Summary
Beskrevet er en metode for å quantitate uttrykket av 96 gener 18 overflaten proteiner av enkeltceller ex vivo, tillater for identifikasjon av ulikt uttrykt gener og proteiner i virus-infiserte celler i forhold til uninfected celler. Vi bruker tilnærming til studiet SIV-infiserte CD4+ T celler isolert fra rhesus aper.
Abstract
Én celle analyse er et viktig verktøy for dissekere heterogene bestander av celler. Identifisering og isolering av sjeldne celler kan være vanskelig. For å overvinne denne utfordringen, en metodikk kombinere indeksert flowcytometri og høy gjennomstrømming multiplex kvantitative polymerasekjedereaksjons (qPCR) ble utviklet. Målet var å identifisere og karakterisere simian immunsviktvirus (SIV)-infiserte celler innenfor rhesus aper. Gjennom kvantifisering av overflaten protein av fluorescens-aktivert celle sortering (FACS) og mRNA av qPCR identifiseres virus-infiserte celler av viral genuttrykk, som er kombinert med verten genet og protein mål å opprette en flerdimensjonal profil . Vi kaller det tilnærming, målrettet encellede BG-transcriptional evaluering eller tSCEPTRE. For å utføre metoden, er levedyktige cellers farget med fluorescerende antistoffer spesifikke for overflate markører brukes for FACS isolering av en celle delsett og/eller nedstrøms fenotypiske analyse. Enkeltceller sorteres etterfulgt av umiddelbar lysis, multiplex omvendt transkripsjon (RT), PCR pre forsterkning og høy gjennomstrømning qPCR av opptil 96 transkripsjoner. FACS målinger registreres ved sortering og senere knyttet til den genuttrykk data av godt posisjon til å skape en kombinert protein og transcriptional profil. Å studere SIV-infiserte celler direkte ex vivo, cellene ble identifisert ved qPCR deteksjon av flere viral RNA arter. Kombinasjonen av viral utskrifter og antallet av hver gir en ramme for klassifisering celler i forskjellige stadier av viral levetid (f.eksproduktiv versus ikke-produktive). Videre var tSCEPTRE av SIV+ celler sammenlignet med infisert celler isolert fra samme prøven å vurdere ulikt uttrykt vert gener og proteiner. Analysen avdekket tidligere verdsatt viral RNA uttrykk heterogenitet blant infiserte celler så vel som i vivo SIV-mediert post-transcriptional gene regulering med encellede oppløsning. Metoden tSCEPTRE er relevant for analyse av noen celle befolkningen mottakelig for identifikasjon av uttrykk av overflaten protein marker(s), vert eller patogen gene(s) eller kombinasjoner av disse.
Introduction
Mange intracellulær patogener stole på verten celle maskiner å gjenskape, ofte endre vert cellebiologi eller målretting svært spesifikke subpopulasjoner av verten cellene å maksimere sine sjanser til overføring. Som et resultat, er celle biologiske prosesser ofte forstyrret, med skadelige konsekvenser for den generelle tilstanden til verten. Forstå samspillet mellom virus og verten cellene der de gjenskape vil belyse sykdom mekanismer som kan hjelpe til utvikling av bedre behandlinger og strategier å hindre infeksjon. Direkte analytisk verktøy som muliggjør studiet av vert-patogen interaksjoner er avgjørende mot dette formål. Én celle analyse er den eneste å entydig tillegge en mobilnettet fenotypen til bestemt genotype eller infeksjon status1. For eksempel skape patogene infeksjoner ofte både direkte og indirekte vertsceller. Derfor skille infiserte celler fra sine infisert kolleger er nødvendig å attributtendringer verten celle direkte infeksjon eller sekundære effekter, eksempel generalisert betennelse. Videre, for mange patogener, som SIV og humant immunsvikt-virus (HIV), verten celle infeksjon går gjennom flere faser, som tidlig, sent, eller latente, hver kan være preget av forskjellige gene og protein uttrykk profiler2 , 3 , 4 , 5. bulk analyser av cellen blandinger mislykkes å fange denne heterogene6. Derimot multiplekset svært encellede analyser kunne kvantifisere uttrykk for både virus og vert tilblivelse tilbud en betyr å løse infeksjon-spesifikke mobilnettet forstyrrelser, inkludert variasjoner over infeksjon stadier. Videre analysere vert-patogen interaksjoner i fysiologisk relevante innstillinger er avgjørende for identifikasjon av hendelser som forekommer i infiserte organismer. Dermed metoder som kan brukes direkte ex vivo er trolig best fange i vivo prosesser.
SIV og HIV målrette CD4+ T celler, som de motvirke vert antiviral "begrensning" faktorer og downregulate antigen presentere molekyler å etablere produktiv infeksjon og unngå immun overvåking7,8, 9,10,11. Uten behandling, infeksjonen resulterer i enorme tap av CD4+ T celler, til slutt kulminerte i ervervet immunodeficiency syndrome (AIDS)12. I innstillingen av antiretroviral terapi vedvare latently infiserte cellen reservoarer i flere tiår, poserer en formidabel barriere til helbredende strategier. Forstå egenskapene i vivo HIV/SIV-infiserte celler har potensial til å avsløre verten celle funksjoner i patogenesen og utholdenhet. Men har dette vært meget utfordrende, hovedsakelig på grunn av low frequency av infiserte celler og mangel på reagenser kan lett identifisere dem. Celler som transkribere viral RNA, er anslått til å være tilstede på 0,01 – 1% av CD4+ T celler i blodet og lymfoidvev13,14,15. Under undertrykkende terapi er latently infiserte celler enda sjeldnere 10-3– 10-7 16,17,18. Viral protein flekker søk som brukes til å studere i vitro infeksjoner, slik som for intracellulær Gag, er suboptimal på grunn av bakgrunnen flekker 0,01-0,1%, lik eller større enn hyppigheten av infiserte celler13, 14. Overflate flekk for konv protein bruker godt karakterisert SIV/HIV konv-spesifikke monoklonale antistoffer har også vist seg for å være vanskelig, trolig av lignende grunner. Nylig romanen verktøy mål å forbedre gjenkjenning av celler som uttrykker Gag enten omfatter søk bestemt for kneble RNA eller ved å bruke alternative bildebehandling teknologier14,15,19. Men disse forbli begrenset i antall kvantitative mål utføres på hver celle.
Her beskriver vi metodikk som (1) identifiserer enkelt virus-infiserte celler direkte ex vivo av sensitiv og bestemt viral genet kvantitative qPCR og (2) kvantifiserer uttrykk for opptil 18 overflaten proteiner og 96 gener for hver infisert (og infisert) cellen. Denne metodikken kombinerer encellede overflaten protein måling av FACS etterfulgt av umiddelbar celle lyse og gene expression analyse bruker multiplekset målrettet qPCR på Biomark systemet. Integrert fluidic krets (IFC) teknologien tillater multiplex kvantifisering av 96 gener fra 96 prøver samtidig ved en matrise av 9,216 kamre som individuelle qPCR reaksjonene utføres. Levende celle FACS sorteringen registrerer høyt innhold protein overflod mål mens bevare det hele transcriptome for analyse utført umiddelbart nedstrøms. Identifisere virus-infiserte celler, analyser bestemt alternativt skjøtes og unspliced viral RNAs (vRNA) er inkludert i qPCR analyse, sammen med et panel av brukerdefinerte analyser totalt opptil 96 gener, maksimalt antall analyser er innkvartert i IFC. Genuttrykk og protein-informasjon som er samlet for hver celle er knyttet av godt posisjon. Vi har tidligere rapportert resultater fra denne analysen andre steder20. Her gir vi mer detaljert metodiske retningslinjene samt ytterligere beskrivende phenotyping av SIV-infiserte CD4+ T celler.
Denne tilnærmingen, som vi kaller tSCEPTRE, kan brukes av suspensjon av noen levedyktig celle befolkningen reaktiv til fluorescently merket antistoffer og uttrykke en transcriptome kompatibel med tilgjengelig qPCR analyser. Det kan for eksempel brukes for å karakterisere differensial gene og protein uttrykk i sjeldne celler eller celler som ikke lett skilles ved overflaten protein. Eksempel utarbeidelsen er avhengig av en standard flekker kommersielt tilgjengelig antistoffer-protokoll. Cytometers med én celle sortering evnen er også kommersielt tilgjengelig, men flere biosikkerhet forholdsregler er nødvendige for behandling smittsomme lever celler. Innspillingen single - cellen protein uttrykk profilen for hver celle av godt posisjon, referert til heretter er som indeksert sortering, en vanlig funksjon i kommersielt tilgjengelig FACS sortering programvare. Beregningsorientert analyse av ulikt uttrykt vert gener blant celle populasjoner av interesse er ikke beskrevet her, men referanser tilbys til tidligere publiserte metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: En skjematisk av protokollen arbeidsflyten er vist i figur 1. Det består av tre viktigste trinn: FACS, RT og cDNA før forsterkning og qPCR for opptil 96 gener samtidig. To versjoner av protokollen, sortere celler i begrense fortynninger og sortering enkeltceller, er beskrevet nærmere i trinn 5 og 6, henholdsvis. Disse strategiene adresse ulike problemstillinger, men Følg lignende fremgangsmåter.
1. forutsetning eller tidligere analyser
- Valider alle gene expression analyser som tidligere beskrevet6.
Merk: Dette trinnet er gjort godt før eksperimentet datoen. Validere alle analyser, er kommersielle og egendefinert, nødvendig for å sikre effektiv og lineære forsterkning av relevante ned til én celle-nivå. Mange kommersielt tilgjengelig og egendefinerte analyser ikke oppfyller disse spesifikasjonene. Behandling og automatisert kurve passende for samtidige kvalifisering av uttrykket analyser av opptil 96 gener finnes på Koding tilleggsfiler 1 – 5, men individuelle analyser kan kvalifiseres ved hjelp R2 og stigningstallet for den lineære passformen. Representant vellykkede og mislykkede analysen kvalifisering tomter er vist i figur 2. -
Utvikle en flyt cytometric panel av antistoffer stain celle overflate markører av interesse.
- Sjarmere antistoffer av flekker en relevante eksempler, for eksempel rhesus perifert blod mononukleære celler (PBMCs), med hver antistoff. Start med 20 µL antistoff per test i 100 µL flekker reaksjon og opprette åtte todelt føljetong fortynninger. Identifisere optimal konsentrasjon som viser maksimalt flekker intensiteten samtidig opprettholde et klart skille mellom de negative og positive populasjonene.
- Evaluere den kombinerte flekker på ekstra cellen prøven (e) med blanding av alle antistoffer på optimal konsentrasjon i trinn 1.2.1. Kontroller at den flekker er samme som observert for individuelle antistoff flekker. Hvis den flekker er mindre enn hva er observert når noen antistoff ble brukt i isolasjon, vurdere alternative fluorochrome conjugates for å erstatte slike antistoffer.
2. Gene Expression analysen forberedelse
- Kombiner 96 genuttrykk søk i en RNase/DNase-gratis 1-15 mL tube (størrelsen kan variere etter antall Sorter plater). Panelet av analyser i denne studien er angitt i tabell 1 og tabell 2. Resulterende materialet kalles "Analysen Mix". Legg hver analysen til en siste konsentrasjon av 180 nM i revers primere. Legge til DNA suspensjon Buffer for å oppnå riktig fortynning av analysen miksen.
Merk: For praktiske formål, egendefinerte (brukergenerert) analysen aksjer kan være forberedt på 18 µM til med konsentrasjonen av kommersielt tilgjengelig "20 x" gene expression qPCR analyser (Tabell for materiale). 18 µM kombinasjoner av egendefinerte forover og bakover grunning for hver genet er laget av lager løsninger i DNA suspensjon bufferen. Kommersielt tilgjengelige analyser (Tabell for materiale) også inkludere sonder, men sonder kreves ikke for RT eller cDNA før forsterkning og kan dermed utelates for egendefinerte analyser. Det anbefales å inkludere én eller flere housekeeping gener for bruk i kvalitetskontroll for å vurdere effektiviteten av sortering, celle utvinning og cDNA syntese. Bruk av tilfeldige primere generere cDNA er ikke fastslått, men ventes å være mindre effektiv enn gen-spesifikke primere. - Forberede 2 x analysen plate for bruk i trinn 7.1 (multiplex qPCR). Pipetter 6 µL av hver analysen for hver 96 x 96 chip matrise forventet, i alle godt av en 96-brønns PCR plate. For eksempel for 5 chips, vil 30 µL av hver analysen oppta en enkelt brønn i 96-brønnen plate. Hvis bruker 96 analyser, inneholder hver brønn av 96-brønns platen en analysen. Forsegle platen med selvklebende segl.
Merk: Ideelt trinn 2.1 og 2.2 utføres samtidig, for å unngå flere fryse-Tin sykluser gene expression analyser. Alle gener i analysen platen må har også vært i analysen Mix (trinn 2.1). Både analysen blandingen og analysen platen kan lagres på 20 ° C eller 4 ° C for lang - eller kortsiktig bruk, henholdsvis.
3. overflate flekk levedyktige cellers
Merk: Intracellulær flekker, permeabilization og fiksering er ikke kompatible med denne metoden som de kompromiss RNA.
- Forberede kompensasjon prøvene ved å legge hver antistoff oppført i Tabell for materiale til 40 µL av kompensasjon perler på 2.5-fold høyere konsentrasjon enn som brukes for cellen flekker. Inkuber for 20 min ved 25 ° C beskyttet mot lyset. Legg til 3 mL PBS perler og sentrifuge på 500 x g for 3 min på 25 ° C. Sug opp PBS og resuspend perler på ~ 300 µL av PBS.
- Klargjøre flyt cytometric cellen sorter for eksempel behandling: få kompensasjon rør, oppretter kompensasjonsmatrise og bruke matrise til oppkjøp filene for de eksperimentelle prøvene.
- Klargjør master blandingen fluorescerende antistoff cocktail ved å kombinere riktige volumet av hver antistoff som angitt i Tabellen for materiale, i en 1,5 mL rav rør for alle prøver å være farget. Vortex og sentrifuger samler cocktail 21000 x g i 2 minutter ved 25 ° C til pellets antistoffer.
Merk: Antistoffer her er oppført i Tabellen for materiale. - Tine cryopreserved cellene i et 37 ° C vannbad for 2 min. Legg til 0,5-2 mL celle suspensjon til 12 mL PBS i en 15 mL tube, sentrifuge på 500 x g for 3 min ved 25 ° C, og Sug opp PBS. Resuspend i 3 mL PBS og overføre til en 5 mL polystyren rør. Sentrifuge som ovenfor og Sug opp PBS forlate ~ 20 µL gjenværende PBS.
Merk: Flekker temperaturen kan tilpasses til varmere eller kaldere temperaturer som trengs for spesifikke applikasjoner ved å endre antistoff titrering flekker forhold tilsvarende (se trinn 1.2). - Resuspend opptil 2 x 107 vasket celler i 80 µL antistoff cocktail og ruge for 20 min ved 25 ° C beskyttet mot lyset. For eksempler overstiger 2 x 107 celler, øke flekker reaksjon volumet tilsvarende for å opprettholde < 2 x 107 celler/100 µL.
- Vask cellene ved å legge til 3 mL PBS, sentrifugering på 500 x g for 3 min, og aspirating nedbryting.
- Grundig resuspend cellene i 300-500 µL av PBS og filter av pipettering gjennom en 35 µm nylon celle sil cap. Holde cellene på is og beskyttet fra lys til sorteringen.
4. forberede celle samling plater, utføre FACS Sorter og generere cDNA
- Kombinere RT-forforsterker reaksjonen blanding komponentene (tabell 3) av pipettering inn i et enkelt RNAse DNAse-fri sterilt rør.
Merk: Dette trinnet kan utføres før eller under fargingen i trinn 3. RT enzymet kan utelates her å finne ut bidrag av malen DNA qPCR signalet. - Bruk en flerkanals pipette for å dispensere 10 µL av RT-forforsterker reaksjonen blanding til ønsket antall 96-brønns PCR Sorter samling plater. Forsegle platene med lim, og plasser platene på pre kjølt 96-brønns aluminium blokker.
- Opprette cellen sortering gating ordningen på flyt cytometer etter henter fra ca 20.000 celler med farget prøven. Kontroller at kompensasjonsplanen gjelder de innsamlede dataene. Tegne gates og definere gating treet som identifiserer celle population(s) rundt å være isolert for gene expression analyse.
Merk: Gating treet brukes for innsamling av potensielle SIV vRNA+ celler vises i Figur 3. - Angi passende instrument-innstillingene for å angi antall felt og gruppe celler skal sorteres i hver brønn. Mer detaljert instruksjon for sortering av enten en begrensende celle fortynning serie eller enkeltceller finnes i trinn 5 og 6, henholdsvis.
- FACS sortere cellene i forberedt 96-brønns PCR samling platene. Fjern selvklebende forseglingen før sortering og erstatte med en frisk segl etter sorteringen.
Merk: Holde platene på pre kjølt aluminium blokker til enhver tid, inkludert i sorteringen. - Umiddelbart etter Sorter, vortex og sentrifuger samlingen plate 2000 x g for 1 min på 4 ° C.
- Thermocycle platen i en PCR maskin med forvarmet lokk med følgende: 50 ° C i 15 min (RT), 95 ° C i 2 minutter, etterfulgt av 18 sykluser av 95 ° C for 15 s og 60 ° C i 4 min (pre forsterkning).
- Fortynn cDNA 1:5 ved å overføre 5 μL cDNA til 20 µL av DNA suspensjon buffer i en ny 96-brønns PCR plate. Utvannet cDNA lagres på 4 ° C eller 20 ° C på ubestemt tid på dette punktet. CDNA er nå klar til å brukes som en mal for qPCR (trinn 5.2 7.4).
Merk: Dette fortynning sikrer at primerne i RT-forforsterker reaksjonen ikke bidrar til nedstrøms qPCR.
5. variant A: FACS sortere cellene i en begrense fortynning serie å bestemme frekvensen av vRNA+ celler eller utføre den eksperimentelle kvalitetskontroll
Merk: Før du utfører en enkeltcelle sortering, kan det være for å bestemme frekvensen av celler av interesse, ved sortering cellene i seriell fortynninger i replikere. Dette trinnet gir også verdifulle kvalitetskontroll for Sorter effektivitet, celle lysis, RNA utvinning og cDNA syntese, som beskrevet i trinn 5.3. Tidligere fastsettelse av vRNA+ celle frekvens gir mer nøyaktig beregning av antall enkeltceller som må sorteres for å oppnå tilstrekkelig utvalgsstørrelsen for riktig drevet vRNA+ celle gene expression analyse.
- FACS sortere cellene i 96-brønnen platene forberedt som trinn 4.1-4.2 og samle 1-1000 celler per brønn i flere gjentak.
Merk: Antall Repliker brønner på hver celle fortynning er vanligvis omvendt assosiert med cellen konsentrasjonen per brønn. Når infiserte cellen frekvensen er godt under 1%, bør celle fortynninger fokusere på 100-1000 celler per brønn. En eksempel Sorter plate kart finnes i figur 1, øverst til venstre. Overstiger 1000 celler per brønn bør unngås på grunn av resulterende øker i reaksjon volumet og interferens med nedstrøms cDNA syntese og kvantifisering. - Kombinere qPCR reagenser i en master mix løsning i Tabell 4. For et 25 µL reaksjon volum kombineres 22,5 µL av master mix med 2,5 µL av fortynnet cDNA mal fra trinn 3.9. Utføre qPCR standard sykling betingelser (f.eks94 ° C i 5 min, etterfulgt av 40 sykluser av 94 ° C for 15 s og 60 ° C i 1 min).
Merk: Singleplex qPCR reaksjoner med en konvensjonell sanntid qPCR instrument er anbefalt som en økonomisk foreløpig analyse av én eller noen få analyser å demonstrere effektiv celle sortering, RNA gjenoppretting og cDNA syntese. Det kan også brukes til å beregne antallet vRNA+ celler. Multiplex qPCR reaksjoner med Biomark er vanligvis mer passende for store encellede analyser. - For kvalitetskontroll, tegne Et verdier (Et = Ctmax − Ct) versus antall celler sortert per brønn i loggen10 skala og bruke en lineær regresjonsanalyse.
Merk: Konsekvent gjentak, lineær regresjon skråningen 3,3 (± 0,3) og R2 > 0.9 er tegn på en effektiv eksperiment. Eksempler på optimal og suboptimal Sorter, RT-forforsterker eksperimenter er vist i Figur 4. - Å bestemme frekvensen av vRNA+ celler, tegne cellen tallene sortert per brønn på x-aksen (Logg10 skala) og brøkdel av brønner positivt for vRNA på hver celle fortynning på y-aksen. For et eksempel, se figur 1 (nedre venstre, Poisson-fordelingen). Bruke en lineær regresjonsmodell til dataene for å bestemme antall celler som havn en positiv celle i gjennomsnitt tilsvarer 63,2% av brønner positive (0.632 på y-aksen)21. Konvertere denne celle fortynning nummer (x-aksen skjæringspunkt) til frekvens uttrykt prosentvis. For eksempel tilsvarer en vRNA+ celle per 48 cellene en frekvens på 2,1%.
6. variant B: FACS sortere cellene til én celle analyse
- Følg fremgangsmåten 4.1-4.8, og angi én celle sortert per godt med flyt cytometer indeks Sorter-funksjonen til å opprette individuelle FCS-filer for hver celle sortert, tilordnet av godt posisjon.
Merk: Hvis Sorter samling plater overskrider antall tilgjengelige thermocyclers, sykling kan stoppes etter revers transkriptase inaktivering trinn (95 ° C i 2 minutter) og cDNA kan lagres på 4 ° C til thermocyclers er tilgjengelige. I dette tilfellet starter før forsterkning på den første syklusen for 95 ° C for 15 s. - Valgfritt: Opprett cDNA "pools" bestående av cDNA fra egendefinerte grupper av enkeltceller skjermen for sjeldne cellene rundt bruker gjenværende ufortynnet cDNA. Overføre 2 µL av ufortynnet encellede pre forsterket cDNA av flerkanals Pipetter til en ny 96-brønns plate. Gjenta ved pipettering 2 µL av cDNA fra alle ekstra enkeltceller av en utpekt til det samme også. Skjermen cDNA basseng for gene(s) av interesse (f.eks, vRNA) å avgjøre de som inneholder positivt celler ved hjelp av konvensjonelle qPCR. Siden pooling krever bare en liten aliquot av cDNA fra hver celle, er de resterende ~ 8 µL av cDNA fortsatt tilgjengelig for enkeltceller analyser.
Merk: Pooling strategier er anbefalt før du utfører encellede gene expression analyser å redusere antall enkeltceller avhørt av ressurskrevende multiplex qPCR. Det er egnet for situasjoner der cellene av interesse (f.eks, SIV mRNA +) kan identifiseres av en foreløpig ett-plex qPCR analysen. Grei høy gjennomstrømming strategier for å skape cDNA bassenger inkluderer kombinere 2 µL av ufortynnet cDNA fra en samling Sorter plate (dvs. alle 12 celler i raden A) rader eller kolonner (dvs. alle 8 celler i kolonne 1) inn i en enkelt brønn i en ny plate. For å finne best pooling strategi, bør du vurdere forventet frekvensen av cellene rundt fra trinn 5.4. For eksempel hvis 10% av celler er ventet å være positive, bassenger består av seks encellede cDNA prøver vil ofte være negativ, og cellene i det bassenget kan dermed bli ekskludert fra nedstrøms encellede analyser.
7. multiplex qPCR på Biomark-plattformen
Merk: Denne delen kan følge enten versjon A eller B beskrevet ovenfor. I studien beskrevet her, ble det brukt utelukkende til én celle analyse.
- Forbered qPCR analysen platen av pipettering 4 µL av hver analysen fra 2 x analysen plate (forberedt i trinn 2.2) i en ny 96-brønns PCR plate inneholder 4 µL av analysen lasting reagensen i hver brønn. Opprettholde analysen platen på 4 ° C.
Merk: Analysen platen er stabil 4 ° C i opptil en uke og 20 ° C i en måned. Dermed kan det være nyttig å forberede nok materiale til flere chips og lagre riktig. - Dispensere kontroll linjen væsker fra grunning sprøyter i to innsugsventilene av chip. Fjern den beskyttende plasten fra platen. Plass der en IFC-kontroller med hakk side på A1 posisjon. Fra hovedmenyen velger du skriptet "Prime". Kjør skriptet.
- Forberede Real-Time reaksjonen blanding ved å blande 50 µL av prøve lasting reagens med 500 µL PCR Master mix (Tabell for materiale) for hver microfluidic flis. Pipetter 4.4 µL i hver brønn av en ny 96-brønns PCR plate, heretter utpekt som "eksempel plate".
- Pipetter 3,6 µL av den 1:5 utvannet cDNA fra trinn 4.8 inn i prøven plate som inneholder Real-Time reaksjonen blanding.
Merk: Hvis en PCR ned-utvalg ble utført skjerm for sjeldne (f.eksvRNA+) celler for nedstrøms som omtalt i trinn 6.2, inkludere bare cellene i positiv bassengene. - Etter fullføringen av chip grunning, laste chip viker ved dispensering 5 µL fra analysen platen i tilhørende på hakk (analysen) siden av chip og 5 µL fra prøven platen i tilhørende på den andre (eksempel) siden av brikken. Sett inn chip i IFC kontrolleren og kjøre skriptet "Last mix".
- Overføre chip Biomark plattformen utføre multiplex qPCR. Fortsett med instrumentet oppsett og qPCR programmering etter trinnvise instruksjoner gitt av Real-Time PCR analyse programvare og med Gene Expression (GE) 96.96 Standard V.1 protokollen med 40 sykluser av PCR. Lagre filen ChipRun i en angitt mappe.
Merk: Flere chips kan kjøres daglig og over flere dager. - Analysere qPCR data.
- Åpne sanntid PCR analyseprogramvare. Åpne filen "ChipRun.bml" fra det "filen | Åpne-menyen.
- Finn "Chip Explorer" og "Chip kjøre Sammendrag" i øvre venstre hjørne av vinduet programvare. Identifisere tre komponenter av Chip Run Sammendrag: analysevisninger, eksempeloppsett og detektor oppsett.
- Klikk på "Detektor Setup". Under "Oppgave", klikk "Ny" og velg beholdertype "SBS plate" og beholder formatet "SBS96". Ved siden av "Mapping", klikk på den..., og velger "M96-analysen-SBS96.dsp".
- Valgfritt: Tilordne hver detektor (analysen) et nummer eller navn i "navn"-delen i hver brønn ved å dobbeltklikke på 1st godt. Flytte til neste vel ved å trykke "F2".
- Klikk på "Sample Setup". Under "Oppgave" ved siden av "Mapping", klikker du den..., og velger "M96-prøve-SBS96.dsp".
- Klikk på "Analysevisninger". Under "Oppgave" i kategorien "qPCR", velger "Baseline korreksjon for lineær (derivat)", og "Ct terskelen metode for bruker (detektorer)". I kategorien "Ct terskler" sjekk "Initialiseringen med Auto boks". Velg knappen "Analysere" ovenfor.
- I øvre høyre kvadrant av "Analysevisninger", klikk på den andre kategorien "Resultater Table". Rullegardinmenyen, velg "Varme kart View". Varmekartet data vises.
- Valgfritt: For å sikre ensartet ROX fluorescens over chip, velg "Bildet View" i stedet for "Varme kart View" fra den samme menyen. I andre fra vinduet rett over varmekartet, velger du "ROX". I først fra det høyre vinduet, velger du en av 1-40 sykluser. Klikk på fjerde fra vinduet rett til å bytte til svart-hvitt-visning av ROX fluorescens. Et bilde vises som informerer spruter, partikler, eller mangler på chip. Hvis den ROX ensartethet er grovt skjult, Kjør chip.
- Under det varmekartet, klikk "Terskelen" og "Logg Graph". Justere Ct terskelverdiene for hvert detektor manuelt ved å klikke på analyser (kolonner av varmekartet) og dra terskelen nødvendig å skjære kurvene forsterkning i eksponentiell fase. Når ferdig, klikk "Analysere".
- Eksportere qPCR dataene som en CSV-fil. Importere dataene til et regneark eller statistisk analyse software (f.eksJMP) og kartlegge resultatene etter prøven og analysen posisjoner på chip. Ordne celler i grupper basert på uttrykk for viral gener, ved å opprette en ny kolonne og bruke en betinget formel. Under "Analysere", velg "Tilpass Y av X" og tegne genuttrykk versus gruppe. Bruke statistisk analyse.
Merk: Representant encellede kvantitative uttrykk for fire SIV RNA arter er avbildet bivariate tomter i figur 5A. Kvantitativ vert genuttrykk i SIV RNA+ celler vises i figur 5B. - Pakk ut kvantitative protein uttrykk verdier fra én celle FACS data.
- Åpne .fcs filer fra FACS sortere (trinn 6.1) tilsvarer 96-brønns tallerken med FlowJo versjon 9. Med navnet fremhevet, velge "plattform | Hendelsen nummer Gate | Opprette indekserte Sorter gates". Individuelle celler vises vises ved rad.
- Merk alle 96 celler (ikke rader) og velg "arbeidsområdet | Eksportere | Velg alle kompensert fluors". Under "Datatype", velg "FCS fil", klikk "Export", og velg en betegnet brosjyre.
- Dra nye .fcs filer for enkeltceller i et nytt arbeidsområde for FlowJo. Merk alle celler, klikker du "Legge statistikk" ("Σ" knappen øverst til venstre) "| Mener | Alle fluor parametere".
- Åpne "Tabellredigering" ved å klikke fjerde fra venstre i øvre venstre hjørne. Merk alle for lysstoffrør i den første cellen og dra dem til tabellen redigeringsvinduet. I tabellen editor-vinduet klikker du den samme knappen øverst "Opprette og utsikt-Table". Dette vil opprette en tabell med 96 celler og en numerisk parameter for hver fluor.
- Kopier resultatet til et databaseprogram (f.eksMS Excel, JMP), enten kopiere/lime eller ved å klikke "Lagre og lansere programmet" (fjerde fra venstre museknapp over tabellen).
Merk: Denne fremgangsmåten er spesifikke for FlowJo versjon 9. FlowJo versjon 10 bruker en annen prosedyre for å importere indeksert data. Indekserte flyt dataene kan også være kopiert/limt inn JMP direkte fra CSV-filer opprettet av cellen sorter.
- Flette encellede FACS og qPCR data av på plate nummer og godt plasser. Utføre grafisk og statistiske analyser på kombinert encellede genet (qPCR) og protein uttrykk (FACS) data.
Merk: Eksempler på encellede kombinert qPCR og FACS data er vist i figur 6 (vert overflaten protein uttrykket profiler for SIV-infisert, skjøtes vRNA+ rhesus macaque celler), figur 7 (CD4 genuttrykk versus overflaten CD4 protein uttrykk i skjøtes vRNA+ rhesus macaque celler), og tidligere publisert20. For å identifisere ulikt uttrykt gener i celle population(s) rundt, én celle analyse metodene beskrevet tidligere er anbefalt20,22,23,24, som utgjør andelen celler positiv for et gen som kontinuerlig gene expression verdien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Arbeidsflyten for hele protokollen er avbildet i figur 1. Det består av to varianter som er definert av antall celler sortert: enten begrensende fortynning eller som enkelt celler, som beskrevet i teksten. Eksempler på primer-sonden kvalifisering analyser på 2-fold føljetong RNA fortynninger vises i figur 2. Gating strategien for å identifisere potensielle SIV+ celler vises i Figur 3. En vellykket og mislykket og suboptimal kvalitetskontroll qPCR for rengjøring genet GAPDH med FACS-sortert cellene i begrense fortynning er vist i Figur 4. Encellede kvantitative uttrykk for fire SIV RNA arter og rhesus macaque gener som var ulikt uttrykt i infiserte celler er vist i figur 5. Representant bivariate, histogram og scatterplots viser overflaten protein uttrykk profilen av SIV+ CD4+ T celler målt ved flowcytometri i figur 6. Trivariate bubble handlingen (figur 7) viser forholdet mellom overflaten CD3 eller CD4 protein, CD3 eller CD4 mRNA og kvantitative viral genet (tat/rev) uttrykk i enkeltceller.
Figur 1 : Skjematisk av eksperimentelle arbeidsflyten illustrerer tre hovedkomponenter: flow cytometric sortere, omvendt transkripsjon pluss PCR-baserte pre forsterkning av cDNA (RT, pre-amp), og qPCR. Sorter kan utføres som enten en begrensende fortynning (A, grønn bakgrunn) eller single celler (B, oransje bakgrunn). Umiddelbart etter FACS sortere, celler er lysed og RNA er omvendt transkribert i cDNA og pre forsterket (RT, pre-amp PCR) å forberede qPCR mal. Begrensende fortynning sorterer bestemme frekvensen av celler positiv for viral RNA bruker Poisson-fordelingen statistikk som eksperimentelle effektivitet og smak utvinning. Grønn pil hodet angir anslått antall celler sortert per godt som inneholder en celle positivt for en viral genet (tilsvarende 63,2% sannsynlighet for slike brønner som gene positiv), som er omgjort til en celle frekvens. Frekvens anslag kan brukes å informere antall enkeltceller i en etterfølgende form (B). Indekserte encellede FACS sortering innskudd en celle per brønn og genererer datafilene for hver celle kommentert av godt posisjon i 96-brønnen platen. Encellede qPCR utføres samtidig i multipleks for 96 gener. Kombinere overflaten protein (FACS) og mRNA uttrykk tillater profilering av individuelle celler (høyre kolonne). En valgfri qPCR for en viral genet kan utføres mellom pre forsterkning PCR og multiplex qPCR (B, midten) skjermen enkeltceller eller av encellede cDNA ned-Velg viral RNA+ celler eller basseng for multiplex qPCR analyse. Varmekartet viser genuttrykk (Ct verdi) for 96 analyser (kolonner) og 96 enkeltceller (rader). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Representant qPCR data fra primer kvalifisering eksperimenter vises for vellykket (venstre og midten) og mislyktes (høyre) kommersielt tilgjengelig analyser (CD6, SIV tat/rev, og TLR3, henholdsvis). For CD6 og TLR3, RNA ble Hentet fra 106 FACS-sortert rhesus macaque PBMC CD4+ T-celler ved hjelp av en kommersiell kit. Åtte replikerer en tolv-punkt RNA todelt fortynning serien (0.023-48 ng RNA, tilsvarer 1.2-2400 celle ekvivalenter forutsatt 20 pg RNA per CD4+ T-celle) ble utsatt for RT-preamp og qPCR. For SIV tat/rev, ble RNA Hentet fra rhesus macaque PBMCs infisert i vitro med SIVmac239. RNA fortynninger var forberedt spenner RNA ekvivalenter av 6-12 000 celler. Et (40-Ct) verdiene, som øker med genuttrykk, tegnes kontra estimerte cellen tallene. Fortynning serien viser R2 > 0,97 og skråningen av 3.32 ±0.3 indikerer vellykket primer kvalifisering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Bivariate FACS tomter med gating ordningen for isolering av rhesus macaque celler potensielt infisert av SIV. Sekvensiell portene for å merke minnet (CD95 +) CD4+ T celler vises fra øvre venstre til nedre høyre med hvert befolkningen-navnet som er angitt. Prosent av overordnet plott som faller innenfor hver gate er angitt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Representant eksperimentelle validering av qPCR utføres på FACS-sortert celler i begrense fortynning bruker GAPDH housekeeping genet for tre uavhengige eksperimenter: vellykket (venstre), suboptimal (midten), og mislyktes (høyre). Av 10-100 celler per brønn bør omfatte mer enn 2 Ets og 300-1000 celle brønner i 1 Et. Lineær regresjon skråningen skal 3.32 ± 0.3, R2 > 0.95. Unnlatelse av å oppnå disse spesifikasjonene indikerer tekniske problemer i trinn 1, 2, 3, eller en kombinasjon av disse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Encellede kvantitative viral og vert byggkorn under FACS-sortert rhesus macaque CD4+ T-celler fra hvem lymfeknute 10 dager innlegg-SIVmac251 infeksjon. (A) Viral genuttrykk bivariate tomter av multiplisere-skjøtes (tat/rev) og enkeltvis skjøtes (konv) SIV mRNA av enkelt cellene (til venstre). TAT/rev+konv- celler (lys grønne celler langs x-aksen) express færre kopier av tat/rev RNA enn konv+ cellene (mørk grønn), forenlig med en tidlig stadium av infeksjon og før Rev protein-mediert stabilisering og kjernefysiske eksport av delvis skjøtes vRNAs som konv. Celler som ikke uttrykker skjøtes viral RNA er avbildet i grå (ingen viral RNA), brown (kneble+ og LTR+) eller tan ( kneble+ eller LTR+). Unspliced (kneble+) og total (LTR+) SIV mRNA uttrykk vises for de samme cellene (høyre). Høy overflod av unspliced kneble RNA i tat/rev+konv+ celler er forenlig med sent stadium produktiv infeksjon som uttrykkes rikelig genomisk RNA for emballasje til spirende virions. (B) fiolin eiendommer av rhesus macaque gener ulikt uttrykt i minst ett delsett av SIV-infiserte celler sammenlignet med infisert celler (grå). Statistisk analyse ble utført som beskrevet tidligere20,22,23,24. Stjerne angir false oppdagelsen rate < 10% i kombinert sannsynligheten forhold test sammenligninger i forhold til uninfected celler. Linjen kobles mener verdier over cellegrupper for hver genet. Dette tallet har blitt endret fra Bolton et al. 20 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Representant vert overflaten protein uttrykket profiler av FACS-sortert celler fra rhesus macaque hvem lymfeknute 10 dager innlegg-SIVmac251 infeksjon. (A) Scatterplot visning av CD3, CD4 og ICOS overflaten protein uttrykk i infisert (grå), kneble+tat/rev- (brun) og kneble+tat/rev+ celler (grønn). Fluorescens intensitet er plottet for hver celle (dot). Avvikende boksen plott avbilder interquartile rekkevidde (IQR) og median (boks), de lengst poengene innen 1,5 x IQR fra boksen (værhår) og potensialet outliers (frakoblet poeng). Vannrette stolper øverst angir betydelige forskjeller (p < 0,05, parametriske Diversified rank test). (B) Bivariate og histogrammet visning av overflaten CD3 og CD4 protein uttrykk for celler som vises i (A). Dot plot (venstre) angir prosenter av hver celle befolkningen i en kvadrant. CD3 og CD4 histogrammer (midten, høyre) skildrer overflaten protein downregulation blant kneble+tat/rev+ cellene i forhold til uninfected og kneble+tat/rev- . (C) tolv representant tat/rev+ enkeltceller fra (A-B) vises over tre bivariate tomter for overflate uttrykk for CD3/CD4 (venstre), CD69/CD38 (midten) og ICOS/HLA-DR (høyre). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7 : Trivariate plot vise encellede viral genet (tat/rev), vert genet (CD3 eller CD4) og vert overflaten protein (CD3 eller CD4) uttrykk i SIV-infiserte minne CD4+ T celler fra hvem lymfeknute 10 dager post-SIVmac251 infeksjon. CD4 protein uttrykk (fluorescens) er plottet mot CD4 mRNA (qPCR), mens mengden tat/rev uttrykt av hver celle er reflektert av prikk-størrelse. I tat/rev+ celler (grønn), redusert overflaten CD4 og CD3 protein uttrykk med vedvarende CD4 og CD3 transkripsjoner, henholdsvis, indikerer at overflaten protein uttrykket modulert nedstrøms av genuttrykk. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tabell 1: Primere og sonder brukt for påvisning av SIV nukleinsyrer. Når to sekvenser er angitt for en primer eller sonde, ble ekvimolare mengder begge sekvenser brukt. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tabell 2: en 96-genet panel brukes for kvantifisering av amplicons på Biomark instrument. Fire SIV analyser angis med blå bakgrunn. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tabell 3: Reaksjonen blanding brukes omvendte transkripsjonstjenester og pre forsterkning. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tabell 4: qPCR reaksjonen blanding brukes for sanntids PCR utført på en Quant Studio 6 instrument. Klikk her for å laste ned denne filen.
Ekstra koding fil 1. Instruksjoner for kvalifisering gene expression analyser. Klikk her for å laste ned denne filen.
Ekstra koding fil 2: eksempel kartmalen i JMP. Klikk her for å laste ned denne filen.
Ekstra koding filen 3: Probe kartmalen i JMP. Klikk her for å laste ned denne filen.
Ekstra koding filen 4: Primer Analysis skript for JMP. Klikk her for å laste ned denne filen.
Ekstra koding fil 5. Piecewise analyse skript for JMP. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen beskrevet her, kalt tSCEPTRE, integrerer encellede overflaten protein kvantifisering av multiparameter flowcytometri med kvantitative encellede mRNA uttrykk av meget multiplex RT-qPCR. Unionen av disse to teknologiene kan høyt innhold øyeblikksbilder av den kombinerte transcriptional og protein profilen til enkeltceller i et format som høy gjennomstrømming. Vi bruker metoden til å identifisere hittil unnvikende celler infisert med SIV i vivo, og Beskriv ulikt uttrykt vert gener og proteiner. Protokollen kan tilpasses for studier av noen celle befolkningen rundt skilles av uttrykket av overflaten protein(s), mRNA eller en kombinasjon av disse. Metodene beskrevet er avhengige av nøyaktig én celle sortering og dataregistrering av flowcytometri sammen med kommersielt tilgjengelig qPCR reagenser og multiplekset sanntid PCR instrumentering. Utdataene er følsom, kvantitativ vurdering av encellede kombinerte protein og gene expression dataene.
Andre tilnærminger koble protein og gene uttrykk i enkeltceller har vært beskrevet1,25,26,27. Indekserte FACS sortering etterfulgt av RNAseq, brukt karakterisering av blodkreft stamceller, representerer en særlig lovende tilnærming28. Men mens RNAseq har flere fordeler sammenlignet med målrettet gene expression analyser, nemlig upartiske full transcriptome analyse, det er underlagt en høyere flere sammenligninger statistiske kostnader og kan være mindre følsomme for kvantifisering av lav kopi transkripsjoner. Dessuten, det er ikke er økonomisk gjennomførbart å utføre RNAseq på tusenvis av celler på jakt etter sjeldne infiserte celler på frekvenser < 1% (f.eksHIV, SIV). Andre nye encellede teknologier som mål å generere en enkelt avlesning, dvs. etter FACS eller PCR, for deteksjon av både proteiner og nukleinsyrer i samme celle. Disse inkluderer gjenkjenning av proteiner av fluorescerende antistoffer og mRNA av fluorescerende oligonucleotide sonder etterfulgt av FACS analyse (mRNA-flyt-fisk)14,15,29,30. Alternativt kan proteiner oppdages av par antistoff-oligonucleotide conjugates som oppdages av qPCR parallelt med reversert transkribert mRNA31,32,33,34 . Disse "hybrid" tilnærminger gir samtidig nukleinsyre og protein målinger med encellede oppløsning ligner tSCEPTRE, men de er begrenset hvor de er enten ikke kvantitativ (mRNA-flyt-fisk) eller krever tilpasset antistoff eller mRNA sonder. Vår tSCEPTRE tilnærming er kvantitative for både protein og mRNA målinger reagenser er kommersielt tilgjengelig, med mulig unntak av patogen-spesifikke analyser.
Spesiell oppmerksomhet bør brukes på flere trinn i protokollen før analysen av eksperimentelle prøver. Første, høy-parameteren flowcytometri krever forsiktig optimalisering av et panel av fluorescerende antistoffer å sikre sensitive gjenkjenning og oppløsning35. Hver antistoff bør være titreres individuelt for å identifisere konsentrasjonen som oppnår optimal separasjon og minimal bakgrunn flekker, etterfulgt av flekker når alle antistoff conjugates brukes i kombinasjon. Andre, eksperimentell bestemmelse av aktuelle qPCR gene expression analysen måle hver genet av interesse er viktig. Flere kommersielt tilgjengelig analyser er vanligvis tilgjengelige for hver genet, men i vår erfaring, mange er ikke kvantitativ på encellede nivå6. Derfor er det viktig å kvalifisere alle foreslåtte analyser på serielt utvannet RNA før bruke kvantitativ genuttrykk. Optimalisering av disse reagensene er tidkrevende, men verdien av pålitelig paneler av antistoff conjugates og gene expression analyser som gir sensitive påvisning av alle molekyler rundt rettferdiggjør tid investeringen. Dessuten, det bør gis prioritet til kommersielt tilgjengelig analyser som inneholder sonder som dekker ekson-ekson veikryss (betegnet med suffikset "m1") til å forbedre spesifisitet for mRNA, selv om alternativ søk stand til å oppdage genomisk DNA (suffikset "s1" eller «g1» ) anses usannsynlig å påvirke gene expression resultater på grunn av tilsvarende chromosomal kopier i hver celle. Bevaring av RNA oppstrøms RT er kritisk, og oppnås ved å holde prøver kjølt, som nevnt i protokollen. Tilsvarende varigheten av FACS sortering og intervallet mellom sortering og RT-forforsterker bør holdes til et minimum. For både begrensende fortynning og encellede sortering, kan cDNA først analyseres av konvensjonelle qPCR å vurdere RNA utvinning av svært uttrykt housekeeping gener. Hvis observert uttrykket ikke er ensartet blant av som cellen tallene eller stigningstallet for den lineære passformen for å begrense fortynninger svikter godkjenningen, skal feilsøking utføres på cellen sorterings- og nedstrøms prosedyrer.
Potensielle begrensninger av tilnærming beskrevet her inkluderer (1) oppdagelsen av DNA i tillegg RNA, spesielt for analyser ikke spesifikke for mRNA skjøte veikryss og (2) begrenset antall overflaten proteiner og gener målt. Men er DNA gjenkjenning usannsynlig å bidra vesentlig til differensial vert gene expression analyse av grunner nevnt ovenfor. Dessuten, vi direkte målt omfanget som DNA bidrar til qPCR signalet i denne protokollen av to tilnærminger: a) unntatt revers transkriptase og b) endre cellen lysis protokollen for å forbedre kjernefysiske membranen lysis. I fravær av revers transkriptase, både skjøtes og unspliced viral gener fant fortsatt, men betydelig lavere frekvens enn i nærvær av revers transkriptase (~ 6-fold og 2-fold reduksjoner, henholdsvis)20. Derfor kan viral gene expression analyser overvurdere mengden viral RNA i en celle av celle-assosiert virus-DNA. Vi tilskriver dette funnet cytoplasmatiske RT produkter genereres under verten celle infeksjon, oppstå for både skjøtes og unspliced SIV/HIV RNA fra innkommende virions36. Dermed kan det være lurt å dedikere en del av eksperimenter forhold mangler revers transkriptase å quantitate DNA-avledet mal for noen programmer. Det bør også bemerkes at unspliced SIV/HIV RNA avledet fra innkommende virus ikke kan skilles fra de novo syntetisert viral RNA. Andre vi innarbeidet et kjernefysisk lysis skritt i RT-forforsterker protokollen og observert en eksponentielle økning i integrert SIV DNA (Alu-LTR) eksemplarer (Figur S3 over Bolton et al.) 20. genomic DNA er derfor lite sannsynlig å bidra vesentlig til malen nukleinsyre utvunnet fra cellen lysis metoden brukes her. Av notatet, kan tillegg av en kjernefysisk lysis trinn være nyttig i fremtiden encellede studier søker å undersøke SIV eller andre virus DNA-positive celler, inkludert latently infiserte celler.
Antall overflaten proteiner analysert bestemmes av evnen til flyt cytometric cellen sorter. Gjeldende kommersielt tilgjengelige instrumenter overstige ikke 30 parametere. Fremtidige studier ansette mer avanserte flowcytometri vil ytterligere utvide protein profilering evne av denne tilnærmingen. Antall utskrifter kan også utvides utover 96, gitt støtte reagenser (f.eks, primere høyere konsentrasjon) utstyr og instrumentering. Til slutt, nye encellede teknologier som kombinerer analyse av proteom (massespektrometri), transcriptome (RNAseq) og Genova (DNAseq), erstatter de målrettede tilnærmingene for oppdagelsen forskning31,37, 38 , 39. men målrettet qPCR vil trolig forbli et verdifullt verktøy for validering av slike "omics" tilnærminger som en gull-standard for kvantitative uttrykk analyser.
Kombinert er protein og transkripsjon av tSCEPTRE et kraftig verktøy for å undersøke sjeldne eller vanskelig å identifisere celler som de skjuler patogener, som inneholder oncogenes eller ellers viser en avvikende fenotypen. Nye indikatorer for transcriptionally aktive SIV/HIV-infiserte celler kan identifiseres på denne måten, i tillegg til oppdagelsen av nye mekanismer involvert i patogenesen av disse virusinfeksjoner. Identifikasjon av latently infiserte celler krever videre utvikling av en protokoll til esler virus-DNA integrert i vert genomet. Av notatet er frekvensen av HIV/SIV infiserte celler betydelig lavere i kronisk viremic eller behandlet infeksjon, som vil presentere en praktisk utfordring i studere infiserte celler avledet fra disse innstillingene. Vår tilnærming legger grunnlaget for å vurdere en tidligere uløselige mekanisme: av post-transcriptional regulering på encellede nivå, og har bred anvendelse vert-patogen interaksjoner i tillegg til mer generelle cellulære prosesser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dette arbeidet ble støttet av en samarbeidsavtale (W81XWH-07-2-0067) mellom Henry M. Jackson Foundation for utvikling av militære medisin, Inc., og det amerikanske Department of Defense (DOD). Synspunktene er de av forfatterne, og bør ikke tolkes som representerer plasseringen av den amerikanske hæren eller forsvarsdepartementet. Forskningen ble utført under en godkjent dyr bruk protokoll i et AAALACi akkreditert anlegg i samsvar med det dyr velferd gjerning og andre føderale lover og forskrifter relatert til dyr og eksperimenter som involverer dyr og overholder personvernprinsippene angitt i veiledningen for omsorg og bruk av forsøksdyr, NRC publikasjon, 2011 utgaven.
Acknowledgments
Forfatterne gjerne takke NIAID VRC Flow cytometri kjernen og MHRP Flow cytometri Core fasiliteter for vedlikehold og drift av FACS instrumenter og sortering utstyr; Maria Montero, Vishakha Sharma, Kaimei Song for ekspert teknisk assistanse; Michael Piatak Jr (død) for hjelp med SIV qPCR analysen design; og Brandon Keele og Matthew Scarlotta for SIV isolere sekvenser. Synspunktene er de av forfatterne, og bør ikke tolkes som representerer plasseringen av den amerikanske hæren eller forsvarsdepartementet. Forskningen ble utført under en godkjent dyr bruk protokoll i et AAALAC akkreditert anlegg i samsvar med det dyr velferd gjerning og andre føderale lover og forskrifter relatert til dyr og eksperimenter som involverer dyr og overholder personvernprinsippene angitt i veiledningen for omsorg og bruk av forsøksdyr, NRC publikasjon, 2011 utgaven.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNA extraction and PCR reagents and consumables |
|||
| Genemate 96-Well Semi-Skirted PCR Plate |
BioExpress/VWR |
T-3060-1 |
|
| Adhesive PCR Plate Seals |
ThermoFisher |
AB0558 |
|
| Armadillo 384-well PCR Plate |
ThermoFisher |
AB2384 |
|
| MicroAmp Optical Adhesive Film |
Applied Biosystems/ThermoFisher |
4311971 |
|
| DEPC Water |
Quality Biological |
351-068-101 |
|
| Glass Distilled Water |
Teknova |
W3345 |
|
| Superscript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit |
Invitrogen/ThermoFisher |
11732088 |
|
| SUPERase-In Rnase Inhibitor |
Invitrogen/ThermoFisher |
AM2696 |
|
| Platinum Taq |
Invitrogen/ThermoFisher |
10966034 |
|
| dNTP Mix |
Invitrogen/ThermoFisher |
18427088 |
|
| ROX Reference Dye (if separate from kit) |
Invitrogen/ThermoFisher |
12223012 |
|
| DNA Suspension Buffer |
Teknova |
T0223 |
|
| RNAqueous kit |
Invitrogen/ThermoFisher |
AM1931 |
|
| TaqMan gene expression assays not listed in Table 2 |
|||
| CD6 |
Applied Biosystems/ThermoFisher |
Hs00198752_m1 |
|
| TLR3 |
Applied Biosystems/ThermoFisher |
Hs1551078_m1 |
|
| Biomark reagents |
|||
| Control Line Fluid Kit |
Fluidigm |
89000021 |
|
| TaqMan Universal PCR Mix |
Applied Biosystems/ThermoFisher |
4304437 |
|
| Assay Loading Reagent |
Fluidigm |
85000736 |
|
| Sample Loading Reagent |
Fluidigm |
85000735 |
|
| Dynamic Array 96.96 (chip) |
Fluidigm |
BMK-M-96.96 |
|
| FACS reagents |
|||
| SPHERO COMPtrol Goat anti-mouse (lambda) |
Spherotech Inc. |
CMIgP-30-5H |
|
| CompBeads Anti-Mouse Ig,k |
BD Biosciences |
51-90-9001229 |
|
| 5 ml Polystyrene tube with strainer cap |
FALCON |
352235 |
|
| Aqua Live/Dead stain |
Invitrogen/ThermoFisher |
L34976 |
dilute 1:800 |
| Mouse Anti-Human CD3 BV650 clone SP34-2 |
BD Biosciences |
563916 |
dilute 1:40 |
| Mouse Anti-Human CD4 BV786 clone L200 |
BD Biosciences |
563914 |
dilute 1:20 |
| Mouse Anti-Human CD8 BUV496 clone RPA-T8 |
BD Biosciences |
564804 |
dilute 1:10 |
| Mouse Anti-Human CD28 BV711 clone CD28.2 |
Biolegend |
302948 |
dilute 1:20 |
| Mouse Anti-Human CD95 BUV737 clone DX2 |
BD Biosciences |
564710 |
dilute 1:10 |
| Mouse Anti-Human CD14 BV510 clone M5E2 |
Biolegend |
301842 |
dilute 1:83 |
| Mouse Anti-Human CD16 BV510 clone 3G8 |
Biolegend |
302048 |
dilute 1:167 |
| Mouse Anti-Human CD20 BV510 clone 2H7 |
Biolegend |
302340 |
dilute 1:37 |
| Anti-CD38-R PE clone OKT10 |
NHP reagent recource |
N/A |
dilute 1:100 |
| Mouse Anti-Human CD69 BUV395 clone FN50 |
BD Biosciences |
564364 |
dilute 1:10 |
| Mouse Anti-Human HLA-DR APC-H7 clone G46-6 |
BD Biosciences |
561358 |
dilute 1:20 |
| Mouse Anti-Human ICOS Alexa Fluor 700 clone C398.4A |
Biolegend |
313528 |
dilute 1:80 |
| Instruments |
|||
| BioPrptect Containment Enclosure |
Baker |
||
| BD FACS Aria |
BD Biosciences |
||
| ProtoFlex Dual 96-well PCR system |
Applied Biosystems/ThermoFisher |
4484076 |
|
| Quant Studio 6 qPCR instrument |
Applied Biosystems/ThermoFisher |
4485694 |
|
| IFC controller HX |
Fluidigm |
IFC-HX |
|
| Biomark HD |
Fluidigm |
BMKHD-BMKHD |
References
- Macaulay, I. C., Ponting, C. P., Voet, T. Single-Cell Multiomics: Multiple Measurements from Single Cells. Trends Genet. 33 (2), 155-168 (2017).
- Pasternak, A. O., Lukashov, V. V., Berkhout, B. Cell-associated HIV RNA: a dynamic biomarker of viral persistence. Retrovirology. 10, 41 (2013).
- Mailler, E., et al. The Life-Cycle of the HIV-1 Gag-RNA Complex. Viruses. 8 (9), (2016).
- Varmus, H. Retroviruses. Science. 240 (4858), 1427-1435 (1988).
- Frankel, A. D., Young, J. A. HIV-1: fifteen proteins and an RNA. Annu Rev Biochem. 67, 1-25 (1998).
- Dominguez, M. H., et al. Highly multiplexed quantitation of gene expression on single cells. J Immunol Methods. 391 (1-2), 133-145 (2013).
- Tokarev, A., Guatelli, J. Misdirection of membrane trafficking by HIV-1 Vpu and Nef: Keys to viral virulence and persistence. Cell Logist. 1 (3), 90-102 (2011).
- Malim, M. H., Bieniasz, P. D. HIV Restriction Factors and Mechanisms of Evasion. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (5), a006940 (2012).
- Sugden, S. M., Bego, M. G., Pham, T. N., Cohen, E. A. Remodeling of the Host Cell Plasma Membrane by HIV-1 Nef and Vpu: A Strategy to Ensure Viral Fitness and Persistence. Viruses. 8 (3), 67 (2016).
- Simon, V., Bloch, N., Landau, N. R. Intrinsic host restrictions to HIV-1 and mechanisms of viral escape. Nat Immunol. 16 (6), 546-553 (2015).
- Kirchhoff, F. Immune evasion and counteraction of restriction factors by HIV-1 and other primate lentiviruses. Cell Host Microbe. 8 (1), 55-67 (2010).
- Wigzell, H. Immunopathogenesis of HIV infection. J Acquir Immune Defic Syndr. 1 (6), 559-565 (1988).
- Reynolds, M. R., et al. Ex vivo analysis of SIV-infected cells by flow cytometry. Cytometry A. 77 (11), 1059-1066 (2010).
- Baxter, A. E., et al. Single-Cell Characterization of Viral Translation-Competent Reservoirs in HIV-Infected Individuals. Cell Host Microbe. 20 (3), 368-380 (2016).
- Grau-Exposito, J., et al. A Novel Single-Cell FISH-Flow Assay Identifies Effector Memory CD4+ T cells as a Major Niche for HIV-1 Transcription in HIV-Infected Patients. MBio. 8 (4), (2017).
- Eriksson, S., et al. Comparative analysis of measures of viral reservoirs in HIV-1 eradication studies. PLoS Pathog. 9 (2), e1003174 (2013).
- Finzi, D., et al. Identification of a reservoir for HIV-1 in patients on highly active antiretroviral therapy. Science. 278 (5341), 1295-1300 (1997).
- Chomont, N., et al. HIV reservoir size and persistence are driven by T cell survival and homeostatic proliferation. Nat Med. 15 (8), 893-900 (2009).
- DeMaster, L. K., et al. A Subset of CD4/CD8 Double-Negative T Cells Expresses HIV Proteins in Patients on Antiretroviral Therapy. J Virol. 90 (5), 2165-2179 (2015).
- Bolton, D. L., et al. Combined single-cell quantitation of host and SIV genes and proteins ex vivo reveals host-pathogen interactions in individual cells. PLoS Pathog. 13 (6), e1006445 (2017).
- Quintans, J., Lefkovits, I. Precursor cells specific to sheep red cells in nude mice. Estimation of frequency in the microculture system. Eur J Immunol. 3 (7), 392-397 (1973).
- Finak, G., et al. MAST: a flexible statistical framework for assessing transcriptional changes and characterizing heterogeneity in single-cell RNA sequencing data. Genome Biol. 16, 278 (2015).
- McDavid, A., et al. Modeling bi-modality improves characterization of cell cycle on gene expression in single cells. PLoS Comput Biol. 10 (7), e1003696 (2014).
- McDavid, A., Finak, G., Gottardo, R. The contribution of cell cycle to heterogeneity in single-cell RNA-seq data. Nat Biotechnol. 34 (6), 591-593 (2016).
- Kok, Y. L., Ciuffi, A., Metzner, K. J. Unravelling HIV-1 Latency, One Cell at a Time. Trends Microbiol. , (2017).
- Rato, S., Golumbeanu, M., Telenti, A., Ciuffi, A. Exploring viral infection using single-cell sequencing. Virus Res. 239, 55-68 (2017).
- Wagner, A., Regev, A., Yosef, N. Revealing the vectors of cellular identity with single-cell genomics. Nat Biotechnol. 34 (11), 1145-1160 (2016).
- Nestorowa, S., et al. A single-cell resolution map of mouse hematopoietic stem and progenitor cell differentiation. Blood. 128 (8), e20-e31 (2016).
- Soh, K. T., et al. Simultaneous, Single-Cell Measurement of Messenger RNA, Cell Surface Proteins, and Intracellular Proteins. Curr Protoc Cytom. 75, 41-47 (2016).
- Kochan, J., Wawro, M., Kasza, A. Simultaneous detection of mRNA and protein in single cells using immunofluorescence-combined single-molecule RNA FISH. Biotechniques. 59 (4), 209-212 (2015).
- Stahlberg, A., Thomsen, C., Ruff, D., Aman, P. Quantitative PCR analysis of DNA, RNAs, and proteins in the same single cell. Clin Chem. 58 (12), 1682-1691 (2012).
- Assarsson, E., et al. Homogenous 96-plex PEA immunoassay exhibiting high sensitivity, specificity, and excellent scalability. PLoS One. 9 (4), e95192 (2014).
- Fredriksson, S., et al. Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays. Nat Biotechnol. 20 (5), 473-477 (2002).
- Genshaft, A. S., et al. targeted profiling of single-cell proteomes and transcriptomes in a single reaction. Genome Biol. 17 (1), 188 (2016).
- Mahnke, Y. D., Roederer, M. Optimizing a multicolor immunophenotyping assay. Clin Lab Med. 27 (3), 469-485 (2007).
- Liang, C., Hu, J., Russell, R. S., Kameoka, M., Wainberg, M. A. Spliced human immunodeficiency virus type 1 RNA is reverse transcribed into cDNA within infected cells. AIDS Res Hum Retroviruses. 20 (2), 203-211 (2004).
- Stegle, O., Teichmann, S. A., Marioni, J. C. Computational and analytical challenges in single-cell transcriptomics. Nat Rev Genet. 16 (3), 133-145 (2015).
- Wu, M., Singh, A. K. Single-cell protein analysis. Curr Opin Biotechnol. 23 (1), 83-88 (2012).
- Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications. Genome Med. 9 (1), 75 (2017).
