Summary
该单分子荧光原位杂交协议的优化, 以量化的 RNA 分子在萌芽期酵母在营养生长和减数分裂。
Abstract
单分子荧光原位杂交 (smFISH) 是研究单细胞基因表达能力的一种强有力的技术, 因为它能够检测和计数单个 RNA 分子。与深度测序方法互补, smFISH 提供了有关转录丰度的细胞间变异和特定 RNA 亚单位定位的信息。最近, 我们用 smFISH 研究了在萌芽酵母减数分裂过程中基因NDC80的表达, 其中存在两个转录亚型, 短转录异构体具有与长异构体共享的整个序列。为了自信地识别每个转录异构体, 我们优化了已知的 smFISH 协议, 并获得了在酵母减数分裂过程中获得的样品的 smFISH 数据的高一致性和质量。在这里, 我们描述了这个优化的协议, 我们用来确定是否获得高质量的 smFISH 数据的标准, 以及在其他酵母菌株和生长条件下实现此协议的一些提示。
Introduction
动态调控基因表达推动生物体的发展, 以及它对环境压力、感染和新陈代谢变化的反应。关注转录调控的研究依赖于测量 RNA 丰度的技术。其中一种方法, 称为单分子荧光原位杂交 (smFISH), 用于检测单个细胞中的单个 RNA 分子1,2。该方法允许测量基因表达中细胞对细胞的变异性和细胞内 RNA 定位的测定。
在最常用的 smFISH 技术中, 对单个 rna 分子的检测需要多个短 DNA 探针 (通常为 48 20 探针), 它们是与目标 RNA 互补的, 并与同一荧光染料相结合。单一荧光探针的结合导致微弱信号, 但所有探针的集合信号是健壮的。这一特性大大提高了信噪比, 因为即使一个探针可以显示出目标绑定, 这种信号与目标 RNA 分子3相比, 预计将非常微弱。在检测误差范围内, RNA 分子的数量可以在不同的生长条件和突变体之间进行计数和比较。
自第一次开发以来, smFISH 已适应研究基因表达式的各个方面4, 如转录伸长1,2, 拼接5,6, 转录爆裂7,8,9, 胞内位基因表达式10,11,12, RNA 本地化13,14,15。最近, 我们用这种方法研究了同一基因的两个转录亚型的表达式, 其中短转录异构体 (NDC80ORF) 具有与长异构体共享的整个序列 (NDC80luti)16。为了唯一地识别两个 mRNA 亚型, 我们使用了两个探针集: 一组特定于NDC80luti的唯一序列, 另一组与另一个荧光染料结合, 绑定到两个亚型的共同区域。NDC80luti rna 被标识为具有两个荧光信号的 colocalized 点, 而NDC80ORF RNA 是仅包含来自公共探测器集的信号的一个。由于NDC80ORF 成绩单的数量是用 "减法" 方法计算的, 因此有必要提高探针杂交的效率和高信噪比, 以自信地识别 smFISH 点并减少误差。传播。
本文介绍了一种优化的协议, 以执行 smFISH 在萌芽酵母酿酒酵母。在该协议中, 对 smFISH 实验中的细胞数、固定时间、消化时间、消化缓冲、探针浓度、杂交缓冲等进行了优化, SK1 了在营养的情况下,酵母的应变背景。生长或减数分裂。然而, 我们也在这篇手稿中注意到: (1) 在图像采集后检查 smFISH 数据质量的方法, (2) 协议中可能需要对不同应变背景和生长条件进行额外优化的步骤。
Protocol
注意: 此协议中使用的所有缓冲区和媒体都列在表 1中。试剂的供应商信息列在物料表中。
1天/天 1-2:
注意: 对于植物培养, 在首选培养基中, 将细胞生长到直径为0.4 到0.6 的 OD600 。对于减数分裂培养, 诱导细胞进行减数分裂使用首选方法 (通常培养在 OD600 1.85)。
1. 样品的固定和消化
- 将3% 个甲醛中的单元格的总直径约为3.5 个600 。
- 对于营养培养, 在15毫升圆锥管中加入5.52 毫升的培养基, 480 µL 37% 甲醛。
- 对于减数分裂培养, 在2毫升离心管中加入1840µL 的160µL 37% 甲醛的培养。反转 ~ 5 次混合。
注意: 甲醛是有毒的。根据制度规定处理和处分。
- 把管子放在滚筒上, 室温下20分钟。对于减数分裂样品, 在室温下固定20分钟后, 继续固定在4˚C, 旋转。
注意: 隔夜固定提高了 smFISH 的重现性和质量。应优化固定时间。 - 虽然样品是固定的, 解冻200毫米钒 Ribonucleoside 复合物 (VRC) 在65˚C 至少10分钟。
- 在15毫升管中准备消化大师组合: 1 样品, 混合425µL 的缓冲 B 与40µL 200 毫米 VRC (温暖到65˚C);对于5个样品, 混合2125µL 的缓冲 B 与200µL 200 毫米 VRC (温暖到65˚C)。漩涡 ~ 5 s, 以充分并用重悬 VRC 之前添加到主混合, 这将出现浅褐色绿色后, VRC 添加。
注: 在消化过程中加入 VRC 提高了 smFISH 结果的一致性, 有可能通过抑制 zymolyase 混合物引入的核酸酶污染物, 从粗萃取物中提纯。应优化此步骤所需的 VRC 量。 - 对于营养样品, 离心管在〜 1057 x g 3 分钟。对于减数分裂样品 (在隔夜固定后), 离心机在 2.1万 x g 1.5 分钟醒酒或吸入上清到甲醛废料。
注意: 所有的离心步骤都是在室温下进行的。 - 并用重悬细胞在1.5 毫升的冷缓冲 B 通过吹打上下或翻转管和弹搅拌混合。泥沙后将植物标本转移到2毫升管。
- 离心机在 2.1万 x g 的1.5 分钟. 通过真空吸入或吹打去除液体的大部分, 留下100µL。
- 并用重悬1.5 毫升的冷缓冲 B 中的细胞。
- 离心机在 2.1万 x g 的1.5 分钟. 通过真空吸入或吹打去除液体的大部分, 留下100µL。
- 1.5 毫升冷缓冲器中的并用重悬细胞 b. 离心机在 2.1万 x g 1.5 分钟内完全通过真空或吹打吸入液体。
- 并用重悬细胞在425µL 消化大师混合, 并简要涡旋到并用重悬。添加5µL 100T 10 毫克/毫升 zymolyase 每管。
注: 在加入管之前, zymolyase 每一次涡旋。每管单独添加 zymolyase, 而不是添加到主混合。这两个步骤有助于保持管之间的消化一致性, 因为 zymolyase 沉淀迅速。 - 漩涡 2-3 s 混合。把管子放在滚筒上, 在30˚C 上消化15-30 分钟。对于营养细胞和早期减数分裂阶段, 通常需要15分钟, 而对于减数分裂前期和减数分裂, 通常需要30分钟。
注: 检查显微镜每5分钟后15分钟, 并停止消化时, 80% 的细胞出现不透明和不屈光。从这一点上来说, 细胞非常脆弱。轻轻地处理细胞, 避免使用真空吸入或涡流. - 离心管在〜 376 x g 3 分钟, 完全去除液体吹打。
- 轻轻地并用重悬细胞与1毫升缓冲 B 由吹打上下1-2 次混合。
- 离心管在〜 376 x g 3 分钟, 通过吹打去除缓冲 B 液体。在1毫升的70% 乙醇中轻轻并用重悬细胞 (用无 RNase 水稀释)。
- 在室温下孵育 3.5-4 小时。
2. 杂交
- 将甲酰胺带到室温下 (50 毫升整除, 在水浴中需要30分钟)。
注: 不要打开甲酰胺瓶, 直到瓶子达到室温, 以避免甲酰胺氧化。
注意: 甲酰胺是有毒的。根据制度规定处理和处分。 - 在15毫升圆锥管中制备10% 甲酰胺洗涤缓冲器。
- 离心管在〜 376 x g 3 分钟, 去除500µL 70% 乙醇的吹打。轻轻吸管向上和向下并用重悬其余的细胞, 然后转移细胞到低粘附管。
注: 使用低粘接管可大大减少后续洗涤过程中的细胞损耗。 - 再离心管在〜 376 x g 为3分钟, 除去所有的乙醇由吹打。
- 加入1毫升10% 甲酰胺洗涤缓冲液, 轻轻吸管2-3 次, 并用重悬细胞。
- 在准备杂交溶液时, 允许细胞在室温下坐20分钟。对于1样品, 混合50µL 的杂交缓冲 (室温度), 5 µL 200 毫米 VRC (温暖到65˚C) 和1µL 的每个探针 (200 nM 决赛)。对于5个样品, 混合250µL 的杂交缓冲 (室温度), 25 µL 200 毫米 VRC (温暖到65˚C) 和5µL 的每个探针 (200 nM 决赛)。
- 解冻杂交缓冲 (冻结在-20 ˚C) 到室温前打开管, 以防止甲酰胺氧化。
- 加入200毫米 VRC 后, 涡流为5-10 秒, 然后再添加探头, 这是设计和购买商业, 并根据制造商的指示重组。
- 如果两个探头共同孵化, 添加1µL 的探针的1:10 稀释 #1 股票, 以及1µL 的1:10 稀释的探针 #2 股票, 做最后稀释1:500 为任一探针。最好的信噪比所需的浓度需要优化 (参见讨论细节)。
- 将样品离心至 376 x 克, 3 分钟. 吹打将上清入危险废物中。
- 在每个管中添加至少50µL 的杂交溶液。轻弹管子混合。
- 在30˚C 在滚筒上孵育至少16小时在黑暗中。
2天/天3
3. 洗涤和成像
- 把甲酰胺带到室温。
- 在15毫升圆锥管中制备10% 甲酰胺洗涤缓冲器 (FWB)。
- 从滚筒滚筒上取下管子, 将它们放到箔覆盖的盒子里, 以防光线。
- 将样品离心至 376 x 克, 3 分钟. 吹打将上清入危险废物中。
- 并用重悬在1毫升 10% FWB 通过轻轻吹打上下2-3 次。
- 在箔覆盖盒中孵育30˚C 30 分钟 (不旋转)。
- 将样品离心至 376 x 克, 3 分钟. 吹打清除上清至危险废物, 并留下50µL。
- 同时, 在15毫升圆锥管中制备 DAPI/FWB: 1 例, 混合1000µL 10% 甲酰胺洗涤缓冲器, 1 毫克µL DAPI。对于10个样品, 混合10毫升10% 甲酰胺洗涤缓冲器与10µL 5 毫克/毫升 DAPI。并用重悬在1毫升的 DAPI/FWB 轻轻吹打上下2-3 次。
- 在箔覆盖盒中孵育30˚C 30 分钟 (不旋转)。
- 在冰上解冻防漂白试剂。
- 离心机样品在 ~ 376 x g 为3分钟, 完全移除上清的吹打。如果需要, 离心机再次清除所有上清。
- 对于没有立即成像的样本, 并用重悬在50µL 的 GLOX 缓冲区中不带酶的颗粒。吸管上下3-4 次混合。
- 把所有的 unimaged 样品放在铝箔覆盖的盒子里4˚C, 直到准备好图像。当准备好图像, 离心样品在〜 376 x g 为2分钟, 并完全清除上清液吹打。并用重悬在 GLOX 与酶如下。
- 对于正在成像的样品, 添加15-20 µL 的 GLOX 缓冲酶。轻轻吸管上下混合。
注: 添加的体积可以根据细胞颗粒的大小而变化。建议用酶 resuspending 15 µL 的 GLOX 缓冲颗粒, 并在显微镜下检查细胞密度。如果细胞过于致密 (细胞在彼此的顶部聚集), 增加额外的 GLOX 缓冲与酶。如果单元格太稀疏, 请离心取样并取出5µL 的缓冲器。 - 吸管5µL 到盖玻片 (18 毫米 x 18 毫米, 1), 并将盖玻片放在幻灯片上。
- 在放置盖玻片的幻灯片的顶端放置一个实验室擦拭。轻轻按实验室擦拭设置幻灯片 (应该看到液体从所有四边缘盖玻片)。
- 把幻灯片转到显微镜室, 在铝箔覆盖的盒子里。
- 图像采用宽场荧光显微镜, 高放大倍数 (60-100X) 和高数值孔径。
注: 为了收集 smFISH 探头发射的光子的最大数量, 不推荐共焦显微镜, 因为它们极大地限制了所收集的光量。在这里, 数据收集在一台装有 100X, 1.4 NA 目标, 使用过滤器 CY5 (EX632/22, EM679/34) 成像在1.3 秒, 100% T;TRITC (EX542/27, EM597/45), 1.3 s, 100% T;和 DAPI (EX390/18, EM435/48), 0.05-0. 1 s, 32%-50% T。还应获取一个明亮的字段参考图像。获取15-25 切片的步骤大小为 0.1-0.2 µm, 从完全低于焦点的视野完全以上, 以确保所有的 RNA 斑点被占。
4. 图像分析
- 使用已发布的 smFISH 分析工具 (如鱼量化17和独奏曲2) 和自定义程序 (根据实验的确切要求) 分析 smFISH 数据。
注意: 一个好的分析管道应该允许用户确定一个阈值, 将真实的 RNA 斑点与背景分开, 输出统计数据, 如 X、Y 和 Z (可选) 坐标和每个点的强度、每个单元格中的斑点数。, 并可能将参数作为筛选错误检测的一种方法。
Representative Results
为了评估 smFISH 协议的工作方式 (在图 1中概述), 我们设计了一组54探针, 这些探测器平铺NDC80基因 (图 2A, top) 的开放阅读框架。位于最5端的探头称为探针 1;下一, 探针 2;第三个, 探头 3,等。27探针分配奇数 (探针 1, 3, 5.........) 都与 CAL 氟 590 (CF590) 荧光染料共轭;和27探针分配一个偶数 (探针 2, 4, 6...), 共轭到类星体 670 (Q670) 荧光染料。因此, 这些交替探头集通常被称为 "奇/偶" 探头。在杂交时, 两个探针集都应该标注相同的成绩单。
在现场检测后, 我们使用了一些测量方法来判断 smFISH 数据集的质量。第一个是定位的程度和质量的奇/甚至探头。在我们的例子中, 88% 的 smFISH 点 colocalized (图 2A 和 2B), 其中95% 的斑点配对在2个像素之间 (图 2C, 配对), 这是在预期值内给定任何颜色和检测两个荧光通道之间的畸变。相比之下, 不到10% 的未配对点的距离小于2像素, 这表明 misidentifying 一个点对的概率很低 (图 2C)。在两个通道 (图 2B中, 将 CF590-only 与 Q670-only 进行比较) 中, 未配对点的12% 是均匀划分的;因此, 我们得出结论, 对于这个 2.4 kb 基因, 在每个细胞的零到45个转录之间有一系列的表达, 每一个荧光通道中都能准确地检测到94% 的 RNA 分子。如果 smFISH 协议是次优, 你将观察 (1) 一个更大的分数的 smFISH 点, 其中只有一个的两个荧光信号 (非 colocalized) 和/或 (2) 单元格具有非常低的信噪比或根本没有信号。
接下来我们问, smFISH 信号的检测是否偏向于每个细胞的 RNA 分子总数。在一个种群中, 每个细胞中特定 RNA 的总数分布在一个分配中, 有些细胞的 rna 分子比其他的多。一个好的 smFISH 协议应该强有力地检测 rna, 不管每个细胞中是否存在大量的 rna 分子。为了测试这一点, 对于每个单元, 我们计算了 smFISH 点的分数与 colocalized 信号和分数仅有两个荧光信号之一。在对每个单元格的总斑点数相同的单元格进行分组后, 我们计算了给定组中 colocalized (配对) 或非 colocalized (CF590-only 或 Q670-only) 斑点的平均分数, 并将此平均值绘制为总数量的函数。每个单元格的点 (图 3)。对于每个类别的斑点, 分数是相似的整个范围内的总斑点每细胞。例如, 将细胞与每细胞共20个荧光点相对于30个斑点, colocalized 斑点的平均分数是相似的。这一结果表明, 我们的协议可以检测到细胞中的 RNA 分子范围 (每细胞至少有40个分子)。如果协议工作 suboptimally, 你可能会观察到偏见。例如, 两个荧光信号中只有一个的斑点的分数可能会随着每个细胞的总斑点数的增加而增加。
使用这个优化的协议, 我们检查了NDC80基因的表达式, 它编码一个动粒蛋白, 在不同的生长条件。NDC80基因表示两个 mRNA 亚型: 长 undecoded 记录异构体, NDC80luti, 在 5 ' 端有一个 ~ 400 基对扩展, 与短NDC80ORF 异构体比较, 但两个成绩单共享NDC80基因的编码区域 (参见图 4A中的示意图)。我们设计了两组探头: CF 590 集绑定到NDC80luti的唯一 5 ' 区域。Q 670 集绑定到NDC80luti 和NDC80ORF的公共区域。NDC80luti 记录被检测为来自两个探测器集的信号 colocalized 的 smFISH 点, 而NDC80ORF 记录是那些仅从 Q 670 发出信号的位置。由于NDC80luti的唯一段的大小, 我们只能在该区域上平铺20个寡核苷酸探针, 这比建议的30到48探针少。因此, 我们首先确定这个探针集是否能在我们的优化协议中稳健地检测 RNA。对于任一荧光通道, 我们将信噪比 (信噪比, 定义为相对于光斑强度的点周围像素的方差) 与每个 smFISH 点检测到的信号相对应, 并为所有斑点生成一个散点图。在整个视图字段 (图 4A中的示例图像和图 4B中的图形) 中标识。对于 Q 670 和 CF 590 探针集 (优化的图 4B), 都清楚地确定了两个不同的种群, 这表明, 真正的 smFISH 点 (在灰色区域内) 可以与背景信号分离。请注意, 在次优条件下, 这种分离不太明显 (次优,图 4B)。
我们使用这两个探针集研究NDC80luti 和NDC80ORF在营养生长和减数分裂过程中的表达式。在营养细胞中, 检测到来自 Q 670 探针集的鲁棒信号, 但不是从 CF 590 探针集 (图 5A, 植物人), 同意北印迹的观察, 只有短异构体在营养生长过程中表达16.这一结果还表明, CF 590 探针集是具体的, 在我们的优化 smFISH 协议中产生低背景。与此相反, 在减数分裂前期发现了两个探针集的鲁棒信号, 大多数斑点有 colocalized 信号 (图 5A, 减数分裂前期)。与北印迹分析 (图 5B) 一起, 此观察证实长异构体NDC80luti 是在减数分裂中明确表达的。这两种类型的基因在细胞质 (DAPI 区域外) 检测到, 这表明两者都是从细胞核中输出的, 与核糖体分析数据18一致。
为了确定是否收集了足够的数据, 以便准确地解释我们的数据集固有的生物变异, 我们使用每个单元的统计数据进行了引导分析, 其中包括 (1) 每个单元格的 colocalized 点的分数和 (2)斑点的分数与两个荧光信号之一 (CF 590 只和 Q 670 只)。在这个分析中, 一个程序随机选择一个细胞从437量化的细胞500迭代。接下来, 计算了与这500个选定单元相关的统计数据的平均值和方差。这一过程被重复, 以随机选择两个细胞从所有细胞, 没有替代;然后随机选择三个单元格等。直到达到总数据集大小的一半。数据集中的方差停滞不前在40个单元格之后, 这表明在这一点之后, 平均值中的大部分变化都是数据的固有特性, 而不是采样 (图 6, 嵌入) 的工件。当我们将样本方差除以样本平均值, 作为每个迭代周期中取样的单元数的函数 (图 6) 时, 这种效果变得更加明显。随着数据的显示, 方差的变化变得 diminishingly 小60细胞后。在 smFISH 实验中量化的细胞数量应该超过达到稳定平均值和变化的高原所需的最小细胞数。在我们的例子中, 我们每个样本的数量超过95个细胞, 每次复制。细胞总数 (> 400 细胞) 远远超过了反映人口平均值所需的最小细胞数 (~ 60 细胞)。
使用自定义的 Matlab 程序16, 发现植物细胞的中位数为每细胞 5 NDC80ORF 记录, 而在减数分裂前期细胞中, 中位数显著下降到每细胞4个记录 (双尾魏氏秩和测试, p = 0.026) (图 7)。每个单元格的NDC80luti 成绩单的中位数为21个记录, 100% 个单元格表示NDC80luti 记录。由于 mRNA 分子的数量是离散的数量, 我们将给定数量的成绩单作为一个步进、相对频率直方图来绘制细胞的分数。每个直方图中最大的 bin 被规范化为相同的高度。
图 1: smFISH 协议的流程图.细胞在室温下固定以甲醛20分钟或4˚C, 分别用于营养生长样本和减数分裂样品。在缓冲 B 洗涤三次后, 细胞被 zymolyase 消化, 直到 70%-90% 的细胞被消化。然后将所消化的样品洗涤一次与缓冲 B 去除 zymolyase, 然后透在70% 乙醇 (乙醇) 3.5 小时。为了准备杂交, 样品首先孵化10% 甲酰胺洗涤缓冲 (FWB) 为 ~ 20 分钟。接下来, 样品被悬浮在50µL 的杂交溶液中, 其中含有荧光探针, 用于夜间在30˚C 的黑暗中孵化。杂交后, 样品在 10% FWB 中孵化30分钟, 冲洗掉多余的探针, 然后在 10% FWB 中孵化出 4 ', 6-diamidino-2 苯基吲哚 (DAPI) 来染色 DNA。对于在 FWB/DAPI 孵化后立即成像的样本, 悬浮在 GLOX 缓冲中补充过氧化氢酶、Trolox 和葡萄糖氧化酶 (GLOX + enz);而其他样品则悬浮在 GLOX 缓冲液中, 没有酶, 储存在4˚C, 可达3小时。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 使用奇/偶数探头评估 smFISH 质量.(A) 顶部: 奇/偶探头组的示意图。五十四寡核苷酸探针平铺NDC80基因的设计。奇数编号的探测器标有一个荧光 (CF590, 以洋红显示), 以及偶数号探头, 另一荧光 (Q670, 以绿色显示)。底部: 具有代表性的 smFISH 图像的减数分裂前期细胞获得使用奇/甚至探针集。样品被采取了6小时后, 细胞 (UB8144) 转移到孢子培养基, 这些细胞在减数分裂前期被捕的时间。DNA 被 DAPI (以蓝色显示) 染色。图像显示为 z 堆栈的最大强度投影。刻度条: 5 µm (B) 使用奇/偶数探针集获得的配对或未配对 smFISH 点的百分比。对428次减数分裂前期细胞进行了分析, 从两个独立实验中汇集。此图从图 2中修改-图4中的陈et 。16 (C) 每对配对点之间的距离的累积密度函数 (CDF) 和未配对点的近邻之间的距离。对于一个荧光通道中的每个检测点, 在互补信道中, 应用 "k 近邻" 算法来识别最近检测到的点-和该点的距离。定位是相互最近的邻居被认为配对, 并生成一个新的列表记录配对, CF590-only 和 Q670-only 检测。对于每个检测类别, 在 Matlab 中绘制了距离的 CDF 直方图, 确认正确配对的点确实比其他信道中没有相应点的位置更接近。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 配对和未配对斑点的分数, 作为每个单元格的总 RNA 数的函数.为了测试 smFISH 斑点的检测和配对在不同的表达水平上是否有偏差, 单个细胞按总 RNA 表达进行分组。对每组细胞分别计算配对、CF590-only 和 Q670-only 检测的平均分数。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 使用为NDC80luti 和 NDC80 smFISH 基因而设计的探头所生成的数据的质量评估.Q 670 探针 (以绿色显示) 杂交到NDC80luti 和NDC80ORF 基因之间共享的公共区域, 而 CF 590 探针 (以洋红显示) 杂交到NDC80luti的唯一 5 ' 区域.(A) 具有代表性的 smFISH 图像NDC80luti 和NDC80ORF 在减数分裂前期, 获得优化的与次优条件。在减数分裂前期, 诱导菌株 UB8144 (优化条件) 和 UB1337 (次优条件) 进行减数分裂和固定。这两种菌株有不同的同步系统来诱导减数分裂, 但是使用任何一种系统都不会影响 smFISH 质量 (没有显示数据)。在次优条件下, 细胞被固定在室温下20分钟 (不过夜固定), 消化 zymolyase 没有 VRC 补充, 并杂交在较低浓度的 VRC。图像显示为 z 堆栈的最大强度投影。DNA 被 DAPI (以蓝色显示) 染色。刻度条: 5 µm (B) Scatterplots 显示信噪比 (信噪比) 和在图 4A中所示的视场中检测到的每个 smFISH 点的信号, 无论是荧光通道, 还是优化或次优条件。在优化条件下, 存在两个 smFISH 点的种群。真实的 smFISH 点位于灰色区域内, 与背景信号分离。在次优条件下, 单个基因很难分辨, 而在现场检测软件运行后, 真实斑点与背景之间的分离则不那么明显。请单击此处查看此图的较大版本.
图 5: NDC80luti 和NDC80ORF 记录的表达式被世俗控制.(A) 在营养生长和减数分裂期间, NDC80luti 和NDC80ORF 的代表 smFISH 图像。当细胞 (UB8144) 在富含营养的培养基中呈指数增长时, 就采取了营养样本。减数分裂前期标本在细胞 (UB8144) 转移到孢子培养基后6小时进行, 这些细胞在减数分裂前期被逮捕。Q 670 探针 (以绿色显示) 杂交到NDC80luti 和NDC80ORF 基因之间共享的公共区域, 而 CF 590 探针 (以洋红显示) 杂交到NDC80 的唯一 5 ' 区域 luti.DNA 被 DAPI (以蓝色显示) 染色。每个细胞都是由其 Zip1-GFP 信号进行的, 是减数分裂前期的标记。我们的 smFISH 协议保留强大的 GFP 信号, 无需进一步修改。营养生长: Zip1-GFP 阴性。减数分裂前期: Zip1-GFP 阳性。图像显示为 z 堆栈的最大强度投影。刻度条: 5 µm。此数字从图 2C中修改为陈et 。16. (B) NDC80ORF、 NDC80luti以及在减数分裂期间 Ndc80 蛋白质 (Ndc80p) 水平 (UB4074)。NDC80luti 和NDC80ORF 级别由北印迹确定, Ndc80p 级别由 anti-V5 应用免疫印迹在指定的时间点确定。Hxk1p, 装载控制应用免疫印迹。作为应变 UB8144, 此应变也将pGAL-NDT80 GAL4-ER同步系统1920。细胞被转移到孢子培养基在0小时, 并释放从粗线期逮捕由β雌二醇添加6小时后。在 S/减数分裂前期, NDC80luti 记录被有力地检测到, 而NDC80ORF 记录在减数分裂进入 (0 小时) 和减数分裂分裂 (7-9 小时) 之前主要存在。此数字从图 6J中修改为陈et 。16请单击此处查看此图的较大版本.
图 6: 为所示的减数分裂前期示例执行的引导分析图 5.所有的量化细胞都聚集在一起, 一个给定数量 (n) 的细胞被随机抽样500次。计算了平均和95% 置信区间为每细胞配对和不配对 mRNA 的分数。这些数据是为数字 n (嵌入) 的每个选择绘制的。通过绘制样本方差除以平均值, 作为单元数 (n) 取样的函数, 可视化了高原的方差。测量的细胞总数 (437 个细胞) 大大超过了错误停滞不前 (~ 60 细胞) 的数量, 表明额外的数据不会提高对测量的信心。请单击此处查看此图的较大版本.
图 7: 量化显示的 smFISH 数据图 5, 使用从三独立实验中汇集的数据, 以给定数目的NDC80luti 和NDC80ORF 记录的单元格的相对频率直方图作为图表.虚线表示每个单元格中NDC80luti 和NDC80ORF 记录的中位数。每个直方图都归一化, 以便在所有直方图中最大的 bin 高度相同。分析了637个细胞的营养生长和437的减数分裂前期。对NDC80luti 和NDC80魏氏分别执行了双尾秩和测试, 比较了营养和减数分裂前期样本。此数字从图 2D中修改为陈et 。16请单击此处查看此图的较大版本.
| 缓冲 B (1 升库存: 1.2 米山梨醇; 0.1 米磷酸钾缓冲液, pH 值 7.5) | 1x |
| 核酸酶水 | 500毫升 |
| 山梨 醇 | 218.6 克 |
| 2PO4 | 2.18 克 |
| K2HPO4 | 14.62 克 |
| 核酸酶水 | 带到1升最终音量 |
| * 过滤灭菌后, 在50毫升整除数中贮存4˚C | |
| Zymolyase 100T (10 毫克/毫升) | |
| * 存储在整除数的-20 ˚C | |
| 在1毫升 MilliQ 水中溶解10毫克 zymolyase 粉 | |
| E. 大肠杆菌tRNA (10 毫克/毫升) | |
| * 存储在整除数的-20 ˚C | |
| 在1毫升 MilliQ 水中溶解10毫克 tRNA 粉 | |
| 70% 乙醇 (50 毫升) | 1x (毫升) |
| 纯乙醇 | 35 |
| 核酸酶水 | 15 |
| * 常温贮存 | |
| 杂交缓冲 (10 毫升) | 1x (毫升) |
| 50% 葡聚糖硫酸盐 | 2 |
| 大肠杆菌tRNA (10 毫克/毫升) | 1 |
| 200毫米钒 ribonucleoside 络合物 (VRC) | 0。1 |
| BSA, 50 毫克/毫升 | 0.04 |
| 20x SSC | 1 |
| 甲 酰 胺 | 1 |
| 核酸酶水 | 4.86 |
| * 存储在-20 ˚C 250 µL 或 500-µL 整除数 | |
| 10% 甲酰胺洗涤缓冲器 (10 毫升) | 1x (毫升) |
| 在室温下的甲酰胺 | 1 |
| 20x SSC | 1 |
| 核酸酶水 | 8 |
| * 使新鲜, 漩涡为20-30s 混合 | |
| 10% 葡萄糖解答 | |
| * 过滤器灭菌后在整除数4˚C 储存 | |
| 1克葡萄糖在10毫升无核酸酶水中溶解 | |
| 葡萄糖氧化酶 | |
| * 存储在整除数的-20 ˚C | |
| 溶解3.7 毫克葡萄糖氧化酶在1毫升50毫米 NaOAc, pH 5 | |
| 抗漂白 (GLOX) 缓冲器, 无酶 (1 毫升) | 1x (µL) |
| 10% 葡萄糖在无核酸酶水中 | 40 |
| 1米三, pH 值8。0 | 10 |
| 20x SSC | 100 |
| 核酸酶水 | 850 |
| * 做新鲜的, 也可以储存整除数在4˚C | |
| 抗漂白 (GLOX) 缓冲器, 具有酶 (50 µL) | 1x (µL) |
| 过氧化氢酶 (涡旋温和, 容易安定) | 0。5 |
| 葡萄糖氧化酶 | 0。5 |
| 100毫米 Trolox (溶解在乙醇) | 1 |
| GLOX 缓冲区 | 50 |
| * 每一次都要新鲜, 准备冰, 可以储存在4˚C 2-3 小时 |
表1。缓冲区和媒体
Discussion
此处提供的协议来自其他已发布的 smFISH 协议2、3、21、22、23, 并专门针对酵母应变背景 SK1 进行了优化。优化后的参数包括细胞数、固定时间、离心速度和持续时间、消化时间、消化缓冲、探针浓度和杂交缓冲。其他参数, 如杂交温度和持续时间没有优化。在本节中, 我们分享了一些注释, 它将有助于使本议定书适应任何酵母菌的背景和感兴趣的生长条件。
发芽酵母细胞壁是在 smFISH 中获得高质量的图像的主要挑战, 因为细胞壁防止探针穿透。zymolyase 细胞壁的不完全消化导致探针的低效杂交和信号中细胞间的高细胞变异性。然而, 过度消化可能使细胞过于脆弱, 导致在洗涤步骤和细胞爆裂过程中显着细胞损失在幻灯片准备成像。因此, 优化消化时间是至关重要的。我们建议通过在不同的时间内消化相同的样品来进行 smFISH 试验。在我们的情况下, 我们得到了最好的 smFISH 数据, 如果我们停止消化时, 80% 的细胞变得不屈光。通常, 在相同的生长条件下, 不同基因突变株可以用相似的时间来消化。然而, 在发芽酵母的不同生长条件和减数分裂的不同阶段, 消化时间不同。一旦确定了时间, smFISH 的质量就会重现。注意, 对于有缺陷细胞壁合成和/或成分的突变株, 消化可能在15分钟以内完成. 使用不同批次的 zymolyase 也可能略微改变消化时间。
为了达到高信噪比, 需要最佳探针浓度。我们在商业上设计和购买我们的 smFISH 探头。好的探针 (通常是20市场) 应该有一个百分比的 GC 范围从35% 到 45%, 最小间距2基对探头之间, 低交叉反应性。我们使用了一个基于 web 的探头设计器从制造商生成一个探针列表, 如果有足够的探头可以选择, 我们将使用在酿酒基因组数据库中的爆破算法, 以消除超过17基对重叠的探头与其他基因组区域。我们为探测集选择了更 photostable 的荧光染料 (CAL 590), 该探测器组退火NDC80luti (CF 590) 的唯一区域, 因为在此集合中, 满足上述所有条件 (20 探针) 的探头数量低于制造商推荐的最小编号 (25 探头)。在根据制造商的指示重组探头解决方案后, 我们对库存溶液进行了1:10 稀释, 并将稀释溶液储存在 5-µL 整除数-20 ˚C。每个整除只使用一次。为了优化, 我们应该从1:10 稀释溶液中进行串行稀释, 并测试浓度产生最佳信噪比。我们建议从原来的股票做一个稀释系列 1:250, 1:500, 1:1000 和1:2000。在我们的例子中, 1:500 稀释因子导致最佳信噪比, 为 CF 590 和 Q 670 探针集。
最佳的固定时间也是成功 smFISH 的关键。我们发现, 夜间固定在4˚C, 而不是固定在室温20分钟, 大大提高了一致性和质量的 smFISH 结果的减数分裂样本。虽然我们没有测试如何过夜固定可能会影响营养样品, 室温固定在这种生长条件下工作良好。因此, 为了优化 smFISH 协议的新菌株或生长条件, 我们建议开始时, 在室温下固定时间和增加的固定时间, 如果遇到高变异性的信号。
与其他已发布的协议3,22,23相比, 我们的协议使用 RNase 抑制剂 VRC 在消化过程中和较高浓度的 VRC 在杂交期间。在这两个步骤中添加 VRC 提高了 smFISH 结果的一致性, 可能是通过更好地保留 RNA 分子对核酸酶活动, 这可能是由 zymolyase 混合 (酶是从粗提取物纯化, 可能含有 RNase污染物)。因此, 我们建议使用我们的协议中列出的 VRC 量, 或者更高浓度的 VRC 进行优化。
在缓冲 B 和甲酰胺洗涤缓冲液的洗涤步骤中, 细胞的很大一部分可以丢失。为了减少细胞损耗, 可以提高离心速度。在我们的情况下, 使用高速 (2.1万 x g) 颗粒我们的样品在缓冲 B 洗涤明显减少细胞损失。然而, zymolyase 消化后细胞变得非常脆弱, 所以不建议改变离心速度。相反, 我们建议使用来自美国科学的低粘附管, 这大大有助于在洗涤过程中, 在甲酰胺洗涤缓冲细胞颗粒。总的来说, 我们的协议可以持续地生成一层足够致密的细胞来进行高效成像。通常, 7 的视野应该产生 > 130 细胞适合量化。
最后, 确定图像分析所需的最佳参数和输出是很重要的。为了检测 smFISH 点, 发布的分析程序通常用高斯内核过滤原始图像, 以删除背景信号, 并要求用户确定每组图像的信噪比,2,17。不幸的是, 目前还没有一个单一的标准来确定正确的参数, 因此需要对这些不同设置进行一些经验测试。要设置每个步骤所需的参数, 需要迭代地输入不同的参数集, 并检查从每个集合中获得的结果与几个代表性单元中的手动计数是否匹配。一旦找到一组参数, 它可以用于大多数的图像, 尽管不同的生长条件和遗传背景。
此外, 可以测试在量化22之前是否可以执行 smFISH 图像的最大强度投影。这一步简化了光斑检测算法, 并大大减少了成像时间, 但在一些潜在有用的信息, 如个别斑点, 如其亚细胞定位的成本。在我们的例子中, 由NDC80基因产生的 mRNA 分子数量足够低, 这一处理后斑点很好地分离 (在萌芽的酵母3,7) 的成绩单上并不少见。在定位分析至关重要的情况下, 分析管道需要确定每个 smFISH 点在每个通道中的位置, 以评估定位。根据所要求的具体问题, 其他信息, 如每个点的强度可能也需要从管道中提取, 以便进一步分析。优化协议和图像分析管线的关键步骤, 对于获取高品质的 smFISH 数据, 研究感兴趣的问题至关重要。
Disclosures
作者没有披露利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢安妮多德森和斯蒂芬妮的建议如何优化 smFISH 协议, 泽维尔 Darzacq 为帮助与分析平台, 海盐黄提出的统计分析建议。这项工作得到了来自3月的钱 (5 FY15-99), 皮尤慈善信托基金 (00027344), 达蒙罗扬癌症研究基金会 (35-15) 和格伦基金会的资助, EÜ, 和 NSF 研究生研究金赠款号。DGE-1106400 到 JC。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BSA, RNase-free (50 mg/mL) | Ambion | AM2616 | Store at -20 °C. |
| Catalase | Sigma | C3515 | Store at 4 °C for short-term. Vortex before use. |
| DAPI | Sigma | D9564 | Store at -20 °C after reconstitution in water. Protect from light. |
| 50% Dextran Sulfate | Milli Pore | S4030 | Store at room temperature. Very viscous liquid. Handle with patience. |
| E. coli tRNA | Sigma | R4251 | Store at -20 °C in aliquots after reconstitution in water. |
| Ethanol (100%, 200 proof) | various | Flammable. | |
| 37% Formaldehyde | Fisher | F79-500 | Store at room temperature. Toxic. Use and dispose with caution. |
| Formamide | Ambion | AM9342 | Store at 4 °C. Open after the temperature equilibrates to room temperature in order to prevent oxidation. Toxic. Use and dispose with caution. |
| Glucose | various | Store at 4 °C after dissolving in nuclease-free water. | |
| Glucose oxidase | Sigma | G2133 | Store at -20 °C in aliquots after reconstitution in 50 mM NaOAc, pH 5. |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9932 | Store at room temperature. |
| Potassium phosphate (monobasic and dibasic) | various | Store at room temperature. | |
| Probe library, diluted in TE, pH 8.0 | Biosearch Technologies | Store at -20 °C in aliquots (5 µL) after reconstitution in TE pH 8.0, following the instructions from the manufacturer. Protect from light. | |
| Sorbitol | various | Store at room temperature. | |
| 20X SSC | Ambion | AM9763 | Store at room temperature. |
| TE, pH 8.0 | Ambion | AM9849 | Store at room temperature. |
| 1 M Tris, pH 8.0 | Ambion | AM9856 | Store at room temperature. |
| Trolox | Sigma | 238813 | Store at -20 °C in aliquots. |
| 200 mM Vanadyl ribonucleoside complex (VRC) | NEB | S1402S | Store at -20 °C in aliquots after reconstitution, following the instructions from the manufacturer. |
| Zymolyase 100T | MP Biomedicals | 08320932 | Store at -20 °C in aliquots after reconstitution in water. |
| Low-adhesion tubes | USA Scientific | 1415-2600 | Store at room temperature. |
References
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