Summary
Målet med denne artikkel er å gi en detaljert beskrivelse av anbefalte fremgangsmåtene å vurdere lungefunksjon i bevisst mus ved dobbel-kammer plethysmography.
Abstract
Air endres opprettet av et bevisst emne puste spontant i en boks for kroppen er grunnlaget for plethysmography, en teknikk som brukes til ikke-invasively vurdere noen funksjoner i lungefunksjon hos mennesker så vel som i forsøksdyr. Denne artikkel fokuserer på bruk av dobbel-kammer plethysmography (DCP) i liten dyrene. Den gir bakgrunnsinformasjon om metodikken samt en detaljert fremgangsmåte for vellykket vurdere lungefunksjon i bevisst, spontant puste dyr på en ikke-invasiv måte. DCP kan brukes til å overvåke lungefunksjon flere dyr i parallell, så vel som å identifisere endringer av aerosolized stoffer over en valgt tidsperiode og gjentatt. Eksperimenter med kontroll og allergiske mus brukes her å demonstrere nytten av teknikken, forklare tilknyttede utfallet parametrene, samt for å diskutere relaterte fordeler og svakheter. Samlet inneholder DCP gyldige og teoretisk lyd readouts som kan klareres evaluere lungefunksjon bevisst liten dyr både ved baseline og etter utfordringer med aerosolized stoffer.
Introduction
Den økende bruken av små dyr å modell menneskelige luftveissykdommer har oppfordret utviklingen av teknikker for å vurdere kvantitativt funksjonene i luftveiene i disse dyrene. Foreløpig er tvunget oscillation teknikken (FOT) anerkjent som den mest nøyaktige måten å vurdere åndedretts mekanikken i små dyr1,2. Men som nevnt av phenotyping usikkerhet prinsippet, er hva som er oppnådd i måling presisjon med FOT handlet av mot tap i noninvasiveness3. Faktisk er FOT målinger ervervet under kontrollerte eksperimentelle forhold som nødvendiggjør anestesi, trakeotomi eller muntlig intubasjon, samt mekanisk ventilasjon; et scenario langt fra virkeligheten.
I situasjoner hvor kravene eksperimentell proscribe bruk av bedøvende agenter eller ring for liten eller ingen avvik fra dyrets naturlige fysiologiske tilstand, kan dobbel-kammer plethysmography (DCP) vurderes. Som navnet indikerer, består DCP oppsett av to tilkoblede stive kamre bygget for å isolere som hermetisk som mulig at dyret (eller nese), i det fremre kammeret, fra dens syn, i bakre kammer. Stilling, dyret er bevisst og puster spontant mens tilværelse behersket. Fordi veggene i kamrene ikke kan utvide eller trekke, genererer bevegelsen av luft og ut av dyret en tilsvarende, men motsatt bølgeform inne det bakre kammeret, som et resultat av komprimering/dekomprimering av omkringliggende luften. Bølgeform på grunn av nese flyt i fremre kammer og en knyttet til thorax bevegelse i bakre kammer kan dermed atskilt og fanget samtidig. Avhengig av utformingen av DCP, kan disse bølgeformer erverves med en trykket transdusere eller pneumotachographs henholdsvis registrere endringene i kammer trykk eller luftstrøm og ut av kamrene som en funksjon av tid. Sistnevnte tilnærmingen er mer vanlig i dag.
Mens dyr puste frekvens kan nøyaktig bestemmes av noen slags plethysmography teknikker, er situasjonen ikke det samme for fastsettelse av Tidalvolum og relaterte ventilasjon parametrene (f.eks, minuttventilasjon, ekspirasjonsvolum, etc.). I motsetning til hele kroppen plethysmograph (WBP) teknikken, hvor dyr Tidalvolum anslås fra boksen signal4,5, gir DCP teknikken nøyaktig vurderinger av Tidalvolum. Dette er knyttet til direkte oppkjøp av dyrets thorax bevegelse i det bakre kammeret, som er proporsjonal med endringene i lunge volum under puste.
I tillegg til disse nøyaktig ventilatory parametere (f.eksTidalvolum, puste frekvens og minuttventilasjon), noen forstyrrelser i form av respiratoriske syklusen kan også brukes til å undersøke neuronal aspekter som styrer den åndedretts stasjonen eller åndedretts reflekser. Et konkret eksempel på programmet ville være evalueringen av irritasjon potensialet av inhalert stoffer på øvre luftveier sensoriske neurons6. Her, bestemmes varigheten av en pause ved utbruddet av utløpsdato ved å bruke en parameter som heter slutten-Inspiratorisk pause (EIP), også referert til som varighet oppbremsing6. Forlengelse av denne pausen av en irriterende stoffet er forbundet med nedleggelsen av dyr glottis, forårsaker en målbar periode oppbremsing i første del av utløpsdato6,7.
En annen viktig fordel av DCP er at det gir to validert og ubestridte parametere som luftveisobstruksjon. En kalles flyten i midt-tidevanns ekspirasjonsvolum og er forkortet EF508,9,10. Det er luftstrømmen på midtveis volum av hver tidevanns under utløp. EF50 er Hentet fra thorax flyt spor, og kan dermed måles uten fremre kammer (dvs.i hodet ut konfigurasjon). Den andre kalles bestemt airway motstand og er forkortet sRaw11,12,13. Fastsetting av sRaw krever samtidig opptak av dyrets nese og thoracic flyter som det er beregnet fra tidsforsinkelsen mellom disse separate åndedretts spor på null flyt på slutten av inspirasjon. Begrunnelsen som beskriver grunnlaget som denne forsinkelsen gjelder sRaw var expatiated tidligere11. Enkelt sagt, foran endringene i lunge volum luften bevegelsen siden en trykkgradient må utvikle for å kjøre luftstrøm. I en sunn dyr puster stille, er denne forsinkelsen vanligvis svært liten. Imidlertid er trykkgradient som kreves til en gitt flyt (f.eks, en strøm nok til å gi tilstrekkelig ventilasjon) påvirket av graden av luftveiene motstand. Under bronchoconstriction, for eksempel er gradient av trykk er nødvendig for en gitt flyt større, noe som innebærer at dyret må jobbe hardere for å puste. En større gradient trykket i dyrets syn innebærer også at en større del av flyten og ut av den bakre kammeret skyldes dekompresjon/kompresjon av luft i thorax, som er del av den totale thorax utvidelse/retraksjonen som er ut av fase med nasal flyten. Økt motstand på grunn av bronchoconstriction vil dermed øke forsinkelsen mellom bak og foran chambers og øker dermed sRaw. Graderingen press som driver luftstrøm og ut av lungene er også påvirket av første thorax gassvolumet (TGV). På en større TGV for eksempel utvidelse/tilbakekallingen av thorax måtte generere gitt gradering press er større (bare fordi volumet forskyvning som kreves for å generere en gitt gradering press er større), som innebærer også at den dyr må jobbe hardere for å puste. Igjen, disse ekstra thorax forskyvninger er nødvendig å dekomprimere/komprimere luften i thorax og er dermed ut av fase med nasal strømmen. Så, en økt TGV vil også øke forsinkelsen mellom kammer og øker dermed sRaw. Som kan sees, resultere både bronchoconstriction og økt TGV i en viktig innsats for å trekke luft inn i lungene. Dette er i hovedsak fysiologiske betydningen av sRaw. Det representerer arbeidet som kreves for å puste5,14.
Det er derfor viktig å forstå at to forskjellige faktorer påvirker sRaw: airway motstand og TGV. Faktisk kan sRaw uttrykkes som produktet av luftveiene motstand og TGV11. Bevisst dyr kan endre deres TGV på vilje, å tilpasse deres ventilasjon til et gitt miljø. Under slike forhold, der dyr naturlige fysiologiske tilstand er uendret, er det derfor umulig å skjelne om en endring i sRaw stammer fra en endring i airway motstand, fra en endring i TGV eller fra en blanding av to. Derfor er det anbefalt å utfylle DCP evalueringen med mer invasiv målinger av respiratoriske mekanikk og/eller lunge volumer, som dem som tilbys av FOT1,15.
Hittil har DCP brukt i ulike forskning programmer. Teknikken kan brukes med eller uten hode kammeret til kvantitativt og evaluere nøyaktig effekten av ulike stoffer, som farmasøytisk agenter, allergener, irritanter eller andre meglere, på lungefunksjon i bevisst smådyr 16,17,18. Fremre kammer kan også brukes som en utsette chamber aerosolized stoffer eller varierende gass konsentrasjoner (hypoksi, hypercapnia, etc.)19. Praktisk, det gjør det mulig å måle samtidig de akutte virkningene av disse eksponeringene. Faktisk er en av de felles bruk av DCP å vurdere graden av respons til aerosolized methacholine i forskjellige modeller av luftveissykdommer20,21,22,23, 24 , 25.
Selv om DCP teknikken er tilsynelatende enkle, noen praktiske utfordringer potensielt motvirke uerfarne brukere eller svekke nøyaktigheten og reproduserbarhet resultatene. Utredningen gir en detaljert beskrivelse av de anbefalte prosedyrene for å kunne registrere lungefunksjon av DCP i bevisst, behersket, spontant pustende mus. Beskrivelsen gjelder uttalte utstyret (se Tabell for materiale). Verktøyet og verdien av DCP er også demonstrert i en vanlig modell av allergiske lungebetennelse i to stammer mus testet ved baseline og som svar på aerosolized methacholine.
Protocol
Følgende ble godkjent av Quebec hjerte og lunge Institute dyr komiteen i henhold til veiledning av det kanadiske rådet på dyr omsorg (CCAC).
1. forberedelse
- Studien
- (Kritisk) Før du utfører noen forsøk, få du de aktuelle godkjenningene (f.eks IACUC) og opplæring (f.eks dyr håndtering).
- Gjør deg kjent med utstyret og operativsystemet programvare. Les brukerhåndbøkene og, om nødvendig opprette en konfigurasjonsfil til å definere antall områder, input signaler, analyserer og parametere.
Merk: Pass på å velge en høy samplingsfrekvens (2 KHz). - Konfigurere analyserer innstillingene for parametrene av interesse.
- Velg Tuning fra verktøylinjen og deretter analyserer.
- Justere flyt terskelen til en verdi som riktig skiller åndedragene (mus: 0,5 mL/s) og velge Ti + Te kan beregne puste.
- Angi en verdi for barometertrykk (760 mm Hg) og angi maksimalt avvik for Inspiratorisk/ekspiratorisk volum på et vindpust skal være gyldig (mus: 20%).
- Klikk på innstillingen i feltet beregnet parametere justere grensene for aksept.
Merk: Følgende innstillinger ble brukt for beskrevet musen eksperimenter: inspirasjon tid, 50 til 170 ms; utløpstid, 40-180 ms; hyppigheten av pusting, 30 til 450 bpm; bestemt airway motstand, 0 til 15 cmH2O·s; midexpiratory flyt med en presisjon på minst 3 desimaler. - En gang fullført, velg Bruk og Lukk for å avslutte dialogboksen.
- Bar-menyen verktøy, gå til Tuning igjen og deretter lagring til å angi en ønsket datahastighet for lagring. Klikk på Bruk og Lukk å lukke vinduet.
Merk: Et gjennomsnitt på hver 10 s brukes vanligvis. - Opprette en protokoll i operativsystemet programvare til å definere en sekvens av kommandoer og ønsket tidspunkt for hver. Et eksempel er vist i figur 1.
- Hvis forsøket omfatter av et stoff av aerosol, forberede hensiktsmessige løsninger og fortynninger ifølge konsentrasjonen skal testes.
- Dyr
- Arbeid i et rolig område fjernt fra bolig rommet. Tillate dyr å justere til endring av miljø.
- Veie dyrene og velge riktig tilbakeholdenhet.
- (Kritisk) Acclimate dyrene til restrainer og prosedyrer før starten av eksperimentet. Avhengig av eksperimentell design, acclimation økter for å øke varigheten (f.eks 5-30 min) kan være nødvendig.
Merk: Dyr som ikke acclimate bør fjernes fra studien.- På hver acclimation økt, setter du inn dyr i restrainer, fortsetter den tilbake åpner; holde enheten loddrett kan være nyttig.
- Når Dyret er i posisjon, tilbake stempelet og forsiktig låse den på plass uten å bruke en overdreven kraft.
- (Kritisk) Visuelt kontrollere at dyr puster normalt. Eventuelt justere sin posisjon ved å flytte låsemekanismen. Kontroller at dyrets nares er stikker utenfor nese-membran med sin snute hviler mot indre veggene i restrainer.
- Koble fra baksiden av thorax kammeret, sett restrainer som inneholder dyret gjennom gummi åpning i thorax chamber, og Lukk kammeret.
- Feste hodet kammeret og gi en skjevhet flyt. Bruke en flyt på 0,5 L/min for en mus.
- Tillate dyr å slappe av i 5 minutter.
- Når Dyret er rolig, starte innspillingen nese og thoracic signaler. Kontroller på skjermen at sporene er glatt og at de viser en vanlig pustemønster; se eksemplet i figur 2.
Merk: Hvis protokollen innebærer aerosol administrasjon av et stoff, kan en saltvann utfordring inkluderes i acclimation prosedyren. - På slutten av hver økt, fjerne dyret fra thorax kammeret og i restrainer og returnere den til sin bolig bur og rom.
- Utstyr
- På dagen for eksperimentet, starter en eksperimentell økt og laste den nødvendige konfigurasjonsfilen.
Merk: Kontroller at det inneholder ønsket protokollen for eksperimentet. - Gå til løpe i verktøyet stang-menyen. Angi eksperimentet og dyr. Når ferdig, klikk på Kjør -knappen nederst i vinduet.
- Fortsett med kalibrering av systemet. Kalibrer hvert område og innsignaler separat.
- Slå på bias flyt generatoren, koble den til hodet kammeret via et stykke rør og justere infusjonshastigheten.
- Lukk topp åpningen av hodet kammer med en cap.
- Koble fra baksiden av thorax kammer, sett ordentlig kalibreringsverktøy inne gummi åpne mellom hodet og kroppen kammer å lage en hermetiske forsegling. Deretter lukker og re-fest baksiden av thorax kammeret.
- Kontroller at siden porten thorax kammeret er avkortet.
- Menyen programvare verktøyet stang, gå til Tuning og deretter Kalibrer.
- Gå til Inngang 1 (thorax) og velg Calibrate å starte kalibrering dialogboksen for thorax flyt signalet.
- (Kritisk) Kontroller at de viste parameterne i dialogvinduet kalibrering viser de riktige innstillingene, dvs. fysisk stress brukes lav verdi: 0; Fysisk stress brukt høy verdi:-20 mL/s; Eksempler: integrere. Når ferdig, klikk på lav i eksempler -vinduet.
- Kontroller at signalet generert er konstant over visningsvinduet og klikk på Lukk.
- Koble en 20 mL sprøyte gjennom porten av thorax kammer med en plast-kontakt og et stykke rør.
- (Kritisk) Velg høy i eksempler -vinduet og umiddelbart injisere 20 mL av luft inn i kammeret løpet 2 s på en flow rate som konstant som mulig.
- Kontroller at signalet generert vises i visningsvinduet. Bruk pilen ikon for å bekrefte om signalet er sentrert og symmetrisk rundt null. Klikk på Lukk. Fjerne forskyvningen fra null ved å klikke på fjerne AC forskyvning i eksempler -vinduet
Merk: Høy verdi kalibreringen kan gjøres, hvis nødvendig. - Kontroller at resulterende Skalert Input utvalg er innenfor anbefalt område (mus: ±280 ±420 mL/s). (Kritisk) Gjenta kalibrering trinnene hvis verdiene er utenfor gyldig område.
- Kalibrere hodet kammer på en lignende måte som thorax kammeret (trinn 1.3.3.6). Denne gangen Velg inngang 2 (nasal).
Merk: (Viktig) Verdien for fysisk stress brukt høy verdi må være satt til + 20 mL/s. Dette vil endre polariteten til flyten i fremre kammer i forhold til den bakre kammeret. Når Dyret er åndedrag, blir derfor nesten to flyt signaler i fase, bortsett fra forsinkelsen brukes til å beregne sRaw.
- På dagen for eksperimentet, starter en eksperimentell økt og laste den nødvendige konfigurasjonsfilen.
2. lunge funksjonen målinger
- Veie dyrene og merke deres kropp vekt.
- Sett inn dyret innen restrainer og plasser den inne i thorax plethysmograph kammeret (trinn 1.2.3.1 til 1.2.3.5).
- Tillate dyr å slappe av i minst 5 minutter.
- Starter protokollen kommandoene ved å velge det første trinnet, og klikk deretter på kjøre.
- Kontroller på skjermen som dyrets puste signaler er vanlig og glatt (figur 2). Programvaren viser automatisk beregnet parameterne på pusten med pusten basis. Kontroller at dyrets parametere er stabil.
- Registrere pustemønster under grunnlinjen forhold i opptil 10 minutter.
- For protokoller som involverer administrasjon av en test av aerosol, gjør du som følger:
- Justere forstøveren på tid og plikt syklusen, etter behov.
Merk: I eksemplene i denne artikkelen, i forstøveren ble operert på en 5% driftssyklus for 10 s. - Utfør en bilen utfordring (f.eks saltvann) og Registrer svaret.
- Hvis nødvendig, utsette dyret til økende konsentrasjoner av testen stoffet ved å endre konsentrasjonen i forstøveren i økende trinn (f.eks dobling konsentrasjoner). Registrert svaret etter hver administrasjon.
- På slutten av eksperimentelle økten, hvis ikke blir gjort automatisk, stoppe innspillingen og tilbake dyret til sin bolig bur og rom.
- Justere forstøveren på tid og plikt syklusen, etter behov.
- Hvis nødvendig, velger du Kjør bar på menyen verktøy til å kjøre en annen eksperimentell økt.
- Mellom økter, rense plethysmograph chambers og skyll forstøveren med vann.
Merk: Alkoholbruk kan forårsake irreversibel skade på plethysmograph.
- Mellom økter, rense plethysmograph chambers og skyll forstøveren med vann.
- Hvis studien innebærer gjentatt evalueringer over tid, kan du gjenta hele måling rekkefølgen på hver valgte timepoint.
Merk: Det anbefales klokt å utfylle studiet med noen nøyaktige mål av respiratoriske mekanikk og/eller lunge volumer1,15.
3. dataanalyse
Merk: Programvaren automatisk lagrer filen eksperimentelle og eksporterer innspilte parameterne når eksperimentelle økten er lukket.
- Beregne en planlagt gjennomsnittet for parametrene av interesse for hvert dyr og eksperimentelle.
Merk: tabell 1 lister opp en rekke typiske parametere, kategoriseres basert på hvilken type informasjon de gir. - Når relevante evaluere effekten av det aerosolized stoffet studerte på parametrene av interesse på hver konsentrasjon med et bestemt punkt (f.eks maksimal eller minimal verdi), et gjennomsnitt eller på full tid-kurset en normalisering til baseline kan også bli vurdert.
- Rapportere resultatene med gruppen midler og feil i en tabell eller et grafisk format. Analysere resultatene statistisk.
Merk: Studien, toveis ANOVAs med gjentatt tiltak ble brukt til å vurdere effekten av methacholine, allergenet-house-støv midd (HDM)- og deres samspill forskjellige DCP readouts (sRaw og EF50) samt ulike FOT readouts (RN, G og H), i begge stammer mus. Sidaks flere sammenligning tester ble så brukt til å bestemme konsentrasjonen av methacholine som allergisk musene som er forskjellige fra kontroll mus. De samme testene ble brukt til å vurdere effekten av dager, HDM og deres samspill ved baseline (dvs.før methacholine) på readouts luftveisobstruksjon (sRaw og EF50) og ventilasjon mønster (BF, TV, MV og EIP). Pearsons sammenhenger ble brukt for å evaluere sammenhenger mellom sRaw oppnådd med DCP og RN med FOT. Alle statistiske analyser og diagrammer som ble utført med alternative standard statistisk programvare (f.eksGraphPad prisme). p ≤ 0,05 ble regnet som tilstrekkelig til å avvise nullhypotesen.
Representative Results
Resultatene av gjentatte evalueringer av lungefunksjon av DCP, utføres under planlagte forhold på tre dager (dager 12, 13 og 14 av protokollen illustrert i figur 1) i kontroll og allergiske BALB/c mus, vises i Figur 3 . Parameterne som ble valgt å vurdere mønster av puste inkludert puste frekvens (figur 3A), Tidalvolum (figur 3B), minuttventilasjon (Figur 3 c) og slutten-Inspiratorisk pause (figur 3D). Parameterne som brukes til å vurdere luftveisobstruksjon var EF50 (figur 3E) og sRaw (figur 3F). Resultatene av hver valgte parameter var stabil over disse tre dager i begge grupper, med ingen synlig effekt forårsaket av allergiske betennelse.
Graden av respons til methacholine ble evaluert av DCP på påfølgende dager (dager 12, 13 og 14 av protokollen illustrert i figur 1) i både kontrollen og allergiske BALB/c mus. Resultatene vises i Figur 4, vise endringene i de to parameterne som luftveisobstruksjon, nemlig sRaw (figur 4A, B og C) og EF50 (Figur 4 d, E og F). Som forventet, trinnvis konsentrasjoner av methacholine gradvis økt sRaw og gradvis redusert EF50. Disse svarene var kraftig av allergiske betennelse, spesielt i siste konsentrasjonen testet, som dokumentert av tilstedeværelsen av hyperresponsiveness. Resultatene viser også at overdrevet graden av respons var begrenset til første dag (dag 12), som ikke ble det observert under to påfølgende vurderinger (dvs., på dager 13 og 14).
Resultatene av evalueringen av respiratoriske mekanikk av FOT, utføres på den siste dagen av eksperimentelle protokollen (dag 15; Figur 1) i både kontrollen og allergiske BALB/c mus, vist i figur 5. Disse eksperimentene ble inkludert i studien å utfylle DCP evalueringene. FOT er anerkjent som en mer presis tilnærming å vurdere lungefunksjon2. En av styrkene er at det gir topografiske innsikt om hvilke områder av lunge (gjennomføre airways versus perifere airways og lungevev) påvirkes av testet intervensjon (f.eks, allergener og methacholine). Anbefalte metodikken å vurdere åndedretts mekanikk med FOT var beskrevet tidligere1. Her, ble tre FOT parametere brukt til å beskrive endringene i luftveiene mekanikk indusert av allergiske betennelse og methacholine. Disse parameterne som er inkludert: 1-newtonsk motstand (RN; Figur 5A), en parameter som endringer i verdien hovedsakelig gjenspeiler variasjoner i motstanden av store gjennomfører luftveiene; 2-vev demping (G; Figur 5B), en parameter som endringer i verdien hovedsakelig gjenspeile variasjoner i vev motstand; og 3-vev elastance (H; Figur 5C), en parameter som endringer i verdien hovedsakelig gjenspeiler variasjoner i vev stivhet2. Som forventet, var det en økning i hver av disse parameterne svar på trinnvis konsentrasjoner av methacholine. Samsvarer med sRaw og EF50 resultatene med DCP fra forrige dag (dag 14; Figur 1), endringer i RN indusert av methacholine (figur 5A) var sammenlignbar mellom kontrollen og allergiske musene. Faktisk verdiene for sRaw på dag 14 korrelert med verdier for RN på dag 15 (figur 5 d). Økningen i H av methacholine ble også tilsvarende mellom kontrollen og allergiske mus (figur 5B). Methacholine-indusert økning i G var imidlertid betydelig større i allergisk mus (figur 5C). Dette resultatet viser tilstedeværelse av en vedvarende hyperresponsive fenotypen i allergisk mus på dag 15, som ikke ble funnet av DCP evalueringene utført på de to foregående dagene.
Det hele studiet ble gjentatt med C57BL/6 mus. Resultatene av påfølgende DCP evalueringene av sRaw, dager 12, 13 og 14 protokollen (figur 1) og FOT evalueringen av RN, på dag 15, er vist i figur 6. I som bestemte musen belastning, ble overdreven methacholine svaret observert i allergisk mus opprettholdt over tre påfølgende dager (figur 6A, Bog C). Denne hyperresponsive fenotypen ble også avbildet med FOT på dag 15 av økende RN indusert av methacholine som var mer uttalt i allergisk mus (figur 6E). Dette var i sterk kontrast med resultatene med BALB/c musene, der en progressiv avtagende av hyperresponsiveness oppstod fra dager 12 til 14 (Figur 4) og mangel på forskjellen i methacholine-indusert økning i RN ble observert på dag 15 (figur 5A). Sammen indikerte disse resultatene en tid-varierende effekt av allergenet på methacholine-indusert svar mellom de to stammene mus. Viktigere, ble denne belastningen forskjellen avbildet av både DCP og FOT. Concordantly, verdiene i sRaw målt ved DCP på dag 14 korrelert med verdier for RN målt i FOT på dag 15 (figur 6F), som ble observert med BALB/c musene (figur 5 d).
Figur 1 . Protokoller brukes til å indusere allergisk lungebetennelse og å vurdere graden av respons til methacholine. Denne studien ble gjennomført på kvinnelige BALB/c og C57BL/6 mus 7 til 9 uker gammel. En rekke tiltak som er gjennomført over hele undersøkelsen vises i panelet (A). Halvparten av mus var utsatt for 50 µg av huset-støv midd (HDM) ekstrakt gjennom på 14 sammenhengende dager å indusere allergisk lungebetennelse. Den andre halvparten ble utsatt for saltvann og brukt som kontroll. Lungefunksjon ble vurdert av dobbel-kammer plethysmography (DCP) på tre separate anledninger (dager 12, 13 og 14, svart sirkler) etter en acclimation økt (dag 11, grå sirkel) som inkluderte en utfordring med aerosolized saltvann. Under hver økt, ble planlagte lungefunksjon og svaret methacholine vurdert ved hjelp av automatiserte protokollen vises i panelet (B). På dag 15, ble en invasiv vurdering av respiratoriske mekanikk med tvungen oscillation teknikk (FOT) utført som beskrevet tidligere1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 . Representant flyt signaler fra en sunn BALB/c mus. Panelene viser typisk opptak spor ved dobbel-kammer plethysmography i en kontroll mus under grunnlinjen forhold. Thorax flyt vises i øvre panelet og nasal flyt vises i nedre panel. Negative verdier er under inspirasjon og positive verdier er under utløp. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 . Gjentatt evalueringer av lungefunksjon i bevisst BALB/c mus. Planlagte lungefunksjon ble vurdert av dobbel-kammer plethysmography (DCP) i kontroll (åpne symboler) og allergiske (solid symboler) mus dager 12, 13 og 14 av protokollen illustrert i figur 1. DCP parameterne som brukes til å vurdere lungefunksjon inkludert puste frekvens i (A), Tidalvolum (TV) med (B), minuttventilasjon (MV) i (C), slutten Inspiratorisk pause (EIP) i (D), flyter i midt-tidevanns ekspirasjonsvolum ( EF50) i (E) og bestemte airway motstand (sRaw) i (F). Verdiene av pusting frekvens, TV, MV, sRaw og EIP for hver mus var gjennomsnittsverdiene registrert over 1,5 min. Verdien av EF50 var minimal verdi innhentet i denne innspillingen perioden. Resultatene presenteres som gruppe betyr ± standardavvik (n = 5/gruppe). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 . Methacholine bronchoprovocation test i bevisst BALB/c mus. Methacholine respons ble vurdert av dobbel-kammer plethysmography (DCP) i kontroll (åpne symboler) og allergiske (solid symboler) mus dager 12, 13 og 14 av protokollen illustrert i figur 1. DCP parameterne som brukes til å vurdere responsen inkluderte bestemt airway motstand (sRaw) i (A) til (C) og flyt på midt-tidevanns ekspirasjonsvolum (EF50) i (D) gjennom (F). Bronchoprovocation ble utført av aerosolizing methacholine i DCP hodet kammeret for 10 s ved trinnvis konsentrasjoner. Responsen var overvåket under 1,5 min etter hvert konsentrasjon. Verdien for sRaw for hver musen på hver konsentrasjon var gjennomsnittsverdien registrert over 1,5 min. Verdien av EF50 var minimal verdi innhentet i denne innspillingen perioden. Resultatene presenteres som gruppe betyr ± standardavvik (n = 5/gruppe). Stjerne symbolet * angir en statistisk signifikant forskjell (p 
Figur 5 . Invasiv vurdering av respiratoriske mekanikken i BALB/c mus. Åndedretts mekanikk ved baseline og som svar på methacholine ble evaluert av tvungen oscillation teknikken (FOT) på dag 15 av protokollen illustrert i figur 1. Kontrollen (åpne symboler) og allergiske (solid symboler) mus var det samme som de testet av dobbel-kammer plethysmography (DCP) på dager 12, 13 og 14. Parameterne som brukes til å vurdere åndedretts mekanikk var newtonsk motstand (RN) i (A), vev elastance (H) med (B) og vev demping (G) i (C). Bronchoprovocation ble utført av nebulizing trinnvis konsentrasjoner av methacholine direkte i endotracheal tube bedøvet, tracheotomized, lammet og mekanisk ventilasjon mus i supine posisjon. Responsen var overvåket under 5 min etter hvert konsentrasjon. Verdien for hver parameter for hver musen på hver konsentrasjon var den høyeste verdien i denne innspillingen perioden. Resultatene presenteres som gruppe betyr ± standardavvik (n = 5/gruppe). Panelet (D) viser sammenhengen mellom bestemte airway motstand (sRaw) målt ved DCP på dag 14 og RN målt i FOT på dag 15. Åpne symboler representerer verdiene ved baseline og solid symboler representerer maksimal verdiene på den høyeste konsentrasjonen av methacholine testet for kontrollen (sirkler) eller allergisk (ruter) mus. Rammemargen viser bestemmelseskoeffisient (r-2). Stjerne symbolet * angir en statistisk signifikant forskjell (p ≤ 0,05). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 . Respiratory funksjon og invasiv åndedretts mekanikken i C57BL/6 mus. Bestemt airway motstand (sRaw) ble vurdert av dobbel-kammer plethysmography (DCP) ved baseline og som svar på methacholine i kontroll (åpne symboler) og allergiske (solid symboler) mus dager 12 (A), 13 (B) og 14 (C) av den protokollen er illustrert i figur 1. Newtons motstand (RN) ved baseline og svar på methacholine ble vurdert av tvungen oscillation teknikken (FOT) på dag 15 (D). Bronchoprovocations ble utført som beskrevet i Figur 4 og figur 5 for DCP og FOT, henholdsvis. Resultatene presenteres som gruppe betyr ± standardavvik (n = 5/gruppe). Panelet (E) viser sammenhengen mellom sRaw målt ved DCP på dag 14 og RN målt i FOT på dag 15. Åpne symboler representerer verdiene ved baseline og solid symboler representerer maksimal verdiene på den høyeste konsentrasjonen av methacholine testet for kontrollen (sirkler) eller allergisk (ruter) mus. Rammemargen viser bestemmelseskoeffisient (r-2). Stjerne symbolet * angir en statistisk signifikant forskjell (p ≤ 0,05). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Parameteren | Enhet | Beskrivelse | Informasjon |
| F | BPM | Puste frekvens | Mønster av ventilasjon |
| TV | mL | Tidalvolum | |
| MV | mL | Minuttventilasjon | |
| Ti | MS | Inspiratorisk tid | |
| Te | MS | Ekspiratorisk tid | |
| PIF | mL/s | Topp Inspiratorisk flyt | |
| PEF | mL/s | PEF-måler | |
| EV | mL | Ekspirasjonsvolum | |
| NTV | mL | Nasal Tidalvolum | |
| NEV | mL | Nasal ekspirasjonsvolum | |
| EIP | MS | Slutten Inspiratorisk pause | |
| EEP | MS | Slutten ekspiratorisk pause | |
| dT | MS | Tidsforsinkelsen | Luftveisobstruksjon |
| sRaw | cmH2O·s | Bestemt airway motstand | |
| sGaw | 1/cmH2O·s | Bestemt airway konduktans | |
| EF50 | mL/s | Flyte på midt-tidevanns ekspirasjonsvolum | |
| SR | % | Suksessraten | Kvalitetskontroll |
| N | Antall gyldige åndedrag |
Tabell 1. Liste over vanlige parametere Hentet fra dobbelt-kammer plethysmography. Parameterne var gruppert etter innholdet i informasjonen de gir under en lungefunksjon evaluering.
| Fordeler | Begrensninger |
| · Bevisst dyr | · Nødvendigheten av å kontrollere omgivelsene |
| · Nøyaktig ventilasjon parametere | · Tidligere acclimation av dyrene |
| · Ubestridte indeksene av luftveisobstruksjon (sRaw, EF50) | · Kravet hermetisk skille nese og thoracic renn |
| · Tilpasningsdyktig til ulike arter og dyr størrelser | · Absoluttverdien variasjon for noen utfallet parametere |
| · Brukes i mange forskning | · sRaw ikke et riktig mål av motstand |
| · Enkel teknikk | · Tilstedeværelsen av de øvre luftveiene |
| · Følsom endre | · Utfyller målinger med en invasiv vurdering |
Tabell 2. Liste over fordeler og begrensninger forbundet med dobbel-kammer plethysmography.
| Dobbel-kammer Plethysmography | Tvunget Oscillation teknikk | |
| Dyrets bevissthetstilstand | Uendret | Anesthetized (og vanligvis lammet) |
| Dyrets posisjon | Oppreist | Supine |
| Dyrets tilgjengelighet | Begrenset innenfor kammeret | Tilgjengelig |
| Dyr integrasjon til måling enheten | Nese eller hals segl | Trakeotomi eller muntlig intubasjon |
| Dyrets airway treet | Intakt | Delvis-øvre luftveier segmentet utelukket (i.e. nasal gjennomfører, svelg og strupehodet) |
| Lungevolumet der utfallet parameterne hentes | Variabel - spontan volum av dyret | Standardiserte - kontrollerte rekruttering manøvrer og positiv slutten-utåndingstrykket. |
| Frekvens for parameterne utfallet blir vurdert | Variabel - spontan pusting frekvensen av dyret | Kontrollert - ved hjelp av forhåndsdefinerte bølgeformer på angitte frekvenser |
| Bidrag fra øvre luftveier segmentet utfallet parameterne | Forventes | Omgås |
| Området av aerosol levering | Inne i hodet kammeret | Direkte i luftrøret |
| Effekten av øvre luftveier segmentet på inhalert dose / aerosol deponering mønster | Forventes | Hindret |
| Evnen til å oppdage endring - basert på resultatene av studien | Observert | Observert |
| Iboende variasjon av teknikken - basert på resultatene av studien | Svingninger i variasjonskoeffisienten for sRaw ved baseline: 7.5-20.6% | Svingninger i variasjonskoeffisienten RN ved baseline: 3.6-13,4% |
Tabell 3. Sammenligning mellom dobbelt-kammer plethysmography og tvunget oscillation teknikker.
Discussion
Muligheten til å måle lungefunksjonen i bevisst dyr er tydelig hjemlet i luftveiene forskning. Generelt, er DCP en interessant tilnærming til å evaluere funksjonen ventilasjon i luftveiene i bevisst og spontant puste dyr26. Mer spesifikt, slår DCP eller dens hodet ut variant, ofte en riktig balanse mellom kvaliteten på informasjonen og ønsket nivå av invasiveness3 (tabell 2). Teknikken kan tilpasses til ulike arter (f.eks mus, rotte, marsvin) eller dyr størrelser og kan brukes i mange forskning. Det er spesielt nyttig å vurdere flere dyr samtidig i en parallell studien design, overvåke funksjonen åndedretts gjentatte måte, og å fange the kinetics av svar over tid. I tillegg teknikken er enkel og kan læres i relativt rimelig tid. I dagens papir, en protokoll ansette DCP målinger i mus ble brukt som et eksempel å beskrive de praktiske aspektene av dette behersket plethysmography teknikken også for å diskutere viktige tiltak og relaterte resultater.
Når du arbeider med bevisst dyr, er det viktig å kontrollere forholdene i omgivelsene (f.eks rolig rom med et begrenset antall personer eller aktivitet) for å generere reproduserbar resultater. Siden restrainers kommer i ulike dimensjoner, er det viktig å starte med riktig størrelse, slik at puste bevegelsene er Uaffisert. Det er også nyttig og ofte nødvendig å acclimate dyrene eksperimentelle set-up og prosedyrer, som det er godt etablert i mus at påbud påvirker puste frekvens12. Avhengig av eksperimentell design eller betingelser, kan flere økter med trinnvis varighet være nødvendig. Til slutt er gir tid ved starten av et eksperiment for dyr å justere til rommet endres og nødvendig håndtering en enkel vurdering som viste seg å være effektive for å sikre at pustemønster er konsekvent regelmessig og avslappet ved baseline. Arbeide under forhold der dyrene er komfortable, godt tilpasset og rolig vil også være nyttig i forhold til resultatet variasjon og kvalitet. Det begrenser også noen stress-indusert utgivelsen av katekolaminer, som kan øke airway kaliber og dempe en indusert bronchoconstriction.
Det er viktig å forstå at det er behov for å skille som hermetisk som mulig nese og thoracic renn. Avhengig av systemet eller arter studerte, kan tetting mekanismen variere i form så vel som effekt. I DCP vi beskrevet her, opprettes segl mellom dyrets snute og begrensende enheten. Når vurdere lungefunksjon av DCP, er det også viktig å gi en tilstrekkelig og kontinuerlig bias flyt, som en reduksjon i nivået av oksygen tilgjengelig for dyret vil resultere i betydelige effekter. Tatt i betraktning for dyr i restrainer begrenser tilbøyelighet for luftlekkasjer opprettet av agitasjon og maksimerer dermed kvaliteten på dataene. Contrastingly, en bryter i seglet vil resultere i enten avviste datasett eller en undervurdering av noen parametere.
I tillegg for å aktivere separat innspillingen av nese flyt, brukes hodet kammeret vanligvis til å utsette dyr aerosolized stoffer. Som illustrert i denne artikkelen, kan dette brukes til å utføre en bronchoprovocation test for å demonstrere ulike grader av respons. I slike eksperimenter, justere utvalget av testet konsentrasjoner kan være nødvendig avhengig av arter, belastning, eller sex av dyrene studerte. Som tidligere viste8,9,10,27viser nåværende resultater at methacholine-indusert endringene i sRaw korrelert med invasiv FOT målinger av luftveiene motstand. Resultatene viser også at DCP teknikken ikke er så følsomme som FOT for sin evne til å oppdage åndedretts dysfunksjon og identifisere en endret respons lokalisert innenfor de nedre deler av lungekreft (lungevev og/eller små tilbehør airways) . Siden dyrets airways er intakt, kan tilstedeværelsen av de øvre luftveiene, som står for den største delen av totale åndedretts motstanden mot luftstrømmen28, påvirke aerosol distribusjon og deponering i tillegg å dempe bidraget fra lavere luftveiene til en måling. Tabell 3 oppsummerer andre forskjeller mellom DCP teknikken og FOT. Til slutt, mens det ville være teoretisk mulig å anslå dyrets totale airway motstand (inkludert øvre luftveier) fra en måling av sRaw, er det generelt anbefalt å utfylle DCP evalueringen med en invasiv måleverdien teknikken som FOT-29 å få direkte målinger av detaljert åndedretts mekanikk. Avhengig av målene for studien, kan målinger av øvre luftveier motstand også bli vurdert30,31,32.
Konklusjon
På grunn av sin begrensede grad av invasiveness er DCP en teknikk som kan oppfylle et viktig behov i luftveiene forskning. Det er kjøpedyktig skaffe nøyaktig readouts ventilasjon mønster i bevisst dyr samtidig med noen ubestridte indekser av luftveisobstruksjon. Innhentet informasjon også virkelig utfyller som fra mer invasiv tilnærminger.
Disclosures
DB og AR er ansatt av SCIREQ vitenskapelige åndedretts utstyr Inc, en kommersiell person involvert i emner relatert til innholdet i denne artikkelen. DB eier også lager. SCIREQ Inc. er en også teknologier.
Acknowledgments
SML er støttet av en studentship fra kanadiske institutter for helseforskning, MG støttes av en bursary fra åndedretts helse nettverket av FRQS (Fonds de recherche du Québec-Santé) og YB er stipendiat fra FRQS.
FORFATTERNES BIDRAG
Alle forfattere bidratt til oppfatningen av manuskriptet og/eller video. SML og LD innsamlede dataene. SML, LD, YB, DM, DB og AR bidratt til dataanalyse, generering av tall og manuskriptet skriving. YB, AR, KL og MG var involvert i forbereder video skriptet. Stykket ble fremført av YB, KL og MG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetyl-β-methylcholine chloride | Sigma-Aldrich | A-2251 | Methacholine |
| Phosphate buffered saline | Multicell | 311-506-CL | PBS 10X |
| House dust mite extract | GREER | 290902 | HDM |
| DCP complete system | SCIREQ Inc. /emka TECHNOLOGIES | ||
| iox software | SCIREQ Inc. /emka TECHNOLOGIES | ||
| Aerogen Aeroneb nebulizer | SCIREQ Inc. /emka TECHNOLOGIES | ||
| flexiVent FX complete system | SCIREQ Inc. /emka TECHNOLOGIES |
References
- McGovern, T. K., Robichaud, A., Fereydoonzad, L., Schuessler, T. F., Martin, J. G. Evaluation of respiratory system mechanics in mice using the forced oscillation technique. J Vis Exp. (75), e50172 (2013).
- Bates, J. H. T. CORP: Measurement of lung function in small animals. J Appl Physiol (1985). 123 (5), 1039-1046 (2017).
- Bates, J. H., Irvin, C. G. Measuring lung function in mice: the phenotyping uncertainty principle. J Appl Physiol. 94 (4), 1297-1306 (2003).
- Lim, R., et al. Measuring respiratory function in mice using unrestrained whole-body plethysmography. J Vis Exp. (90), e51755 (2014).
- Enhorning, G., van Schaik, S., Lundgren, C., Vargas, I. Whole-body plethysmography, does it measure tidal volume of small animals? Can J Physiol Pharmacol. 76 (10-11), 945-951 (1998).
- Vijayaraghavan, R., Schaper, M., Thompson, R., Stock, M. F., Alarie, Y. Characteristic modifications of the breathing pattern of mice to evaluate the effects of airborne chemicals on the respiratory tract. Arch Toxicol. 67 (7), 478-490 (1993).
- Willis, D. N., Liu, B., Ha, M. A., Jordt, S. E., Morris, J. B. Menthol attenuates respiratory irritation responses to multiple cigarette smoke irritants. FASEB J. 25 (12), 4434-4444 (2011).
- Neuhaus-Steinmetz, U., et al. Sequential development of airway hyperresponsiveness and acute airway obstruction in a mouse model of allergic inflammation. Int Arch Allergy Immunol. 121 (1), 57-67 (2000).
- Glaab, T., et al. Tidal midexpiratory flow as a measure of airway hyperresponsiveness in allergic mice. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 280 (3), L565-L573 (2001).
- Glaab, T., et al. Noninvasive measurement of midexpiratory flow indicates bronchoconstriction in allergic rats. J Appl Physiol (1985). 93 (4), 1208-1214 (2002).
- Pennock, B. E., Cox, C. P., Rogers, R. M., Cain, W. A., Wells, J. H. A noninvasive technique for measurement of changes in specific airway resistance. J Appl Physiol Respir Environ Exerc Physiol. 46 (2), 399-406 (1979).
- DeLorme, M. P., Moss, O. R. Pulmonary function assessment by whole-body plethysmography in restrained versus unrestrained mice. J Pharmacol Toxicol Methods. 47 (1), 1-10 (2002).
- Flandre, T. D., Leroy, P. L., Desmecht, D. J. Effect of somatic growth, strain, and sex on double-chamber plethysmographic respiratory function values in healthy mice. J Appl Physiol (1985). 94 (3), 1129-1136 (2003).
- Criee, C. P., et al. Body plethysmography--its principles and clinical use. Respir Med. 105 (7), 959-971 (2011).
- Robichaud, A., et al. Automated full-range pressure-volume curves in mice and rats. J Appl Physiol (1985). 123 (4), 746-756 (2017).
- Mizutani, N., Goshima, H., Nabe, T., Yoshino, S. Complement C3a-induced IL-17 plays a critical role in an IgE-mediated late-phase asthmatic response and airway hyperresponsiveness via neutrophilic inflammation in mice. J Immunol. 188 (11), 5694-5705 (2012).
- Nabe, T., et al. Roles of basophils and mast cells infiltrating the lung by multiple antigen challenges in asthmatic responses of mice. Br J Pharmacol. 169 (2), 462-476 (2013).
- Morris, J. B., et al. Immediate sensory nerve-mediated respiratory responses to irritants in healthy and allergic airway-diseased mice. J Appl Physiol (1985). 94 (4), 1563-1571 (2003).
- Merazzi, D., Mortola, J. P. Effects of changes in ambient temperature on the Hering-Breuer reflex of the conscious newborn rat. Pediatr Res. 45 (3), 370-376 (1999).
- Rao, R., Nagarkatti, P. S., Nagarkatti, M. Delta(9) Tetrahydrocannabinol attenuates Staphylococcal enterotoxin B-induced inflammatory lung injury and prevents mortality in mice by modulation of miR-17-92 cluster and induction of T-regulatory cells. Br J Pharmacol. 172 (7), 1792-1806 (2015).
- Agrawal, A., et al. Inhibition of mucin secretion with MARCKS-related peptide improves airway obstruction in a mouse model of asthma. J Appl Physiol (1985). 102 (1), 399-405 (2007).
- Mabalirajan, U., Aich, J., Agrawal, A., Ghosh, B. Mepacrine inhibits subepithelial fibrosis by reducing the expression of arginase and TGF-beta1 in an extended subacute mouse model of allergic asthma. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 297 (3), L411-L419 (2009).
- Desmet, C., et al. Treatment of experimental asthma by decoy-mediated local inhibition of activator protein-1. Am J Respir Crit Care Med. 172 (6), 671-678 (2005).
- Zang, N., et al. Pulmonary C Fibers Modulate MMP-12 Production via PAR2 and Are Involved in the Long-Term Airway Inflammation and Airway Hyperresponsiveness Induced by Respiratory Syncytial Virus Infection. J Virol. 90 (5), 2536-2543 (2015).
- Shukla, M., et al. Carryover of cigarette smoke effects on hematopoietic cytokines to F1 mouse litters. Mol Immunol. 48 (15-16), 1809-1817 (2011).
- Murphy, D. J. Respiratory function assessment in safety pharmacology. Curr Protoc Pharmacol. , Chapter 10 Unit10 19 (2003).
- Lofgren, J. L., et al. Restrained whole body plethysmography for measure of strain-specific and allergen-induced airway responsiveness in conscious mice. J Appl Physiol (1985). 101 (5), 1495-1505 (2006).
- DiMaria, G. U., Wang, C. G., Bates, J. H., Guttmann, R., Martin, J. G. Partitioning of airway responses to inhaled methacholine in the rat. J Appl Physiol (1985). 62 (3), 1317-1323 (1987).
- Hoymann, H. G. Lung function measurements in rodents in safety pharmacology studies. Front Pharmacol. 3, 156 (2012).
- Agrawal, A., Singh, S. K., Singh, V. P., Murphy, E., Parikh, I. Partitioning of nasal and pulmonary resistance changes during noninvasive plethysmography in mice. J Appl Physiol (1985). 105 (6), 1975-1979 (2008).
- McLeod, R. L., Young, S. S., Erickson, C. H., Parra, L. E., Hey, J. A. Characterization of nasal obstruction in the allergic guinea pig using the forced oscillation method. J Pharmacol Toxicol Methods. 48 (3), 153-159 (2002).
- Miyahara, S., Miyahara, N., Takeda, K., Joetham, A., Gelfand, E. W. Physiologic assessment of allergic rhinitis in mice: role of the high-affinity IgE receptor (FcepsilonRI). J Allergy Clin Immunol. 116 (5), 1020-1027 (2005).
