بقعة منخفضة (الشكل 2). 12% البقع مزاوج قسمت بالتساوي بين القناتين (الشكل 2B، قارن CF590 فقط مع Q670 فقط)؛ وهكذا، خلصنا إلى أن لهذا الجين 2.4 كيلو بايت مع طائفة من التعبير بين صفر إلى 45 محاضر كل خلية، اكتشفت ~ 94% جزيئات الحمض النووي الريبي بدقة في كل قناة الفلورسنت. ولو دون المستوى الأمثل بروتوكول سمفيش، أن المرء يلاحظ (1) جزء أكبر من البقع سمفيش مع واحد فقط من إشارتين الفلورسنت (غير كولوكاليزيد)، و/أو (2) الخلايا مع نسبة الإشارة إلى الضوضاء منخفضة جداً أو لا توجد إشارة على الإطلاق.

لقد طلبنا التالية إذا كان متحيزا للكشف عن إشارة سمفيش فيما يتعلق بالعدد الإجمالي لجزيئات الحمض النووي الريبي كل خلية. في عدد سكان، العدد الإجمالي للجيش النيبالي الملكي خاصة في كل خلية يكمن في توزيع، مع بعض الخلايا التي تأوي أكثر من جزيئات الحمض النووي الريبي من غيرها. بروتوكول سمفيش جيدة ينبغي أن قوة كشف الجيش الملكي النيبالي بغض النظر عما إذا كان رقم ارتفاع أو انخفاض عدد من جزيئات الحمض النووي الريبي موجودة في كل خلية. لاختبار هذا، لكل خلية، قمنا بحساب جزء صغير البقع سمفيش مع إشارات كولوكاليزيد والكسر مع واحد فقط من إشارتين الفلورسنت. بعد تجميع الخلايا التي كانت على نفس العدد من مجموع النقاط كل خلية، قمنا بحساب متوسط كسر كولوكاليزيد (زوجي) أو غير كولوكاليزيد (CF590 فقط أو Q670 فقط) البقع في مجموعة معينة، ورسوم بيانية هذا المتوسط كدالة لإجمالي عدد البقع كل خلية (الشكل 3). لكل فئة من البقع، الكسور متشابهة عبر طائفة كاملة من العدد الإجمالي للبقع كل خلية. على سبيل المثال، مقارنة الخلايا مع مجموعة بقع الفلورسنت 20 كل خلية مقابل تلك مع ما مجموعة 30 البقع، الكسور متوسط من البقع كولوكاليزيد كانت متشابهة. واقترحت هذه النتيجة أن لدينا بروتوكول يمكن الكشف عن جزيئات طائفة من الجيش الملكي النيبالي في خلية (تصل إلى مالا يقل عن 40 ~ جزيئات كل خلية). إذا كان يعمل البروتوكول suboptimally، قد يلاحظ المرء وجود تحيز. على سبيل المثال، قد يؤدي إلى زيادة جزء صغير البقع مع واحد فقط من إشارات الفلورسنت اثنين كإجمالي عدد البقع كل خلية زيادة.

باستخدام هذا البروتوكول الأمثل، قمنا بدراسة التعبير عن الجين NDC80 ، الذي يقوم بترميز بروتين kinetochore، في ظروف مختلفة للنمو. الجين NDC80 تعرب عن اثنين مرناً isoforms: isoform نص طويل أونديكوديد، NDC80لوتي، يحتوي على ملحق ~ 400 قاعدة أزواج في نهاية 5 ' بالمقارنة مع القصير NDC80ORF إيسوفورم، ولكن كل النصوص حصة منطقة ترميز الجينات NDC80 (انظر تخطيطي في الشكل 4A). لقد قمنا بتصميم مجموعتين من تحقيقات: مجموعة CF 590 بربط منطقة فريدة من نوعها 5 ' NDC80لوتي؛ ويربط مجموعة 670 ف منطقة مشتركة من NDC80لوتي و NDC80ORF. تم الكشف عن وقائع NDC80لوتي كالبقع سمفيش فيها التحقيق الإشارات من كل مجموعات كولوكاليزيد، في حين NDC80ORF النصوص تلك مع إشارة فقط من Q 670. نظراً لحجم الجزء فريدة من نوعها من NDC80لوتي، نحن يمكن أن تجانب فقط 20 المسابير اليغنوكليوتيد على طول هذه المنطقة، وعدد أقل من المسابر 30 إلى 48 الموصى بها. وبذلك، عقدنا العزم أولاً إذا هذا مجموعة التحقيق يمكن الكشف عن قوة الجيش الملكي النيبالي في لدينا بروتوكول الأمثل. أما القناة الفلورسنت، رسوم بيانية نسبة الإشارة إلى الضوضاء (دائرة الاستخبارات الوطنية، ويعرف فرق البيكسلات المحيطة بمكان بالنسبة إلى كثافة بقعة) ضد إشارة الكشف عن كل بقعة سمفيش، وولدت من سكاتيربلوت لجميع المواقع وحدد في كامل مجال الرؤية (الصور مثلاً في الشكل 4A ) وقطع في الشكل 4B. اثنين من السكان متميزة محددة تحديداً واضحا لكلا 670 ف ويحدد التحقيق CF 590 (محسن، الشكل 4B)، مما يوحي بأنه يمكن فصل بقع سمفيش الحقيقية (داخل منطقة رمادية) من إشارة أساسية. لاحظ أن هذا الفصل في حالة دون المستوى الأمثل، كان أقل وضوحاً (Suboptimal، الشكل 4B).

نحن استخدام هذه المجموعات مسبار اثنين لدراسة التعبير عن NDC80لوتي و NDC80ORFأثناء النمو الخضري والانقسام الاختزالي. في الخلايا النباتية، تم الكشف عن إشارة قوية من مجموعة التحقيق 670 ف، ولكن لا من CF 590 مسبار تعيين (الشكل 5A، الخضري)، الاتفاق مع الملاحظة من النشاف شمال الذي أعرب عن isoform القصيرة فقط أثناء النمو الخضري16 . واقترحت هذه النتيجة أيضا أن مجموعة التحقيق CF 590 محددة، مما أسفر عن خلفية منخفضة في البروتوكول سمفيش الأمثل لدينا. وفي المقابل، تم الكشف عن إشارة قوية من كلا مجموعات التحقيق في الطور الأول هو، وقد كولوكاليزيد معظم البقع إشارة (الشكل 5A، هو الطور الأول). وأكدت هذه الملاحظة جنبا إلى جنب مع تحليل لطخة الشمالية (الشكل 5 (ب))، أن أعرب عن isoform طويلة NDC80لوتي على وجه التحديد في الانقسام الاختزالي. تم الكشف عن هذين النوعين من مرناس في السيتوبلازم (خارج منطقة DAPI)، مما يوحي بأن كلاهما تم تصديرها من النواة، تمشيا مع الريبوسوم التنميط البيانات18.

لتحديد إذا تم جمع البيانات الكافية لدقة حساب التباين البيولوجي الجوهرية لمجموعة البيانات التي لدينا، أجرينا تحليل bootstrap استخدام الإحصاءات لكل خلية، التي تشمل (1) جزء البقع كولوكاليزيد كل خلية و (2) جزء صغير البقع مع إحدى الإشارات الفلورسنت اثنين (CF 590 فقط و 670 Q فقط). وفي هذا التحليل، عشوائياً برنامج خلية واحدة من الخلايا المحددة كمياً 437 تكرارات 500. وبعد ذلك، حسبت المتوسط وتباين الإحصاءات ذات الصلة المرتبطة بهذه الخلايا المحددة 500. وكان ثم تكرار هذه العملية لتحديد خليتين عشوائياً من جميع الخلايا، دون استبدال؛ ومن ثم اختيار عشوائي ثلاث خلايا، إلخ. حتى واحد كان بلغ نصف حجم مجموعة البيانات الإجمالية. الفرق في مجموعة البيانات استقرت بعد الخلايا ~ 40، مما يدل على أن بعد هذه النقطة أكثر من التباين في الوسط الجوهرية للبيانات بدلاً من قطعة أثرية من undersampling (الشكل 6، اقحم). وأصبح هذا التأثير أكثر وضوحاً عندما كنا رسوم بيانية الفرق العينة مقسوماً على متوسط العينة، كدالة لعدد الخلايا في كل دورة التكرار (الشكل 6). مع البيانات المعروضة، أصبح التغيير في الفرق الصغيرة ديمينيشينجلي بعد الخلايا ~ 60. وينبغي أن يتجاوز عدد الخلايا كمياً في تجربة سمفيش الحد الأدنى لعدد الخلايا المطلوبة لتحقيق متوسط مستقرة وهضبة للفرق. وفي حالتنا، نحن كمياً الخلايا ما يزيد على 95 كل عينة، كل تكرار. كذلك تجاوز العدد الإجمالي للخلايا (الخلايا > 400) الحد الأدنى لعدد الخلايا (الخلايا ~ 60) المطلوبة لتعبر عن متوسط السكان.

مع مصنوعة خصيصا برنامج Matlab16، تم العثور على الخلايا النباتية إلى متوسط قدرة 5 NDC80ORF محاضر كل خلية، بينما في الطور الأول هو الخلايا، انخفض المتوسط بشكل كبير إلى النصوص 4 كل خلية (ثنائي الطرف الرتبي اختبار "مجموع الدرجة"، ف = 0.026) (الشكل 7). عدد متوسط من النصوص NDC80لوتي كل خلية محاضر 21، وأعرب عن 100% الخلايا النصوص NDC80لوتي . نحن رسوم بيانية جزء صغير الخلايا مع عدد معين من النصوص كالرسم بياني تردد النسبي تدريجي، ونظرا لأن عدد جزيئات مرناً كمية منفصلة. وكان تطبيع بن أكبر من كل من الرسم البياني لنفس الارتفاع.

Figure 1
رقم 1: فلووتشارت لبروتوكول سمفيش. خلايا ثابتة مع والفورمالديهايد في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة أو في 4 ˚C بين عشية وضحاها، للنمو الخضري العينات وعينات هو، على التوالي. بعد الغسيل في "المخزن المؤقت ب" ثلاث مرات، يتم هضمها الخلايا من زيمولياسي حتى يتم هضمها ~ 70% إلى 90% خلايا. عينات هضمها ثم غسلها مرة واحدة مع "المخزن المؤقت ب" لإزالة زيمولياسي، وبيرميبيليزيد في وقت لاحق في 70% إيثانول (EtOH) لمدة ساعة ~3.5. للتحضير التهجين، هي أولاً المحتضنة العينات في 10% ميثلامين غسل العازلة (FWB) ~ 20 دقيقة. بعد ذلك، يتم حراكه العينات في ~ 50 ميليلتر من "التهجين الحل" الذي يحتوي على تحقيقات الفلورسنت، للحضانة بين عشية وضحاها في الظلام في 30 ˚C. بعد التهجين، العينات المحتضنة في FWB 10% لمدة 30 دقيقة ليغسل المسابير الزائدة، وثم المحتضنة في FWB 10% مع 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) وصمة عار في الحمض النووي. للحصول على نموذج تصويرها فورا بعد الاحتضان FWB/DAPI، هو حراكه العينة في المخزن المؤقت جلوكس تكملة مع أوكسيديز الكاتالاز، ترولوكس، والسكر (جلوكس + انز)؛ حيث أن عينات أخرى هي حراكه في المخزن المؤقت جلو دون الإنزيمات والمخزنة في 4 ˚C يصل إلى ~ 3 ساعات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: تقييم جودة سمفيش باستخدام المسابر الفردية/حتى. (أ) أعلى: التخطيطي لمجموعات الفردية/حتى التحقيق. وقد صممت أربعة وخمسون اليغنوكليوتيد المسابير تبليط الجين NDC80 . كانت وصفت المسابير الفردية مع واحد فلوروفوري (CF590، سيظهر في أرجواني)، والمسابير زوجية، مع آخر فلوروفوري (Q670، تظهر باللون الأخضر). أسفل: الصور سمفيش الممثل من خلايا الطور الأول هو الحصول عليها باستخدام مجموعات التحقيق الفردية/حتى. تم أخذ العينات بعد نقل الخلايا (UB8144) إلى تبوغ المتوسطة، وقت عندما ألقي القبض على هذه الخلايا في الطور الأول هو 6 ساعات. وكان الملون الحمض النووي مع DAPI (يظهر باللون الأزرق). تظهر الصور إسقاطات الحد الأقصى-كثافة مكدسات z. شريط الحجم: 5 ميكرومتر. (ب) النسبة المئوية للبقع سمفيش المزدوجة أو مزاوج الحصول عليها باستخدام مجموعات الفردية/حتى التحقيق. تم تحليل ما مجموعة 428 الطور الأول هو الخلايا، تجمع من تجربتين مستقلة. يتم تعديل هذا الرقم من الرقم 2-الملحق رقم 4 لتشن et al. 16 (ج) A التراكمي كثافة دالة (CDF) المسافة بين كل زوج من البقع المزدوجة، والمسافة بين أقرب جار لبقعة مزاوج. لكل بقعة المكتشفة في إحدى القنوات الفلورسنت، تم تطبيق الخوارزمية "ك أقرب جاره" التعرف على الفور الكشف عن أقرب – والمسافة إلى تلك البقعة – في قناة مكملة. واعتبرت تعريب التي كانت المتبادل أقرب الجيران إقران، وقائمة جديدة تم إنشاؤها في تسجيل اكتشافات المزدوجة، CF590 فقط، و Q670--فقط. لكل فئة من اكتشافات، كان رسم مدرج تكراري قوات الدفاع المدني للمسافات في Matlab، مؤكدة أن البقع المقترنة بشكل صحيح في الواقع كانت أقرب بكثير في المسافة من تلك دون المقابلة بقعة في قناة أخرى. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
رقم 3: عدد الكسور البقع المزدوجة ومزاوج، كدالة للجيش الملكي النيبالي إجمالي كل خلية- لاختبار إذا كان متحيزا لكشف والمزاوجة بين البقع سمفيش في مستويات مختلفة من التعبير، تم تجميع الخلايا الفردية بمجموع الجيش الملكي النيبالي التعبير. وحسبت يعني كسور المكتشفة المزدوجة، CF590 فقط، و Q670--فقط لكل مجموعة من الخلايا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: تقييم جودة البيانات سمفيش التي تم إنشاؤها باستخدام المسابر المصممة ل NDC80لوتي و NDC80ORF مرناس- هجن المسابير Q 670 (يظهر باللون الأخضر) إلى منطقة مشتركة تتقاسمها NDC80لوتي و NDC80ORF مرناس، حين هجن المسابير CF 590 (مبين في أرجواني) إلى منطقة فريدة من نوعها 5 ' NDC80لوتي . (A) صور سمفيش ممثل من NDC80لوتي و NDC80ORF في الطور الأول هو، اكتسبت الأمثل دون مقابل الشروط دون الحد الأمثل. سلالات UB8144 (الوضع الأمثل) و UB1337 (الوضع الأمثل) الناجم عن الخضوع للانقسام وتم تثبيتها أثناء الطور الأول هو. هذه السلالات اثنين المرفأ تزامن مختلف النظم للحث على الانقسام، ولكن استخدام أما النظام لا يؤثر على جودة سمفيش (البيانات لا تظهر). في حالة دون المستوى الأمثل، تم إصلاح الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة (لا بين عشية وضحاها التثبيت)، يهضم مع زيمولياسي دون فكتوريا استكمالها، وتهجين بتركيز أقل من فكتوريا. تظهر الصور إسقاطات الحد الأقصى-كثافة مكدسات z. وكان الملون الحمض النووي مع DAPI (يظهر باللون الأزرق). شريط الحجم: 5 ميكرومتر. سكاتيربلوتس (ب) عرض نسبة الإشارة إلى الضوضاء (دائرة الاستخبارات الوطنية) والإشارة من كل بقعة سمفيش اكتشاف في مجال الرؤية المعروضة في الشكل 4A، أما قناة الفلورسنت، فضلا عن الظروف الأمثل أو دون المستوى الأمثل. في الوضع الأمثل، حضر اثنان من السكان من البقع سمفيش. وتقع البقع سمفيش الحقيقية داخل المنطقة الرمادية، يفصل بين الإشارات الخلفية. في حالة دون المستوى الأمثل، مرناس الفردية ومن الصعب أن تميز بالعين المجردة، والفصل بين النقاط الحقيقية والخلفية بعد تشغيل برنامج الكشف الموضعي أقل وضوحاً. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الشكل 5: التعبير عن NDC80لوتي و NDC80ORF النصوص تخضع وقتيا. (A) صور سمفيش ممثل من NDC80لوتي و NDC80ORF أثناء النمو الخضري والانقسام الاختزالي. وأخذت العينات الخضري عندما كانت تنمو خلايا (UB8144) أضعافاً مضاعفة في المتوسط غنية المغذيات. وأخذت العينات هو الطور الأول بعد نقل الخلايا (UB8144) إلى تبوغ المتوسطة، وقت عندما ألقي القبض على هذه الخلايا في الطور الأول هو 6 ساعات. هجن المسابير Q 670 (يظهر باللون الأخضر) إلى منطقة مشتركة تتقاسمها NDC80لوتي و NDC80ORF مرناس، حين هجن المسابير CF 590 (مبين في أرجواني) فريدة من نوعها 5 ' منطقة NDC80لوتي . وكان الملون الحمض النووي مع DAPI (يظهر باللون الأزرق). أقيم كل خلية بإشارة Zip1-التجارة والنقل، علامة للطور الأول هو. لدينا بروتوكول سمفيش يحافظ على إشارة قوية في التجارة والنقل دون مزيد من التعديل. النمو الخضري: Zip1-التجارة والنقل السلبي. الطور الأول هو: Zip1-بروتينات فلورية خضراء إيجابية. تظهر الصور إسقاطات الحد الأقصى-كثافة مكدسات z. شريط الحجم: 5 ميكرومتر. يتم تعديل هذا الرقم من الرقم 2 لتشن et al. 16-(ب) NDC80ORF، NDC80لوتي، ومستوى البروتين (Ndc80p) Ndc80 أثناء الانقسام الاختزالي (UB4074). NDC80لوتي و NDC80ORF هي التي تحدد مستويات وصمة عار شمال، ويتحدد مستوى Ndc80p immunoblot مكافحة V5 في النقاط الزمنية المشار إليها. Hxk1p، تحميل عنصر التحكم إيمونوبلوت. كما سلالة UB8144، هذه السلالة أيضا المرافئ GAL4 بجال-NDT80-ER مزامنة نظام19،20. خلايا نقلت إلى المتوسطة تبوغ في الساعة 0 وصدر من الإقامة الجبرية في باتشيتيني بإضافة بيتا-استراديول بعد 6 ساعات. قوة الكشف عن نسخة NDC80لوتي في الطور الأول S/هو، في حين NDC80ORF النصوص كانت موجودة أساسا قبل دخولها هو (0 ساعة) وخلال الشعب هو (7-9 ساعات). يتم تعديل هذا الرقم من الرقم 6J لتشن et al. 16 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- 

Figure 6
رقم 6: Bootstrap تحليل لعينات الطور الأول هو سيظهر في الشكل 5 . تم تجميع كافة الخلايا المحددة كمياً، واستخرجت عدد معين من الخلايا (ن) عشوائياً إلى 500 مرة. وحسبت يعني وفاصل الثقة 95% لجزء صغير مرناً المزدوجة ومزاوج كل خلية. تم رسم هذه البيانات لكل خيار من ن رقم (داخلي). وكان تصور الهضبة في الفرق برسم التباين العينة مقسوماً على المتوسط، كدالة لعدد الخلايا (ن) أخذ عينات. العدد الإجمالي لقياس الخلايا (خلايا 437) تفوق بكثير الرقم الذي استقرت الخطأ (~ 60 الخلايا)، مما يشير إلى أن بيانات إضافية لن تتحسن الثقة في القياسات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 7
رقم 7: القياس الكمي للبيانات سمفيش المبينة في الشكل 5 ، وتنقيط كرسوم بيانية التواتر النسبي للخلايا مع عدد معين من NDC80لوتي و NDC80ORF محاضر كل خلية، باستخدام البيانات المجمعة من ثلاث تجارب مستقلة. خط متقطع يشير إلى متوسط عدد NDC80لوتي و NDC80ORF محاضر كل خلية. وكان تطبيع كل الرسم البياني حيث أن الارتفاع الأقصى بن هو نفسه عبر كافة رسوم بيانية. عدد إجمالي للخلايا 637 حللت للنمو الخضري و 437 للطور الأول هو. تم إجراء اختبار "مجموع الدرجة الرتبي" ثنائي الطرف ل NDC80لوتي و NDC80ORF، على التوالي، مقارنة عينات الخضري وهو الطور الأول. يتم تعديل هذا الرقم من الشكل 2D لتشن et al. 16 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- 

المخزن المؤقت ب (الأسهم ل 1: 1.2 م السوربيتول; 0.1 M البوتاسيوم الفوسفات المخزن المؤقت، ودرجة الحموضة 7.5) س 1
المياه خالية من نوكلاس 500 مل
السوربيتول ز 218.6
خ2ص4 ز 2.18
ك2هبو4 ز 14.62
المياه خالية من نوكلاس إلى الحجم النهائي ل 1
* تخزين في ˚C 4 في مختبرين 50 مل بعد تصفية تعقيم
زيمولياسي 100T (10 مغ/مل)
* تخزين في ˚C-20 في مختبرين
حل 10 مغ زيمولياسي مسحوق في 1 مل المياه ملك
هاء القولونية الحمض الريبي النووي النقال (10 مغ/مل)
* تخزين في ˚C-20 في مختبرين
حل مسحوق الحمض الريبي النووي النقال ملغ 10 في 1 مل المياه ملك
إيثانول 70% (50 مل) 1 × (mL)
الإيثانول النقي 35
المياه خالية من نوكلاس 15
* تخزين في درجة حرارة الغرفة
المخزن المؤقت التهجين (10 مل) 1 × (mL)
كبريتات ديكستران 50% 2
الحمض الريبي النووي النقال كولاي (10 مغ/مل) 1
200 ملم فاناديل ريبونوكليوسيدي معقدة (فكتوريا) 0.1
جيش صرب البوسنة، 50 ملغ/مل 0.04
20 x SSC 1
ميثلامين 1
المياه خالية من نوكلاس 4.86
* تخزين في ˚C-20 في مختبرين 250 ميليلتر أو 500 ميليلتر
المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي ميثلامين 10% (10 مل) 1 × (mL)
ميثلامين في درجة حرارة الغرفة 1
20 x SSC 1
المياه خالية من نوكلاس 8
* جعل دوامة ل 20-30s جديدة، مزيج
محلول جلوكوز 10%
* تخزين في ˚C 4 في مختبرين بعد تصفية تعقيم
حل 1 غ جلوكوز في 10 مل مياه خالية من نوكلاس
أوكسيديز الجلوكوز
* تخزين في ˚C-20 في مختبرين
حل ملغ 3.7 الغلوكوز أوكسيديز في 1 مل من 50 مم ناواك، الأس الهيدروجيني 5
المخزن المؤقت لمكافحة التبييض (جلوكس)، دون الإنزيمات (1 مل) 1 × (ميليلتر)
جلوكوز 10% في المياه خالية من نوكلياسي 40
1 "م تريس"، pH 8.0 10
20 x SSC 100
المياه خالية من نوكلياسي 850
* جعل الطازجة، ويمكن أيضا تخزين مختبرين في 4 ˚C
المخزن المؤقت لمكافحة التبييض (جلو)، مع الإنزيمات (50 ميليلتر) 1 × (ميليلتر)
كاتالاز (دوامة أقل ما يقال، يستقر بسهولة) 0.5
أوكسيديز الجلوكوز 0.5
100 مم ترولوكس (الذائبة في الإيثانول) 1
المخزن المؤقت جلو 50
* جعل جديدة كل مرة، إعداد على الجليد، ويمكن تخزينها في 4 ˚C لمدة 2-3 ساعات

الجدول 1. مخازن ووسائل الإعلام

Discussion

بروتوكول المعروضة هنا مشتقة من الأخرى سمفيش نشرت البروتوكولات2،3،21،،من2223، وهو على وجه التحديد الأمثل لخلفية سلالة الخميرة SK1. وشملت المعلمات الأمثل عدد الخلايا، ومدة التثبيت، سرعة الطرد المركزي ومدة، ومدة الهضم، الهضم المخزن المؤقت، تركيز التحقيق، والتهجين المخزن المؤقت. كانت ليست الأمثل المعلمات الأخرى مثل درجة الحرارة التهجين ومدتها. في هذا القسم، ونحن نشاطر بعض الملاحظات التي تساعد على التكيف مع هذا البروتوكول لأي خلفية سلالة الخميرة وشروط النمو للفائدة.

جدار خلية الخميرة مهدها هو أحد التحديات الكبرى ضد الحصول على صور عالية الجودة سمفيش في مهدها الخميرة للخلية جدار يمنع اختراق التحقيق. الهضم غير مكتملة للجدار خلية زيمولياسي يؤدي إلى التهجين غير فعالة من تحقيقات وارتفاع خلية إلى تقلب في إشارة. غير أن الهضم الإفراط يمكن جعل الخلايا هشة جداً، المؤدية إلى كبير الخلية الخسارة خلال خطوات الغسيل والخلية في انفجار أثناء إعداد الشرائح للتصوير. ومن ثم، تحسين مدة الهضم أمر حاسم. نوصي بإجراء تجربة رائدة سمفيش بهضم نفس العينة لكميات مختلفة من الوقت. وفي حالتنا، حصلنا على البيانات سمفيش أفضل إذا توقفنا في الهضم عندما أصبح ~ 80% خلايا غير الانكسار. عادة، يمكن هضمها سلالات متحولة وراثية مختلفة لنفس الشرط النمو، مع توقيت مماثلة. ومع ذلك، تختلف مدة الهضم عند المقارنة بين ظروف نمو مختلفة ومراحل مختلفة من الانقسام في مهدها الخميرة. حالما يتم تحديد التوقيت، نوعية سمفيش استنساخه. ملاحظة للحصول على سلالات متحولة مع توليف جدار الخلية المعيبة و/أو تكوين، قد يتسنى إكمال الهضم في أقل من 15 دقيقة استخدام مجموعات مختلفة من زيمولياسي قد أيضا قليلاً تغيير توقيت الهضم.

مطلوب تركيز التحقيق الأمثل لتحقيق نسبة الإشارة إلى الضوضاء عالية. نحن تصميم وشراء لدينا تحقيقات سمفيش تجارياً. يجب أن يكون جيد المسابر (غالباً 20-الصرف) نسبة مئوية من GC تتراوح بين 35 في المائة إلى 45 في المائة، الحد أدنى لتباعد 2 قاعدة أزواج بين المجسات ومنخفض ه. كنا مسبار المستندة إلى ويب مصمم من الشركة المصنعة لإنشاء قائمة تحقيقات، وإذا كانت هناك تحقيقات كافية للاختيار من بينها، سوف نستخدم الخوارزمية الانفجار في قاعدة بيانات الجينوم Saccharomyces إلى القضاء التحقيقات مع أكثر من 17 زوج قاعدي يتداخل مع المناطق الأخرى الجينوم. اخترنا أكثر فوتوستابل نيون صبغ (CAL فلور 590) لمجموعة التحقيق التي أنيالس إلى منطقة فريدة من نوعها في NDC80لوتي (CF 590) لأن في هذه المجموعة، كان أقل من عدد المجسات التي تستوفي جميع المعايير المذكورة أعلاه (20 المسابير) الحد الأدنى الذي أوصت به الشركة المصنعة (المسابر ~ 25). بعد إعادة تشكيل الحل مسبار اتباع إرشادات الشركة المصنعة، قدمنا 01:10 إضعاف الحل الأسهم وتخزينها في حل المخفف في مختبرين 5 ميليلتر في ˚C-20. واستخدمت كل قاسمة مرة واحدة فقط. للتحسين، واحدة ينبغي أن تجعل المسلسل تخفيف من 01:10 إضعاف الحل واختبار التركيز التي تعطي أفضل نسبة الإشارة إلى الضوضاء. ونحن نوصي بجعل سلسلة تمييع 1: 250، 1: 500، 1: 1000، و 1:2000 من المخزون الأصلي. وفي حالتنا، أدى عامل تخفيف 1: 500 أفضل نسبة الإشارة إلى الضجيج، لمجموعات التحقيق كل CF 590 و 670 ف.

وقت التثبيت الأمثل أيضا أهمية حاسمة لنجاح سمفيش في مهدها الخميرة. نحن العثور على هذا التثبيت بين عشية وضحاها في 4 ˚C بدلاً من إصلاح في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة، تحسنت بشكل ملحوظ الاتساق والجودة من نتائج العينات هو سمفيش. على الرغم من أننا لم تختبر كيف بين عشية وضحاها قد تؤثر على التثبيت عينات الخضري، عملت التثبيت في درجة حرارة الغرفة جيدا لهذا الشرط النمو. وهكذا، على النحو الأمثل في بروتوكول سمفيش لسلالات جديدة أو ظروف النمو، نوصي بدءاً من وقت التثبيت قصيرة في درجة حرارة الغرفة وزيادة فترة التثبيت إذا تم مصادفة تقلب عالية لإشارة.

مقارنة مع أخرى البروتوكولات المنشورة3،،من2223، لدينا بروتوكول يستخدم مثبط رناسي فكتوريا خلال الهضم وأعلى تركيز لفكتوريا خلال التهجين. إضافة فكتوريا في هاتين الخطوتين تحسين اتساق النتائج سمفيش، وربما من الأفضل الحفاظ على جزيئات الحمض النووي الريبي ضد نوكلاس النشاط الذي يمكن الأخذ بمزيج زيمولياسي (الإنزيم هو تنقيته من مستخلصات النفط الخام وقد تحتوي على رناسي الملوثات). وبالتالي، نوصي باستخدام مبلغ فكتوريا كما وردت في البروتوكول أو تركيزات أعلى حتى من فكتوريا للتحسين.

يمكن أن يكون جزء كبير من الخلايا فقدت خلال خطوات الغسيل في "المخزن المؤقت ب" واغسل ميثلامين المخزن المؤقت. لتقليل الخسائر في الخلية، واحد يمكن أن تزيد من سرعة الطرد المركزي. وفي حالتنا، باستخدام سرعة عالية (21,000 س ز) إلى بيليه لدينا عينات خلال "ب المخزن المؤقت" يغسل فقدان الخلية انخفاضا كبيرا. ومع ذلك، تصبح الخلايا هشة للغاية بعد الهضم زيمولياسي، ولذلك لا يوصي بتغيير سرعة الطرد المركزي. بدلاً من ذلك، فإننا نقترح استخدام أنابيب التصاق منخفضة من "الولايات المتحدة الأمريكية العلمية"، التي تساعد إلى حد كبير بيليه الخلايا أثناء يغسل في المخزن المؤقت للغسيل ميثلامين. عموما، يمكن استمرار تولد لدينا بروتوكول أحادي الطبقة الكثيفة ما يكفي لتصوير كفاءة الخلايا. بشكل عام، ينبغي أن تسفر عن 7 الحقول لعرض > 130 الخلايا مناسبة للقياس الكمي.

وأخيراً، من المهم تحديد بارامترات الأمثل والنواتج المطلوبة من تحليل الصور. عادة للكشف عن بقع سمفيش، برامج تحليل المنشورة تصفية صور raw باستخدام نواة الضبابي لإزالة الإشارات الخلفية، وأطلب من المستخدمين لتحديد نسبة الإشارة إلى الضوضاء لاستخدام لكل مجموعة من الصور2،17. ولسوء الحظ، لا توجد حاليا معيار واحد الذي يتم تحديد المعلمات الصحيحة، وحتى بعض الاختبارات التجريبية لهذه الإعدادات المختلفة ضروري. لتعيين معلمات اللازمة لكل خطوة من هذه الخطوات، يحتاج المرء تكراري مجموعات مختلفة من معلمات الإدخال والتحقق من مدى يطابق النتائج التي تم الحصول عليها من كل مجموعة من العد اليدوي في بعض الخلايا الممثل. حالما يتم العثور على مجموعة واحدة من المعلمات، يمكن استخدامه بالنسبة للصور التي تم الحصول عليها على الرغم من ظروف النمو المختلفة والخلفيات الوراثية.

وبالإضافة إلى ذلك، يمكن اختبار واحد إذا كان الإسقاط كحد أقصى-كثافة الصور سمفيش يمكن أن يؤديها قبل القياس الكمي22. هذه الخطوة يبسط خوارزمية الكشف الموضعي، ويقلل كثيرا من وقت التصوير، ولو على حساب بعض المعلومات يمكن أن تكون مفيدة حول النقاط الفردية، مثل التعريب سوبسيلولار بهم. وفي حالتنا، كان عدد مرناً الجزيئات التي تنتجها الجينات NDC80 منخفضة بما يكفي أن البقع جيدا تم فصل بعد هذا التجهيز (ليس من غير المألوف للنصوص في مهدها الخميرة3،7). في الحالات التي يكون فيها تحليل كولوكاليزيشن الحرجة، يحتاج خط الأنابيب التحليل تحديد موقع كل بقعة سمفيش في كل قناة لتقييم كولوكاليزيشن. اعتماداً على الأسئلة المحددة التي يجري طلب، معلومات أخرى مثل الكثافة من كل بقعة قد تحتاج أيضا إلى أن تستخلص من خط الأنابيب لمزيد من التحليل. أمثلية المفتاح خطوات في البروتوكول وأنابيب تحليل الصورة أمر حاسم في الحصول على الجودة العالية للبيانات سمفيش لدراسة مسألة الفائدة.

Disclosures

الكتاب قد لا يوجد تضارب في الكشف عن.

Acknowledgments

ونحن نشكر دودسون Anne وستيفاني هاينريش لإسداء المشورة بشأن كيفية تحسين بروتوكول سمفيش، دارزاكق كزافييه للمساعدة في تحليل منهاج العمل، هوانغ هاي لاقتراحات بشأن التحليل الإحصائي. هذا العمل كان تدعمها الأموال من مارس الدايمات (5-FY15-99) والخيرية بيو (00027344)، مؤسسة أبحاث السرطان رونين ديمون (35-15) وغلين مؤسسة EÜ، وجبهة الخلاص الوطني الدراسات العليا البحوث زمالة منحة رقم 1106400 تأيين لجيمي كارتر.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BSA, RNase-free (50 mg/mL) Ambion AM2616 Store at -20 °C.
Catalase Sigma C3515 Store at 4 °C for short-term. Vortex before use.
DAPI Sigma D9564 Store at -20 °C after reconstitution in water. Protect from light.
50% Dextran Sulfate Milli Pore S4030 Store at room temperature. Very viscous liquid. Handle with patience.
E. coli tRNA Sigma R4251 Store at -20 °C in aliquots after reconstitution in water.
Ethanol (100%, 200 proof) various Flammable.
37% Formaldehyde Fisher F79-500 Store at room temperature. Toxic. Use and dispose with caution.
Formamide Ambion AM9342 Store at 4 °C. Open after the temperature equilibrates to room temperature in order to prevent oxidation. Toxic. Use and dispose with caution. 
Glucose various Store at 4 °C after dissolving in nuclease-free water.
Glucose oxidase Sigma G2133 Store at -20 °C in aliquots after reconstitution in 50 mM NaOAc, pH 5.
Nuclease-free water Ambion AM9932 Store at room temperature.
Potassium phosphate (monobasic and dibasic) various Store at room temperature.
Probe library, diluted in TE, pH 8.0  Biosearch Technologies Store at -20 °C in aliquots (5 µL) after reconstitution in TE pH 8.0, following the instructions from the manufacturer. Protect from light. 
Sorbitol various Store at room temperature.
20X SSC Ambion AM9763 Store at room temperature.
TE, pH 8.0 Ambion AM9849 Store at room temperature.
1 M Tris, pH 8.0 Ambion AM9856 Store at room temperature.
Trolox Sigma 238813 Store at -20 °C in aliquots.
200 mM Vanadyl ribonucleoside complex (VRC) NEB S1402S Store at -20 °C in aliquots after reconstitution, following the instructions from the manufacturer.
Zymolyase 100T MP Biomedicals 08320932 Store at -20 °C in aliquots after reconstitution in water.
Low-adhesion tubes USA Scientific 1415-2600 Store at room temperature.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280 (5363), 585-590 (1998).
  2. Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
  3. Rahman, S., Zenklusen, D. Single-molecule resolution fluorescent in situ hybridization (smFISH) in the yeast S. cerevisiae. Methods Mol Biol. 1042, 33-46 (2013).
  4. Gaspar, I., Ephrussi, A. Strength in numbers: quantitative single-molecule RNA detection assays. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 4 (2), 135-150 (2015).
  5. Vargas, D. Y., et al. Single-molecule imaging of transcriptionally coupled and uncoupled splicing. Cell. 147 (5), 1054-1065 (2011).
  6. Waks, Z., Klein, A. M., Silver, P. A. Cell-to-cell variability of alternative RNA splicing. Mol Syst Biol. 7, 506 (2011).
  7. Zenklusen, D., Larson, D. R., Singer, R. H. Single-RNA counting reveals alternative modes of gene expression in yeast. Nat Struct Mol Biol. 15 (12), 1263-1271 (2008).
  8. Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells. PLoS Biol. 4 (10), e309 (2006).
  9. Senecal, A., et al. Transcription factors modulate c-Fos transcriptional bursts. Cell Rep. 8 (1), 75-83 (2014).
  10. Levesque, M. J., Ginart, P., Wei, Y., Raj, A. Visualizing SNVs to quantify allele-specific expression in single cells. Nat Methods. 10 (9), 865-867 (2013).
  11. Hansen, C. H., van Oudenaarden, A. Allele-specific detection of single mRNA molecules in situ. Nat Methods. 10 (9), 869-871 (2013).
  12. Ginart, P., et al. Visualizing allele-specific expression in single cells reveals epigenetic mosaicism in an H19 loss-of-imprinting mutant. Genes Dev. 30 (5), 567-578 (2016).
  13. Long, R. M., et al. Mating type switching in yeast controlled by asymmetric localization of ASH1 mRNA. Science. 277 (5324), 383-387 (1997).
  14. Park, H. Y., Trcek, T., Wells, A. L., Chao, J. A., Singer, R. H. An unbiased analysis method to quantify mRNA localization reveals its correlation with cell motility. Cell Rep. 1 (2), 179-184 (2012).
  15. Jourdren, L., Delaveau, T., Marquenet, E., Jacq, C., Garcia, M. CORSEN, a new software dedicated to microscope-based 3D distance measurements: mRNA-mitochondria distance, from single-cell to population analyses. RNA. 16 (7), 1301-1307 (2010).
  16. Chen, J., et al. Kinetochore inactivation by expression of a repressive mRNA. eLife. 6, e27417 (2017).
  17. Mueller, F., et al. FISH-quant: automatic counting of transcripts in 3D FISH images. Nat Methods. 10 (4), 277-278 (2013).
  18. Brar, G. A., et al. High-resolution view of the yeast meiotic program revealed by ribosome profiling. Science. 335 (6068), 552-557 (2012).
  19. Carlile, T. M., Amon, A. Meiosis I is established through division-specific translational control of a cyclin. Cell. 133 (2), 280-291 (2008).
  20. Benjamin, K. R., Zhang, C., Shokat, K. M., Herskowitz, I. Control of landmark events in meiosis by the CDK Cdc28 and the meiosis-specific kinase Ime2. Genes Dev. 17 (12), 1524-1539 (2003).
  21. Dodson, A. E., Rine, J. Heritable capture of heterochromatin dynamics in Saccharomyces cerevisiae. eLife. 4, e05007 (2015).
  22. Trcek, T., et al. Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast. Nat Protoc. 7 (2), 408-419 (2012).
  23. Youk, H., Raj, A., van Oudenaarden, A. Imaging single mRNA molecules in yeast. Methods Enzymol. 470, 429-446 (2010).

Tags

علم الوراثة، 135 قضية، والأسفار جزيء واحد في الموقع التهجين (سمفيش)، والخميرة مهدها، الانقسام، الانقسام الاختزالي، الجيش الملكي النيبالي، وتحليل خلية مفردة، النسخ، لوتي
التهجين <em>في الموقع</em> Fluorescence جزيء واحد (سمفيش) التحليل في مهدها الخميرة النمو الخضري والانقسام الاختزالي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, J., McSwiggen, D., Ünal,More

Chen, J., McSwiggen, D., Ünal, E. Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis. J. Vis. Exp. (135), e57774, doi:10.3791/57774 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter