Summary
描述的方法, 以定量的表达96基因和18表面蛋白的单细胞前体, 允许鉴定差异表达基因和蛋白质的病毒感染细胞相对未感染的细胞。我们采用这种方法来研究与恒河猴分离的 SIV 感染的 CD4+ T 细胞。
Abstract
单细胞分析是解剖细胞异质种群的重要工具。稀有细胞的鉴别和分离可能是困难的。为克服这一挑战, 开发了一种结合指数流式细胞仪和高通量多路聚合酶链反应 (qPCR) 的方法。目的是确定和鉴定猕猴体内存在的猿猴免疫机能丧失病毒 (SIV) 感染细胞。通过荧光活化细胞分选 (qPCR) 和 mRNA 对表面蛋白进行定量测定, 通过病毒基因表达识别病毒感染细胞, 并与宿主基因和蛋白质测量相结合, 创建多维剖面图。.我们的方法, 目标单细胞 Proteo 转录评价, 或 tSCEPTRE。为了执行该方法, 活细胞被染色的荧光抗体特定的表面标记用于外地的细胞子集和/或下游表型分析隔离。单细胞排序后, 立即裂解, 多重反转转录 (RT), PCR 预扩, 高通量 qPCR 高达96成绩单。在分类时记录了这些测量结果, 然后通过良好的位置与基因表达数据联系在一起, 形成了蛋白质和转录剖面的组合。通过对多种病毒 RNA 种类的qPCR 检测, 对细胞进行直接的体外研究。病毒转录和数量的结合提供了一个框架, 将细胞划分为病毒生命周期的不同阶段 (例如, 生产性与非生产性)。此外, 将 SIV+细胞的 tSCEPTRE 与同标本分离的未感染细胞进行比较, 以评估差异表达的宿主基因和蛋白质。分析表明, 以前不赏识病毒 RNA 表达的异质性之间的感染细胞, 以及体内SIV 介导的转录后基因调节与单细胞分辨率。tSCEPTRE 方法适用于通过表达表面蛋白标记, 宿主或病原体基因, 或其组合, 对任何能够识别的细胞群体进行分析。
Introduction
许多胞内病原体依赖宿主细胞机械进行复制, 经常改变宿主细胞生物学, 或针对宿主细胞的非常特定的亚群, 以最大限度地提高它们的传播几率。因此, 细胞生物学过程通常被打乱, 对宿主的整体健康造成有害影响。了解病毒与它们复制的宿主细胞之间的相互作用将阐明可能有助于发展改进的治疗方法和预防感染的策略的疾病机制。能够研究寄主-病原体相互作用的直接分析工具对这一目的至关重要。单细胞分析提供了唯一的方法, 明确地将细胞表型归因于特定基因型, 或感染状态1。例如, 病原体感染经常引起宿主细胞的直接和间接变化。因此, 区分受感染细胞与未感染的对应者是必要的, 将宿主细胞的变化归因于直接感染或次生效应, 如广泛性炎症。此外, 对许多病原体, 如 SIV 和人体免疫机能丧失病毒 (HIV), 宿主细胞感染通过多个阶段, 如早期, 晚期, 或潜伏, 其中每一个可能的特点是不同的基因和蛋白表达谱2,3,4,5. 对细胞混合物的大量分析将无法捕获这种异质性6。相比之下, 高度复用的单细胞分析能够量化病毒和宿主基因的表达, 提供了一种方法来解决感染特定的细胞扰动, 包括跨感染阶段的变化。此外, 分析宿主-病原体在生理相关设置中的相互作用对于鉴定发生在受感染生物体中的事件至关重要。因此, 可以直接应用于体内的方法很可能在体内过程中获得最佳的捕获。
SIV 和 HIV 靶 CD4+ T 细胞, 他们抵消宿主抗病毒 "限制" 因素和 downregulate 抗原提出分子, 以建立生产性感染和避免免疫监测7,8, 9,10,11。如果没有治疗, 感染会导致 CD4 和 T 细胞的大量损失, 最终达到后天免疫机能丧失综合症 (艾滋病)12的高潮。在抗逆转录病毒治疗的设置中, 潜伏感染的细胞库持续了数十年, 给治疗策略带来了巨大的障碍。了解体内艾滋病毒/SIV 感染细胞的性质, 有可能揭示宿主细胞的功能在发病机制和持久性。然而, 这是非常有挑战性的, 主要是由于感染细胞的频率低和缺乏试剂能够轻易辨认出来。转录病毒 RNA 的细胞, 估计是存在于血液和淋巴组织的 CD4+ T 细胞的 0.01–1%13,14,15。在压制疗法下, 潜伏感染细胞在 10-3–10-7 16,17,18, 更不频繁。用于研究体外感染的病毒蛋白染色方法, 例如胞内封堵, 由于0.01–0.1% 的背景染色, 类似或大于感染细胞13的频率, 是次优, 14。使用具有良好特征的 SIV/HIV 病毒特定单克隆抗体的表面染色也被证明是困难的, 可能是出于类似的原因。最近, 新的工具的目的是改善检测的细胞表达的插科打诨, 要么纳入特定的化验方法, 或使用替代成像技术14,15,19。然而, 这些方法在对每个细胞进行的定量测量数量上仍然有限。
在这里, 我们描述了 (1) 通过敏感和特异的病毒基因定量 qPCR 识别单个病毒感染细胞的方法, (2) 量化了多达18种表面蛋白和96个基因的表达, 每个感染者 (和未感染) 细胞。这种方法结合了单细胞表面蛋白的测量, 其次是立即细胞裂解和基因表达分析使用多路定向 qPCR Biomark 系统。集成的射流电路 (IFC) 技术允许96个基因的多重定量从96个样品同时, 完成由9216个室的矩阵, 其中个体 qPCR 反应被执行。活细胞转录的分类记录高含量的蛋白质丰度测量, 同时保留整个进行分析后立即进行下游。为了识别受病毒感染的细胞, 在 qPCR 分析中包括了用于交替拼接和 unspliced 病毒 rna (vRNA) 的特定化验, 连同一组用户定义的化验, 总计多达96个基因, 目前所容纳的最大化验数量国际金融公司。为每个细胞收集的基因表达和蛋白质信息是由良好的位置联系在一起的。我们以前在别处报告了这一分析结果20。在这里, 我们提供更详细的方法学指导和进一步描述分型的 SIV 感染 CD4+ T 细胞。
这种方法, 我们的期限 tSCEPTRE, 可以适用于任何可行的细胞群体的悬浮反应荧光标记抗体和表达转录兼容可用 qPCR 化验。例如, 它可以用来表征在稀有细胞中的差异基因和蛋白质表达, 而不容易与表面蛋白标记区分的细胞。样品准备依赖于标准染色协议使用商业上可用的抗体。具有单细胞分拣能力的 Cytometers 也可以在商业上获得, 但是处理传染性活细胞需要额外的生物安全预防措施。通过井位记录每个单元格的单细胞蛋白表达谱, 此处称为索引排序, 是商业上可使用的流式程序排序软件的一个常见特征。在感兴趣的细胞群中差异表达宿主基因的计算分析这里没有描述, 但参考被提供给以前发布的方法。
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Protocol
注意: 协议工作流的示意图如图 1所示。它由三个主要步骤组成: qPCR、RT 和 cDNA 预扩, 同时可同时为多达96种基因提供。在步骤5和步骤6中, 分别详细描述了两个版本的协议, 对单元格进行限制稀释和对单个单元格进行排序。这些策略针对不同的研究问题, 但遵循类似的程序。
1. 先决条件或以前的分析
- 验证所有的基因表达化验, 如前所述6。
注意: 这一步是在实验日期之前做好的。验证所有的化验, 商业和风俗, 是需要确保有效和线性放大相关 RNA 下到单细胞水平。许多商业上可用的和定制的化验无法满足这些规格。在补充编码文件 1–5中提供了多达96种基因的同时表达式检测的处理和自动曲线拟合, 但可以使用 R2和线性拟合的斜率来限定单个检测。典型的成功和失败的化验鉴定图如图表 2所示。 -
开发一个流细胞的抗体面板染色细胞表面标记的兴趣。
- 滴定抗体通过染色相关样本, 如恒河外周血单个核细胞 (PBMCs), 每种抗体。从20µL 抗体每测试100µL 染色反应, 并创建八双倍串行稀释。确定最大染色强度的最佳浓度, 同时保持阴性和阳性人群之间的清晰分离。
- 使用所有抗体混合在步进1.2.1 中确定的最佳浓度, 评估附加细胞样本的联合染色。确保染色类似于个别抗体污渍所观察到的。如果染色小于任何抗体被隔离使用时所观察到的, 请考虑替代 fluorochrome 共轭物替代这种抗体。
2. 基因表达测定制剂
- 将96基因表达式的检测组合成一个 RNase/DNase 的1–15毫升管 (大小可能与排序板的数量不同)。本研究中使用的化验小组列于表 1和表 2。所产生的材料称为 "化验组合"。将每种化验添加到最终浓度为 180 nM 的前向和反向底漆。添加 DNA 悬浮缓冲器, 以达到适当稀释的化验组合。
注: 出于实际目的, 自定义 (用户生成的) 化验储存可在18µM, 以符合商业上可用的 "20x" 基因表达 qPCR 化验 (材料表) 的浓度。18µM 混合自定义正向和反向底漆为每个基因是由库存解决方案在 DNA 悬浮缓冲。商业可用的化验 (材料表) 也包括探针, 但探针是不需要的 RT 或 cDNA 预放大, 因此可以省略为自定义化验。建议包括一个或多个管家基因, 用于质量控制, 以评估排序, 细胞恢复和 cDNA 合成的效率。使用随机引物生成 cDNA 还没有确定, 但预期比基因特异性底漆效率低。 - 准备在步骤 7.1 (多路 qPCR) 使用的2x 检测板。为每 96 x 96 芯片阵列预期, 吸管6µL 每个化验入每个指定的井96井 PCR 板材。例如, 对于5芯片, 每种检测的30µL 将占据96井板中的单个井。如果使用96化验, 96 井板的每一个井将包含化验。用胶粘剂密封密封板。
注意: 理想情况下, 步骤2.1 和2.2 同时执行, 以避免多种冻融循环用于基因表达测定。化验盘内的所有基因也必须存在于化验组合中 (步骤 2.1)。化验组合和化验盘均可贮存于-20 摄氏度或4摄氏度, 供长期或短期使用。
3. 表面染色活细胞
注: 细胞内染色、通透和固定与此方法不相容, 因为它们会损害 RNA。
- 通过将材料表中列出的每种抗体添加到40µL 的补偿珠, 在2.5 倍高浓度比用于细胞染色时, 制备补偿样品。孵育20分钟, 在25摄氏度保护免受光照。添加3毫升 PBS 到珠和离心机在 500 x g 3 分钟在25°c。吸入 pbs 和并用重悬300µL 的 pbs 珠子。
- 为样品处理准备流动细胞细胞分拣器: 获取补偿管, 创建补偿矩阵, 并将矩阵应用于实验样品的采集文件。
- 结合材料表中指定的每种抗体的适当体积, 准备荧光抗体鸡尾酒的总组合, 在1.5 毫升琥珀色管中, 所有样品都要染色。涡流和离心机的鸡尾酒在 2.1万 x g 2 分钟在25°c, 以颗粒的抗体聚集。
注: 此处使用的抗体列在材料表中。 - 在37摄氏度的水浴中解冻冷冻细胞2分钟. 将细胞悬浮液的0.5–2毫升添加到12毫升的 PBS 中, 在15毫升管中, 离心机在 500 x g处3摄氏度, 并吸入 PBS。并用重悬3毫升的 PBS 和转移到一个5毫升聚苯乙烯管。离心机, 并吸入 pbs, 留下20µL 残余 PBS。
注: 染色温度可根据特定应用所需的温升或较冷温度进行调整, 相应地修改抗体滴定染色条件 (见步骤 1.2)。 - 并用重悬 2 x 107洗涤细胞在80µL 抗体鸡尾酒和孵化为20分钟在25°c 保护免受光。对于超过 2 x 107细胞的样品, 应相应增加染色反应量, 以维持 < 2 x 107 cells/100 µL。
- 通过增加3毫升 PBS, 离心 500 x g 3 分钟, 并吸上清液来冲洗细胞。
- 彻底并用重悬300–500µL 中的细胞和吹打通过一个35µm 尼龙细胞过滤器帽筛选。保持细胞在冰上, 并保护光, 直到排序。
4. 准备细胞采集板, 进行操作的分类, 并生成 cDNA
- 将 RT-功放反应组合组分 (表 3) 通过吹打成单 RNAse/DNAse 无菌管。
注意: 此步骤可在步骤3的染色前或期间进行。在这里可以省略 RT 酶, 以确定 DNA 模板对 qPCR 信号的贡献。 - 使用多通道吸管将10µL 的 RT 功放反应混合到所需数量的96井 PCR 排序收集板。用胶膜封住板材, 并将板材放在预冷的96井铝块上。
- 通过从染色样品的大约2万个细胞中获取数据, 建立流式细胞仪的单元分类浇注方案。确保将补偿矩阵应用于所收集的数据。绘制门并定义用于识别用于基因表达分析的需要隔离的细胞群的浇口树。
注: 用于收集潜在的 SIV vRNA+单元格的浇口树如图 3所示。 - 输入适当的仪器设置, 以指定要对每个井进行排序的单元格的数目和子集。在步骤5和6中分别提供了用于对限定细胞稀释系列或单个细胞进行排序的附加详细说明。
- 将细胞分类成准备好的 96-井 PCR 收集板。在分拣前先取下粘合剂密封, 再用新的密封件替换。
注: 在预冷的铝块上保持板材在任何时候, 包括在排序期间。 - 紧接着排序, 漩涡并且离心机收集板材在 2000 x g为1分钟在4°c。
- Thermocycle 在一台 PCR 机中用预热盖子使用以下条件:50 °c 为15分钟 (RT), 95 °c 为 2 min, 跟随18个周期95°c 为十五年代和60°c 为4分钟 (预放大)。
- 将 5 ul 的 cdna 转移到20µL 的 DNA 悬浮缓冲液中, 将 cdna 1:5 稀释为新的96井 PCR 板。稀释后的 cDNA 可在此时无限期贮存在4摄氏度或-20 摄氏度。该 cDNA 现在已经准备好用作 qPCR 的模板 (步骤 5.2, 7.4)。
注: 这种稀释可确保功放反应中的底漆不利于下游 qPCR。
5. 变体 A: 将单元格分类为限定稀释系列, 以确定 vRNA+细胞的频率或进行实验性质量控制
注意: 在执行单单元格排序之前, 通过将单元格排序为复制中的串行稀释, 可以确定感兴趣的单元格的频率。此步骤还为排序效率、细胞裂解、RNA 恢复和 cDNA 合成提供了有价值的质量控制, 如步骤5.3 所述。事先确定 vRNA+细胞频率允许更准确地估计的单细胞数量必须排序, 以达到足够的样本大小, 适当的动力 vRNA+细胞基因表达分析。
- 4.1–4.2 将单元格分类成在步骤中准备的96井板, 并在多个复制中收集1–1,000 细胞。
注: 每个细胞稀释后的复制井数量通常与每个井的细胞浓度成反比。当受感染的细胞频率远远低于 1%, 细胞稀释应关注100–1,000 细胞每井。如图 1所示, 一个示例排序板块图, 左上。由于反应量的增加和对下游 cDNA 合成和定量的干扰, 应避免超过1000个细胞。 - 在表 4中结合主混合解决方案中的 qPCR 试剂。对于25µL 反应量, 22.5 µL 的主混和2.5 µL 的稀释 cDNA 模板从步骤3.9。使用标准循环条件执行 qPCR (例如, 94 °c 为5分钟, 后跟40个周期94°c 为十五年代和60°c 为1分钟)。
注: Singleplex qPCR 反应使用传统的实时 qPCR 仪器被推荐作为经济的初步分析的一个或几个化验, 以证明有效的细胞分类, RNA 恢复和 cDNA 合成。它也可以用来计算 vRNA+细胞的频率。使用 Biomark 的多重 qPCR 反应通常更适合于大规模的单细胞分析。 - 对于质量控制, 绘制 et 值 (et = ct最大− ct) 与在10尺度上按井排序的单元数, 并应用线性回归分析。
注意: 一致的复制, 线性回归斜率 3.3 (0.3), R2 > 0.9 表明了一个有效的实验。最佳和次优排序的例子, RT 功放实验如图 4所示。 - 要确定 vRNA+单元格的频率, 请在 x 轴 (日志10刻度) 和 vRNA 的每一个单元格的 y 轴上的稀释度中, 绘制每个井的单元格数。有关示例, 请参见图 1 (左下, 泊松分布)。将线性回归模型应用于数据, 以确定平均一个正单元格的单元数, 对应于63.2% 的井正 (0.632 在 y 轴)21。将此单元格稀释数 (x 轴截距) 转换为以百分比表示的频率。例如, 每48个单元格中的一个 vRNA+单元格等效于2.1% 的频率。
6. 变异 B: 单细胞分析的分类细胞
- 按照步骤 4.1–4.8, 并指定一个单元格排序每井使用流式细胞仪的索引排序功能, 以创建每个单元格的每个 FCS 文件排序, 由良好的位置映射。
注: 如果分类收集板的数量超过可用 thermocyclers 的数量, 则可以在逆转录酶失活步骤 (95 °c 为2分钟) 后停止循环, 并且 cDNA 可以存储在4摄氏度, 直到 thermocyclers 可用。在这种情况下, 在十五年代第一个周期95摄氏度开始预放大。 - 可选: 创建 cdna "池", 由用户定义的批次单细胞的 cdna, 用残留的未稀释的 cDNA 筛查稀有的感兴趣的细胞。用多通道吸管将未稀释的单细胞预扩 cDNA 转移2µL 到新的96井板中。重复通过吹打2µL 的 cDNA 从所有额外的单一细胞的指定池进入相同的井。筛选感兴趣基因 (如vRNA) 的 cDNA 池, 以确定那些使用常规 qPCR 的阳性细胞。由于池只需要一个小整除的 cdna 从每个细胞, 其余的8µL 的 cdna 仍可用于单细胞分析。
注意: 建议在进行单细胞基因表达分析之前, 采用聚集策略, 以减少资源密集型多重 qPCR 所审问的单个细胞数量。这是适当的情况下, 细胞的利益 (例如, SIV mRNA +) 可以识别的初步单丛 qPCR 检测。直接的高通量策略可以创建 cdna 池, 包括将2µL 的未稀释 cDNA 与集合排序板块的行 (即a 行中的所有12个单元格) 或列 (即1 列中的所有8个单元) 相结合, 变成一个新板块中的单个井。要确定最佳池策略, 请考虑步骤5.4 中感兴趣的单元格的预期频率。例如, 如果预计10% 的细胞是阳性的, 则由六个单细胞 cDNA 样本组成的池通常是阴性的, 因此, 在该池中所代表的细胞可以排除在下游单细胞分析中。
7. Biomark 平台上的多路 qPCR
注意: 本节可以遵循上面描述的 A 或 B 的版本。在本文所描述的研究中, 它完全适用于单细胞分析。
- 用吹打4µL 测定板 (在步骤2.2 中制备) 的方法, 将 qPCR 测定板制备成一个新的96井 PCR 板, 其中含有4µL 的测定试剂。将化验盘保持在摄氏4摄氏度。
注: 检测板稳定在4摄氏度, 长达一周, 在-20 °c 一个月。因此, 为多个芯片准备足够的材料和适当的存储可能是有用的。 - 将控制线液从启动注射器中分配到芯片的两个进气阀中。从盘子下面取下保护塑料。将芯片放在国际金融公司控制器上, A1 位置有缺口侧。从主菜单中, 选择 "质数" 脚本。运行脚本。
- 通过将50µL 的样品装药试剂与500µL 的 PCR 总配比 (材料表) 混合, 对每个微流控芯片进行实时反应组合的制备。吸管4.4 µL 入一个新的96井 PCR 板材的每个井, 以后被选定作为 "样品板材"。
- 吸管3.6 µL 1:5 稀释 cDNA 从步骤4.8 到样本板包含实时反应组合。
注: 如果在步骤6.2 中讨论了用于下游分析的罕见 (例如, vRNA+) 细胞的 PCR 下选择, 则只包括在正池中表示的单元格。 - 在芯片启动完成后, 通过将检测板上的5µL 从该芯片的缺口 (检测) 端到相应的井中, 并将5µL 从样品板插入芯片的其它 (样品) 侧的相应井中, 加载芯片入口。将芯片插入 IFC 控制器并运行 "负载组合" 脚本。
- 将芯片转移到 Biomark 平台执行复用 qPCR。按照实时 pcr 分析软件提供的分步指导和使用基因表达 (GE) 96.96 标准 v 1 协议40周期 pcr 技术, 进行仪器设置和 qPCR 编程。将 ChipRun 文件保存在指定的文件夹中。
注: 多个芯片可能每天运行多天。 - 分析 qPCR 数据。
- 打开实时 PCR 分析软件。从 "文件" 中打开 "ChipRun bml" 文件 |打开 "菜单。
- 在软件窗口的左上角找到 "芯片资源管理器" 和 "芯片运行摘要"。确定芯片运行摘要的三组件: 分析视图、示例设置和检测器设置。
- 点击 "探测器设置"。在 "任务" 下, 单击 "新建" 并选择容器类型 "SBS 板", 以及容器格式 "SBS96"。在 "映射" 旁边, 单击 "..." 按钮, 然后选择 "M96-检测-SBS96. dsp"。
- 可选: 通过双击 1st井, 在每个井的 "名称" 部分分配每个检测器 (检测) 一个数字或名称。按 "F2" 移动到下一井。
- 单击 "示例设置"。在 "映射" 旁边的 "任务" 下, 单击... 按钮, 然后选择 "M96-SBS96. dsp"。
- 点击 "分析视图"。在 "qPCR" 选项卡的 "任务" 下, 选择 "线性 (导数) 的基线校正" 和 "用户 (探测器) 的 Ct 阈值方法"。在 "Ct 阈值" 选项卡中, 检查 "使用自动框初始化"。单击上面的 "分析" 按钮。
- 在 "分析视图" 的右上象限, 单击第二个选项卡 "结果表"。从下拉菜单中, 选择 "热图视图"。将显示带有数据的热图。
- 可选: 为了确保在芯片上均匀的火箭荧光, 选择 "图像视图" 而不是从同一菜单中的 "热图视图"。在第二个从右边的窗口上方的热图, 选择 "火箭"。在第一个从右窗口中, 选择一个1–40周期。点击第四从右窗口切换到黑白显示火箭荧光。将出现一个图像, 通知芯片上的飞溅、粒子或缺陷。如果火箭的均匀性被严重遮蔽, 重新运行芯片。
- 在热图下, 单击 "阈值" 和 "日志图"。通过单击测试 (热图的列) 并根据需要拖动阈值以在指数相位相交放大曲线, 手动调整每个检测器的 Ct 阈值。完成后, 单击 "分析"。
- 将 qPCR 数据导出为. csv 文件。将数据导入电子表格或统计分析软件 (例如, 选配), 并根据芯片上的样本和检测位置绘制结果图。通过创建新的列并使用条件公式, 将单元格组织为基于病毒基因表达式的组。在 "分析" 下, 选择 "适合 Y X", 并绘制基因表达式与组。应用统计分析。
注:图 5A中的二元地块描述了四种 SIV RNA 的代表性单细胞定量表达。在 SIV RNA+细胞中的定量宿主基因表达如图 5B所示。 - 从单细胞流化物数据中提取定量蛋白质表达值。
- 使用 FlowJo 版本9打开与96井板相对应的 "资产管制" 分类 (步骤 6.1) 中的. fcs 文件。突出显示文件名后, 选择 "平台 |事件号门 |创建索引排序门 "。单个单元格将显示为行。
- 突出显示所有96个单元格 (非行) 并选择 "工作区 |出口 |选择所有补偿 fluors "。在 "数据类型" 下, 选择 "FCS 文件", 单击 "导出", 然后选择指定的文件夹。
- 将新的. fcs 文件拖动到新的 FlowJo 工作区中。突出显示所有单元格, 单击 "添加统计信息" (左上角的 "Σ" 按钮) |意思 |所有流体参数 "。
- 通过单击左上角左侧的第四个按钮打开 "表编辑器"。突出显示第一个单元格的所有荧光灯并将其拖到 "表编辑器" 窗口中。在 "表编辑器" 窗口中, 单击 "创建和查看表" 顶部的同一按钮。这将为每个流体创建一个96个单元格和一个数值参数表。
- 通过复制/粘贴或单击 "保存和启动应用程序" (第四从表上方的左侧按钮) 将输出复制到数据库软件中 (如Excel、选配)。
注意: 此过程特定于 FlowJo 版本9。FlowJo 版本10使用不同的过程导入索引数据。索引流数据也可以直接从由单元格排序器创建的. csv 文件复制/粘贴到选配中。
- 根据车牌号和井位, 合并单单元的 qPCR 数据和数据。对联合单细胞基因 (qPCR) 和蛋白质表达 (资产管制) 数据进行图形和统计分析。
注: 如图 6所示, 单细胞联合 qPCR 和流化因子数据的例子 (用于 SIV 病毒感染、拼接 vRNA+恒河猴细胞的宿主表面蛋白表达谱),图 7 (CD4基因表达与表面CD4 蛋白表达在拼接 vRNA+恒河猴细胞), 并曾发表20。为确定细胞群体中差异表达基因的兴趣, 建议使用以前描述的单细胞分析方法20,22,23,24, 其中占基因阳性细胞的比例以及持续基因表达值。
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Representative Results
图 1描述了整个协议的工作流。它由被排序的单元数定义的两个变体: 限制稀释或作为单个单元格, 如文本中所述。如图 2所示, 2 倍串行 RNA 稀释的引物探针鉴定分析的例子。图 3显示了用于识别潜在的 SIV+单元格的浇口策略。如图 4所示, 一个成功的、次优和失败的质量控制 qPCR, 用于在限制稀释中的GAPDH分类细胞的管家基因。图 5显示了在感染细胞中差异表达的四种 SIV RNA 和恒河猴基因的单细胞定量表达。具有代表性的二元、直方图和 scatterplots 描述了在图 6中用流式细胞仪测量的 SIV RNA+ CD4+ T 细胞的表面蛋白表达谱。三元气泡图 (图 7) 显示了表面 CD3 或 CD4 蛋白、 CD3或CD4 mRNA 之间的关系, 以及在单个细胞中的数量病毒基因 (达/转)表达。
图 1: 实验工作流示意图说明了三主要成分: 流细胞排序, 反向转录加上 PCR 的 cDNA 预扩 (RT, 前置放大器) 和 qPCR.排序可以作为一个限制稀释 (a, 绿色背景) 或作为单个单元 (B, 橙色背景) 执行。紧接着, 细胞裂解, RNA 被反向转录为 cDNA 和预放大 (RT, 前置放大器 PCR), 以准备 qPCR 模板。限制稀释排序通过泊松分布统计, 以及实验效率和样品恢复, 确定病毒 RNA 阳性细胞的频率。绿箭头表明, 每井的估计细胞数, 其中包含一个细胞阳性的病毒基因 (对应于63.2% 的概率, 这种水井是基因阳性), 转换成细胞频率。频率估计可用于通知在后续排序 (B) 中收集的单个单元格的数量。索引的单单元的流式计算方法将每一个单元格存入一个细胞, 并为每个单元格生成数据文件, 并在96井板内的位置标注。单细胞 qPCR 在96基因同时进行多重复用。结合表面蛋白和 mRNA 表达允许对单个细胞 (右列) 进行分析。一种可选的病毒基因 qPCR 可在预扩 PCR 和多路 qPCR (B、中) 之间进行, 以筛单细胞或单细胞 cDNA 池, 用于下选择病毒 RNA+细胞或池进行多重 qPCR 分析。热图说明了96项化验 (柱) 和96个单细胞 (行) 的基因表达 (Ct 值)。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2:来自入门资格实验的代表 qPCR 数据显示成功 (左和中) 和失败 (正确) 商业上可用的化验 (CD6, SIV达/修订, 和 TLR3,分别).对于CD6和TLR3, RNA 是从 106的的猕猴 PBMC CD4+ T 细胞使用商业套件提取。八复制十二点 rna 二倍稀释系列 (0.023-48 ng rna, 对应于1.2–2,400 细胞等值假设 20 pg rna 每 CD4+ T 细胞) 被接受了 RT-功放和 qPCR。对于 SIV 的 PBMCs, 从体外感染 SIVmac239 的恒河猴中提取 RNA。rna 稀释在6–12,000 细胞的 rna 等价物中制备。Et (40-Ct) 值, 随着基因表达的增加, 绘制与估计的细胞数。稀释系列展示 R2 > 0.97 和倾斜3.32 ±0.3 表明成功的底漆资格。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3:二元流控地块与浇口方案分离的恒河猴细胞可能感染的 SIV.选择内存的顺序门 (CD95+) CD4+ T 细胞显示从左上至下右, 每个填充名表示。显示在每个门内的父绘图的百分比。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 具有代表性的实验验证 qPCR 在限制稀释使用中的应用GAPDH三项独立实验的家政基因: 成功 (左), 次优 (中), 失败 (右).每井10-100 个细胞的复制不超过2个 Ets, 并且在 1 Et 内300–1,000 细胞井。线性回归斜率应为 3.32 0.3, R2 > 0.95。未能达到这些规格表明步骤1、2、3或其组合中的技术困难。请单击此处查看此图的较大版本.
图 5: 单细胞定量病毒和宿主基因在 CD4 猕猴中的表达 肠系膜淋巴结 T 细胞 post-SIVmac251 感染10天.(A) 病毒基因表达的多变量的多重拼接 (达/转) 和单一拼接 (环境污染) SIV mRNA 的单细胞 (左).在 x轴上的光绿色细胞 (如: 与环保+细胞 (深绿色) 相比, 其相对于早期感染阶段和在修订前的蛋白质介导的稳定和核出口部分拼接 vRNAs 如环境污染。不表达拼接病毒 rna 的细胞以灰色 (无病毒 rna)、褐色 ( LTR+ 和多色+) 或棕褐色 ( LTR+ 或 +) 来描述。Unspliced (插科打诨+) 和总 (LTR+) SIV mRNA 表达式显示相同的细胞 (右)。unspliced 的高丰度在达/冯智活+细胞与后期生产感染是一致的, 其中丰富的基因组 RNA 表示包装成萌芽期病毒.(B) 与未感染的细胞相比, 在至少一小部分的 SIV 病毒感染细胞中, 恒河猴基因的小提琴地块差异表达 (灰色)。统计分析的执行情况如前所述20、22、23、24。星号表示假发现率 < 10% 在联合似然比测试比较相对未感染的细胞。线连接每个基因的细胞组的平均值。这个数字已经从博尔顿等。20请单击此处查看此图的较大版本.
图 6:恒河猴肠系膜淋巴结转移细胞的代表性寄主表面蛋白表达谱10天 post-SIVmac251 感染.(A) 散点图显示 CD3、CD4 和 ICOS 表面蛋白表达的未感染 (灰色),插科打诨+达/转- (棕色), 和插科打诨+达/转+细胞 (绿色)。荧光强度为每个细胞 (点) 绘制。离群框图描绘四分位范围 (IQR) 和中值 (框), 最远的点在 1.5 x IQR 从箱子 (胡须) 和潜在的例外 (断开的点)。水平杆在顶部表明显著差异 (p < 0.05, 非参数魏氏等级测试)。(B) (a) 所示细胞的表面 CD3 和 CD4 蛋白表达的双变量和直方图显示。点图 (左) 表示象限内每个单元格的百分比。CD3 和 CD4 直方图 (中, 右) 描述的表面蛋白下调之间的插科打诨+ 达/转+细胞相对未感染和插科打诨+达/转细胞。(C) 十二个具有代表性的A–B /转速+单细胞来自 (CD3/CD4) 的三个二元地块, 用于表面表达 (左)、CD69/CD38 (中间) 和 ICOS/HLA-DR (右)。请单击此处查看此图的较大版本.
图 7: 三元图显示单细胞病毒基因 (达/转), 宿主基因 (CD3或CD4), 和宿主表面蛋白 (CD3 或 CD4) 表达在 SIV 感染记忆 CD4+ T 细胞从肠系膜淋巴结10天post-SIVmac251 感染.CD4 蛋白表达 (荧光) 是针对CD4 mRNA (qPCR) 绘制的, 而每个细胞表达的达/转数则由网点大小来反映。在达/转+细胞 (绿色), 减少表面 CD4 和 CD3 蛋白表达与持续的CD4和CD3转录, 分别表明, 表面蛋白表达调制下游基因表达。请单击此处查看此图的较大版本.
表 1:用于检测 SIV 核酸的引物和探针.当为底漆或探针指示两个序列时, 使用了两个序列的摩尔量。请单击此处下载此文件.
表 2: Biomark 仪器中用于定量 amplicons 的96基因组。四 SIV 化验表明以蓝色背景。请单击此处下载此文件.
表 3:反应组合用于反向转录和预放大.请单击此处下载此文件.
表 4:qPCR 反应组合用于实时 PCR 在量化工作室6仪器上进行.请单击此处下载此文件.
补充编码文件1。限定基因表达测定的说明.请单击此处下载此文件.
补充编码文件 2: 在就业选配样本地图模板.请单击此处下载此文件.
补充编码文件 3: 在选配中的探头地图模板.请单击此处下载此文件.
补充编码文件 4: 就业选配入门分析脚本.请单击此处下载此文件.
补充编码文件5。用于选配的分段分析脚本.请单击此处下载此文件.
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Discussion
这里描述的协议, 称为 tSCEPTRE, 集成单细胞表面蛋白定量的多参数流式细胞仪与数量单一细胞 mRNA 表达的高复用 RT qPCR。这两种技术的结合使高容量的单细胞转录和蛋白质剖面快照具有高通量格式。我们使用该方法来识别在体内感染 SIV 的迄今难以捉摸的细胞, 并描述差异表达的宿主基因和蛋白质。该协议可用于研究任何感兴趣的细胞群体, 其表达的表面蛋白, mRNA, 或其组合。采用流式细胞仪与商用 qPCR 试剂和多路实时 PCR 仪器进行了精确的单细胞分选和数据记录。输出灵敏度高, 定量评价单细胞结合蛋白和基因表达数据。
在单个细胞中连接蛋白质和基因表达的其他方法已被描述为1、25、26、27。索引后的 RNAseq 的分类, 并成功地应用于造血干细胞的特性, 代表了一个特别有希望的方法28。然而, 虽然 RNAseq 有几个优势超过目标基因表达分析, 即无偏全转录分析, 它是受较高的多比较统计成本和可能不敏感的量化低拷贝成绩单。此外, 目前在经济上是不可行的, 对数以千计的细胞进行 RNAseq, 以寻找在频率 < 1% (例如HIV、SIV) 中出现的稀有感染细胞。其他新兴的单细胞技术的目的是产生一个单一的读数,即通过外地监测或 PCR, 以检测蛋白质和核酸在同一细胞。这些措施包括通过荧光寡核苷酸探针检测蛋白质的荧光抗体和 mrna, 其次是资产管制分析 (mRNA 流鱼)14,15,29,30。或者, 蛋白质可以通过对抗体-寡核苷酸结合检测, qPCR 与反向转录 mRNA31,32,33,34平行检测。.这些 "混合" 方法提供了同时核酸和蛋白质测量与单细胞分辨率类似 tSCEPTRE, 但它们是有限的, 他们要么不是定量 (mRNA 流-鱼) 或可能需要定制的抗体或 mRNA探针。我们的 tSCEPTRE 方法是定量的蛋白质和 mRNA 的测量和所有试剂是商业化的, 可能例外的病原体特异的化验。
在对实验样品进行分析之前, 应特别注意议定书的几个步骤。首先, 高参数流式细胞术需要仔细优化一组荧光抗体, 以确保敏感检测和分辨率35。每种抗体都应单独滴定, 以确定达到最佳分离和最小背景染色的浓度, 然后结合所有抗体共轭物进行染色评价。其次, 实验确定适当的 qPCR 基因表达法测量每个感兴趣的基因是必要的。多项商业可用的化验通常可用于每种基因, 但按照我们的经验, 许多人在单细胞6级没有定量。因此, 在使用定量基因表达之前, 必须对序列稀释 RNA 的所有建议的化验进行限定。这些试剂的优化是耗时的, 但可靠的抗体共轭和基因表达化验的价值, 允许敏感检测所有利益分子的时间投资的合理性。此外, 应优先考虑的商业可得的化验, 包括跨越外显子-显子的交叉点 (指定后缀 "m1"), 以改善 mRNA 特异性, 虽然可以检测基因组 DNA 的替代化验 (后缀 "s1" 或 "g1") 被认为不太可能影响基因表达的结果, 由于染色体复制在每个细胞。保存的 RNA 上游的 RT 是至关重要的, 是通过保持样品冷冻, 如在整个议定书中所指出的。同样, 功放的时间和分类和 RT 之间的间隔应保持在最低限度。对于限制性稀释和单细胞分选, 可以先用常规 qPCR 分析 cDNA, 评估高度表达的管家基因 RNA 的恢复。如果所观察到的表达式在类似单元格数的复制中不一致, 或者对于限制稀释的线性拟合的斜率无法验证, 则应在单元分类和下游过程中进行故障排除。
此处描述的方法可能存在的局限性包括 (1) 检测除 RNA 之外的 DNA, 特别是用于不特定于 mRNA 剪接结的化验, 以及 (2) 受限的表面蛋白质和基因测量的数量。然而, 由于上述原因, DNA 检测不太可能对差异宿主基因表达分析作出重大贡献。此外, 我们通过两种方法直接测量了 DNA 在该协议中对 qPCR 信号的贡献程度: a) 不包括逆转录酶, b) 修改细胞裂解协议以增强核膜裂解。在没有逆转录酶的情况下, 剪接和 unspliced 病毒基因仍被检测到, 但频率明显低于逆转录酶 (分别为6倍和2倍的减少)20。因此, 病毒基因表达的检测可能高估细胞中存在的病毒 RNA 的数量, 因为存在细胞相关的病毒 DNA。我们将这一发现归因于宿主细胞感染过程中产生的细胞质 RT 产物, 已知发生在来自传入病毒36的剪接和 unspliced SIV/HIV RNA 中。因此, 在某些应用中, 最好将部分实验用于缺乏逆转录酶定量 DNA 衍生模板的条件。还应指出, 来自传入病毒的 unspliced SIV/HIV rna 不能与新合成的病毒 rna 区分开来。第二, 我们将核裂解步骤纳入 RT-功放协议中, 观察到集成的 SIV DNA (LTR) 拷贝的指数增加 (博尔顿等的图 S3 ) 。20. 因此, 基因组 DNA 不太可能对从这里使用的细胞裂解方法中提取的核酸模板作出重大贡献。值得注意的是, 在未来的单细胞研究中, 增加核裂解步骤可能是有用的, 试图调查 SIV 或其他病毒 DNA 阳性细胞, 包括潜伏感染细胞。
分析的表面蛋白质的数量取决于流动细胞细胞分拣器的能力。现有的商用仪器不超过30个参数。未来的研究使用更先进的流式细胞术将进一步扩大这种方法的蛋白质分析能力。成绩单的数量也可以延长到96以后, 提供辅助试剂 (例如, 更高浓度的底漆), 设备和仪器。最终, 新兴的单细胞技术, 结合蛋白质组 (质谱), 转录 (RNAseq), 和染色体 (DNAseq) 的分析, 将取代发现研究的目标方法31,37,38,39. 然而, 目标 qPCR 可能仍然是验证这种 "组学" 方法作为定量表达分析的黄金标准的宝贵工具。
联合蛋白和转录分析 tSCEPTRE 是一个强大的工具, 以调查罕见或难以辨认的细胞, 如那些窝藏病原体, 含有癌基因, 或其他表现出异常表型。转录活性 SIV/HIV 感染细胞的新标记可以用这种方法来确定, 并发现新的机制涉及这些病毒感染的发病机理。潜伏感染细胞的鉴定将需要进一步制定一个协议的驴病毒 DNA 集成在宿主基因组。值得注意的是, 艾滋病毒/SIV 感染细胞的频率在慢性 viremic 或治疗感染中明显降低, 这将在研究从这些环境中获得的受感染细胞方面提出实际的挑战。我们的方法为评估以前顽固的机制奠定了基础: 在单细胞水平的转录后调节, 对宿主病原体相互作用以及更一般的细胞过程具有广泛的适用性。
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Disclosures
这项工作得到了亨利 m. 杰克逊军事医学 W81XWH-07-2-0067 基金会和美国国防部 (DOD) 之间的合作协议的支持。所表达的观点是作者的意见, 不应被解释为代表美国陆军或国防部的立场。根据《动物福利法》和与动物有关的动物和实验的其他联邦法规和条例, 在 AAALACi 认可的设施中进行了一项经批准的动物使用议定书的研究, 并遵守原则《实验室动物护理和使用指南》 (NRC) 发表, 2011 版。
Acknowledgments
作者要感谢 NIAID VRC 流式细胞术核心和 MHRP 流式细胞仪核心设施, 以维护和操作的外地仪器和分拣设备;玛丽亚蒙特罗, Vishakha 夏尔马, 凯美歌曲为专家技术协助;迈克尔 Piatak (已故) 协助与 SIV qPCR 化验设计;布兰登上基尔和马修 Scarlotta 为 SIV 隔离序列。所表达的观点是作者的意见, 不应被解释为代表美国陆军或国防部的立场。根据《动物福利法》和与动物有关的动物和实验的其他联邦法规和条例, 在 AAALAC 认可的设施中进行了一项经批准的动物使用议定书的研究, 并遵守原则《实验室动物护理和使用指南》 (NRC) 发表, 2011 版。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNA extraction and PCR reagents and consumables |
|||
| Genemate 96-Well Semi-Skirted PCR Plate |
BioExpress/VWR |
T-3060-1 |
|
| Adhesive PCR Plate Seals |
ThermoFisher |
AB0558 |
|
| Armadillo 384-well PCR Plate |
ThermoFisher |
AB2384 |
|
| MicroAmp Optical Adhesive Film |
Applied Biosystems/ThermoFisher |
4311971 |
|
| DEPC Water |
Quality Biological |
351-068-101 |
|
| Glass Distilled Water |
Teknova |
W3345 |
|
| Superscript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit |
Invitrogen/ThermoFisher |
11732088 |
|
| SUPERase-In Rnase Inhibitor |
Invitrogen/ThermoFisher |
AM2696 |
|
| Platinum Taq |
Invitrogen/ThermoFisher |
10966034 |
|
| dNTP Mix |
Invitrogen/ThermoFisher |
18427088 |
|
| ROX Reference Dye (if separate from kit) |
Invitrogen/ThermoFisher |
12223012 |
|
| DNA Suspension Buffer |
Teknova |
T0223 |
|
| RNAqueous kit |
Invitrogen/ThermoFisher |
AM1931 |
|
| TaqMan gene expression assays not listed in Table 2 |
|||
| CD6 |
Applied Biosystems/ThermoFisher |
Hs00198752_m1 |
|
| TLR3 |
Applied Biosystems/ThermoFisher |
Hs1551078_m1 |
|
| Biomark reagents |
|||
| Control Line Fluid Kit |
Fluidigm |
89000021 |
|
| TaqMan Universal PCR Mix |
Applied Biosystems/ThermoFisher |
4304437 |
|
| Assay Loading Reagent |
Fluidigm |
85000736 |
|
| Sample Loading Reagent |
Fluidigm |
85000735 |
|
| Dynamic Array 96.96 (chip) |
Fluidigm |
BMK-M-96.96 |
|
| FACS reagents |
|||
| SPHERO COMPtrol Goat anti-mouse (lambda) |
Spherotech Inc. |
CMIgP-30-5H |
|
| CompBeads Anti-Mouse Ig,k |
BD Biosciences |
51-90-9001229 |
|
| 5 ml Polystyrene tube with strainer cap |
FALCON |
352235 |
|
| Aqua Live/Dead stain |
Invitrogen/ThermoFisher |
L34976 |
dilute 1:800 |
| Mouse Anti-Human CD3 BV650 clone SP34-2 |
BD Biosciences |
563916 |
dilute 1:40 |
| Mouse Anti-Human CD4 BV786 clone L200 |
BD Biosciences |
563914 |
dilute 1:20 |
| Mouse Anti-Human CD8 BUV496 clone RPA-T8 |
BD Biosciences |
564804 |
dilute 1:10 |
| Mouse Anti-Human CD28 BV711 clone CD28.2 |
Biolegend |
302948 |
dilute 1:20 |
| Mouse Anti-Human CD95 BUV737 clone DX2 |
BD Biosciences |
564710 |
dilute 1:10 |
| Mouse Anti-Human CD14 BV510 clone M5E2 |
Biolegend |
301842 |
dilute 1:83 |
| Mouse Anti-Human CD16 BV510 clone 3G8 |
Biolegend |
302048 |
dilute 1:167 |
| Mouse Anti-Human CD20 BV510 clone 2H7 |
Biolegend |
302340 |
dilute 1:37 |
| Anti-CD38-R PE clone OKT10 |
NHP reagent recource |
N/A |
dilute 1:100 |
| Mouse Anti-Human CD69 BUV395 clone FN50 |
BD Biosciences |
564364 |
dilute 1:10 |
| Mouse Anti-Human HLA-DR APC-H7 clone G46-6 |
BD Biosciences |
561358 |
dilute 1:20 |
| Mouse Anti-Human ICOS Alexa Fluor 700 clone C398.4A |
Biolegend |
313528 |
dilute 1:80 |
| Instruments |
|||
| BioPrptect Containment Enclosure |
Baker |
||
| BD FACS Aria |
BD Biosciences |
||
| ProtoFlex Dual 96-well PCR system |
Applied Biosystems/ThermoFisher |
4484076 |
|
| Quant Studio 6 qPCR instrument |
Applied Biosystems/ThermoFisher |
4485694 |
|
| IFC controller HX |
Fluidigm |
IFC-HX |
|
| Biomark HD |
Fluidigm |
BMKHD-BMKHD |
References
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