Summary
Beskrivs är en metod för att kvantifiera uttrycket av 96 gener och 18 ytproteiner genom singelcellerna ex vivo, möjliggör identifiering av differentially uttryckt gener och proteiner i virus-infekterade celler i förhållande till icke-infekterade celler. Vi tillämpar en strategi för studien SIV-infekterade CD4+ T celler isolerade från rhesus makaker.
Abstract
Encelliga analys är ett viktigt verktyg för dissekera heterogena populationer av celler. Identifiering och isolering av sällsynta celler kan vara svårt. För att övervinna denna utmaning, en metodik som kombinerar indexerade flödescytometri och hög genomströmning multiplexade kvantitativa polymeras-kedjereaktion (qPCR) utvecklades. Syftet var att identifiera och karaktärisera simian immunodeficiency virus (SIV)-infekterade celler inom rhesus makaker. Genom kvantitering av surface protein av fluorescens-aktiverad cell sortering (FACS) och mRNA av qPCR identifieras virus-infekterade celler av viral genuttryck, som kombineras med värd genen och protein mätningar för att skapa en flerdimensionell profil . Vi benämner det tillvägagångssätt, riktade Single-Cell Proteo-transkriptionell utvärdering eller tSCEPTRE. För att utföra metoden, är viabla celler färgade med fluorescerande antikroppar specifika för yta markörer används för FACS isolering av cell delmängd eller nedströms fenotypiska analys. Enstaka celler sorteras följt av omedelbar lysis, multiplex omvänd Transkription (RT), före PCR-amplifiering och hög genomströmning qPCR av upp till 96 utskrifter. FACS mätningar registreras vid tidpunkten för sortering och därefter kopplade till gen uttryck data för väl position för att skapa en kombinerad protein och transkriptionell profil. För att studera SIV-infekterade celler direkt ex vivo, celler identifierades av qPCR detektion av flera viral RNA arter. Kombinationen av viral avskrifter och kvantiteten av varje tillhandahålla en ram för klassificering av celler i olika faser av viral livscykel (t.ex., produktiva kontra icke-produktiva). Dessutom var tSCEPTRE av SIV+ -celler jämfört med icke-infekterade celler isolerade från samma prov att bedöma Differentiellt uttryckta värd gener och proteiner. Analysen visade tidigare unappreciated viral RNA uttryck heterogenitet bland infekterade celler samt i vivo SIV-medierad post-transcriptional genreglering med encelliga upplösning. Den tSCEPTRE metoden är relevant för analysen av någon cell befolkningen mottagliga för identifiering av uttryck av surface protein marker(s), värd eller patogen gene(s) eller kombinationer av dessa.
Introduction
Många intracellulära patogener lita på mottagande cell maskiner att replikera, ofta ändra värd cellbiologi eller inriktning mycket specifika subpopulations av värdceller att maximera sina chanser att förökning. Som ett resultat, störs cell biologiska processer ofta, med skadliga konsekvenser för den allmänna hälsan hos värden. Förstå samspelet mellan virus och värdcellerna där de replikera kommer att belysa sjukdomsmekanismer som får stöd i utvecklingen av förbättrade terapier och strategier för att förhindra infektion. Direkta analytiska verktyg som möjliggör studier av värd-patogen interaktioner är avgörande mot detta syfte. Encelliga analys ger det enda medlen att otvetydigt tillskriva en cellulär fenotyp en bestämd genotyp eller infektion status1. Till exempel framkalla patogena infektioner ofta både direkta och indirekta förändringar i värdceller. Därför skilja infekterade celler från deras oinfekterade motsvarigheter är nödvändigt att attributändringar värd cell antingen direkt infektion eller sekundära effekter, såsom generaliserad inflammation. Dessutom för många patogener, som SIV och mänskliga immunodeficiency virus (HIV), värd cell infektion fortskrider genom flera etapper, som tidigt, sent, eller latent, som alla kan kännetecknas av distinkta genen och protein expression profiler2 , 3 , 4 , 5. bulk analyser av cell blandningar kommer att misslyckas att fånga denna heterogenitet6. Däremot multiplexed mycket encelliga analyser kunna kvantifiera uttrycket av både virus och värd gener erbjuder ett sätt att lösa infektion-specifika cellulära störningar, inklusive varianter infektion investeringsfaser. Vidare, analysera värd-patogen interaktioner i fysiologiskt relevanta inställningar är kritiska för identifiering av händelser som inträffar i infekterade organismer. Således, metoder som kan tillämpas direkt ex vivo är sannolikt att bästa fånga i vivo processer.
SIV och HIV rikta CD4+ T celler, där de motverkar värd antivirala ”begränsning” faktorer och downregulate antigenpresenterande molekyler för att fastställa produktiv infektion och undvika immun övervakning7,8, 9,10,11. Utan behandling, infektionen resulterar i omfattande förluster av CD4+ T celler, slutligen kulminerade i förvärvad immunbrist syndrom (AIDS)12. I inställningen av antiretroviral behandling kvarstår latent infekterade cellen reservoarer i årtionden, poserar ett formidabelt hinder för botande strategier. Förstå egenskaperna för vivo/SIV hivinfekterade celler har potential att avslöja värd cell funktioner instrumentell i patogenes och uthållighet. Men har detta mycket utmanande, främst på grund av low frequency av infekterade celler och brist på reagens kan lätt identifiera dem. Celler som transkribera viral RNA, uppskattas för att närvara vid 0,01 – 1% av CD4+ T celler i blod och lymfatisk vävnad13,14,15. Under suppressiv behandling är latent infekterade celler ännu mindre frekvent vid 10-3– 10-7 16,17,18. Virala protein färgning analyser att fungerar bra för att studera in vitro infektioner, exempelvis intracellulära Gag, är suboptimal på grund av bakgrundsfärgning 0,01 – 0,1%, lika med eller större än frekvensen av infekterade celler13, 14. Yta färgning för Env protein med välkarakteriserad SIV och HIV Env-specifika monoklonala antikroppar har också visat sig vara svårt, sannolikt av liknande skäl. Nyligen har nya verktyg syftar till att förbättra upptäckten av celler som uttrycker Gag av antingen införliva analyser specifika för gag RNA eller genom att använda alternativa imaging teknik14,15,19. Sådana tillvägagångssätt är dock fortfarande begränsat antal kvantitativa mätningar utförs på varje cell.
Här, vi beskriver metodik som (1) identifierar enda virus-infekterade celler direkt ex vivo av känsliga och specifika viral genen kvantitativa qPCR och (2) kvantifierar uttryck för upp till 18 ytproteiner och 96 gener för varje infekterad (och oinfekterade) cell. Denna metod kombinerar encelliga ytan protein mätning av FACS följt av omedelbar cell lysis och gen uttryck analys använder multiplexed riktade qPCR på Biomark systemet. Integrerad fluidic krets (IFC) tekniken gör multiplexade kvantitering av 96 gener från 96 prover samtidigt, genom en matris av 9216 kammare där de enskilda qPCR reaktionerna utförs. Levande cellen FACS sorteringen poster hög-innehåll protein överflöd mätningar medan bevara den hela transkriptom analys utförs omedelbart nedströms. För att identifiera virus-infekterade celler, analyser är specifika för alternativt skarvade och Osplitsat viral RNAs (vRNA) ingår i den qPCR-analysen, tillsammans med en panel av användardefinierade analyser totalt upp till 96 gener, det maximala antalet analyser som för närvarande bor i IFC. Den genuttryck och protein information samlas in för varje cell är sammanlänkade genom väl position. Vi har tidigare rapporterat resultat från denna analys någon annanstans20. Här, vi ge mer detaljerad metodologiska riktlinjer samt ytterligare beskrivande fenotypning av SIV-infekterade CD4+ T celler.
Detta synsätt, som vi kallar tSCEPTRE, kan tillämpas på upphävanden av någon livskraftig cell befolkningen reaktiva fluorescently märkt antikroppar och uttrycker en transkriptom kompatibel med tillgängliga qPCR-analyser. Det kan till exempel användas för kännetecknar differentiell gen- och proteinuttryck i sällsynta celler eller celler som inte lätt att skilja av surface protein markörer. Provberedningen är beroende av en standard färgning protokoll använder kommersiellt tillgängliga antikroppar. Cytometers med encelliga sortering kapacitet är också kommersiellt tillgängliga, men ytterligare biosäkerhet försiktighetsåtgärder krävs för bearbetning av infektiös levande celler. Inspelning den enda – cell protein uttryck profilen för varje cell av väl position, häri är som indexeras sortering, gemensamt för kommersiellt tillgängliga FACS sortering programvara. Computational analys av Differentiellt uttryckta värd gener bland cellpopulationer sevärdheter beskrivs inte här, men referenser tillhandahålls till tidigare publicerade metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Obs: En schematisk av protokollet arbetsflödet visas i figur 1. Det består av tre huvudsakliga steg: FACS, RT och cDNA före förstärkning och qPCR för upp till 96 gener samtidigt. Två versioner av protokollet, sortering celler i begränsa utspädningar och sortering enstaka celler, beskrivs i detalj i steg 5 och steg 6, respektive. Dessa strategier itu olika frågeställningar men följa liknande förfaranden.
1. förkunskap eller tidigare analyser
- Validera alla gen uttryck analyser som ska användas som tidigare beskrivits6.
Obs: Detta steg görs i god tid före den experiment. Validerar alla analyser, är kommersiella och anpassade, skyldig att säkerställa effektiv och linjär förstärkning av relevanta RNA nivån i enskild cell. Många kommersiellt tillgängliga och anpassade analyser inte uppfyller dessa specifikationer. Bearbetning och automatiserade kurva montering för samtidiga kvalificering av uttrycket analyser av upp till 96 gener finns i Kodning tilläggsfilerna 1 – 5, men enskilda analyser kan betecknas med R2 och lutningen på den linjära passformen. Representativa lyckade och misslyckade assay kvalifikation tomter visas i figur 2. -
Utveckla en flöde flödescytometrisk panel av antikroppar att färga cellen yta markörer av intresse.
- Titrera antikroppar genom färgning ett relevant urval, exempelvis rhesus perifera mononukleära blodceller (PBMC), med varje antikropp. Börja med 20 µL av antikroppen per test i 100 µL färgning reaktion och skapa åtta tvåfaldiga seriella utspädningar. Identifiera den optimala koncentrationen som uppvisar den högsta färgning intensiteten samtidigt bibehålla en tydlig åtskillnad mellan de negativa och positiva populationerna.
- Utvärdera den kombinerade färgning på ytterligare cell provexemplaren med blandningen av alla antikroppar vid den optimala koncentrationen bestäms i steg 1.2.1. Säkerställa att färgningen är liknande den som observerats för enskilda antikropp fläckar. Om färgningen är mindre än vad som observerats när någon antikropp användes i isolering, överväga alternativa fluorokrom konjugat för att ersätta sådana antikroppar.
2. gen uttryck Assay förberedelse
- Kombinera 96 genuttryck analyser i ett RNase/DNAS-free 1 – 15 mL tub (storlek kan variera med antalet sortera plattor). Panelen om analyser som använts i denna studie anges i tabell 1 och tabell 2. Det resulterande materialet benämns ”Assay Mix”. Lägg varje försök till en slutlig koncentration på 180 nM framåt och bakåt primers. Lägg till DNA Suspension buffert för att uppnå den tillämpliga utspädningen av Assay mixen.
Obs: För praktiska ändamål, anpassade (användargenererat) assay bestånd vara beredda på 18 µM överensstämma med koncentrationen av kommersiellt tillgängliga ”20 x” gen uttryck qPCR analyser (Tabell för material). 18 µM mixar av anpassade framåt och bakåt primer för varje gen görs från stamlösningar i DNA Suspension bufferten. Kommersiellt tillgängliga analyser (Tabell för material) har även sonder, men sonder krävs inte för RT eller cDNA före förstärkning och kan således utelämnas för anpassade analyser. Det rekommenderas att inkludera en eller mer städning gener för användning i kvalitetskontroll för att bedöma effektiviteten av sortering, cell återhämtning och cDNA syntes. Användningen av slumpmässiga grundfärger att generera cDNA har inte fastställts, men förväntas vara mindre effektiva än gen-specifika primers. - Förbered 2 x assay plattan för användning i steg 7,1 (multiplex qPCR). För varje 96 x 96 chip array förväntade, överför med pipett 6 µL av varje försök till varje designerat väl av en PCR-plattan med 96 brunnar. Exempelvis för 5 marker, kommer att 30 µL av varje test sysselsätta en enda brunn i plattan med 96 brunnar. Om använder 96 analyser, innehåller varje brunn plattan med 96 brunnar ett test. Försegla plattan med självhäftande förslutning.
Obs: Helst steg 2.1 och 2.2 genomförs samtidigt, för att undvika flera frysning-tining cykler för gen uttryck analyser. Alla gener inom assay plattan måste har också varit närvarande i Assay Mix (steg 2.1). Både den assay mix och assay plattan kan lagras vid-20 ° C eller 4 ° C för lång eller kort sikt användning, respektive.
3. ytan fläcken viabla celler
Obs: Intracellulära färgning, permeabilisering och fixering är inte kompatibla med den här metoden som de äventyra RNA.
- Bereda ersättning proverna genom att lägga till varje antikropp som anges i Tabellen för material till 40 µL av ersättning pärlor på 2,5 gånger högre koncentration än den som används för cellen färgning. Inkubera i 20 min vid 25 ° C skyddas från ljus. Lägga till 3 mL PBS i pärlor och centrifugera vid 500 x g under 3 minuter vid 25 ° C. Aspirera PBS och återsuspendera pärlorna i ~ 300 µL av PBS.
- Förbereda den flöde flödescytometrisk cell Sorteraren för provet bearbetning: förvärva ersättning rör, skapar kompensationsmatris och tillämpa matris till förvärvet filer för experimentell exemplar.
- Förbereda huvudmixen fluorescerande antikroppar cocktail genom att kombinera lämplig volym av varje antikropp som anges i Tabell av material, i en 1,5 mL bärnstensfärgad tub för alla prover att färgas. Vortex och centrifugera aggregerar cocktailbaren på 21 000 x g under 2 minuter vid 25 ° C till pellet antikroppen.
Obs: Antikroppar används här listas i Tabell för material. - Tina de nedfrysta cellerna i 37 ° C vattenbad för 2 min. Lägg till 0,5 – 2 mL cellsuspension till 12 mL PBS i en 15 mL tub, Centrifugera vid 500 x g under 3 minuter vid 25 ° C, och aspirera PBS. Återsuspendera i 3 mL PBS och överföring till en 5 mL polystyren tub. Centrifugera som ovan och aspirera PBS, lämnar ~ 20 µL kvarstående PBS.
Obs: Färgning temperaturen får anpassas till varmare eller kallare temperaturer som behövs för specifika applikationer genom att ändra den antikroppstitrering som färgning villkor med detta (se steg 1.2). - Omsuspendera upp till 2 x 107 tvättas cellerna i 80 µL av antikroppar cocktail och inkubera i 20 min vid 25 ° C skyddas från ljus. För prover som överstiger 2 x 107 celler, utöka färgning reaktion med detta för att bibehålla < 2 x 107 celler/100 µL.
- Tvätta cellerna genom att tillföra 3 mL PBS, centrifugering vid 500 x g i 3 min och Aspirera supernatanten.
- Grundligt resuspendera cellerna i 300 – 500 µL av PBS och filter av pipettering genom badmössa SIL 35 µm nylon cell. Hålla cellerna på is och skyddas från ljus tills sortera.
4. Förbered Cell samlingsplattor, utföra FACS sortera och generera cDNA
- Kombinera de RT-preamp reaktionsblandning komponenterna (tabell 3) med pipett till en enda RNAse/DNAS-free sterilt rör.
Obs: Detta steg kan utföras före eller under färgning i steg 3. Enzymet RT utelämnas här att bestämma DNA mallen till qPCR signal bidrag. - Använd en flerkanalspipett för att fördela 10 µL av RT-preamp reaktionsblandning i önskat antal 96 brunnar PCR-sortera samlingsplattor. Förslut plattorna med självhäftande film, och placera plåtarna på pre kylda 96 brunnar aluminium block.
- Upprätta cellen sortering Usenets systemet på flödescytometer genom att förvärva data från ungefärligt 20.000 cellerna färgas provet. Säkerställa att matrisen ersättning tillämpas på insamlade data. Rita grindar och definiera Usenets trädet som identifierar cell befolkningsgrupperna uppskattas komma av intresse för att vara isolerade för gen uttryck analys.
Obs: Usenets trädet används för insamling av potentiella SIV vRNA+ celler visas i figur 3. - Ange lämpligt instrument för att ange antal och delmängd av celler ska sorteras i varje brunn. Ytterligare detaljerad instruktion för sortering av antingen en begränsande cell spädningsserien eller enstaka celler finns i steg 5 och 6, respektive.
- FACS sortera cellerna i beredda 96 brunnar PCR-samlingsplattor. Ta bort självhäftande tätning före sortering och ersätta med en ny tätning efter sorteringen.
Obs: Hålla plattorna på förhand kyld aluminium block vid alla tillfällen, inklusive under Sortera. - Omedelbart efter sortera, vortex och centrifugera samlingen tallrik vid 2000 x g i 1 min vid 4 ° C.
- Thermocycle plattan i en PCR-maskin med förvärmd lock med följande villkor: 50 ° C under 15 minuter (RT), 95 ° C i 2 min, följt av 18 cykler av 95 ° C för 15 s och 60 ° C under 4 minuter (före förstärkning).
- Späd den cDNA 1:5 genom att överföra 5 μL cDNA in 20 µL av DNA suspension buffert i en ny PCR-plattan med 96 brunnar. Utspädda cDNA kan lagras vid 4 ° C eller -20 ° C på obestämd tid på denna punkt. CDNA är nu redo att användas som en mall för qPCR (steg 5.2, 7,4).
Obs: Denna utspädning garanterar att primers i RT-preamp reaktionen inte bidrar till nedströms qPCR.
5. variant A: FACS sortera celler till en begränsa utspädning serie att bestämma frekvensen av vRNA+ celler eller utföra experimentella kvalitetskontroll
Obs: Innan du utför en encellig typ, det kan vara till nytta att bestämma frekvensen av celler av intresse, genom att sortera cellerna i seriespädningar i replikera. Detta steg ger också värdefulla kvalitetskontroll för sortera effektivitet, cellys, RNA återhämtning och cDNA syntes, som beskrivs i steg 5.3. Tidigare bestämning av vRNA+ cell frekvens möjliggör mer exakt uppskattning av antalet enstaka celler som måste lösas för att uppnå tillräcklig urvalsstorlek för lämpligt powered vRNA+ cell gene expression analys.
- FACS sortera cellerna plattorna 96-väl tillagad som steg 4.1 – 4.2, och samla in 1 – 1 000 celler per brunn i flera replikat.
Obs: Antalet replikera brunnar på varje cell utspädning är vanligtvis omvänt samband med cellkoncentrationen per brunn. När den infektera cellen frekvensen är betydligt lägre än 1%, bör cell utspädningar fokusera på 100 – 1 000 celler per brunn. Ett exempel sortera plattan karta ges i figur 1, överst till vänster. Överstiger 1 000 celler per brunn bör undvikas på grund av resulterande ökar i reaktionsvolym och störningar med nedströms cDNA syntes och kvantifiering. - Kombinera de qPCR reagenserna i en master mix lösning i tabell 4. För en 25 µL reaktionsvolym kombineras 22,5 µL av master mix med 2,5 µL utspädda cDNA mall från steg 3,9. Utföra den qPCR med cykling standardförhållanden (t.ex., 94 ° C i 5 min, följt av 40 cykler av 94 ° C för 15 s och 60 ° C i 1 min).
Obs: Singleplex qPCR reaktioner med en konventionell realtids qPCR instrumentet rekommenderas som ett ekonomiskt preliminär analys av ett eller ett fåtal analyser att demonstrera effektiva cellen sortera, RNA återhämtning och cDNA syntes. Det kan också användas för att beräkna frekvensen av vRNA+ celler. Multiplex qPCR reaktioner med Biomark är vanligtvis mer lämpligt för storskalig encelliga analyser. - För kvalitetskontroll, rita Et värden (Et = Ctmax − Ct) kontra antal celler sorterade per brunn på en log10 -skala och tillämpa en linjär regressionsanalys.
Obs: Konsekvent replikat, linjär regression lutningen på 3.3 (± 0,3) och R2 > 0,9 är vägledande för ett effektivt experiment. Exempel på optimal och suboptimala sortera, RT-preamp experiment visas i figur 4. - Att fastställa frekvensen av vRNA+ celler, rita cell nummer sorterade per brunn på x-axeln (log10 skala) och andelen brunnar positivt för vRNA på varje cell utspädning på y-axeln. För ett exempel, se figur 1 (nedre vänstra, Poisson-fördelningen). Tillämpa en linjär regressionsmodell uppgifterna att bestämma antalet celler som hyser en positiv cell i genomsnitt motsvarar 63,2% av brunnarna positiv (0.632 på y-axeln)21. Konvertera denna cell utspädning tal (x-axeln intercept) till Frekvens uttryckt i procent. Exempelvis motsvarar en vRNA+ cell per 48 celler en frekvens på 2,1%.
6. variant B: FACS sortera celler för Single-cell analys
- Följ steg 4.1 – 4.8, och ange en cell sorterade per väl med den flödescytometer index sortera-funktionen för att skapa enskilda FCS filer för varje cell sorteras, mappas av väl position.
Obs: Om antalet sortera samlingsplattor överstiger antalet tillgängliga thermocyclers, cykling kan stoppas efter omvänt transkriptas inaktivering steget (95 ° C i 2 min) och cDNA kan lagras vid 4 ° C tills thermocyclers är tillgängliga. I detta fall påbörjas före förstärkning på den första cykeln av 95 ° C för 15 s. - Valfritt: Skapa cDNA ”pooler” bestående av cDNA från användardefinierade partier av enstaka celler till skärmen för sällsynta celler av intresse med hjälp av kvarvarande outspädd cDNA. Över 2 µL av outspädd encelliga pre förstärkta cDNA med flerkanalspipett till en nya plattan med 96 brunnar. Upprepa genom pipettering 2 µL av cDNA från alla ytterligare enstaka celler av en utsedda pool i samma väl. Skärm cDNA pooler för gene(s) av intresse (t.ex., vRNA) att avgöra de som innehåller positiva celler använder konventionella qPCR. Eftersom pooling kräver endast en liten delmängd av cDNA från varje cell, är den återstående ~ 8 µL av cDNA fortfarande tillgänglig för enskild cell analyser.
Obs: Pooling strategier rekommenderas innan encelliga gen uttryck analyser i ett försök att minska antalet enstaka celler förhördes av resurskrävande multiplex qPCR. Det är lämpligt för situationer där cellerna av intresse (t.ex., SIV mRNA +) kan identifieras genom en preliminär singel-plex qPCR-analys. Okomplicerad hög genomströmning strategier för att skapa cDNA pooler inkluderar att kombinera 2 µL av outspädd cDNA från en samling sortera Plates (dvs alla 12 celler i rad A) rader eller kolumner (dvs alla 8 celler i kolumn 1) i en enda brunn i en ny platta. För att avgöra det bästa pooling strategi, överväga förväntade frekvensen av cellerna i intresse från steg 5,4. Exempelvis om 10% av celler förväntas vara positiv, pool består av sex encelliga cDNA prover blir ofta negativ och cellerna representeras däri kan således uteslutas från nedströms encelliga analyser.
7. multiplex qPCR på Biomark-plattformen
Obs: Detta avsnitt får följa antingen version A eller B ovan. I studien beskrivs häri, tillämpades det uteslutande till encelliga analys.
- Förbereda qPCR assay plattan genom pipettering 4 µL av varje analys från 2 x assay plattan (bereddes i steg 2.2) in i en ny PCR-plattan med 96 brunnar innehållande 4 µL av assay lastning reagens i varje brunn. Upprätthålla assay plattan vid 4 ° C.
Obs: Assay plattan är stabil vid 4 ° C i upp till en vecka och vid-20 ° C för en månad. Således kan det vara bra att förbereda tillräckligt material för flera marker och förvaras på lämpligt sätt. - Fördela de kontroll linje vätskorna från priming sprutorna i två insugningsventilerna av chip. Ta bort den skyddande plasten från under plattan. Placera chipet på en IFC-styrenhet med den skårade sidan vid A1 position. Från huvudmenyn, Välj ”Prime” skriptet. Kör skriptet.
- Förbered den Real-Time reaktion Mix genom att blanda 50 µL prov lastning reagens med 500 µL av PCR-Master Mix (Tabell för material) för varje mikroflödessystem chip. Pipettera 4.4 µL till varje brunn av en nya plattan med 96 brunnar PCR, hädanefter betecknas som ”prov plattan”.
- Pipettera 3,6 µL av de 1:5 utspädda cDNA från steg 4,8 till provet plattan som innehåller Real-Time reaktion mixen.
Obs: Om en PCR utfördes down-urval att skärmen för sällsynta (t.ex., vRNA+) celler för efterföljande analys som beskrivs i steg 6,2, inkluderar endast celler representerade i positiva pooler. - Efter slutförandet av chip priming, läsa chip öppningarna genom tubens 5 µL från assay plattan till motsvarande väl på skårade (analys) sidan av chip och 5 µL från provet plattan till motsvarande väl på andra (prov) sidan av chip. Sätt chip i IFC handkontrollen och kör skriptet ”läsa in mix”.
- Överföra chip till Biomark plattformen att utföra den multiplexade qPCR. Fortsätt med instrumentet inställning och qPCR programmering efter stegvisa instruktioner som tillhandahålls av programvaran Real-Time PCR-analys och använda protokollet gen uttryck (GE) 96.96 Standard V.1 med 40 cykler av PCR. Spara filen ChipRun i en angiven mapp.
Obs: Flera marker kan köras per dag och över flera dagar. - Analysera qPCR data.
- Öppna programvaran för realtids-PCR-analys. Öppna filen ”ChipRun.bml” från den ”fil | Öppna ”menyn.
- Leta upp ”Chip Explorer” och ”Chip kör Sammanfattning” i det övre vänstra hörnet av fönstret programvara. Identifiera tre komponenter för Chip kör Sammanfattning: analysvyer, prov Setup och detektor Setup.
- Klicka på ”detektor Setup”. Under ”uppgift”, klicka på ”ny” och Välj typen container ”SBS plattan” och container format som ”SBS96”. Klicka på bredvid ”Mapping”, den... och välj ”M96-Assay-SBS96.dsp”.
- Valfritt: Tilldela varje detektor (analys) ett nummer eller namn i avsnittet ”namn” i varje brunn genom att dubbelklicka på den 1st väl. Flytta till nästa väl genom att trycka på ”F2”.
- Klicka på ”prov Setup”. Under ”uppgift” bredvid ”Mapping”, klicka på... knappen, och välj ”M96-prov-SBS96.dsp”.
- Klicka på ”analysvyer”. Välj ”Baseline Correction för linjär (derivat)” under ”aktivitet” i fliken ”qPCR”, och ”Ct tröskel metod för användaren (detektorer)”. I fliken ”Ct tröskelvärden” kontrollera ”initieringen med Auto låda”. Klicka på knappen ”analysera” ovan.
- Klicka på den andra fliken ”resultattavla” i den övre högra kvadranten av ”analysvyer”. Från den nedrullningsbara menyn, Välj ”värme kartvy”. Stresskartan med data visas.
- Valfritt: För att säkerställa enhetliga ROX fluorescens över chip, Välj ”bild Visa” istället för ”värme kartvy” från samma meny. I andra från höger fönstret ovanför stresskartan, Välj ”ROX”. I först från det högra fönstret, väljer du en av 1 – 40 cykler. Klicka på fjärde från höger fönstret för att växla till svartvit display av ROX fluorescens. En bild visas som informerar stänker, partiklar, eller defekter på chip. Om ROX likformigheten döljs grovt, kör igen chip.
- Klicka på ”tröskel” och ”Log graf” under stresskartan. Justera Ct tröskelvärdena manuellt för varje detektor genom att klicka på analyser (kolumner av stresskartan) och dra tröskeln som krävs för att överlappa den förstärkning kurvor i den exponentiella fasen. När du är klar, klicka på ”analysera”.
- Exportera qPCR data som en CSV-fil. Importera data till ett kalkylblads- eller statistisk analysprogramvara (t.ex., JMP) och karta resultaten av prov och test positioner på chip. Organisera grupper baserat på uttrycket av virala gener, genom att skapa en ny kolumn och använder en villkorlig formel celler. Under ”analysera”, Välj ”passa Y av X” och rita genuttryck kontra grupp. Använda statistisk analys.
Obs: Representativa encelliga kvantitativa uttryck av fyra SIV RNA arter skildras i bivariate tomter i figur 5A. Kvantitativa värden genuttryck i SIV RNA+ celler visas i figur 5B. - Extrahera kvantitativ protein uttrycksvärden från encelliga FACS data.
- Öppna .fcs filer från FACS sortera (steg 6.1) motsvarande plattan med 96 brunnar med FlowJo version 9. Med filnamnet markerat, välj ”plattform | Event nummer Gate | Skapa indexerade sortera gates ”. Enskilda celler visas visas av raden.
- Markera alla 96 celler (inte rader) och välj ”arbetsyta | Exportera | Välj alla kompenserad fluors ”. Under ”datatyp”, Välj ”FCS fil” och klicka på ”Exportera” Välj en angiven mapp.
- Dra nya .fcs filer för enskilda celler i en ny FlowJo-arbetsyta. Markera alla celler, klicka på ”Lägg till statistik” (”Σ” knappen i det övre vänstra hörnet) ”| Menar | Alla fluor parametrar ”.
- Öppna ”redigerare” genom att klicka på knappen fjärde från vänster i övre vänstra hörnet. Markera alla för i den första cellen och dra dem till tabell redaktör fönster. Klicka på samma knapp längst upp ”skapa och Visa tabell” i fönstret tabell redaktör. Detta kommer att skapa en tabell med 96 celler och en numerisk parameter för varje fluor.
- Kopiera resultatet till en databasprogramvara (t.ex., MS Excel, JMP), genom att antingen kopiera/klistra in eller genom att klicka på ”Spara och starta program” (fjärde från vänster knappen ovanför tabellen).
Obs: Detta förfarande är specifika för FlowJo version 9. FlowJo version 10 använder en annan procedur för att importera indexerade data. Indexerade flödesdata kan också kopieras/klistras in JMP direkt från CSV-filer som skapats av cell Sorteraren.
- Sammanfoga encelliga FACS data och qPCR av registreringsnummer och väl position. Utföra grafiska och statistiska analyser på den kombinera enskild cell genen (qPCR) och protein uttryck (FACS) data.
Obs: Exempel på encelliga kombinerat qPCR och FACS data visas i figur 6 (värd yta protein uttryck profiler för SIV-infekterade, skarvade vRNA+ rhesus makaker celler), figur 7 (CD4 genuttryck kontra yta CD4 proteinuttryck i skarvade vRNA+ rhesus makaker celler), och tidigare publicerade20. För att identifiera differentially uttryckt gener i cellen befolkningsgrupperna uppskattas komma av intresse är encelliga analys metoder beskrivs tidigare rekommenderade20,22,23,24, som står för andelen celler som är positiva för en gen samt kontinuerlig gen Uttryckets värde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Arbetsflödet för hela protokollet avbildas i figur 1. Det består av två variationer definieras av antalet celler sorterade: antingen begränsa utspädning eller som enstaka celler, som beskrivs i texten. Exempel på primer-probe kvalifikation analyser på 2-faldig seriespädningar av RNA visas i figur 2. Usenets strategin för att identifiera potentiella SIV+ celler visas i figur 3. En framgångsrik, suboptimal och misslyckade kvalitetskontroll qPCR för städning genen GAPDH på FACS-sorterade celler att begränsa utspädning visas i figur 4. Encelliga kvantitativa uttryck av fyra SIV RNA arter och rhesus makaker gener som uttrycktes differentially i infekterade celler visas i figur 5. Representant bivariate, histogram och scatterplots skildra ytan protein uttryck profil SIV RNA+ CD4+ T celler mätt med flödescytometri i figur 6. Trivariate bubbla tomten (figur 7) visar förhållandet mellan ytan CD3 eller CD4 protein, CD3 eller CD4 mRNA och kvantitativa viral genen (tat/varv) uttryck i enstaka celler.
Figur 1 : Schematisk bild av experimentella arbetsflöde illustrerar tre huvudkomponenter: flow flödescytometrisk sortera, omvänd Transkription plus PCR-baserade före förstärkning av cDNA (RT, förförstärkare), och qPCR. Sorteringen kan utföras som antingen en begränsande utspädning (A, grön bakgrund) eller som enstaka celler (B, orange bakgrund). Omedelbart efter FACS sorteringen, celler är lyserat och RNA är omvända transkriberas till cDNA och pre amplifierade (RT, förförstärkare PCR) att förbereda qPCR mall. Begränsande utspädning sorterar bestämmer frekvensen av celler som är positiva för viral RNA med Poissonfördelning statistik samt experimentella effektivitet och prova recovery. Grön pil huvudet visar det uppskattade antalet celler sorterade per väl innehållande en cell positivt för en viral genen (motsvarande 63,2% sannolikhet för sådana brunnar vara gen positivt), som omvandlas till en cell-frekvens. Frekvens uppskattningar kan användas för att informera antalet enstaka celler samlas i en efterföljande sortering (B). Indexerade encelliga FACS sortering insättningar en cell per brunn och genererar datafiler för varje cell kommenterad av väl position inom plattan med 96 brunnar. Encelliga qPCR utförs i multiplex för 96 gener samtidigt. Att kombinera ytan protein (FACS) och mRNA uttryck möjliggör profilering av enskilda celler (högra kolumnen). En valfri qPCR för en viral genen kan utföras mellan före förstärkning PCR och multiplexade qPCR (B, mitten) till skärmen enstaka celler eller pooler av encelliga cDNA down-Välj viral RNA+ celler eller pooler för multiplex qPCR-analys. Stresskartan illustrerar genuttryck (Ct-värde) för 96 analyser (kolumner) och 96 enstaka celler (rader). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Representant qPCR data från primer kvalifikation experiment visas för framgångsrik (vänster och mitten) och misslyckats (höger) kommersiellt tillgängliga analyser ( CD6, SIV tat/rev, och TLR3, respektive). För CD6 och TLR3, RNA extraherades från 106 FACS-sorterade rhesus makaker PBMC CD4+ T-celler med hjälp av ett kommersiellt kit. Åtta replikeras av en tolv-punkt RNA två-faldig utspädning serie (0.023-48 ng RNA, motsvarande 1,2 – 2 400 cell medel förutsatt att 20 pg RNA per CD4+ T-cell) utsattes för RT-preamp och qPCR. För SIV tat/revextraherades RNA från rhesus makaker PBMC smittade i vitro med SIVmac239. RNA spädningar var spanning RNA medel 6 – 12 000 celler. Et (40-Ct), som ökar med genuttryck, ritas kontra uppskattade cell nummer. Spädningsserien uppvisar R2 > 0,97 och lutning 3.32 ±0.3 Ange framgångsrik primer kvalifikation. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Bivariate FACS tomter med gating system för isolering av rhesus makaker celler potentiellt smittade av SIV. Sekventiella portar för att välja minne (CD95 +) CD4+ T celler visas från övre vänstra till nedre högra med varje befolkningen namn angivet. Procent av överordnat tomt som faller inom varje gate indikeras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Representativa experimentell validering av qPCR utförs på FACS-sorterade celler att begränsa utspädning med GAPDH städning genen för tre oberoende experiment: framgångsrik (vänster), suboptimal (mitten), och misslyckades (höger). Replikat av 10-100 celler per brunn bör sträcka sig över högst 2 Ets och 300 – 1000 cell brunnar inom 1 Et. Linjär regression lutningen bör vara 3.32 ± 0,3, R2 > 0,95. Misslyckandet med att uppnå dessa specifikationer anger tekniska svårigheter i steg 1, 2, 3, eller en kombination av dessa. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Single-cell kvantitativa viral och värd genuttryck i FACS-sorterade rhesus makaker CD4+ T-celler från mesenteriska lymfkörteln 10 dagar post-SIVmac251 infektion. (A) Viral genuttryck bivariate tomter av multiplicera-skarvas (tat/rev) och ensamma skarvas (env) SIV mRNA av enstaka celler (vänster). Tatrev+env– celler (ljus gröna celler längs x-axeln) Express färre kopior av tat/rev RNA än de env+ cellerna (Mörkgrön), konsekvent med en tidig skede av infektionen och före Rev protein-medierad stabilisering och kärnteknisk export av delvis skarvade vRNAs såsom env. Celler som inte uttrycker skarvade viral RNA skildras i grå (ingen viral RNA), brun (gag+ och LTR+) eller tan ( gag+ eller LTR+). Osplitsat (gag+) och totalt (LTR+) SIV mRNA uttryck visas för samma celler (höger). Hög förekomst av Osplitsat gag RNA i tat/rev+env+ celler är konsekvent med sena skede produktiv infektion under vilken uttrycks riklig genomisk RNA för förpackningar i spirande virioner. (B) Violin tomter av rhesus makaker gener differentially uttryckt i en delmängd av SIV-infekterade celler jämfört med icke-infekterade celler (grå). Statistisk analys utfördes enligt den tidigare20,22,23,24. Asterisken anger falsk upptäckten hastighet < 10% i kombinerade sannolikheten baserat test jämförelser i förhållande till icke-infekterade celler. Linjen ansluter medelvärden över cellgrupper för varje gen. Denna siffra har ändrats från Bolton et al. 20 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Representativ yta protein uttryck värdprofiler FACS-sorterade celler från rhesus makaker mesenteriska lymfkörteln 10 dagar post-SIVmac251 infektion. (A) spridningsdiagram visas av CD3, CD4 och ICOS ytan proteinuttryck i oinfekterade (grå), gag+tat rev.– (brun) och gag+tat rev.+ celler (grön). Fluorescensintensiteten plottas för varje cell (dot). Avvikare lådagram skildrar interkvartilintervall (IQR) och medianen (lådan), de mest borterst pekar inom 1,5 x IQR från de rutan (morrhår), och eventuella extremvärdena (frånkopplad Poäng). Horisontella staplar längst indikera signifikanta skillnader (p < 0,05, icke-parametriska Wilcoxon rank-test). (B) Bivariate och histogram visning av surface CD3 och CD4 proteinuttryck för celler som visas i (A). Dot tomt (vänster) anger procentandelar av varje cell befolkning inom en kvadrant. CD3 och CD4 histogram (mitten, höger) skildrar ytan protein nedreglering bland gag+tat rev.+ i förhållande till oinfekterade och gag+tat rev.– celler. (C), tolv representativa tat rev.+ enstaka celler från (A – B) visas över tre bivariate tomter för ytan uttryck av CD3/CD4 (vänster), CD69/CD38 (mitten) och ICOS/HLA-DR (höger). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7 : Trivariate tomt visning av encelliga viral genen (tat/varv), värd genen (CD3 eller CD4) och värd yta (CD3 eller CD4) proteinuttryck i SIV-infekterade minne CD4+ T celler från mesenteriska lymfkörteln 10 dagar post-SIVmac251 infektion. CD4 proteinuttryck (fluorescens) ritas mot CD4 mRNA (qPCR), medan mängden tat/varv uttryckt genom varje cell återspeglas av dot storlek. I tat/rev+ celler (grön), minskade ytan CD4 och CD3 proteinuttryck med ihållande CD4 och CD3 avskrifter, respektive, indikerar att den ytan proteinuttryck moduleras nedströms av genuttryck. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1: Grundfärger och sonder används för detektion av SIV nukleinsyror. När två sekvenser är indicerat för en primer eller sond, användes equimolar mängder båda sekvenserna. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Tabell 2: en 96-gen panel används för kvantitering av amplikoner på Biomark instrument. Fyra SIV analyser indikeras med blå bakgrund. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Tabell 3: Reaktionsblandning används för omvänd Transkription och före amplifiering. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Tabell 4: qPCR reaktionsblandning används för realtids-PCR utförs på ett Quant Studio 6 instrument. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Kompletterande kodning fil 1. Instruktioner för kvalificerade gen uttryck analyser. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Kompletterande kodning fil 2: Exempelmappning mall i JMP. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Kompletterande kodning fil 3: Probe karta mallen i JMP. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Kompletterande kodning fil 4: Primer analys skript för JMP. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Kompletterande kodning fil 5. Styckevis analys skript för JMP. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet beskrivs här, kallas tSCEPTRE, integrerar encelliga ytan protein kvantifiering av multiparametrar flödescytometri med kvantitativa encelliga mRNA uttryck av mycket multiplexade RT-qPCR. Unionen av dessa två tekniker möjliggör hög-innehåll ögonblicksbilder av den kombinerade transkriptionell och protein profil av enstaka celler i en hög genomströmning format. Vi använder metoden för att identifiera hittills svårfångade celler infekterade med SIV i vivooch beskriva Differentiellt uttryckta värd gener och proteiner. Protokollet kan anpassas för att studera någon cell befolkningen av intresse kan särskiljas genom uttrycken av surface proteinernas, mRNA eller en kombination därav. De beskrivna metoderna beroende korrekt encelliga sortering och dataregistrering av flödescytometri paras med kommersiellt tillgängliga qPCR reagens och multiplexed realtids PCR instrumentering. Utdata är känslig, kvantitativ bedömning av encelliga kombinerade protein och gen uttryck data.
Andra tillvägagångssätt som förbinder protein och gen uttryck i enstaka celler har varit beskrivs1,25,26,27. Indexerade FACS sortering följt av RNAseq, tillämpats korrekt karakterisering av hematopoetiska stamceller, representerar en särskilt lovande metod28. Men, medan RNAseq har flera fördelar jämfört med riktade gene expression analyser, nämligen opartisk full transkriptom analys, det är föremål för en högre multipla jämförelser statistiska kostnad och kan vara mindre känsliga för kvantifiering av låg kopia avskrifter. Dessutom är det inte för närvarande ekonomiskt möjligt att utföra RNAseq på tusentals celler på jakt efter sällsynta infekterade celler närvarande vid frekvenser < 1% (t.ex., HIV, SIV). Andra framväxande encelliga teknologier syftar till att generera en enda avläsning, dvs av FACS eller PCR, för detektion av både proteiner och nukleinsyror i samma cell. Dessa inkluderar påvisande av proteiner av fluorescerande antikroppar och mRNA av fluorescerande oligonukleotiden sonder följt av FACS analys (mRNA-flöde-fisk)14,15,29,30. Alternativt, proteiner kan upptäckas av par av antikropp-oligonukleotiden konjugat som upptäcks av qPCR parallellt med omvänt transkriberas mRNA31,32,33,34 . Dessa ”hybrid” synsätt ger samtidig nukleinsyra och protein mätningar med encelliga upplösning liknar tSCEPTRE, men de är begränsade eftersom de antingen inte kvantitativa (mRNA-flöde-fisk) eller kan kräva anpassade antikropp eller mRNA sonder. Vår metod för tSCEPTRE är kvantitativa för både protein och mRNA mätningar och alla reagenser som är kommersiellt tillgängliga, med undantag av patogen-specifika analyser.
Särskild uppmärksamhet bör tillämpas till flera steg i protokollet före analysen av experimentprover. Första, hög-parametern flödescytometri kräver noggrann optimering av en panel av fluorescerande antikroppar att säkerställa känslig detektion och resolution35. Varje antikropp bör titreras individuellt för att identifiera den koncentration som uppnår optimal separation och minimal bakgrundsfärgning, följt av bedömningen av färgning när alla antikropp konjugat används i kombination. Andra, Experimentell bestämning av lämpliga qPCR gen uttryck analysen att mäta varje gen av intresse är viktigt. Flera kommersiellt tillgängliga analyser finns vanligtvis tillgängliga för varje gen, men enligt vår erfarenhet, många är inte kvantitativ på de encelliga nivåerna6. Det är därför viktigt att kvalificera alla föreslagna analyser på seriellt spädas RNA före användning för kvantitativ genuttryck. Optimering av reagenserna är tidskrävande, men värdet av tillförlitliga paneler av antikroppar och gen uttryck analyser som möjliggör känslig detektion av alla molekyler av intresse motiverar investeringen i tid. Dessutom bör prioriteras till kommersiellt tillgängliga analyser innehållande sonder som spänner över exon-exon korsningar (designerat med suffixet ”m1”) att förbättra specificitet för mRNA, även om alternativa testmetoder kan upptäcka genomiskt DNA (suffixet ”s1” eller ”g1” ) anses osannolikt att påverka gen uttryck resultat på grund av motsvarande kromosomala kopior i varje cell. Bevarandet av RNA uppströms för RT är kritisk och uppnås genom att hålla prover kylda, som noterat i hela protokollet. Likaså varaktighet FACS sortering och intervallet mellan sortering och RT-preamp bör hållas till ett minimum. För både begränsande utspädning och encelliga sortering, kan cDNA först analyseras av konventionella qPCR att bedöma RNA återvinning av starkt uttryckt städning gener. Om det observerade uttrycket inte är enhetlig bland replikat av som cell nummer eller lutningen på den linjära passformen för att begränsa utspädningar misslyckas validering, bör felsökning utföras på cell sorterings- och nedströms förfaranden.
Potentiella begränsningar av den metod som beskrivs här är (1) upptäckt av DNA förutom RNA, särskilt för analyser inte specifika för mRNA splice korsningar, och (2) begränsat antal ytproteiner och gener mäts. DNA-identifiering är dock osannolikt att bidra avsevärt till differential värd gen uttryck analys av anledning som anges ovan. Dessutom vi direkt mätt i omfattning som DNA bidrar till qPCR signal i detta protokoll genom två metoder: en) exklusive omvänt transkriptas, och (b) ändra cellen lysis protokoll för att förbättra nukleära membranet lysis. I avsaknad av omvänt transkriptas, båda skarvas och Osplitsat virala gener upptäcktes fortfarande, men på betydligt lägre frekvens än i närvaro av omvänt transkriptas (~ 6-fold och 2-faldig minskningar, respektive)20. Därav, viral genen uttryck analyserna kan överskatta mängden viralt RNA finns i en cell på grund av cell-associerade virus-DNA. Vi tillskriver detta konstaterande cytoplasmiska RT produkter genereras under värd cell infektion, påvisats för både skarvade och Osplitsat SIV och HIV RNA med ursprung från inkommande virioner36. Således kan det vara tillrådligt att ägna en del av experiment till villkor saknas omvänt transkriptas för att kvantifiera DNA-derived mall för vissa program. Det bör också noteras att Osplitsat SIV och HIV RNA härrör från inkommande virus inte kan särskiljas från de novo syntetiseras viral RNA. Det andra vi ett kärnvapen lysis steg införlivas med RT-preamp protokollet och observerade en exponentiell ökning av integrerade SIV DNA (Alu-LTR) kopior (Figur S3 av Bolton o.a.) 20. genomiskt DNA är därför osannolikt att bidra avsevärt till mallen nukleinsyra som utvinns från cell lysis metoden som används här. Notera, kan tillägg av ett kärnvapen lysis steg vara användbar i framtiden encelliga studier syftar till att undersöka SIV eller andra virus DNA-positiva celler, inklusive latent infekterade celler.
Numrera av ytproteiner analyseras styrs av kapaciteten hos flöde flödescytometrisk cell Sorteraren. Nuvarande kommersiellt tillgängliga instrument överstiger inte 30 parametrar. Framtida studier anställa mer avancerade flödescytometri kommer att ytterligare bredda proteinet profilering anlagen av detta synsätt. Antalet utskrifter kan också utvidgas utöver 96, medföljande stödjande reagens (t.ex., primers högre koncentration), utrustning och instrument. Slutligen, ny enskild cell teknik som kombinerar analys av proteomet (masspektrometri), transkriptom (RNAseq), och arvsmassan (DNAseq) kommer att ersätta de målinriktade strategier för discovery research31,37, 38 , 39. dock riktade qPCR kommer sannolikt att förbli ett värdefullt verktyg för validering av sådana ”omics” tillvägagångssätt som en guld-standard för kvantitativa uttryck analyser.
Kombinerad analys av protein och transkription av tSCEPTRE är ett kraftfullt verktyg för att undersöka sällsynta eller svåra att identifiera celler som dessa härbärgerat patogener, som innehåller onkgener eller annars uppvisar en avvikande fenotyp. Nya markörer för transcriptionally aktiva SIV/HIV-infekterade celler kan identifieras i detta sätt, liksom upptäckten av nya mekanismer som är involverade i patogenesen av dessa virusinfektioner. Identifiering av latent infekterade celler kommer att kräva ytterligare utveckling av ett protokoll till åsnor virala DNA integrerat i värd genomet. Notera är frekvensen av HIV/SIV infekterade celler betydligt lägre i kronisk viremic eller behandlad infektion, som kommer att presentera en praktisk utmaning i att studera infekterade celler från dessa inställningar. Vår strategi lägger grunden för att bedöma en tidigare svårlösta mekanism: med post-transcriptional regleringen på enskild cell-nivå, och har bred tillämplighet på värd-patogen interaktioner samt mer allmänna cellulära processer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Detta arbete stöds av ett samarbetsavtal (W81XWH-07-2-0067) mellan Henry M. Jackson Foundation för den befordran av militär medicin, Inc., och US Department av Defense (DOD). De åsikter som framförs är författarnas och ska inte tolkas för att representera ståndpunkter av den amerikanska armén eller försvarsdepartementet. Forskningen genomfördes enligt en godkänd användning av djur-protokollet i en AAALACi ackrediterade anläggning i enlighet med djurskyddslagen, andra federala lagar och förordningar som avser djur och experiment med djur och följer principerna anges i guiden för skötsel och användning av försöksdjur, NRC publikation, 2011 upplagan.
Acknowledgments
Författarna vill tacka NIAID VRC Flow flödescytometri kärnan och MHRP Flow flödescytometri Core faciliteter för underhåll och drift av FACS instrument och sortering utrustning. Maria Montero, Vishakha Sharma, Kaimei Song för teknisk experthjälp; Michael Piatak, Jr. (död) för hjälp med SIV qPCR assay design; och Brandon Keele och Matthew Scarlotta för SIV isolera sekvenser. De åsikter som framförs är författarnas och ska inte tolkas för att representera ståndpunkter av den amerikanska armén eller försvarsdepartementet. Forskningen genomfördes enligt en godkänd användning av djur-protokollet i en AAALAC ackrediterade anläggning i enlighet med djurskyddslagen, andra federala lagar och förordningar som avser djur och experiment med djur och följer principerna anges i guiden för skötsel och användning av försöksdjur, NRC publikation, 2011 upplagan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNA extraction and PCR reagents and consumables |
|||
| Genemate 96-Well Semi-Skirted PCR Plate |
BioExpress/VWR |
T-3060-1 |
|
| Adhesive PCR Plate Seals |
ThermoFisher |
AB0558 |
|
| Armadillo 384-well PCR Plate |
ThermoFisher |
AB2384 |
|
| MicroAmp Optical Adhesive Film |
Applied Biosystems/ThermoFisher |
4311971 |
|
| DEPC Water |
Quality Biological |
351-068-101 |
|
| Glass Distilled Water |
Teknova |
W3345 |
|
| Superscript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit |
Invitrogen/ThermoFisher |
11732088 |
|
| SUPERase-In Rnase Inhibitor |
Invitrogen/ThermoFisher |
AM2696 |
|
| Platinum Taq |
Invitrogen/ThermoFisher |
10966034 |
|
| dNTP Mix |
Invitrogen/ThermoFisher |
18427088 |
|
| ROX Reference Dye (if separate from kit) |
Invitrogen/ThermoFisher |
12223012 |
|
| DNA Suspension Buffer |
Teknova |
T0223 |
|
| RNAqueous kit |
Invitrogen/ThermoFisher |
AM1931 |
|
| TaqMan gene expression assays not listed in Table 2 |
|||
| CD6 |
Applied Biosystems/ThermoFisher |
Hs00198752_m1 |
|
| TLR3 |
Applied Biosystems/ThermoFisher |
Hs1551078_m1 |
|
| Biomark reagents |
|||
| Control Line Fluid Kit |
Fluidigm |
89000021 |
|
| TaqMan Universal PCR Mix |
Applied Biosystems/ThermoFisher |
4304437 |
|
| Assay Loading Reagent |
Fluidigm |
85000736 |
|
| Sample Loading Reagent |
Fluidigm |
85000735 |
|
| Dynamic Array 96.96 (chip) |
Fluidigm |
BMK-M-96.96 |
|
| FACS reagents |
|||
| SPHERO COMPtrol Goat anti-mouse (lambda) |
Spherotech Inc. |
CMIgP-30-5H |
|
| CompBeads Anti-Mouse Ig,k |
BD Biosciences |
51-90-9001229 |
|
| 5 ml Polystyrene tube with strainer cap |
FALCON |
352235 |
|
| Aqua Live/Dead stain |
Invitrogen/ThermoFisher |
L34976 |
dilute 1:800 |
| Mouse Anti-Human CD3 BV650 clone SP34-2 |
BD Biosciences |
563916 |
dilute 1:40 |
| Mouse Anti-Human CD4 BV786 clone L200 |
BD Biosciences |
563914 |
dilute 1:20 |
| Mouse Anti-Human CD8 BUV496 clone RPA-T8 |
BD Biosciences |
564804 |
dilute 1:10 |
| Mouse Anti-Human CD28 BV711 clone CD28.2 |
Biolegend |
302948 |
dilute 1:20 |
| Mouse Anti-Human CD95 BUV737 clone DX2 |
BD Biosciences |
564710 |
dilute 1:10 |
| Mouse Anti-Human CD14 BV510 clone M5E2 |
Biolegend |
301842 |
dilute 1:83 |
| Mouse Anti-Human CD16 BV510 clone 3G8 |
Biolegend |
302048 |
dilute 1:167 |
| Mouse Anti-Human CD20 BV510 clone 2H7 |
Biolegend |
302340 |
dilute 1:37 |
| Anti-CD38-R PE clone OKT10 |
NHP reagent recource |
N/A |
dilute 1:100 |
| Mouse Anti-Human CD69 BUV395 clone FN50 |
BD Biosciences |
564364 |
dilute 1:10 |
| Mouse Anti-Human HLA-DR APC-H7 clone G46-6 |
BD Biosciences |
561358 |
dilute 1:20 |
| Mouse Anti-Human ICOS Alexa Fluor 700 clone C398.4A |
Biolegend |
313528 |
dilute 1:80 |
| Instruments |
|||
| BioPrptect Containment Enclosure |
Baker |
||
| BD FACS Aria |
BD Biosciences |
||
| ProtoFlex Dual 96-well PCR system |
Applied Biosystems/ThermoFisher |
4484076 |
|
| Quant Studio 6 qPCR instrument |
Applied Biosystems/ThermoFisher |
4485694 |
|
| IFC controller HX |
Fluidigm |
IFC-HX |
|
| Biomark HD |
Fluidigm |
BMKHD-BMKHD |
References
- Macaulay, I. C., Ponting, C. P., Voet, T. Single-Cell Multiomics: Multiple Measurements from Single Cells. Trends Genet. 33 (2), 155-168 (2017).
- Pasternak, A. O., Lukashov, V. V., Berkhout, B. Cell-associated HIV RNA: a dynamic biomarker of viral persistence. Retrovirology. 10, 41 (2013).
- Mailler, E., et al. The Life-Cycle of the HIV-1 Gag-RNA Complex. Viruses. 8 (9), (2016).
- Varmus, H. Retroviruses. Science. 240 (4858), 1427-1435 (1988).
- Frankel, A. D., Young, J. A. HIV-1: fifteen proteins and an RNA. Annu Rev Biochem. 67, 1-25 (1998).
- Dominguez, M. H., et al. Highly multiplexed quantitation of gene expression on single cells. J Immunol Methods. 391 (1-2), 133-145 (2013).
- Tokarev, A., Guatelli, J. Misdirection of membrane trafficking by HIV-1 Vpu and Nef: Keys to viral virulence and persistence. Cell Logist. 1 (3), 90-102 (2011).
- Malim, M. H., Bieniasz, P. D. HIV Restriction Factors and Mechanisms of Evasion. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (5), a006940 (2012).
- Sugden, S. M., Bego, M. G., Pham, T. N., Cohen, E. A. Remodeling of the Host Cell Plasma Membrane by HIV-1 Nef and Vpu: A Strategy to Ensure Viral Fitness and Persistence. Viruses. 8 (3), 67 (2016).
- Simon, V., Bloch, N., Landau, N. R. Intrinsic host restrictions to HIV-1 and mechanisms of viral escape. Nat Immunol. 16 (6), 546-553 (2015).
- Kirchhoff, F. Immune evasion and counteraction of restriction factors by HIV-1 and other primate lentiviruses. Cell Host Microbe. 8 (1), 55-67 (2010).
- Wigzell, H. Immunopathogenesis of HIV infection. J Acquir Immune Defic Syndr. 1 (6), 559-565 (1988).
- Reynolds, M. R., et al. Ex vivo analysis of SIV-infected cells by flow cytometry. Cytometry A. 77 (11), 1059-1066 (2010).
- Baxter, A. E., et al. Single-Cell Characterization of Viral Translation-Competent Reservoirs in HIV-Infected Individuals. Cell Host Microbe. 20 (3), 368-380 (2016).
- Grau-Exposito, J., et al. A Novel Single-Cell FISH-Flow Assay Identifies Effector Memory CD4+ T cells as a Major Niche for HIV-1 Transcription in HIV-Infected Patients. MBio. 8 (4), (2017).
- Eriksson, S., et al. Comparative analysis of measures of viral reservoirs in HIV-1 eradication studies. PLoS Pathog. 9 (2), e1003174 (2013).
- Finzi, D., et al. Identification of a reservoir for HIV-1 in patients on highly active antiretroviral therapy. Science. 278 (5341), 1295-1300 (1997).
- Chomont, N., et al. HIV reservoir size and persistence are driven by T cell survival and homeostatic proliferation. Nat Med. 15 (8), 893-900 (2009).
- DeMaster, L. K., et al. A Subset of CD4/CD8 Double-Negative T Cells Expresses HIV Proteins in Patients on Antiretroviral Therapy. J Virol. 90 (5), 2165-2179 (2015).
- Bolton, D. L., et al. Combined single-cell quantitation of host and SIV genes and proteins ex vivo reveals host-pathogen interactions in individual cells. PLoS Pathog. 13 (6), e1006445 (2017).
- Quintans, J., Lefkovits, I. Precursor cells specific to sheep red cells in nude mice. Estimation of frequency in the microculture system. Eur J Immunol. 3 (7), 392-397 (1973).
- Finak, G., et al. MAST: a flexible statistical framework for assessing transcriptional changes and characterizing heterogeneity in single-cell RNA sequencing data. Genome Biol. 16, 278 (2015).
- McDavid, A., et al. Modeling bi-modality improves characterization of cell cycle on gene expression in single cells. PLoS Comput Biol. 10 (7), e1003696 (2014).
- McDavid, A., Finak, G., Gottardo, R. The contribution of cell cycle to heterogeneity in single-cell RNA-seq data. Nat Biotechnol. 34 (6), 591-593 (2016).
- Kok, Y. L., Ciuffi, A., Metzner, K. J. Unravelling HIV-1 Latency, One Cell at a Time. Trends Microbiol. , (2017).
- Rato, S., Golumbeanu, M., Telenti, A., Ciuffi, A. Exploring viral infection using single-cell sequencing. Virus Res. 239, 55-68 (2017).
- Wagner, A., Regev, A., Yosef, N. Revealing the vectors of cellular identity with single-cell genomics. Nat Biotechnol. 34 (11), 1145-1160 (2016).
- Nestorowa, S., et al. A single-cell resolution map of mouse hematopoietic stem and progenitor cell differentiation. Blood. 128 (8), e20-e31 (2016).
- Soh, K. T., et al. Simultaneous, Single-Cell Measurement of Messenger RNA, Cell Surface Proteins, and Intracellular Proteins. Curr Protoc Cytom. 75, 41-47 (2016).
- Kochan, J., Wawro, M., Kasza, A. Simultaneous detection of mRNA and protein in single cells using immunofluorescence-combined single-molecule RNA FISH. Biotechniques. 59 (4), 209-212 (2015).
- Stahlberg, A., Thomsen, C., Ruff, D., Aman, P. Quantitative PCR analysis of DNA, RNAs, and proteins in the same single cell. Clin Chem. 58 (12), 1682-1691 (2012).
- Assarsson, E., et al. Homogenous 96-plex PEA immunoassay exhibiting high sensitivity, specificity, and excellent scalability. PLoS One. 9 (4), e95192 (2014).
- Fredriksson, S., et al. Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays. Nat Biotechnol. 20 (5), 473-477 (2002).
- Genshaft, A. S., et al. targeted profiling of single-cell proteomes and transcriptomes in a single reaction. Genome Biol. 17 (1), 188 (2016).
- Mahnke, Y. D., Roederer, M. Optimizing a multicolor immunophenotyping assay. Clin Lab Med. 27 (3), 469-485 (2007).
- Liang, C., Hu, J., Russell, R. S., Kameoka, M., Wainberg, M. A. Spliced human immunodeficiency virus type 1 RNA is reverse transcribed into cDNA within infected cells. AIDS Res Hum Retroviruses. 20 (2), 203-211 (2004).
- Stegle, O., Teichmann, S. A., Marioni, J. C. Computational and analytical challenges in single-cell transcriptomics. Nat Rev Genet. 16 (3), 133-145 (2015).
- Wu, M., Singh, A. K. Single-cell protein analysis. Curr Opin Biotechnol. 23 (1), 83-88 (2012).
- Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications. Genome Med. 9 (1), 75 (2017).
