Summary
Beskrevet er en metode til at kvantificere udtryk for 96 gener og 18 overflade proteiner af enkelt celler ex vivo, giver mulighed for identifikation af varierende udtrykte gener og proteiner i virus-inficerede celler i forhold til ikke-inficerede celler. Vi anvender tilgang til undersøgelse SIV-inficerede CD4+ T celler isoleret fra rhesus makakaber.
Abstract
Enkelt-celle analyse er et vigtigt redskab for dissekere heterogene befolkninger af celler. Identifikation og dyrkning af sjældne celler kan være svært. For at overvinde denne udfordring, en metode, der kombinerer indekseret flowcytometri og høj overførselshastighed multipleksede kvantitative polymerase kædereaktion (qPCR) blev udviklet. Formålet var at identificere og karakterisere simian immundefektvirus (SIV)-inficerede celler stede i rhesus makakaber. Gennem kvantitering af overflade proteiner af fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS) og mRNA af qPCR, er virus-inficerede celler identificeret ved viral genekspression, som er kombineret med værten gen- og protein målinger til at oprette en flerdimensional profil . Vi kalder den tilgang, målrettede encellede Proteo-transcriptional evaluering eller tSCEPTRE. For at udføre metoden, er levedygtige celler farves med fluorescerende antistoffer specifikke for overflade markører, der anvendes til FACS isolation af en celle delmængde og/eller downstream fænotypiske analyser. Enkelt celler er sorteret efterfulgt af umiddelbar lysis, multiplex reverse transkription (RT), PCR pre forstærkning og høj overførselshastighed qPCR af op til 96 udskrifter. FACS målinger registreres på tidspunktet for sortering og senere knyttet til genekspression data af godt stand til at skabe en kombineret protein og transcriptional profil. For at studere SIV-inficerede celler direkte ex vivo, cellerne blev identificeret af qPCR påvisning af flere viral RNA arter. Kombinationen af viral udskrifter og mængden af hvert giver en ramme for klassificering af celler i forskellige stadier af den virale livscyklus (f.eks., produktive kontra ikke-produktive). Desuden var tSCEPTRE af SIV+ celler i forhold til ikke-inficerede celler isoleret fra den samme model, som skal vurdere varierende udtrykt vært gener og proteiner. Analysen viste tidligere miskendte viral RNA udtryk heterogenitet blandt inficerede celler samt i vivo SIV-medieret post-transcriptional gen forordning med enkelt-celle opløsning. Metoden tSCEPTRE er relevante for analysen af enhver celle befolkningens imødekommenhed over for identifikation af udtryk af overflade protein marker(s), vært eller patogen molekylærgenetisk eller kombinationer heraf.
Introduction
Mange intracellulære patogener stole på vært celle maskiner til at replikere, ofte at ændre værten cellebiologi eller rettet mod meget specifikke delpopulationer af værtsceller at maksimere deres chancer for formering. Som et resultat, er celle biologiske processer almindeligt forstyrret, med skadelige konsekvenser for den generelle sundhed i værten. Forstå samspillet mellem virus og værtsceller, hvor de replikere vil belyse sygdomsmekanismer, der kan støtte i udviklingen af forbedrede terapier og strategier til at forhindre infektion. Direkte analytiske værktøjer, der aktiverer undersøgelse af vært-patogen interaktioner er væsentlige mod herpå. Enkelt-celle analyse giver kun mulighed for utvetydigt at tilskrive en cellulær fænotype til en given genotype eller infektion status1. For eksempel, fremkalde patogene infektioner ofte både direkte og indirekte ændringer i værtsceller. Derfor skelne inficerede celler fra deres ikke-inficerede modparter er nødvendige attribut vært celle ændringer enten direkte infektion eller sekundære effekter, såsom generaliseret betændelse. Desuden, for mange patogener, som SIV og human immundefekt virus (HIV), host celle infektion provenuet gennem flere faser, som tidligt, sent, eller latent, hver især kan være kendetegnet ved forskellige gen- og protein udtryk profiler2 , 3 , 4 , 5. bulk analyser af celle blandinger vil undlade at fange denne heterogenitet6. Derimod multipleksede meget encellede analyser at kvantificere udtryk for både virus og vært gener tilbyder et middel til at løse infektion-specifikke cellulære perturbationer, herunder variationer på tværs af infektion faser. Yderligere, analysere vært-patogen interaktioner i fysiologisk relevante indstillinger er kritisk for identifikation af hændelser, der opstår i inficerede organismer. Således er metoder, der kan anvendes direkte ex vivo er sandsynligt, at bedste fange i vivo processer.
SIV og HIV målrette CD4+ T celler, hvor de modvirke vært antiviral "begrænsning" faktorer og nedregulere antigen præsentere molekyler til at skabe produktive infektion og undgå immun overvågning7,8, 9,10,11. Uden behandling, infektionen resulterer i massive tab af CD4 celler,+ T, i sidste ende kulminerede i erhvervet immundefekt syndrom (AIDS)12. I indstillingen i antiretroviral behandling persistere latent inficerede celle reservoirer i årtier, udgør en enorm hindring for helbredende strategier. Forstå egenskaberne for i vivo HIV/SIV-inficerede celler har potentiale til at afsløre vært celle funktioner medvirkende patogenese og vedholdenhed. Men dette har meget udfordrende, primært på grund af low frequency af inficerede celler og mangel på reagenser kunne let identificere dem. Celler, der transskriberer viral RNA, er anslået til at være til stede på 0,01 – 1% af CD4+ T-celler i blodet og lymfoide væv13,14,15. Under undertrykkende terapi er latent inficerede celler endnu mindre hyppige på 10-3– 10-7 16,17,18. Viral protein farvning-undersøgelser, at arbejde godt for at studere in vitro infektioner, såsom intracellulære Gag er suboptimal på grund af baggrunden farvning af 0,01-0,1%, svarende til eller større end hyppigheden af inficerede celler13, 14. Overflade farvning for Env protein af godt karakteriseret SIV/HIV Env-specifikke monoklonale antistoffer har også vist sig for at være vanskelig, sandsynligvis af lignende årsager. For nylig, Roman værktøjer har til formål at forbedre påvisningen af celler, der udtrykker Gag af enten indarbejde undersøgelser vedrørende specifikke for gag RNA eller ved hjælp af alternative tænkelig teknologier14,15,19. Men sådanne tilgange forblive begrænset antal kvantitative målinger udført på hver celle.
Her, vi beskriver metoder, som (1) identificerer enkelt virus-inficerede celler direkte ex vivo af følsom og specifik viral gen kvantitative qPCR og (2) kvantificerer udtryk for op til 18 overflade proteiner og 96 gener for hver inficeret (og uinficerede) celle. Denne metode kombinerer encellede overflade protein måling af FACS efterfulgt af umiddelbar celle lysis og gen expression analyse bruger multipleksede målrettede qPCR på Biomark systemet. Den integrerede fluidic kredsløb (IFC) teknologi tillader multipleksede kvantitering af 96 gener fra 96 prøver samtidig, udført af en matrix af 9,216 kamre, som er udført i de enkelte qPCR reaktioner. Den levende celle FACS sortering registrerer high-indhold protein overflod målinger, mens bevare den hele transkriptom analyse udføres umiddelbart nedstrøms. For at identificere virus-inficerede celler, assays specifikke for alternativt splejset og unspliced viral RNA'er (vRNA) er inkluderet i qPCR analyse, sammen med et panel af brugerdefinerede assays sammentælling op til 96 gener, det maksimale antal assays i øjeblikket indkvarteret i IFC. Genekspression og protein oplysninger indsamles for hver celle er forbundet af godt holdning. Vi har tidligere rapporteret resultaterne fra denne analyse andetsteds20. Her, vi giver mere detaljerede metodologiske retningslinjer samt yderligere beskrivende fænotyper af SIV-inficerede CD4+ T celler.
Denne tilgang, som vi kalder tSCEPTRE, kan anvendes til suspensioner nogen levedygtig celle befolknings reaktiv til fluorescently mærket antistoffer og udtrykke en transkriptom kompatibel med tilgængelige qPCR assays. Det kan for eksempel bruges til kendetegner differential gen- og protein udtryk i sjældne celler eller celler ikke let kendetegnet ved overfladen protein markører. Prøveforberedelsen bygger på en standard farvning protokollen ved hjælp af kommercielt tilgængelige antistoffer. Cytometers med enkelt-celle sortering evne er også kommercielt tilgængelige, men yderligere biosikkerhed forholdsregler er nødvendige for behandling af smitsomme levende celler. Optagelse single - celle protein udtryk profil for hver celle ved godt position, omhandlet heri er som indekseret sortering, en fælles funktion af kommercielt tilgængelige FACS sortering software. Beregningsmæssige analyse af varierende udtrykt vært gener blandt cellepopulationer af interesse er beskrevet ikke her, men referencer leveres til tidligere offentliggjorte metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: En skematisk af protokollen arbejdsprocessen er vist i figur 1. Det består af tre vigtigste trin: FACS, RT og cDNA pre forstærkning og qPCR for op til 96 gener samtidig. To versioner af protokollen, sortering celler i begrænsningen fortyndinger og sortering enkelt celler, er beskrevet mere detaljeret i trin 5 og trin 6, henholdsvis. Disse strategier tage forskellige forskningsspørgsmål men Følg lignende procedurer.
1. forudsætning eller forudgående analyser
- Validere alle gen expression assays skal bruges som tidligere beskrevet6.
Bemærk: Dette trin er gjort godt før eksperimentet. Validering af alle assays, er kommercielle og custom, forpligtet til at sikre effektiv og lineær forstærkning af relevante RNA en enkelt celle ad gangen. Mange kommercielt tilgængelige og brugerdefinerede assays undlader at overholde disse specifikationer. Forarbejdning og automatiseret kurve montering for samtidige kvalifikation af udtryk assays af op til 96 gener er fastsat i Supplerende kodning filer 1-5, men enkelte assays kan være kvalificeret ved hjælp af R2 og hældning af den lineære pasform. Repræsentative vellykkede og mislykkede assay kvalifikation parceller er vist i figur 2. -
Udvikle et flow cytometric panel af antistoffer mod pletten celle overflade markører af interesse.
- Titreres antistoffer ved farvning en relevante prøve, for eksempel rhesus perifert blod mononukleære celler (PBMC), med hver antistof. Starter med 20 µL antistof pr. test i 100 µL farvning reaktion og skabe otte dobbelt serielle fortyndinger. Identificere den optimale koncentration, der udstiller den maksimale farvning intensitet samtidig opretholde en klar adskillelse mellem de negative og positive befolkninger.
- Evaluere den kombinerede farvning på yderligere celle stikprøveudvælgelsen ved hjælp af en blanding af alle antistoffer i den optimale koncentration bestemmes i trin 1.2.1. Sikre at farvning er magen til den konstaterede for enkelte antistof pletter. Hvis farvning er mindre end hvad er observeret, hvor enhver antistof blev brugt i isolation, overveje alternative fluorokrom konjugater for at erstatte sådanne antistoffer.
2. gen Expression Assay forberedelse
- Kombiner 96 genekspression undersøgelser i en RNase/DNase-frit 1 – 15 mL tube (størrelse kan variere med antallet af sorter plader). Panelet af assays anvendes i denne undersøgelse er angivet i tabel 1 og tabel 2. Den resulterende materiale er benævnt "Assay Mix". Tilføje hver analyse til en endelig koncentration på 180 nM af forward og reverse primere. Tilføje DNA Suspension Buffer for at opnå en passende fortynding af Assay Mix.
Bemærk: For praktiske formål, custom (bruger-genereret) assay bestande kan tilberedes på 18 µM skal være i overensstemmelse med koncentrationen af kommercielt tilgængelige "20 x" gen expression qPCR assays (Tabel af materialer). 18 µM blandinger af brugerdefinerede frem og bak primer for hvert gen er lavet af stamopløsninger i DNA Suspension Buffer. Kommercielt tilgængelige assays (Tabel af materialer) også omfatte sonder, men sonder er ikke påkrævet for RT eller cDNA pre forstærkning og kan dermed udelades for brugerdefinerede assays. Anbefales det at medtage en eller flere husholdning gener for brug i kvalitetskontrol for at vurdere effektiviteten af sortering, celle opsving og cDNA syntese. Brug af tilfældige primere til at generere cDNA er ikke fastlagt, men forventes at være mindre effektiv end gene-specifikke primere. - Forberede 2 x assay plade til brug i trin 7.1 (multiplex qPCR). For hver enkelt 96 x 96 chip array forventet, der afpipetteres 6 µL af hver analyse i hver udpeget godt af en 96-brønd PCR plade. For eksempel, for 5 chips, vil 30 µL af hvert assay indtage en enkelt brønd i 96-brønd plade. Hvis du bruger 96 assays, vil hvert hul i 96-brønd plade indeholde en analyse. Forsegle pladen med selvklæbende segl.
Bemærk: Ideelt set trin 2.1 og 2.2 udføres samtidigt, for at undgå flere fryse-tø cykler for gen expression assays. Alle gener inden for assay pladen skal har også været til stede i Assay Mix (trin 2.1). Både assay mix og assay plade kan opbevares ved-20 ° C og 4 ° C for lang - eller kortfristede brug, henholdsvis.
3. overfladen pletten levedygtige celler
Bemærk: Intracellulær farvning, permeabilization og fiksering er ikke kompatible med denne metode som de kompromis RNA.
- Forbered kompensation prøver ved at tilføje hver antistof, der er anført i Tabel af materialer til 40 µL af kompensation perler på 2,5 højere koncentration end den, der anvendes til celle farvning. Ruger i 20 min. ved 25 ° C beskyttet mod lys. Tilføj 3 mL PBS perler og centrifugeres 500 x g i 3 min. ved 25 ° C. Opsug PBS og resuspend perlerne i ~ 300 µL af PBS.
- Forberede flow cytometric celle sorteringsanlæg til prøven forarbejdning: erhverve kompensation rør, opretter kompensationsmatrix og anvende matrix til erhvervelse filer til de eksperimentelle prøver.
- Forberede den master mix af fluorescerende antistof cocktail ved at kombinere den passende volumen af hver antistof som angivet i Tabel af materialer, i en 1,5 mL rav tube til alle prøver, der skal farves. Vortex og centrifugeres cocktail på 21.000 x g i 2 minutter ved 25 ° C til pellet antistoffet aggregater.
Bemærk: Antistoffer bruges her er angivet i Tabel af materialer. - Optø de befrugtede celler i et 37 ° C vandbad for 2 min. Tilføj 0,5 – 2 mL cellesuspension til 12 mL PBS i en 15 mL tube, centrifugeres 500 x g i 3 minutter ved 25 ° C, og Opsug PBS. Resuspend i 3 mL PBS og overførsel til en 5 mL polystyren tube. Der centrifugeres som ovenfor og Opsug PBS, forlader ~ 20 µL resterende PBS.
Bemærk: Farvning temperaturen kan tilpasses til varmere eller koldere temperaturer, som er nødvendig for specifikke programmer ved at ændre antistoftitrering farvning betingelser i overensstemmelse hermed (Se trin 1.2). - Resuspend op til 2 x 107 vasket celler i 80 µL antistof cocktail og Inkuber i 20 min ved 25 ° C beskyttet mod lys. For prøver overstiger 2 x 107 celler, øge farvning reaktion volumen i overensstemmelse hermed for at vedligeholde < 2 x 107 celler/100 µL.
- Cellerne vaskes ved tilsætning af 3 mL PBS, centrifugering ved 500 x g i 3 min, og sugning supernatanten.
- Grundigt resuspend celler i 300-500 µL af PBS og filter af pipettering gennem en 35 µm nylon celle si cap. Holde celler på is og beskyttet mod lys indtil slags.
4. Forbered celle samling plader, udføre FACS sortering og generer cDNA
- Kombiner komponenterne RT-preamp mastermix (tabel 3) når der afpipetteres i en enkelt RNAse/DNAse-frit sterile rør.
Bemærk: Dette trin kan udføres før eller under farvning i trin 3. RT enzymet kan udelades her til at bestemme skabelonen DNA til qPCR signal bidrag. - Brug en multikanalpipette til at undvære 10 µL af RT-preamp mastermix i det ønskede antal 96-brønd PCR form samling plader. Forsegle plader med selvklæbende film, og læg pladerne på forhånd kølet 96-brønd aluminium blokke.
- Etablere cellen sortering gating ordningen på flow forskellige ved at erhverve data fra cirka 20.000 celler af bejdset prøven. Sikre at kompensationsmatrix anvendes til de indsamlede data. Tegne gates og definere gating træet, der identificerer den celle eller de givne befolkningsgrupper af interesse for at blive isoleret gen expression analyse.
Bemærk: Gating træet anvendt til indsamling af potentielle SIV vRNA+ celler er vist i figur 3. - Indtast de passende instrument indstillinger for at angive antallet og undersæt af celler skal være sorteret i hver brønd. Yderligere detaljeret instruktion til sortering af enten en begrænsende celle fortyndingsrække eller enkelte celler findes i trin 5 og 6, henholdsvis.
- FACS sortere cellerne i rede 96-brønd PCR samling plader. Fjern den selvklæbende seal forud for sortering og erstatte med en frisk sæl efter sorteringen.
Bemærk: Holde pladerne på forhånd kølet aluminium blokke på alle tidspunkter, herunder under slags. - Umiddelbart efter sortering, vortex og centrifugeres indsamling plade på 2.000 x g i 1 min. ved 4 ° C.
- Thermocycle plade i en PCR-maskine med en forvarmet låget ved hjælp af følgende betingelser: 50 ° C i 15 min (RT), 95 ° C i 2 min., efterfulgt af 18 cykler på 95 ° C til 15 s og 60 ° C i 4 min (pre forstærkning).
- Fortynd cDNA 1:5 ved at overføre 5 μl cDNA ind i 20 µL DNA suspension buffer i en ny 96-brønd PCR plade. Fortyndet cDNA kan opbevares ved 4 ° C eller -20 ° C på ubestemt tid på dette tidspunkt. CDNA er nu klar til at blive brugt som en skabelon for qPCR (trin 5.2, 7.4).
Bemærk: Denne fortynding sikrer at primere i RT-preamp reaktion ikke bidrager til downstream qPCR.
5. variation A: FACS slags celler i en begrænse fortyndingsrække at bestemme hyppigheden af vRNA+ celler eller udføre den eksperimentelle kvalitetskontrol
Bemærk: Før du udfører en encellede form, kan det være til nytte at bestemme hyppigheden af celler af interesse, ved at sortere cellerne i serielle fortyndinger i replikeres. Dette trin giver også værdifulde kvalitetskontrol for sortering effektivitet, celle lysis, RNA opsving og cDNA syntese, som beskrevet i trin 5.3. Forudgående fastsættelse af vRNA+ celle frekvens giver mulighed for mere præcis estimering af antallet af enkelt celler, der skal sorteres for at opnå tilstrækkelig stikprøvestørrelse for passende powered vRNA+ celle gen expression analyse.
- FACS sortere cellerne i 96-brønd plader fremstillet efter anvisningerne i trin 4.1-4.2, og indsamle 1 – 1.000 celler pr. brønd i flere replikater.
Bemærk: Antallet af replikat brønde i hver celle fortynding er typisk omvendt forbundet med celle koncentrationen pr. brønd. Når den inficerede celle frekvens er langt under 1%, bør celle fortyndinger fokusere på 100-1.000 celler pr. brønd. Et eksempel sortere plade kort leveres i figur 1, øverst til venstre. Overstiger 1.000 celler pr. brønd bør undgås på grund af deraf følgende stigninger i reaktion volumen og interferens med downstream cDNA syntese og kvantificering. - Kombinere qPCR reagenser i en master mix løsning i tabel 4. For en 25 µL reaktion volumen kombineret 22,5 µL af master mix med 2,5 µL fortyndede cDNA skabelon fra trin 3.9. Udføre qPCR ved hjælp af standard cykel betingelser (fx94 ° C i 5 min, efterfulgt af 40 cyklusser af 94 ° C til 15 s og 60 ° C i 1 min).
Bemærk: Singleplex qPCR reaktioner ved hjælp af en konventionel real-time qPCR instrument er anbefalet som en økonomisk foreløbige analyse af én eller et par assays til at demonstrere effektiv celle sortering, RNA opsving og cDNA syntese. Det kan også bruges til at beregne hyppigheden af vRNA+ celler. Multiplex qPCR reaktioner ved hjælp af Biomark er typisk velegnede til storstilet encellede analyser. - For kvalitetskontrol, afbilde Et værdier (Et = Ctmax − Ct) versus antal celler sorteret pr. brønd på en log10 skala og anvende en lineær regressionsanalyse.
Bemærk: Konsekvent replikater, lineær regression hældningen af 3.3 (± 0,3) og R2 > 0.9 er vejledende for en effektiv eksperiment. Eksempler på optimal og suboptimal form, RT-preamp forsøg er vist i figur 4. - At bestemme hyppigheden af vRNA+ celler, plot celle numre sorteret pr. brønd på x-aksen (log10 skala) og fraktion af wells positiv for vRNA i hver celle fortynding på y-aksen. For eksempel, se figur 1 (nederste venstre, Poisson fordeling). Anvende en lineær regressionsmodel til data til at bestemme antallet af celler, som havnen en positiv celle i gennemsnit svarer til 63,2% af brønde positive (0.632 på y-aksen)21. Konvertere denne celle fortynding tal (x-aksen skæring) til frekvens udtrykt som en procentdel. For eksempel, er en vRNA+ celle per 48 celler svarende til en hyppighed på 2,1%.
6. variation B: FACS slags celler til én celle analyse
- Følg trin 4.1 – 4.8, og angive én celle sorteret pr. brønd med flow forskellige slags indeksfunktionen oprette individuelle FCS filer for hver celle sorteret, kortlagt af godt holdning.
Bemærk: Hvis antallet af sorter samling plader overstiger antallet af ledige termocyklere, cykling kan være stoppet efter reverse transkriptase inaktivering trin (95 ° C i 2 min.) og cDNA kan opbevares ved 4 ° C, indtil termocyklere er tilgængelige. I dette tilfælde påbegyndes før forstærkning på den første cyklus af 95 ° C til 15 s. - Valgfrit: Oprette cDNA "pools" bestående af cDNA fra brugerdefinerede partier af enkelt celler til at screene for sjældne celler af interesse ved hjælp af resterende ufortyndet cDNA. Overføre 2 µL af ufortyndet encellede pre forstærket cDNA ved multikanalpipette til en ny 96-brønd plade. Gentag ved pipettering 2 µL cDNA fra alle yderligere enkelt celler af en udpeget pool i den samme godt. Skærmen cDNA puljer til molekylærgenetisk af interesse (f.eks., vRNA) til at bestemme dem, der indeholder positive celler ved hjælp af konventionelle qPCR. Da pooling kræver kun en lille alikvot af cDNA fra hver celle, er den resterende ~ 8 µL cDNA stadig tilgængelig for encellede analyser.
Bemærk: Samle strategier anbefales før du udfører encellede gen expression analyser i et forsøg på at reducere antallet af enkelt celler, afhørt af ressource-intensive multiplex qPCR. Det er hensigtsmæssigt for situationer, hvor celler af interesse (f.eks., SIV mRNA +) kan identificeres ved en indledende enkelt-plex qPCR assay. Ligetil høj overførselshastighed strategier til at skabe cDNA swimmingpools omfatter kombinere 2 µL af ufortyndet cDNA fra en samling form plade rækker (dvs. alle 12 celler i række A) eller kolonner (dvs. alle 8 celler i kolonne 1), i en enkelt brønd i en ny plade. For at bestemme den bedste pooling strategi, overveje den forventede hyppighed af celler af interesse fra trin 5.4. For eksempel, hvis 10% af celler forventes at være positiv, puljer består af seks enkelt celle cDNA prøver vil ofte være negativ og celler repræsenteret i puljen kan dermed udelukkes fra downstream encellede analyser.
7. multiplex qPCR på Biomark Platform
Bemærk: Dette afsnit kan følge enten version A eller B beskrevet ovenfor. Den undersøgelse, der er beskrevet heri, blev den anvendt udelukkende til enkelt-celle analyse.
- Forberede qPCR assay plade af pipettering 4 µL af hver analyse fra 2 x assay plade (udarbejdet i trin 2.2) ind i en ny 96-brønd PCR plade der indeholder 4 µL af assay lastning reagens i hver brønd. Vedligeholde assay pladen ved 4 ° C.
Bemærk: Assay plade er stabil ved 4 ° C i op til en uge og ved-20 ° C i en måned. Således kan det være nyttigt at forberede tilstrækkeligt materiale til flere chips og gemme korrekt. - Undvære kontrol linje væsker fra priming sprøjter ind i de to indtagelse ventiler af chippen. Fjern den beskyttende plast under pladen. Placere jetonen på en IFC controller med hakket side på A1 holdning. I hovedmenuen skal du vælge "Prime" script. Kør scriptet.
- Forberede Real-Time-mastermix ved at blande 50 µL af prøven lastning reagens med 500 µL PCR Master Mix (Table of Materials) for hver mikrofluid chip. Der afpipetteres 4,4 µL i hvert hul i en ny 96-brønd PCR plade, fremover udpeget som "prøve plade".
- Der afpipetteres 3,6 µL af 1:5 fortyndet cDNA fra trin 4.8 i stikprøven pladen som indeholder Real-Time reaktion Mix.
Bemærk: Hvis en PCR ned-udvalg blev udført for at screene for sjældne (f.eks.vRNA+) celler for downstream analyse som beskrevet i trin 6.2, omfatte kun de celler repræsenteret i de positivt puljer. - Efter afslutningen af chip priming, indlæse chip fjorde ved udlevering 5 µL fra assay pladen ind i de tilsvarende godt på hakket (analyse) side af chip og 5 µL fra prøve plade i de tilsvarende godt på den andre (prøve) side af chippen. Sæt chippen i IFC-controller og køre scriptet "Load mix".
- Overføre chippen til Biomark platformen til at udføre den multipleksede qPCR. Fortsætte med instrument setup og qPCR programmering efter en trinvis instruktion af Real-Time PCR analyse software og ved hjælp af genet udtryk (GE) 96.96 Standard V.1 protokollen med 40 cyklusser af PCR. Gem filen ChipRun i en angivet mappe.
Bemærk: Flere chips kan køres, per dag og over flere dage. - Analysere qPCR data.
- Åbn Real-time PCR analyse Software. Åbn filen "ChipRun.bml" fra de "fil | Åben"menuen.
- Find "Chip Explorer" og "Chip Run Resumé" i øverste venstre hjørne af vinduet software. Identificere tre komponenter af Chip Run Resumé: analyser, eksempelopsætning og detektor Setup.
- Klik på "Detektor Setup". Under "Opgave", klik på "Ny" og vælg containertype "SBS plade" og container format "SBS96". Ved "Tilknytning", klik på den... knap, og vælg "M96-Assay-SBS96.dsp".
- Valgfrit: Tildel hver detektor (analyse) et nummer eller navn i afsnittet "navn" i hver brønd ved at dobbeltklikke på den 1st godt. Flytte til næste godt ved at trykke på "F2".
- Klik på "Eksempelopsætning". Under "Opgave" ud for "Tilknytning", skal du klikke på den... knap, og vælg "M96-eksempel-SBS96.dsp".
- Klik på "Analyser". Under "Opgave" under fanen "qPCR", Vælg "Baseline korrektion for lineær (derivat)", og "Ct tærskel metode for brugeren (detektorer)". I fanen "Ct Tærskler" tjekke "Initialize med Auto kasse". Klik på knappen "Analyze" ovenfor.
- I den øverste højre kvadrant af "Analyser", klik på fanen andet "Resultater tabel". Fra drop-down menuen, Vælg "Varme kortvisning". Zonekort med data vises.
- Valgfrit: For at sikre ensartet ROX fluorescens hele chippen, Vælg "Billedvisning" i stedet for "Varme kortvisning" fra den samme menu. I andet fra vinduet til højre over varmekort, skal du vælge "ROX". Vælg en af 1 – 40 cyklusser i først fra vinduet til højre. Klik på fjerde fra vinduet til højre til at skifte til sort-hvid visning af ROX fluorescens. Et billede vises der informerer splatters, partikler, eller mangler på chippen. Hvis ROX ensartethed sløres groft, re-opstille chippen.
- Under varmekort, skal du klikke på "Threshold" og "Log graf". Justere Ct tærskler for hver detektor manuelt ved at klikke på assays (kolonner af varmekort) og trække tærskel som nødvendigt at skærer forstærkning kurver i den eksponentielle fase. Når du er færdig, skal du klikke på "Analyze".
- Eksportere qPCR data som en .csv-fil. Importere dataene til et regneark eller en statistisk analyse software (f.eks.JMP) og kortlægge resultaterne af prøven og assay positioner på chippen. Organisere cellerne i grupper baseret på udtryk af virale gener, ved at oprette en ny kolonne og bruge en betinget formel. Vælg "Tilpas Y af X" under "Analyze", og plot genekspression versus gruppe. Anvend statistisk analyse.
Bemærk: Repræsentative encellede kvantitative udtryk for fire SIV RNA arter er afbildet i bivariate parceller i figur 5A. Kvantitative vært genekspression i SIV RNA+ celler er vist i figur 5B. - Uddrag kvantitativ protein udtryk værdier fra encellede FACS data.
- Åbn .fcs filer fra FACS sortere (trin 6.1) svarende til 96-brønd plade ved hjælp af FlowJo version 9. Med det filnavn, der er fremhævet, skal du vælge "Platform | Event nummer Gate | Opret indekseret form gates". Individuelle celler vises viste rækkevis.
- Fremhæve alle 96 celler (ikke rækker) og vælg "Workspace | Eksportere | Vælg alle kompenseret mel". Under "Datatype", Vælg "FCS fil", skal du klikke på "Export" og vælg en udpegede mappe.
- Trække nye .fcs filer for individuelle celler i et nyt FlowJo arbejdsområde. Fremhæve alle celler, klik på "Tilføj statistik" ("Σ"-knappen i øverste venstre hjørne) "| Betyde | Alle fluor parametre".
- Åbn "tabel Editor" ved at klikke på den fjerde knap fra venstre i øverste venstre hjørne. Fremhæve alle fluores af den første celle, og træk dem til tabellen editor vindue. Klik på den samme knap øverst "Oprette og se tabel" i redigeringsvinduet tabel. Dette vil oprette en tabel med 96 celler og en numerisk parameter for hver fluor.
- Kopiere output til en database-software (fxMS Excel, JMP), af enten kopiere/indsætte eller ved at klikke på "Gem og lancere programmet" (fjerde fra knappen venstre over tabellen).
Bemærk: Denne procedure er specifikke for FlowJo version 9. FlowJo version 10 bruger en anden procedure til at importere indekserede data. Indekserede flow data kan også kopieres/indsættes i JMP direkte fra .csv-filer oprettet af celle sorteringsanlæg.
- Flette én celle FACS og qPCR data af plade nummer og godt position. Udfører grafisk og statistiske analyser af det kombinerede encellede gen (qPCR) og protein udtryk (FACS) data.
Bemærk: Eksempler på én celle kombineret qPCR og FACS data er vist i figur 6 (vært overflade protein udtryk profiler for SIV-inficerede, splejset vRNA+ rhesus makak celler), figur 7 (CD4 genekspression versus overflade CD4 protein udtryk i splejset vRNA+ rhesus makak celler), og tidligere udgivet20. For at identificere varierende udtrykte gener i celle eller de givne befolkningsgrupper af interesse, enkelt-celle analyse metoder beskrevet tidligere er anbefalet20,22,23,24, som tegner sig for andelen af celler positive for et gen samt kontinuerlige gen expression værdi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Arbejdsgangen for den hele protokol er afbildet i figur 1. Det består af to variationer defineret af antal celler sorteret: enten begrænsende fortynding eller som enkelt celler, som beskrevet i teksten. Eksempler på primer-sonde kvalifikation analyser på 2-fold seriel RNA fortyndinger er vist i figur 2. Den gating strategi til at identificere potentielle SIV+ celler er vist i figur 3. En vellykket, suboptimal og mislykkede kvalitetskontrol qPCR for husholdning gen GAPDH på FACS-sorteret celler begrænse fortynding er vist i figur 4. Encellede kvantitative udtryk for fire SIV RNA arter og rhesus makak gener, der var varierende udtrykt i inficerede celler er vist i figur 5. Repræsentant bivariate, histogram og scatterplots skildrer overflade protein udtryk profil af SIV RNA+ CD4+ T celler målt ved flowcytometri i figur 6. Trivariate boble plot (figur 7) viser forholdet mellem overflade CD3 eller CD4 protein, CD3 eller CD4 mRNA og kvantitative virale gen (tat/rev) udtryk i enkelte celler.
Figur 1 : Skematisk af eksperimentelle arbejdsproces illustrerer tre hovedkomponenter: flow cytometric form, reverse transkription plus PCR-baserede pre forstærkning af cDNA (RT, pre-amp), og qPCR. Sorteringen kan udføres som enten en begrænsende fortynding (A, grøn baggrund) eller enkelte celler (B, orange baggrund). Umiddelbart efter FACS form, celler er mængden og RNA er omvendt transskriberede i cDNA og Pre forstærker (RT, pre-amp PCR) til at forberede qPCR skabelon. Begrænsende fortynding mulige bestemme hyppigheden af celler positive for viral RNA ved hjælp af Poisson-fordelingsstatistik samt eksperimentelle effektivitet og prøve opsving. Det grønne pil hovedet angiver det anslåede antal celler sorteret pr. godt indeholdende én celle positiv for en viral gen (svarende til en 63,2% sandsynlighed af sådanne brønde bliver gen positive), som er omdannet til en celle frekvens. Frekvens skøn kan bruges til at oplyse antallet af enkelt celler indsamlet i en efterfølgende sortering (B). Indekserede encellede FACS sortering indskud en celle pr. brønd og genererer datafiler for hver celle, kommenteret af godt holdning i 96-brønd plade. Encellede qPCR udføres samtidigt multipleks for 96 gener. Kombinere overflade proteiner (FACS) og mRNA udtryk giver mulighed for profilering af individuelle celler (højre kolonne). En valgfri qPCR for en viral gen kan udføres mellem pre forstærkning PCR og multipleksede qPCR (B, midten) til screen enkelt celler eller puljer af encellede cDNA til down-Vælg viral RNA+ celler eller puljer for multiplex qPCR analyse. Varmen kortet illustrerer genekspression (Ct værdi) til 96 assays (kolonner) og 96 enkelt celler (rækker). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Repræsentant qPCR data fra primer kvalifikation eksperimenter er vist vellykket (venstre og midten) og mislykkedes (højre) kommercielt tilgængelige assays (CD6, SIV tat/rev, og TLR3, henholdsvis). For CD6 og TLR3, RNA blev udvundet fra 106 FACS-sorteret rhesus makak PBMC CD4+ T-celler ved hjælp af en kommerciel kit. Otte replikater af en tolv-punkt RNA to-fold fortyndingsrække (0,023-48 ng RNA, svarende til 1,2-2.400 celle ækvivalenter antager 20 pg RNA pr. CD4+ T-celle) blev udsat for RT-forforstærker og qPCR. For SIV tat/revekstraheret RNA fra rhesus makak PBMC inficeret in vitro- med SIVmac239. RNA fortyndinger blev udarbejdet spanning RNA ækvivalenter af 6 – 12.000 celler. Et (40-Ct) værdier, som øger med Gen-ekspression, afbildes versus anslåede celle numre. Fortyndingsrække udstiller R2 > 0,97 og hældningen af 3,32 ±0.3 indikerer succesfulde primer kvalifikation. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Bivariate FACS parceller med ordningen for isolation af rhesus makak cellerne potentielt inficeret af SIV-gating. Sekventiel gates for at vælge memory (CD95 +) CD4+ T celler er vist fra øverste venstre til lavere ret med hver befolkning navn angivet. Procent af overordnet komplot, der falder inden for hver gate er indiceret. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Repræsentant eksperimentelle validering af qPCR udføres på FACS-sorteret celler i begrænsning af fortynding ved hjælp af GAPDH rengøring genet for tre uafhængige eksperimenter: vellykket (venstre), suboptimal (midten), og mislykkedes (til højre). Replikater af 10-100 celler pr. brønd bør strækker sig over mere end 2 Ets og 300 – 1.000 celle brøndene i 1 Et. Den lineære regression skråning bør være 3,32 ± 0,3, Rasmussen2 > 0,95. Manglende evne til at opnå disse specifikationer angiver tekniske vanskeligheder i trin 1, 2, 3, eller en kombination heraf. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Encellede kvantitative viral og vært genekspression i FACS-sorteret rhesus makak CD4+ T-celler fra mesenteriallymfeknuderne lymfeknude 10 dage post-SIVmac251 infektion. (A) Viral genekspression bivariate parceller af ganges-splejset (tat/rev) og enkeltvis splejset (env) SIV mRNA af enkelt celler (til venstre). TAT/rev+env- celler (lys grøn celler langs x-aksen) express færre eksemplarer af tat/rev RNA end env+ celler (mørk grøn), i overensstemmelse med en tidlig fase af infektion og Rev protein-medieret stabilisering og nuklear eksport af delvist splejset vRNAs såsom env. Celler, der ikke udtrykker splejset viral RNA er afbildet i grå (ingen viral RNA), brun (gag+ og LTR+) eller tan (enten gag+ eller LTR+). Unspliced (gag+) og total (LTR+) SIV mRNA udtryk er vist for de samme celler (til højre). Høj overflod af unspliced gag RNA i tat/rev+env+ celler er i overensstemmelse med sene fase produktive infektion under som rigelige genomisk RNA er udtryk for emballage i spirende virioner. (B) Violin parceller af rhesus makak gener varierende udtrykt i mindst én delmængde af SIV-inficerede celler i forhold til ikke-inficerede celler (grå). Statistiske analyser blev udført som beskrevet tidligere20,22,23,24. Stjerne angiver falsk opdagelse sats < 10% i kombinerede risiko ratio test sammenligninger i forhold til ikke-inficerede celler. Linje forbinder gennemsnitlige værdier på tværs af celle grupper for hvert Gen. Dette tal er blevet ændret fra Bolton et al. 20 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Repræsentative vært overflade protein udtrykket profiler af FACS-sorteret celler fra rhesus makak mesenteriallymfeknuderne lymfeknude 10 dage post-SIVmac251 infektion. (A) Scatterplot visning af CD3, CD4 og ICOS overflade protein udtryk i ikke-inficerede (grå), gag+tat/rev- (brun) og gag+tat/rev+ celler (grønne). Fluorescens intensitet er afbildet for hver celle (dot). Outlier boks parceller skildrer interkvartil vifte (IQR) og median (boks), de længst punkter inden for 1,5 x IQR fra boks (knurhår) og potentiale outliers (springende punkter). Vandrette bjælker øverst viser betydelige forskelle (p < 0,05, ikke-parametrisk Wilcoxon rank test). (B) Bivariate og histogram display af overflade CD3 og CD4 protein udtryk for celler vises i (A). Dot plot (venstre) angiver procentdelen af hver celle befolkning inden for en kvadrant. CD3 og CD4 histogrammer (midt, højre) skildrer overflade protein downregulation blandt gag+tat/rev+ celler i forhold til ikke-inficerede og gag+tat/rev- celler. (C) tolv repræsentative tat/rev+ enkelt celler fra (A-B) er vist på tværs af tre bivariate grunde til overflade udtryk af CD3/CD4 (venstre), CD69/CD38 (i midten) og ICOS/HLA-DR (til højre). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7 : Trivariate plot viser encellede virale gen (tat/rev), host gen (CD3 eller CD4) og vært overflade protein (CD3 eller CD4) udtryk i SIV-inficerede hukommelse CD4+ T celler fra mesenteriallymfeknuderne lymfeknude 10 dage post-SIVmac251 infektion. CD4 protein udtryk (Fluorescens) er afbildet mod CD4 mRNA (qPCR), mens mængden af tat/rev udtrykt af hver celle afspejles af dot størrelse. I tat/rev+ celler (grønne), faldt overfladen CD4 og CD3 protein udtryk med vedvarende CD4 og CD3 udskrifter, henholdsvis, angiver, at udtrykket overflade protein er moduleret nedstrøms af genekspression. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Tabel 1: Primere og sonder anvendes til påvisning af SIV nukleinsyrer. Når to sekvenser er indiceret til en primer- eller sonde, blev equimolar beløb af begge sekvenser brugt. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Tabel 2: en 96-gen panel bruges til kvantitering af amplikoner på Biomark instrument. Fire SIV assays er angivet med blå baggrund. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Tabel 3: Anvendes til reverse transkription og pre forstærkning-mastermix. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Tabel 4: qPCR mastermix bruges til real-time PCR udføres på et Quant Studio 6 instrument. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Supplerende kodning fil 1. Instruktioner for at kvalificere gen expression assays. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Supplerende kodning fil 2: prøve kort skabelon i JMP. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Supplerende kodning fil 3: sonde kort skabelon i JMP. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Supplerende kodning fil 4: Primer analyse script for JMP. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Supplerende kodning fil 5. Stykvis analyse script for JMP. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen beskrevet her, betegnes tSCEPTRE, integrerer én celle overflade protein kvantitering af multiparameter flowcytometri med kvantitative encellede mRNA udtryk af stærkt multipleksede RT-qPCR. Foreningen af disse to teknologier gør det muligt for high-indhold snapshots af den kombinerede transcriptional og protein profil af enkelt celler i et format, høj overførselshastighed. Vi bruger metoden til at identificere forhen undvigende celler inficeret med SIV i vivo, og beskrive varierende udtrykt vært gener og proteiner. Protokollen kan tilpasses for studiet af enhver celle population af interesse kan skelnes ved ekspression af overflade de(n), mRNA, eller en kombination heraf. De beskrevne metoder stole på nøjagtig én celle sortering og dataregistrering ved flowcytometri parret med kommercielt tilgængelige qPCR reagenser og multipleksede real-time PCR instrumentation. Outputtet er følsomme, kvantitative vurdering af encellede kombineret protein og gen expression data.
Andre tilgange forbinder protein og gen udtryk i enkelte celler er blevet beskrevet1,25,26,27. Indekserede FACS sortering efterfulgt af RNAseq, med held anvendt til karakterisering af hæmatopoietisk stamceller, repræsenterer en særlig lovende tilgang28. Men, mens RNAseq har flere fordele sammenlignet med målrettede gen expression analyser, nemlig saglig fuld transkriptom analyse, det er underlagt en højere flere sammenligninger statistiske omkostninger og kan være mindre følsomme over for kvantificering af lav kopi udskrifter. Desuden er det ikke i øjeblikket økonomisk muligt at udføre RNAseq på tusindvis af celler på jagt efter sjældne inficerede celler stede ved frekvenser < 1% (fxHIV, SIV). Andre nye encellede teknologier har til formål at generere en enkelt udlæsning, dvs., af FACS eller PCR til påvisning af både proteiner og nukleinsyrer i den samme celle. Disse omfatter påvisning af proteiner af fluorescerende antistoffer og mRNA af fluorescerende oligonukleotid sonder efterfulgt af FACS analyse (mRNA-Flow-fisk)14,15,29,30. Alternativt, proteiner kan påvises ved hjælp af par antistof-oligonukleotid konjugater, der er registreret af qPCR parallelt med omvendt transskriberede mRNA31,32,33,34 . Disse "hybrid" tilgange giver samtidige nukleinsyre og protein målinger med enkelt-celle opløsning svarende til tSCEPTRE, men de er begrænset hvor de enten ikke kvantitative (mRNA-Flow-fisk) eller kan kræve tilpassede antistof eller mRNA sonder. Vores tSCEPTRE tilgang er kvantitative for både protein og mRNA målinger og alle reagenser er kommercielt tilgængelige, med den mulige undtagelse af patogen-specifikke assays.
Særlig opmærksomhed bør anvendes til flere trin i protokollen før analysen af eksperimentelle prøver. Første, høj-parameter flowcytometri kræver omhyggelig optimering af et panel af fluorescerende antistoffer til at sikre følsomme påvisning og beslutning35. Hver antistof bør titreres individuelt for at identificere den koncentration, der opnår optimal adskillelse og minimal baggrund farvning, efterfulgt af vurderingen af farvning når alle antistof konjugater anvendes i kombination. Andet, eksperimentel bestemmelse af passende qPCR gen expression assay at måle hvert gen af interesse er af afgørende betydning. Flere kommercielt tilgængelige assays er typisk tilgængelige for hvert gen, men vores erfaring, mange er ikke kvantitative på én celle niveau6. Det er således vigtigt at kvalificere alle foreslåede assays på seriefremstillede fortyndet RNA før brug for kvantitativ genekspression. Optimering af disse reagenser er tidskrævende, men værdien af pålidelige paneler af antistof konjugater og gen expression assays, der giver mulighed for følsomme påvisning af alle molekyler af interesse begrunder tid investeringen. Derudover bør man prioritere kommercielt tilgængelige assays indeholdende sonder, der spænder over exon-exon vejkryds (udpeget med suffikset "m1"), at forbedre specificitet for mRNA, selvom suppleant-undersøgelser kan påvise genomisk DNA (suffikset "s1" eller "g1" ) anses for usandsynligt, at påvirke gen expression resultater på grund af tilsvarende kromosomale eksemplarer i hver celle. Bevarelse af RNA opstrøms af RT er kritisk og er opnået ved at holde prøver kølede, som nævnt i protokollen. Tilsvarende varighed FACS sortering og intervallet mellem sortering og RT-preamp bør holdes på et minimum. For både begrænsende fortynding og enkelt-celle sortering, kan cDNA først analyseres af konventionelle qPCR at vurdere RNA inddrivelse af stærkt udtrykt husholdning gener. Hvis den observerede udtryk ikke er ensartet blandt replikater af som celle numre eller hældning af den lineære fit til at begrænse fortyndinger fejler efterprøvelse, skal fejlfinding udføres på celle sortering og downstream procedurer.
Potentielle begrænsninger af metoden beskrevet her omfatter (1) registrering af DNA ud over RNA, især af assays ikke specifikke for mRNA splice vejkryds, og (2) begrænset antal overflade proteiner og gener måles. DNA påvisning er imidlertid usandsynligt, at bidrage væsentligt til differentieret vært gen expression analyse af den grund, der er anført ovenfor. Desuden, vi direkte målt i omfang som DNA bidrager til qPCR signal i denne protokol af to tilgange: a) udelukke reverse transkriptase, og b) ændre celle lysis protokol for at forbedre Kernemembranen lysering. I mangel af reverse transkriptase, begge splejset og unspliced virale gener var stadig opdaget, men på væsentligt lavere hyppighed end i nærværelse af reverse transkriptase (~ 6-fold og 2-fold reduktioner, henholdsvis)20. Derfor, virale gen expression assays kan overvurdere mængden af viral RNA i en celle på grund af tilstedeværelsen af celle-associerede viral DNA. Vi tillægger denne konstatering cytoplasmatisk RT produkter frembragt under host celle infektion, vides at forekomme for både splejset og unspliced SIV/HIV RNA stammer fra indgående virioner36. Således, det kan være hensigtsmæssigt at afsætte en del af eksperimenter til betingelser mangler reverse transkriptase for at kvantificere DNA-afledte skabelon for nogle programmer. Det skal også bemærkes, at unspliced SIV/HIV RNA afledt af indgående virus ikke kan skelnes fra de novo syntetiseres viral RNA. For det andet, vi indarbejdet et nukleart lysis skridt i RT-preamp-protokollen og observeret en eksponentiel stigning i integreret SIV DNA (Alu-LTR) Kopier (Figur S3 af Bolton et al.) 20. genomisk DNA er derfor usandsynligt, at bidrage væsentligt til skabelonen nukleinsyre udvundet fra celle lysis metode anvendes her. Af note, kan tilsætning af en nuklear lysis skridt være nyttige i fremtiden encellede undersøgelser søger at undersøge SIV eller andre virus DNA-positive celler, herunder latent inficerede celler.
Antallet af overflade proteiner analyseret er dikteret af kapacitet af flow cytometric celle sorteringsanlæg. Nuværende kommercielt tilgængelige instrumenter overstiger ikke 30 parametre. Fremtidige undersøgelser beskæftiger mere avancerede flowcytometri vil yderligere udvide protein profilering evne til denne tilgang. Antallet af udskrifter kan også forlænges ud over 96, forudsat understøttende reagenser (fx, primere af højere koncentration), udstyr og instrumenter. I sidste ende, nye encellede teknologier, der kombinerer analyse af proteomet (massespektrometri), transkriptom (RNAseq) og genom (DNAseq) afløser de målrettede strategier for discovery forskning31,37, 38 , 39. men målrettet qPCR sandsynligvis vil forblive et værdifuldt redskab til at validere sådanne "omik" tilgange som en guld standard for kvantitative udtryk analyser.
Kombineret protein og transskription analyse af tSCEPTRE er et kraftfuldt værktøj til at undersøge sjældne eller vanskeligt at identificere celler såsom dem husly patogener, der indeholder onkogener eller ellers udstiller en afvigende fænotype. Nye markører for transcriptionally aktive SIV/HIV-inficerede celler kan blive identificeret på denne måde, som opdagelsen af nye mekanismer involveret i patogenesen af disse virusinfektioner. Identifikation af latent inficerede celler vil kræve yderligere udvikling af en protokol til æsler viral DNA integreres i vært genom. Af note er hyppigheden af HIV/SIV inficerede celler betydeligt lavere i kronisk viræmiske eller behandlede infektion, som vil fremlægge en konkret udfordring i at studere inficerede celler, der stammer fra disse indstillinger. Vores tilgang lægger fundamentet for vurdering af en tidligere genstridig mekanisme: af post-transcriptional forordning på én celle-niveau, og har bred anvendelighed til vært-patogen interaktioner samt mere generelle cellulære processer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dette arbejde blev støttet af en samarbejdsaftale (W81XWH-07-2-0067) mellem Henry M. Jackson Foundation for avancement i militær medicin, Inc., og de amerikanske Defense (DOD). De fremsatte synspunkter er dem af forfatterne og bør ikke fortolkes til at repræsentere positioner i den amerikanske hær eller Department of Defense. Forskning blev udført under en godkendte brug af dyr protokol et AAALACi akkrediteret anlæg i overensstemmelse med den animalsk velfærd opføre og andre føderale love og forskrifter vedrørende dyr og eksperimenter involverer dyr og overholder principperne anført i vejledningen for pleje og brugen af forsøgsdyr, NRC publikation, 2011 udgave.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke NIAID VRC Flow flowcytometri kerne og MHRP Flow flowcytometri Core faciliteter til vedligeholdelse og drift af FACS instrumenter og sorteringsapparater; Maria Montero, Vishakha Sharma, Kaimei Song for teknisk ekspertbistand; Michael Piatak, Jr. (afdøde) for assistance med SIV qPCR assay design; og Brandon Keele og Matthew Scarlotta for SIV isolere sekvenser. De fremsatte synspunkter er dem af forfatterne og bør ikke fortolkes til at repræsentere positioner i den amerikanske hær eller Department of Defense. Forskning blev udført under en godkendte brug af dyr protokol et AAALAC akkrediteret anlæg i overensstemmelse med den animalsk velfærd opføre og andre føderale love og forskrifter vedrørende dyr og eksperimenter involverer dyr og overholder principperne anført i vejledningen for pleje og brugen af forsøgsdyr, NRC publikation, 2011 udgave.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNA extraction and PCR reagents and consumables |
|||
| Genemate 96-Well Semi-Skirted PCR Plate |
BioExpress/VWR |
T-3060-1 |
|
| Adhesive PCR Plate Seals |
ThermoFisher |
AB0558 |
|
| Armadillo 384-well PCR Plate |
ThermoFisher |
AB2384 |
|
| MicroAmp Optical Adhesive Film |
Applied Biosystems/ThermoFisher |
4311971 |
|
| DEPC Water |
Quality Biological |
351-068-101 |
|
| Glass Distilled Water |
Teknova |
W3345 |
|
| Superscript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit |
Invitrogen/ThermoFisher |
11732088 |
|
| SUPERase-In Rnase Inhibitor |
Invitrogen/ThermoFisher |
AM2696 |
|
| Platinum Taq |
Invitrogen/ThermoFisher |
10966034 |
|
| dNTP Mix |
Invitrogen/ThermoFisher |
18427088 |
|
| ROX Reference Dye (if separate from kit) |
Invitrogen/ThermoFisher |
12223012 |
|
| DNA Suspension Buffer |
Teknova |
T0223 |
|
| RNAqueous kit |
Invitrogen/ThermoFisher |
AM1931 |
|
| TaqMan gene expression assays not listed in Table 2 |
|||
| CD6 |
Applied Biosystems/ThermoFisher |
Hs00198752_m1 |
|
| TLR3 |
Applied Biosystems/ThermoFisher |
Hs1551078_m1 |
|
| Biomark reagents |
|||
| Control Line Fluid Kit |
Fluidigm |
89000021 |
|
| TaqMan Universal PCR Mix |
Applied Biosystems/ThermoFisher |
4304437 |
|
| Assay Loading Reagent |
Fluidigm |
85000736 |
|
| Sample Loading Reagent |
Fluidigm |
85000735 |
|
| Dynamic Array 96.96 (chip) |
Fluidigm |
BMK-M-96.96 |
|
| FACS reagents |
|||
| SPHERO COMPtrol Goat anti-mouse (lambda) |
Spherotech Inc. |
CMIgP-30-5H |
|
| CompBeads Anti-Mouse Ig,k |
BD Biosciences |
51-90-9001229 |
|
| 5 ml Polystyrene tube with strainer cap |
FALCON |
352235 |
|
| Aqua Live/Dead stain |
Invitrogen/ThermoFisher |
L34976 |
dilute 1:800 |
| Mouse Anti-Human CD3 BV650 clone SP34-2 |
BD Biosciences |
563916 |
dilute 1:40 |
| Mouse Anti-Human CD4 BV786 clone L200 |
BD Biosciences |
563914 |
dilute 1:20 |
| Mouse Anti-Human CD8 BUV496 clone RPA-T8 |
BD Biosciences |
564804 |
dilute 1:10 |
| Mouse Anti-Human CD28 BV711 clone CD28.2 |
Biolegend |
302948 |
dilute 1:20 |
| Mouse Anti-Human CD95 BUV737 clone DX2 |
BD Biosciences |
564710 |
dilute 1:10 |
| Mouse Anti-Human CD14 BV510 clone M5E2 |
Biolegend |
301842 |
dilute 1:83 |
| Mouse Anti-Human CD16 BV510 clone 3G8 |
Biolegend |
302048 |
dilute 1:167 |
| Mouse Anti-Human CD20 BV510 clone 2H7 |
Biolegend |
302340 |
dilute 1:37 |
| Anti-CD38-R PE clone OKT10 |
NHP reagent recource |
N/A |
dilute 1:100 |
| Mouse Anti-Human CD69 BUV395 clone FN50 |
BD Biosciences |
564364 |
dilute 1:10 |
| Mouse Anti-Human HLA-DR APC-H7 clone G46-6 |
BD Biosciences |
561358 |
dilute 1:20 |
| Mouse Anti-Human ICOS Alexa Fluor 700 clone C398.4A |
Biolegend |
313528 |
dilute 1:80 |
| Instruments |
|||
| BioPrptect Containment Enclosure |
Baker |
||
| BD FACS Aria |
BD Biosciences |
||
| ProtoFlex Dual 96-well PCR system |
Applied Biosystems/ThermoFisher |
4484076 |
|
| Quant Studio 6 qPCR instrument |
Applied Biosystems/ThermoFisher |
4485694 |
|
| IFC controller HX |
Fluidigm |
IFC-HX |
|
| Biomark HD |
Fluidigm |
BMKHD-BMKHD |
References
- Macaulay, I. C., Ponting, C. P., Voet, T. Single-Cell Multiomics: Multiple Measurements from Single Cells. Trends Genet. 33 (2), 155-168 (2017).
- Pasternak, A. O., Lukashov, V. V., Berkhout, B. Cell-associated HIV RNA: a dynamic biomarker of viral persistence. Retrovirology. 10, 41 (2013).
- Mailler, E., et al. The Life-Cycle of the HIV-1 Gag-RNA Complex. Viruses. 8 (9), (2016).
- Varmus, H. Retroviruses. Science. 240 (4858), 1427-1435 (1988).
- Frankel, A. D., Young, J. A. HIV-1: fifteen proteins and an RNA. Annu Rev Biochem. 67, 1-25 (1998).
- Dominguez, M. H., et al. Highly multiplexed quantitation of gene expression on single cells. J Immunol Methods. 391 (1-2), 133-145 (2013).
- Tokarev, A., Guatelli, J. Misdirection of membrane trafficking by HIV-1 Vpu and Nef: Keys to viral virulence and persistence. Cell Logist. 1 (3), 90-102 (2011).
- Malim, M. H., Bieniasz, P. D. HIV Restriction Factors and Mechanisms of Evasion. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (5), a006940 (2012).
- Sugden, S. M., Bego, M. G., Pham, T. N., Cohen, E. A. Remodeling of the Host Cell Plasma Membrane by HIV-1 Nef and Vpu: A Strategy to Ensure Viral Fitness and Persistence. Viruses. 8 (3), 67 (2016).
- Simon, V., Bloch, N., Landau, N. R. Intrinsic host restrictions to HIV-1 and mechanisms of viral escape. Nat Immunol. 16 (6), 546-553 (2015).
- Kirchhoff, F. Immune evasion and counteraction of restriction factors by HIV-1 and other primate lentiviruses. Cell Host Microbe. 8 (1), 55-67 (2010).
- Wigzell, H. Immunopathogenesis of HIV infection. J Acquir Immune Defic Syndr. 1 (6), 559-565 (1988).
- Reynolds, M. R., et al. Ex vivo analysis of SIV-infected cells by flow cytometry. Cytometry A. 77 (11), 1059-1066 (2010).
- Baxter, A. E., et al. Single-Cell Characterization of Viral Translation-Competent Reservoirs in HIV-Infected Individuals. Cell Host Microbe. 20 (3), 368-380 (2016).
- Grau-Exposito, J., et al. A Novel Single-Cell FISH-Flow Assay Identifies Effector Memory CD4+ T cells as a Major Niche for HIV-1 Transcription in HIV-Infected Patients. MBio. 8 (4), (2017).
- Eriksson, S., et al. Comparative analysis of measures of viral reservoirs in HIV-1 eradication studies. PLoS Pathog. 9 (2), e1003174 (2013).
- Finzi, D., et al. Identification of a reservoir for HIV-1 in patients on highly active antiretroviral therapy. Science. 278 (5341), 1295-1300 (1997).
- Chomont, N., et al. HIV reservoir size and persistence are driven by T cell survival and homeostatic proliferation. Nat Med. 15 (8), 893-900 (2009).
- DeMaster, L. K., et al. A Subset of CD4/CD8 Double-Negative T Cells Expresses HIV Proteins in Patients on Antiretroviral Therapy. J Virol. 90 (5), 2165-2179 (2015).
- Bolton, D. L., et al. Combined single-cell quantitation of host and SIV genes and proteins ex vivo reveals host-pathogen interactions in individual cells. PLoS Pathog. 13 (6), e1006445 (2017).
- Quintans, J., Lefkovits, I. Precursor cells specific to sheep red cells in nude mice. Estimation of frequency in the microculture system. Eur J Immunol. 3 (7), 392-397 (1973).
- Finak, G., et al. MAST: a flexible statistical framework for assessing transcriptional changes and characterizing heterogeneity in single-cell RNA sequencing data. Genome Biol. 16, 278 (2015).
- McDavid, A., et al. Modeling bi-modality improves characterization of cell cycle on gene expression in single cells. PLoS Comput Biol. 10 (7), e1003696 (2014).
- McDavid, A., Finak, G., Gottardo, R. The contribution of cell cycle to heterogeneity in single-cell RNA-seq data. Nat Biotechnol. 34 (6), 591-593 (2016).
- Kok, Y. L., Ciuffi, A., Metzner, K. J. Unravelling HIV-1 Latency, One Cell at a Time. Trends Microbiol. , (2017).
- Rato, S., Golumbeanu, M., Telenti, A., Ciuffi, A. Exploring viral infection using single-cell sequencing. Virus Res. 239, 55-68 (2017).
- Wagner, A., Regev, A., Yosef, N. Revealing the vectors of cellular identity with single-cell genomics. Nat Biotechnol. 34 (11), 1145-1160 (2016).
- Nestorowa, S., et al. A single-cell resolution map of mouse hematopoietic stem and progenitor cell differentiation. Blood. 128 (8), e20-e31 (2016).
- Soh, K. T., et al. Simultaneous, Single-Cell Measurement of Messenger RNA, Cell Surface Proteins, and Intracellular Proteins. Curr Protoc Cytom. 75, 41-47 (2016).
- Kochan, J., Wawro, M., Kasza, A. Simultaneous detection of mRNA and protein in single cells using immunofluorescence-combined single-molecule RNA FISH. Biotechniques. 59 (4), 209-212 (2015).
- Stahlberg, A., Thomsen, C., Ruff, D., Aman, P. Quantitative PCR analysis of DNA, RNAs, and proteins in the same single cell. Clin Chem. 58 (12), 1682-1691 (2012).
- Assarsson, E., et al. Homogenous 96-plex PEA immunoassay exhibiting high sensitivity, specificity, and excellent scalability. PLoS One. 9 (4), e95192 (2014).
- Fredriksson, S., et al. Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays. Nat Biotechnol. 20 (5), 473-477 (2002).
- Genshaft, A. S., et al. targeted profiling of single-cell proteomes and transcriptomes in a single reaction. Genome Biol. 17 (1), 188 (2016).
- Mahnke, Y. D., Roederer, M. Optimizing a multicolor immunophenotyping assay. Clin Lab Med. 27 (3), 469-485 (2007).
- Liang, C., Hu, J., Russell, R. S., Kameoka, M., Wainberg, M. A. Spliced human immunodeficiency virus type 1 RNA is reverse transcribed into cDNA within infected cells. AIDS Res Hum Retroviruses. 20 (2), 203-211 (2004).
- Stegle, O., Teichmann, S. A., Marioni, J. C. Computational and analytical challenges in single-cell transcriptomics. Nat Rev Genet. 16 (3), 133-145 (2015).
- Wu, M., Singh, A. K. Single-cell protein analysis. Curr Opin Biotechnol. 23 (1), 83-88 (2012).
- Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications. Genome Med. 9 (1), 75 (2017).
